CN103403175A - 脂质化多肽的制造方法 - Google Patents

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Abstract

一种于大肠杆菌制造重组脂质化多肽的方法。该方法包括：提供一种经适应表现重组脂质化多肽的大肠杆菌宿主细胞；以及将该大肠杆菌宿主细胞在能表现呈脂质化形式的多肽的条件下，培养于基本培养基(minimal medium)中。

Description

脂质化多肽的制造方法
相关申请的交叉引用
本申请依据2010年11月15日美国第61/413,588号专利临时申请案，其相关内容已纳入供参考。
背景技术
将具有脂质的膜蛋白进行转译后修饰作用(Post-translationalmodification)，似乎是原核细胞特有的。细菌脂蛋白共有其具有一段位于剪切部位，已知称为脂质区框(lipobox，即[LVI][ASTVI][GAS]C)的连续序列的共通结构特征。参见，例如，von Heijne,Protein Eng2:531-534(1989)。它们的N-端一旦经过脂质部分修饰后，就会将其定锚在细胞表面上，并作用为结构性蛋白(例如，胞壁质蛋白)或催化性蛋白(例如，胞膜结合酵素或运输蛋白)。参见，例如，Hayashi与Wu,J Bioenerg Biomembr22:451-471(1990)。已使用Braun氏脂蛋白详细研究大肠杆菌中的脂蛋白生物合成作用。参见，例如，Braun与Rehn,Eur J Biochem10:426-438(1969)。该蛋白首先以未经修饰的原脂蛋白(prolipoprotein)形式被合成，然后再由原脂蛋白二酰基甘油基转移酶(Lgt)进行修饰。Lgt催化该二酰基甘油基部分从磷脂酰基甘油转移到固有半胱胺酸的硫醇基。接着藉由原脂蛋白讯号肽酶(LspA)，将二酰基甘油基原脂蛋白位于该经修饰半胱胺酸的脂质化讯号序列裂解。再由磷脂质-去脂脂蛋白N-酰基转移酶(Lnt)催化最终的修饰作用，其将脂肪酸加至N-端半胱胺酸而形成该成熟的脂蛋白。
由于大多数脂蛋白位于细菌的细胞表面上，它们很容易暴露至宿主的免疫***。脂蛋白中与半胱胺酸连结的二酰基脂质部分，被免疫***辨识为一种危险的讯号。因此脂蛋白对于保护性免疫作用而言是重要的抗原。重组脂蛋白作为疫苗候选者的应用，已受限于重组脂蛋白的表现量、脂质修饰作用及后续的处理。因此，有需要一种表现脂蛋白的改良方法。
发明内容
本发明基于意外发现，一种培养基组成物能影响培养于该培养基中的大肠杆菌表现脂质化重组蛋白质。
于是，本发明描述一种于大肠杆菌制造脂质化重组多肽的方法。该方法包括：提供一种经适应表现重组脂质化多肽的大肠杆菌宿主细胞；以及将该大肠杆菌宿主细胞在能表现呈脂质化形式的多肽的条件下，培养于基本培养基(minimal medium)中，其中该经前述方法表现的重组脂质化多肽的未成熟对成熟脂蛋白的比例(I/M比例)为3.9或以下。例如，该I/M比例可为0.1或以下、为0.01或以下或是0.001或以下。
于有些具体实施例，该基本培养基可为M9培养基。该基本培养基亦可缺少有机氮源或铁源，或含有70mM或以下的磷酸盐。于有些具体实施例，该基本培养基可包括葡萄糖。该基本培养基的pH值可介于7.0至8.5。
于以下说明将详细列述本发明之一或多项具体实施例。本发明的其他特征、目的与优点，将从这些详细描述与图式，以及从权利要求中显而易见。
具体实施方式
本发明描述一种制造重组脂质化多肽(亦即，脂蛋白)的方法，其藉由将经适应表现该多肽的大肠杆菌宿主细胞培养于能使该多肽以脂质化形式表现的基本培养基中。以下所述数据证明，使用基本培养基(例如M9培养基)可增加成熟脂蛋白于大肠杆菌的表现。
较佳地，该大肠杆菌宿主菌株是，对于因过度表现外源性蛋白质而被诱发的毒性作用具有抗性者。此类大肠杆菌株可经由于美国专利案号6,361,966中所描述的方法加以鉴定或产生。此等大肠杆菌株的实例包括（但不限定于）C43(DE3)(ECCC B96070445)、C41(DE3)(ECCCB96070444)、C0214(DE3)、DK8(DE3)S(NCIMB40885)及C2014(DE3)(NCIMB40884)。
可使用前述任一种大肠杆菌株来制造呈脂质化形式的重组或天然脂蛋白。天然脂蛋白或脂质化蛋白为一种于其天然状态下被脂质化的蛋白质。于一项实例，天然脂蛋白为一种分枝杆菌的脂蛋白，例如Braun脂蛋白。例举性Braun脂蛋白列示于DOLOP，其为细菌脂蛋白的数据库(因特网网址:mrc-lmb.cam.ac.uk/genomes/dolop）。可基于它们的胺基酸序列，使用亦提供于DOLOP数据库的脂蛋白-预测软件，而鉴定得的其他Braun脂蛋白。参见因特网网址mrc-lmb.cam.ac.uk/genomes/dolop/analysis.shtml。
用于本文，重组脂蛋白或重组脂质化蛋白意指一种其天然形式未被脂质化，而是藉由添加一段脂蛋白讯号肽，使其以脂质化形式被制造出来的蛋白质。经发现存在天然脂蛋白的脂蛋白讯号肽(或称脂质讯号肽)为该项技艺已知。可使用的脂蛋白讯号肽包括大肠杆菌吖啶黄素-抗性蛋白E前驱物之讯号肽，及为一种脑膜炎双球菌(Neisseria Mengitidis)Ag473蛋白的讯号肽。可藉由(例如)用于鉴定存在于天然脂蛋白的讯号肽的方式(例如，那些列示于DOLOP数据库的内容)，来鉴定脂蛋白讯号肽。
天然或重组脂蛋白可经由习知重组技术，于大肠杆菌株中进行表现。简言之，是藉由（例如）PCR扩增反应，从其天然来源获得一编码天然脂蛋白的DNA片段，并视需要地经过修饰以使密码子最适化于大肠杆菌使用。为制造重组脂蛋白，可将编码一蛋白质的DNA片段，与编码一脂质讯号肽的核酸序列融合。然后将该DNA片段***大肠杆菌表现载体中，而制得一种表现质体。较佳地，该天然或重组脂蛋白的表现由强启动子，例如T7、T5、T3或SP6（其可为可诱导性，例如被IPTG诱导）来驱动。接着将该表现质体导入所选用的大肠杆菌菌株中，并将阳性转形株培养于适于蛋白质表现的条件下，例如培养于M9培养基中。
于一项较佳的具体实施例，将经适应表现天然或重组脂质化多肽的大肠杆菌宿主细胞培养于M9培养基中。M9培养基可包括葡萄糖做为碳源。于有些具体实施例，M9培养基缺少有机氮源、铁源，或含有70mM或以下的磷酸盐。具有较高pH值(例如pH7-8.5)的M9培养基亦较佳用于表现成熟脂蛋白。
可将由此所表现得的脂蛋白从大肠杆菌细胞分离出，且可经由该项技艺已知的方法，例如以抗-脂蛋白抗体进行的免疫转渍法(immunoblotting)，或质谱分析法(mass spectrometry)确定其脂质化状态。可藉由使用光密度测定法与ImageJ软件分析SDS胶体上相对应的条带密度，来估计未成熟及成熟脂蛋白的表现程度。然后可计算出未成熟对成熟脂蛋白的比例(I/M比例)。本发明所提供的方法可产生具有I/M比例为3.9或以下(例如，0.1、0.01或0.001或以下)的脂质化多肽。
以下的特别实施例仅为例举说明，并非意欲以任何方式限制本发明揭示的其余部份。无需进一步详细描述，据相信习于该项技艺具有通常知识者可基于本文的描述，利用本发明至其最完全程度。所有于本文中引用的公开文献，皆以其完整性以引用方式纳入。
实施例
下所列的数据显示，将大肠杆菌培养于M9培养基可增加大肠杆菌中成熟脂蛋白的表现。除了高量生产完全修饰的脂蛋白外，使用M9培养基亦对于脂蛋白纯化有帮助，因为若有大量未成熟脂蛋白存在培养基中，将会冲击到后续的纯化步骤。本发明制造脂蛋白的方法可用于(例如)生产做为疫苗的重组脂蛋白。
(1)材料与方法
所有化学品皆购自Sigma(圣路易市,MO,USA)与Merck(Darmstadt,德国)。酵母抽出物、胰化蛋白(Tryptone)及酪蛋白胺基酸购自DifcoLaboratories(底特律,MO,USA)。用于分子选殖技术的酵素购自NewEngland Biolabs,Inc.(Beverly,MA,USA)。
使用大肠杆菌株C43(DE3)(Yeastern Biotech Co.,台北,台湾)来表现脂蛋白。于下表1列示所使用的培养基组成，包括Luria-Bertani液体培养基(LB)、Super液体培养基(SB)、Terrific液体培养基(TB)、2xYT、M9培养基与M63培养基。所有培养基均补充以50μg/ml苄青霉素。若可利用，亦可将胰化蛋白、酵母抽出物、酪蛋白胺基酸或氯化铵用做为M9培养基的氮源。为评估碳源对于脂蛋白表现的影响，遂将各种不同量的葡萄糖或甘油添加至不含碳源的M9培养基(CM9)中。测试五种培养条件，包括CM9/0.08%葡萄糖、CM9/2%葡萄糖、CM9/0.08%甘油、CM9/0.4%甘油及CM9/2%甘油。为分析供脂蛋白表现的最适条件，亦增加数组额外的参数。参见下表2。藉由定期测量培养物的值，以监测大肠杆菌于培养期间的生长情形。
表1.培养基组成
Figure BDA00003188159800051
D1E3-表现质体如先前技艺所述构筑。参见Chen等人,疫苗27:1400-1409(2009)。藉由将D1E3-表现质体的D1序列变更为P3序列(为大肠杆菌吖啶黄素-抗性蛋白E前驱物的讯号肽)，而选殖得表现P3E3的质体。藉由将E3序列置换成截短的肺炎链球菌溶血素(Plyt)序列，而改造得表现D1Plyt的质体。将这些表现质体转形入大肠杆菌C43(DE3)菌株中。将经转形的细胞以好气性培养，于5ml的LB培养基中于37℃下生长过夜。在接种入M9培养基或新鲜LB培养基之前，以离心收取100μl隔夜培养物。然后将细菌再悬浮于5ml新鲜培养基，并置于震荡培养箱(200rpm)中37℃下进行好气性生长。待细菌到达晚对数期，经由添加1mM异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白质表现。将培养物再另培育3小时，并从每一个别培养物收取500μl进行离心。将收集的细胞再悬浮于水，使于600nm测得的吸光值为10。然后收集5μl悬浮液，并将其以tricine SDS-PAGE进行分析。
关于SDS胶体电泳分析术，是将细胞悬浮液与等体积的样本缓冲液(63mM Tris-HCl,2%SDS,5%2-巯基乙醇,10%甘油,0.002%溴酚蓝,pH6.8)混合，并煮沸3分钟。将蛋白质以Bio-Rad Mini-PROTEAN3***(Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA,USA)使用16%tricine SDS-PAGE进行分离，然后以考马斯亮蓝(Coomassie Brilliant Blue)R-250染色。关于免疫转渍(immunoblot)分析，系将蛋白质以电泳方式转移至二氟化聚亚乙烯(PVDF)膜(Millipore,Billerica,MA,USA)上。将该膜以溶于含有0.1%Tween-20(TBST)的缓冲食盐水(20mM Tris-HCl,150mM NaCl,pH7.5)的5%脱脂牛奶进行封阻，然后与以1:15000稀释的小鼠抗-(His)6抗体(Amersham Biosciences,New Territories,HK)，静置于室温下反应1小时。经过TBST清洗后，将转渍膜与辣根过氧化酶(HRP)-共轭山羊抗-小鼠IgG(1:15000)(Bethyl Laboratories,Montgomery,TX,USA)，静置于室温下反应1小时。将转渍膜使用Immobilon Western HRP Substrate(Millipore,Billerica,MA,USA)呈色，并于x-射线底片上曝光。关于脂质讯号肽的侦测，是首先将转渍膜与抗-MKKL多株抗体(LTK BioLaboratories,桃园,台湾)(1:2500)反应，然后再与HRP-共轭山羊抗-兔子IgG(1:5000)反应。该抗-MKKL多株抗体是衍生自，经过卵白蛋白-共轭的脂质讯号肽免疫的兔子。
将于大肠杆菌表现的蛋白质，于藉由16%tricine SDS-PAGE分离后，以电泳方式转移至PVDF膜上。将转渍膜以考马斯亮蓝R-250染色1分钟，并以50%甲醇/1%醋酸漂洗三次。将蛋白质条带从该转渍膜切下，并使用Applied Biosystems Model494蛋白定序仪(Mission Biotech Co.LTD,台北,台湾)进行四次Edman分解循环。
藉由使用光密度测定法分析SDS胶体上相对应的条带密度，并以ImageJ软件加以定量，而估算出未成熟与成熟脂蛋白的表现程度。然后再计算出I/M比例。
(2)结果
于下表2中列示，大肠杆菌培养于各种培养基的倍增时间，及该大肠杆菌所表现的D1E3脂蛋白的I/M比例。
进行测试的培养基包括四种富含营养份的培养基：LB、TB、SB与2xYT；及两种缺乏营养份的培养基：M9与M63。对于该四种富含营养份的培养基，使用tricine SDS-PAGE皆观察到两个被诱导的条带，且该二条带于其C-端皆含有(His)6-tag。当以Edman分解进行测定时，位于上方的条带的N-端序列为MKKL。此结果表示，该上方条带具有不完全的脂质修饰，或是缺少脂质部分。而且，已确定该被诱导的上方条带亦可备抗-MKKL抗体辨识。另一方面，在M9培养基组仅观察到一个被诱导的条带。Edman分解结果显示其N-端被封阻，且由免疫转渍分析证实，其并不含有D1的N-端序列。因为天然脂蛋白中的脂质修饰为一种N-酰基-S-二酰基甘油基-半胱胺酸结构，故蛋白质的N-端酰化作用会造成N-端阻碍。此等数据表示，上方的条带对应于未成熟脂蛋白，而下方的条带系对应于成熟的脂蛋白。
进一步对M9培养基组的单一条带进行纯化，且质谱分析法确认其为一种成熟的rlipo-D1E3脂蛋白(亦即，脂质化D1E3)。于前述培养条件下，所诱导的成熟rlipo-D1E3构成总体蛋白质的约17.5%。反之，以LB培养基进行培养，完全修饰的rlipo-D1E3仅占总体蛋白质的9.5%，而未成熟rlipo-D1E3则占总体蛋白质的大约19.4%。M9培养基组的成熟rlipo-D1E3的比产量(specific yield)为3.6μg每mg细胞湿重，其高于LB培养基组的(为2μg每mg细胞湿重)。
亦研究另一种缺乏营养份的培养基(M63)对于大肠杆菌中成熟脂蛋白表现的影响。令人意外地，有表现出两种重组蛋白质形式。诚如所测试的丰富培养基，经由tricine SDS-PAGE观察到上方条带与下方条带。上方条带亦会与抗-MKKL抗体反应且含有MKKL序列，而下方条带的N-端序列无法经由Edman分解侦测到。虽然培养在M63培养基的大肠杆菌中的成熟脂蛋白表现相对上较高，未成熟脂蛋白的表现也很显著。
此等数据表示，富含营养份的培养基并非最适合用于脂蛋白表现。此外，数据亦显示M9为较M63更佳用于脂蛋白表现的缺乏营养份的培养基。
丰富培养基和基本培养基之间的其中一项差异为氮源。将不同氮源添加到M9培养基，来研究它们对于脂蛋白表现的影响。使用胰化蛋白、酵母抽出物或酪蛋白胺基酸做为有机氮源，而氯化铵系用做为无机氮源。检测脂蛋白于培养在补充以不同量此等氮源的M9培养基的大肠杆菌中的表现。虽然培养于所有补充以有机氮源的M9培养基中的大肠杆菌的倍增时间，皆较培养于单独M9培养基中的短(参见表2)，其未成熟的蛋白表现量有显著增加。的确，I/M比值系随着有机氮含量增加而增加。参见表2。将NH4Cl添加至M9培养基并不具有任何明显的作用，惟在1.5%NH4Cl存在下，经由使用抗-MKKL抗体进行的免疫转渍分析有侦测到未成熟脂蛋白。这些数据表示，将氮添加至M9培养基会增加未成熟脂蛋白的表现量。
M63培养基组的未成熟脂蛋白表现量较M9培养基组的高。因为M9培养基与M63培养基之间的主要差异在于碳源，遂研究碳源对脂蛋白表现的影响。将不同量葡萄糖或甘油加入缺少碳源M9培养基(CM9)中，并检测脂蛋白的表现量。培养于添加葡萄糖的CM9中的大肠杆菌的倍增时间，较培养于添加甘油的CM9中的短。参见表2。于添加葡萄糖的M9培养基组，仅侦测到成熟脂蛋白。然而，于添加甘油的M9培养基组，有观察到未成熟脂蛋白。此等数据表示，葡萄糖对于脂蛋白表现而言，是较甘油更佳的碳源。
表2.对于不同培养基的倍增时间(DT)及I/M比值
Figure BDA00003188159800081
Figure BDA00003188159800091
所列数值是以平均值±平均值标准偏差表示(n=2)。
CM9：缺少碳源的M9培养基；PM9：缺少磷酸盐的M9培养基；MgM9：缺少MgSO4的M9培养基；CaM9：缺少CaCl2的M9培养基；pHM9：具有不同pH值的M9培养基。
a：SDS-PAGE、考马斯蓝染色及抗-MKKL抗体无法侦测到未成熟脂蛋白。
b：由SDS-PAGE或考马斯蓝染色未观察到未成熟脂蛋白，但是可使用抗-MKKL抗体侦测到。
研究范围从5.5至8.5的培养基pH值是否会影响脂蛋白成熟作用。于酸性培养基组(pH5.5and pH6.0)，rlipo-D1E3的表现程度相对上较低，且于pH5.5的M9培养基组无法侦测到未成熟脂蛋白。pH值范围介于7.0至8.5的实验组的脂蛋白表现程度很类似。而且，于经缓冲调整为pH5.5与pH7.0的LB培养基组，重组脂蛋白的I/M比值相同。参见表2。有趣地，当LB培养基的pH值增加到8.5，I/M比值降低。参见表2。此等数据表示，具有较高pH值的M9培养基较佳用于表现成熟脂蛋白。
亦测定磷酸盐是否会影响脂蛋白表现。使用含单碱价磷酸二氢盐与二碱价磷酸单氢盐的混合物，以使培养基维持在pH7.0。于补充以25mM磷酸盐的M9培养基组，观察到未成熟的脂蛋白。随着添加100mM磷酸，经由以考马斯蓝染色的观察SDS-PAGE，未成熟的脂蛋白变得更明显，且I/M比值增加到几近于0.2。相反地，将M9培养基中的磷酸盐含量减少50%，对于脂蛋白成熟作用没有影响。
亦针对M9或M63培养基中其他组成，包括CaCl2、MgSO4与FeSO4进行研究。脂蛋白的成熟作用不受MgSO4或CaCl2影响。然而，将FeSO4添加至M9培养基会造成未成熟脂蛋白增加。这些数据证明，在M9培养基中添加磷酸根与铁离子，会导致有缺陷的脂质化作用。
亦研究M9培养基对于rlipo-D1E3以外的成熟脂蛋白的表现的影响。将Ag473的D1序列与截短的肺炎链球菌溶血素(Plyt)融合(亦即制得D1Plyt)，并将此脂蛋白于培养在LB或M9培养基的大肠杆菌中进行表现。于LB培养基组，经由SDS-PAGE明显观察到D1Plyt重组蛋白的一个被诱导的上方条带与一个被诱导的下方条带，而于M9培养基组则是以下方条带较为显著。以其N-端序列进行测定时，上方条带相当于未成熟的脂蛋白。无法获得下方条带的N-端序列，表示其系对应于一成熟的脂蛋白。将于M9培养基组被表现的脂质化D1Plyt进行部分纯化，并使用MALDI-TOF来确认脂质修饰。将另一种讯号肽(来自大肠杆菌的吖啶黄素-抗性蛋白E前驱物的P3)与E3融合，并将该P3E3蛋白于培养在LB或M9培养基的大肠杆菌中进行表现。于LB培养基组，经由SDS-PAGE明显观察到P3E3的两个条带，而于M9培养基组只观察到下方条带。经进一步分析确认，该上方条带为未成熟的脂蛋白，而该下方条带是成熟的脂蛋白。总和上述，数据显示M9培养基整体而言有利用于在大肠杆菌表现完全修饰的脂蛋白。
其他具体态样
本说明书中所揭示的全部特征可以任何组合方式组合。于是，本说明书中所揭示的各别特征可由依相同、相等或类似目的的替代特征取代。因此，除非另行清楚地指示，所揭示的各特征仅为一系列同等物或类似特征的实例。
从前述的说明，习于该项技艺人士可容易地确定本发明的基本特征，且在未偏离其范围下，可进行本发明的各种改变与修饰，以使其适于各种不同用途与状况。因此，于权利要求内亦包含其他具体态样。

Claims (20)

1.一种于大肠杆菌制造重组脂质化多肽的方法，该方法包含：
提供一种经适应表现重组脂质化多肽的大肠杆菌宿主细胞；及
将该大肠杆菌宿主细胞在能表现呈脂质化形式的多肽的条件下培养于基本培养基中，其中经此表现的重组脂质化多肽的未成熟对成熟脂蛋白的比例(I/M比例)为3.9或以下。
2.如权利要求1所述的方法，其中该基本培养基为M9培养基。
3.如权利要求1所述的方法，其中该基本培养基缺少有机氮源。
4.如权利要求1所述的方法，其中该基本培养基含有70mM或以下的磷酸盐。
5.如权利要求1所述的方法，其中该基本培养基缺少铁源。
6.如权利要求1所述的方法，其中该基本培养基包括葡萄糖。
7.如权利要求1所述的方法，其中该基本培养基的pH值介于7.0至8.5。
8.如权利要求2所述的方法，其中该M9培养基缺少有机氮源与铁源且含有70mM或以下的磷酸盐。
9.如权利要求2所述的方法，其中该M9培养基包括葡萄糖。
10.如权利要求2所述的方法，其中该M9培养基的pH值介于7.0至8.5。
11.如权利要求1所述的方法，其中该I/M比例为0.1或以下。
12.如权利要求1所述的方法，其中该I/M比例为0.01或以下。
13.如权利要求1所述的方法，其中该I/M比例为0.001或以下。
14.如权利要求1所述的方法，其中该大肠杆菌宿主细胞具有一表现载体，其包括编码一种含有细菌脂蛋白质讯号肽的重组多肽的核酸序列。
15.如权利要求14项所述的方法，其中该脂蛋白质讯号肽包括Ag473的D1序列。
16.如权利要求14所述的方法，其中该脂蛋白质讯号肽包含吖啶黄素-抗性蛋白E前驱物的P3序列。
17.如权利要求14所述的方法，其中该核酸序列经由操作连接至一种可诱导性启动子。
18.如权利要求17所述的方法，其中该启动子可被异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导。
19.如权利要求1所述的方法，其中该重组多肽包括一病原菌的抗原。
20.如权利要求1所述的方法，其中该大肠杆菌宿主细胞为C43(DE3)。
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