CN101617052A - 用于免疫的***瘤病毒e2多肽 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及编码至少一种***瘤病毒E2多肽的核酸分子、或载体、感染性病毒颗粒或其组合物用于制备用于治疗患有由至少一种***瘤病毒导致的持续性***瘤病毒感染的患者的药物中的应用。本发明还提供了包含一种核酸分子的载体，所述核酸分子包含编码***瘤病毒E1多肽的第一个核苷酸序列和编码***瘤病毒E2多肽的第二个核苷酸序列，其中天然背景序列中与所述第二个核苷酸的5’部分100％相同的所述第一个核苷酸的3’部分被修饰以在所述部分之间显示至多75％的相同性百分比。

Description

用于免疫的***瘤病毒E2多肽
本发明涉及编码至少一种***瘤病毒E2多肽的核酸分子或载体或感染性病毒颗粒制备用于治疗***瘤病毒感染的药物中的应用。本发明特别涉及免疫治疗领域，更特别涉及治疗患有持续性***瘤病毒感染的患者。
***瘤病毒已自许多感染皮肤和粘膜上皮组织的高等生物体中分离。当前，在人类中已鉴别超过100种人***瘤病毒(HPV)基因型(Stoler，2000，Int.J.Gynecol.Path 19，16-28)，通常可被分类为与良性肿瘤相关的“低危”基因型(例如HPV-6和HPV-11)和与潜在可能发展为恶变前损害(例如子宫颈上皮瘤CIN)和最终导致恶性肿瘤的损害相关的“高危”基因型。例如超过99％的***含有HPV DNA并且5个“高危”HPV(HR-HPV)基因型在世界范围内诊断的大约70％浸润性***中鉴定为主要原因是HPV-16和HPV-18(Clifford et al，2003，Br J Cancer 88，63-73)，HPV-31、HPV-33和HPV-45是另外10％的主要原因(Cohen et al.，2005，Science 308，618-621)。
***瘤病毒是由蛋白质衣壳围绕的小DNA病毒(见例如Pfister，1987，The papovaviridae：The Papillomaviruses，Salzman and Howley edition，Plenum Press，New York，p 1-38)。基因组是大约7900个碱基对的双链环状DNA，由三个功能区组成：早期区(E)，晚期区(L)和长控制区(LCR)。LCR包含转录调控序列例如增强子和启动子。晚期区编码L1和L2结构蛋白质，分别是主要和次要衣壳蛋白质，但是发现早期区编码主要存在于核中并控制病毒复制、转录和细胞转化的调控蛋白质(E1-E7)。
E1蛋白是由***瘤病毒基因组编码的最大的(HPV-16 E1有649个氨基酸长)和最保守的蛋白质。E1是DNA结合磷蛋白，有ATP依赖性解旋酶活性，其需要与E2二聚化和相互作用以刺激病毒复制(Desaintes andDemeret，1996，Semin.Cancer Biol.7，339-347；Wilson et al，2002，Virus Gene24，275-290)。解旋酶活性已定位在E1的C末端结构域和中心结构域的DNA结合结构域。E2蛋白(HPV-16 E2有365个氨基酸长)是多功能DNA结合磷蛋白，其调控病毒基因转录和控制DNA复制(Bechtold et al.，2003，J.Virol.77，2021-2028)。调控病毒转录需要二聚化以及结合E2二聚物到E2结合位点(共有序列ACCN6GGT)，其背景序列(context)确定是否病毒转录是反式激活或抑制的(Ham et al.，1991，Trends Biochem.Sci.16，440-444；McBride et al.，1991，J.Biol.Chem.266，18411-18444)。E2也提供对于HPV-16p97启动子的抑制，该启动子控制E6和E7癌蛋白的表达。最终，E2涉及病毒基因组到子代细胞的分配。HPV-16E2的N末端结构域导致反式激活，与E1相互作用和刺激复制，但是C末端结构域涉及DNA结合和二聚化(McBride et al.，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86，510-514)。E4编码蛋白结合和破坏胞质角蛋白网并在病毒成熟中发挥作用。E5蛋白的功能仍存在争议。通过病毒蛋白分别与细胞肿瘤阻抑物基因产物p53和视网膜神经胶质瘤(Rb)结合(reviewed in Howley，1996，Papillomaviruses and theirreplication，p 2045-2076.In B.N.Fields，D.M.Knipe and P.M.Howley(ed)，Virology，3rd ed.Lippincott-Raven Press，New York，N.Y.)，E6和E7蛋白涉及感染HR-HPV的细胞的癌基因转化(Kanda et al.，1988，J.Virol.62，610-613；Vousden et al.，1988，Oncogene Res.3，1-9；Bedell et al.，1987，J.Virol.61，3635-3640)。
HPV感染是最频繁的性传播感染之一，大约25％的成年人性活动被HPV感染(Woodman et al.，2001，The Lancet 357，1831-1836)。大约80％病例在6-12个月内实现自发的病毒清除(Ho et al，1998，N Engl J Med 338，423-428)。但是在剩余的20％中HPV感染发展为恶变前CIN病变，若未诊断可导致浸润性癌症(O′Shaughnessy et al.，2002，Clinical cancer Research 2，314-346)。诱导瘤形成的机制似乎涉及在细胞染色体内HPV基因组的整合(Cullen et al.，1991，J.Virol.65，606-612)，在大部分病例中，这导致HPV基因组DNA在E1/E2区断裂，从E2阻抑物作用释放E6/E7启动子和随后的E6和E7表达上调和细胞转化。
目的为预防HPV感染的预防疫苗即将上市。其靶向在病毒表面表达的衣壳蛋白以便于在病毒穿透进入宿主细胞之前主要通过诱导中和抗体阻断病毒。它们通常依赖于重组产生的在VLP(病毒样颗粒)中自动装配的L1蛋白。由Merck和GlaxoSmithKline(GSK)生产的2种HPV疫苗已成功完成III期临床试验，显示在防止典型特异性宫颈感染上几乎达到100％功效。GSK的疫苗包含HPV-16和HPV-18的VLP混合物，但是Merck的疫苗也包括导致生殖器疣的HPV-6和HPV-11的VLP。
但是，已感染HPV的对象不适合于预防接种以及感兴趣的是治疗疫苗用于治疗处于进展为致癌性病变的风险的感染病人。因为致癌活性有助于HPV E6和E7基因在感染细胞内的表达，大部分努力方向是阻断它们的表达或诱导细胞免疫反应抗这些转化基因产物。在文献中已描述许多方法，例如依赖于使用反义RNA(Steele et al.，1993，Cancer Res 53，2330-2337；Heet al.，1997，Cancer Res.57，3993-3999；Choo et al.，2000，Gynecol.Oncol.78，293-301)，核酶(Chen et al.，1996，Cancer gen Ther.3，18-23；Pan et al.，2004，MoI.Ther.9，596-606)，siRNA(Butz et al.，2003，Oncogene 22，5938-5945；Koivusalo et al.，2005，Mol.Pharmacol.68，372-382)，免疫原性肽(Feltkampet al.，1993，Eur.J.Immunol.23，2242-2249)，编码E6和/或E7的质粒(Peng etal.，2004，J.Virol.78，8468-8476)和病毒载体(WO90/10459；WO99/03885；Kaufmann et al.，2002，Clinical Cancer Res.8，3676-3685)。
当在HPV感染早期表达时，E2蛋白代表治疗接种的第二个潜在靶。在已感染棉尾兔***瘤病毒(CRPV)的兔身上进行的临床前期研究示出了在E2表达后针对已实施的***瘤病毒相关病变的保护作用。例如，施用表达CRPV E2蛋白的重组腺病毒载体导致CRPV诱导的***状瘤和感染的去除，这很可能通过细胞介导的免疫(Brandsma et al，2004，J.Virol.78，116-123)。施用编码CRPV E1和E2蛋白的DNA也有效的防止或至少延迟CRPV诱导的皮肤***状瘤的癌发展(Han et al，2000，J.Virol.74，9712-9716)，虽然保护性免疫显示依赖于施用途径(Han et al.，2000，Vaccine18，2937-2944)。在暴露于HPV的人对象中也支持采用E2治疗***状瘤相关病变的治疗可能性。在健康对象内常常检测到抗E2特异性T辅助免疫(DeJong et al.，2002，Cancer Res.62，472-479)，但是在具有HPV-16相关***妇女身上观察到抗E2和E6的减弱的CD4+T细胞免疫(De Jong et al.，2004，Cancer Res.64，5449-5455)。
使用编码牛***瘤病毒(BPV)E2蛋白的重组MVA(修饰的安卡拉病毒)载体在HPV相关高等级CIN 2和3的病人体内正在进行II期临床试验。病毒颗粒直接注入CIN病变并且预期在表达E6和E7的细胞内E2的产生导致凋亡。在大多数治疗病人中确实观察到CIN病变的衰退。但在一些病例中，病毒DNA未被清除并在1年后检测到病变复发(Garcia-Hernandez etal.，2006，Cancer Gene Ther.13，592-597)。
由于HPV的持续性感染，它的高流行性和HPV诱导癌症显著的发病率，其将继续持续数年成为严重的全球性健康威胁。的确已经证明HR-HPV持续性感染的妇女与无感染的妇女或完成自发病毒清除的妇女比较具有显著的发展为CIN病变的高风险，直至达到200倍(Bory et al.，2002，Int JCancer 102，519-525)。
异常筛查后常规检测HPV感染(例如宫颈涂片检查)。当今HPV感染诊断的医学优势仅仅是进行更高频率的追踪以便检测病变(例如高等级CIN2/3)，一旦它们发生，经切除方法例如袢电外科切除术(LEEP)和锥形活组织检查(锥形切除术)可去除。这样的手术全球的有效率是90％，但是存在产科并发症的风险(例如对于育龄妇女生子产生潜在影响)。除了医学观点并非完全满意之外，这个情况也导致病人的不适(不安)。
因此需要发展用于治疗持续性HPV感染病人、尤其是治疗具有进展为恶变前病变和随后的癌症的人口中存在高风险的病人的疫苗。
因此，在本文中本发明描述一个显著的进展。本发明提供非侵入性和安全方法，其提供针对HR-HPV基因型产生的感染的较早期保护。它的优势是在发生***瘤相关病变前为感染病人提供治疗并随后降低发展为恶变前病变和恶性肿瘤的风险。本发明方便地允许降低与常规切除术相关的风险(例如产科并发症)同时提升了病人的舒适度(例如减少病变检测相关的不安)。重要地，本发明也可允许通过根除感染性***瘤病毒和它相关的分离物而降低由于HPV再感染导致的将来复发的风险。
通过权利要求书中限定的实施方案已解决这个技术问题。
本发明其他方面，特征和优势通过本发明优选实施方案的下述描绘而清楚。这些实施方案是为了公开的目的。
因此，第一方面，本发明提供了编码至少一个***瘤病毒E2多肽的核酸分子、或包含所述核酸分子的载体或感染性病毒颗粒在制备用于治疗患有由至少一个***瘤病毒产生的持续性***瘤病毒感染的宿主生物体的药物中的应用。本发明也涉及所述核酸分子、载体或感染性病毒颗粒用于治疗宿主生物体的持续性***瘤病毒感染。根据一个实施方案，在宿主生物体暴露于至少一种***瘤病毒之后和检测/出现***瘤病毒相关病变之前施用所述核酸分子、载体或感染性病毒颗粒。
如本文所用，除非特别指出，否则术语“一个”被用于表示“至少一个”，“至少第一个”，“一个或多个”或“多个”引用的化合物或步骤。例如术语“一个***瘤病毒E2多肽”包含一个独特类型的***瘤病毒E2多肽，多个***瘤病毒E2多肽，包括其混合物。
在此使用的术语“和/或”包含“和”、“或”和“由所述术语连接的元件的所有或任何其他组合”的意思。
在此使用的术语“大概”或“大约”是指所给值或范围的20％以内，优选10％以内和更优选的5％以内。
术语“氨基酸”和“残基”是同义词，包括天然氨基酸和氨基酸类似物(例如非天然的、合成的和修饰的氨基酸，包括D或L光学异构体)。
在此使用的术语“多肽”，“肽”和“蛋白质”可互换使用，指氨基酸残基的聚合物，其包含经肽键结合的9个或更多个氨基酸。聚合物可以是线性的，分枝的或环状的，可包含天然存在的和/或氨基酸类似物，它可被非氨基酸间断。通常，若氨基酸聚合物是长的(例如超过50个氨基酸残基)，其优选称为多肽或蛋白质，但是若其是50个氨基酸长或更短，优选称为“肽”。
在本发明文中，术语“核酸”，“核酸分子”，“多核苷酸”和“核苷酸序列”可互换使用，定义任何长度的多聚物，如聚脱氧核糖核苷酸(DNA)(例如cDNA，基因组DNA，质粒，载体，病毒基因组，分离的DNA，探针，引物和其任何混合物)或聚核糖核苷酸(RNA)分子(例如mRNA，反义RNA)或混合的聚核糖-聚脱氧核糖核苷酸。它们包含单链或双链，线性或圆形，天然或合成的多核苷酸。此外，多核苷酸可包括非-天然存在的核苷酸，例如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物(见US 5,525,711，US 4,711,955或EPA302 175作为修饰实例)和可被非核苷酸组分间断。如果存在，在聚合之前或之后可进行核苷酸修饰。
如本文所用，当用于定义产物、组合物和方法，术语“包含”指所述产物、组合物和方法包括提及的组分或步骤，但是不排除其他的。“基本上由……组成”表示排除任何必需意义上的其他组分或步骤。因此，基本上由所述组分组成的组合物将不排除微量污染物和药用可接受的载体。“由...组成”将意味着排除微量元素的其他组合物或步骤之外的那些。例如当多肽除了氨基酸序列外不包含任何氨基酸时，多肽是由所述氨基酸序列组成。当氨基酸序列和一些另外的氨基酸残、典型地大约1到50个左右的另外残基一起存在时，多肽是基本上由所述氨基酸序列组成。当氨基酸序列是多肽的最终氨基酸序列的至少一部分时，多肽包含所述氨基酸序列。这样的多肽可以具有达到几百个另外的氨基酸残基。这种另外的氨基酸残基在多肽转运，促进多肽产生或纯化、延长半衰期等中发挥作用。这也可应用于核苷酸序列。
术语“宿主细胞”将被广泛理解包含分离的细胞，一群细胞，以及细胞的特殊组织，例如在组织或器官内。这样的细胞可以是原代细胞、转化细胞或培养细胞。它们可是原核的(例如大肠杆菌(Escherichia coli))，酵母(例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，裂殖酵母(Saccharomycespombe)或巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris))，真核的(例如昆虫，植物和哺乳细胞包括人类细胞)。术语“宿主细胞”包括可能是或已经是本发明使用的核酸分子、载体或感染性病毒颗粒的受体的细胞和这样细胞的子代。
术语“宿主生物体”指脊椎动物，特别地是哺乳动物物种、尤其家禽、农场动物、运动动物(sport animal)和灵长类动物包括人类的成员。优选宿主生物体是患有至少一种***瘤病毒导致的持续性***瘤病毒感染的病人。
“***瘤病毒”指一种病毒，其属于***瘤病毒科亚科。定义包括非人类物种来源包括但不限于牛、马、兔、绵羊、狗、非人类灵长类和啮齿动物的动物***瘤病毒以及人类***瘤病毒(HPV)。
“HPV”更特异性指人类来源和/或其能够感染人类的***瘤病毒。当前已经鉴定了超过100个HPV基因型并且已按照分离的年代顺序编号。按照惯例，HPV分类是基于它们基因组的相关程度。从获得的核苷酸序列的排列对比构建***树(Van Ranst et al，1992，J.Gen.Virol.73，2653；De Villierset al，52004，Virology 324，17-27)。HPV可被分为“高危型”(HR-HPV)和“低危型”(LR-HPV)。HR-HPV指与细胞转化强烈相关的HPV，其可导致潜在可能进展为恶性病变的病变。HR-HPV类型包括但不限于HPV-16，HPV-18，HPV-30，HPV-31，HPV-33，HPV-35，HPV-39，HPV-45，HPV-51，HPV-52，HPV-56，HPV-58，HPV-59，HPV-66，HPV-68，HPV-700和HPV-85。LR-HPV指具有可能导致良性病变如具有低潜能进展为恶性病变的疣的微弱细胞转化潜能的HPV。LR-HPV类型包括但不限于HPV-6和HPV-11。
***瘤病毒可被分离、克隆或来源于自然界的任何来源。这样的来源包括生物学样品，培养的细胞，以及重组材料。如本文所用，“生物学样品”包含收集自暴露于***瘤病毒的宿主生物体的多种样品，该***瘤病毒已被用作***瘤病毒来源或用于诊断或监测化验。在本发明中，收集生物学样品后可以任意方式操作它，例如使用试剂处理，溶解，或富集某种组分(例如多肽或核酸分子)。定义包含生物学流体(例如血液，血浆，血清)，液体样品(例如***样品，宫颈液，细胞学样品)，固体组织样品(例如组织切片，活检标本)和组织培养物。术语“培养的细胞”包含培养物中的细胞(例如ATCC获得的CaSki细胞)，细胞上清和细胞裂解产物。重组材料包括但不限于***瘤病毒(从保藏机构获得)，***瘤病毒基因组，基因组或cDNA文库，包含***瘤病毒基因组片段的质粒或已知包括这样元件的以前的任何人工载体。
作为常识，许多***瘤病毒基因组的核苷酸序列和编码多肽的氨基酸序列已在文献中描述并且在专门的数据库中可获得，例如与HPV-16有关的Genbank登记号NC_1526和K02718；与HPV-18有关的NC_001357和X05015；与HPV-31有关的J04353；与HPV-33有关的M12732；与HPV-35有关的NC_001529；与HPV-39有关的NC_001535；与HPV-45有关的X74479；与HPV-51有关的NC_001533；与HPV-52有关的NC_001592；与HPV-56有关的X74483；与HPV-58有关的D90400；与HPV-59有关的NC_001635；与HPV-68有关的X67160和M73258；与HPV-70有关的U21941以及与HPV-85有关的AF131950。
如本文所用，术语“***瘤病毒E2多肽”包含天然E2多肽(例如自然界中来源于***瘤病毒E2 ORF的表达)，修饰的E2多肽和其免疫原性肽。
免疫原性E2肽具有至少9个氨基酸并且这个术语包括E2表位(例如通过MHC I类和/或II类介导途径能够诱导或激活免疫反应的特异性氨基酸基序，如EP 523 395所述)，多表位构建体(例如WO2005/089164所述)，和截短的E2多肽。截短可以从1到300个氨基酸残基变化，这些氨基酸残基可以是邻近的或非邻近的和定位在N末端，和/或C末端和/或中间。
由本发明使用的核酸分子编码的E2多肽可来源于任何***瘤病毒基因型，特别优选HR-HPV基因型，如选自上述列表组成的一组中的一个，并且更优选HPV-16，HPV-18，HPV-33或HPV-52或其任何组合(例如HPV-16和HPV-18两者)。文献已描述了大量天然E2多肽，例如Cole等(1987，J.Mol.Biol.193，599-608)描述HPV-18E2；Seedorf(1985，Virology，145，181-185)和Kennedy等(1991，J.Virol，，65，2093-2097)描述HPV-16E2，Goldsborough等(1989，Virology 171，306-311)描述HPV-31E2，Cole等(1986，J.Virol，58，991-995)描述HPV-33E2以及Chen等(1982，Nature 299，529-534)和Danos等(1983，J.Virol.46，557-566)描述牛***瘤病毒BPV-1 E2。为了阐述说明，在SEQ ID NO：1给出HPV-16E2多肽的氨基酸序列。
但是，本发明不仅局限于这些示范的序列。事实上，核苷酸和氨基酸序列在不同的***瘤病毒分离物之间可以改变并且这个天然遗传变化包括在本发明的范围内，也包括在如下所述的非天然修饰的范围内。术语“修饰”包括缺失、替代或添加一或多个核苷酸残基或这些可能性的任何组合。当考虑几个修饰时，它们可涉及连续的残基和/或非连续的残基。通过本领域技术人员已知的大量方法例如定点诱变(例如在Amersham，Les Ullis，France的体外诱变***中使用SculptorTM)，PCR诱变，DNA改组和通过化学合成技术(例如产生合成的核酸分子)可在本发明使用的核酸分子中产生修饰。
本发明设计的修饰包含沉默修饰，其不改变编码的E2***瘤病毒的氨基酸序列，同时与相应天然序列比较，对翻译为编码的E2多肽的修饰产生修饰的氨基酸序列。
在编码的E2多肽水平通过使用编码相同氨基酸的一或多个密码子替代E2编码序列的一或多个密码子代表性地进行沉默修饰。而独特的密码子编码Met或Trp残基，本领域已知6个不同密码子可被用于编码精氨酸，亮氨酸或丝氨酸，4个不同的密码子编码丙氨酸，甘氨酸，脯氨酸，苏氨酸和缬氨酸。因此可能不改变氨基酸序列而修饰编码E2的核苷酸序列。期望这样修饰的目的是改善***瘤病毒E2多肽在所需宿主细胞或生物体内的表达，例如哺乳动物包括人宿主细胞。这种修饰的有代表性的实例包括但不限于通过密码子最佳化抑制很少使用的密码子，抑制预期对于表达水平有负面影响的阴性序列元件和/或抑制预期对于本发明使用的核酸分子或载体的稳定性有负面影响的同源序列。
典型地，通过用编码相同氨基酸而且更多使用的一或多个密码子替代一或多个相应于在感兴趣宿主细胞内很少使用的密码子的“天然”密码子(例如HPV)进行密码子最佳化。替代所有相应于很少使用的密码子的天然密码子不是必需的，因为甚至当部分替代时都可以实现表达的增加。此外，可能产生严格遵循最佳密码子使用的一些偏差以将限制性位点导入到生成的核酸分子中。在文献中描述了这种密码子最佳化的核酸分子，例如在WO01/14416、WO02/08435和WO03/018055中。
在本发明中适合抑制的阴性序列元件有代表性的实例包括但不限于具有非常高(＞80％)或非常低(＜30％)GC含量的区域；具有非常高AT含量的区域；不稳定的同向或反向重复序列；RNA二级结构；和/或内部隐蔽性调控元件例如内部TATA盒，chi位点，核糖体进入位点，和/或剪接供体/受***点。
本发明使用的核酸分子或载体内存在的同源序列预期对于其稳定性存在负性影响，特别在载体制备步骤过程中。在同源序列之间可发生重组，可能导致包含于2个同源序列之间的部分丢失。如本文所有，术语“同源序列”表示相互之间在至少40、有利地至少45、优选至少50、更优选至少55、或甚至更优选至少59个连续核苷酸间保持高度相同性。高度相同性是75％或大于75％，有利地80％或大于80％，期望地85％或大于85％，优选90％或大于90％，更优选95％或大于95％，仍然更优选97％或大于97％(例如100％序列相同性)。考虑需要***用于最佳化排列对比的缺口数量和每个缺口的长度，2个核苷酸序列之间的百分比相同性是序列共有的相同位置数量的函数。在本领域内可获得多种的计算机程序和数学算法例如GCGWisconsin package确定核苷酸序列之间的百分比相同性。
通过简并至少一个同源序列内的密码子使用优选抑制2个同源核酸序列之间的同源性以便于上述同源序列之间的相同性百分比减少到少于75％。这可以通过编码相同氨基酸的一或多个密码子替代存在于同源部分的一或多个“天然”(HPV)密码子进行。简并所有天然密码子不是必须的，因为部分替代足以减少同源性。当本发明所用的核酸分子或载体编码核苷酸和氨基酸序列相对保守(例如编码2个或更多个E2多肽如HPV-16和HPV-18E2多肽的序列)或或包含共有部分(例如编码HPV-16E1和E2的共享59个核苷酸的序列)的2个***瘤病毒多肽时，这种修饰是非常有用的。这样的实施方案的代表性的实例在SEQ ID NO：6中给出，提供相应于存在于编码E1和E2序列中的59个核苷酸部分的简并序列的实例。
在编码E2多肽的水平翻译的修饰导致一或多个E2多肽的氨基酸残基的突变。有利地，修饰的E2多肽与相应天然多肽在全长氨基酸序列或其片段(例如长度上至少9，20，50，100，200，300个氨基酸)上保持高度的氨基酸序列相同性，其是75％或大于75％，有利地大于80％，期望地大于85％，优选大于90％，更优选大于95％，仍更优选大于97％(例如100％序列相同性)。考虑需要导入用于最佳排列对比的缺口数量和每个缺口的长度，2个多肽之间的百分比相同性是序列共有的相同位置数量的函数。在本领域内可获得多种计算机程序和数学算法确定氨基酸序列之间的百分比相同性，例如NCBI可获得的W2H HUSAR软件和Blast程序(例如Altschul etal，1997，Nucleic Acids Res.25，3389-3402；Altschul et al.，2005，FEBS J.272，5101-5109)。
在一个实施方案中，本发明使用的核酸分子被修饰以编码对于天然E2多肽的生物学活性至少一种是缺陷的、更特别地对于病毒复制和/或转录激活是缺陷的E2多肽。通过常规方法可确定对于这种生物活性关键的氨基酸，例如通过结构和功能分析，本领域技术人员可容易地确定能够减少或去除给定生物学活性的突变类型。本领域已知涉及E2的转录激活和复制活性的残基定位在N末端部分内，而C末端部分负责识别病毒DNA和二聚体上的E2结合位点。如本文所用，E2的N末端部分包括从起始子Met开始的头220个氨基酸残基。例如，通过定点诱变或PCR技术缺失或替代调控病毒复制的E2N末端部分的一或多个氨基酸残基以显著减少或去除E2复制功能和产生***瘤病毒基因组复制缺陷的E2多肽。可选择地或联合地，可缺失或替代E2N末端部分负责转录激活的一或多个氨基酸残基以显著减少或去除E2激活从***瘤病毒启动子转录的活性。适当的缺陷E2多肽的有代表性的实例在本领域技术人员可获得的文献中描述，例如Demeretet al.(1995，Nucleic Acids Res.23，4777-4784)，Sakai et al.(1996，J.Virol.70，1602-1611)，Brokaw et al.(1996，J.Virology 70，23-29)和Ferguson et al.(1996，J.Virology 70，4193-4199)。使用本领域技术人员已知的标准方法在适当的化验中可容易地确定E2复制和转录激活活性的减少或缺失(Sakai et al.，1996，J.Virol.70，1602-1611)。
本发明使用的核酸编码的优选的复制缺陷E2多肽来源于HPV-16并包含SEQ ID NO：1所示氨基酸序列，除了至少39位的Glu(E39)残基被修饰，例如替代为除了Glu之外的任何氨基酸残基。另一个优选的转录激活缺陷的E2多肽来源于HPV-16并包含SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，除了至少73位的Ile(I73)残基被修饰，例如替代为除了Ile以外的任何氨基酸残基。一个甚至更优选的复制和转录激活缺陷的E2多肽来源于HPV-16并包含SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，除了至少39位的Glu(E39)残基和73位的Ile(I73)残基被修饰，例如分别在39位和73位替代为除Glu和Ile以外的任何氨基酸残基。更优选地，在39位的Glu残基和/或在73位的Ile残基被Ala残基替代(E39A和/或I73A)。在本发明中，这样的缺陷E2多肽可来自任何***瘤病毒并且本领域技术人员可以将HPV-16E2所述的修饰用于来自另一个***瘤病毒基因型的E2多肽(例如经序列比较可鉴定位于与HPV-16E2的39位和/或73位等价的位置的氨基酸残基并通过标准技术修饰)。为了阐述说明，这样的残基分别相当于HPV-18E2的43位的Glu和77位的Ile，HPV-33和HPV-52的39位的Glu和73位的Ile。
在另一个实施方案中，本发明使用的核酸分子被修饰以编码***瘤病毒E2多肽和一或多个融合配偶体在E2的N末端、C末端或者在同时在N和C末端的融合体。融合配偶体可来源于***瘤病毒或非***瘤病毒。经遗传方式进行融合，例如通过在编码E2多肽和编码融合配偶体的核苷酸序列的框架内融合以便表达融合的编码序列产生单一多肽。融合可以是直接(即之间没有任何另外氨基酸残基)或通过接头肽连接E2多肽到融合配偶体。接头的存在可促进融合蛋白的正确形成，折叠和/或发挥功能。本发明适合的接头是2到30个氨基酸长和由氨基酸残基如甘氨酸，丝氨酸，苏氨酸，天冬酰胺，丙氨酸和/或脯氨酸组成(见例如Wiederrecht et al，1988，Cell54，841；Aumailly et al，1990FEBS Lett.262，82；及Dekker et al.，1993，Nature 362，852)。
适合的非***瘤病毒融合配偶体包括但不限于钙网蛋白(Cheng et al.，2001，J.Clin.Invest.108，669-678)，结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)热休克蛋白70(HSP70)(Chen et al.，2000，Cancer Res.60，1035-1042)，泛素(Rodriguez et al.，1997，J.Virol.71，8497-8503)和细菌毒素例如铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)外毒素A的易位结构域(ETA(dIII))(Hung et al.，2001Cancer Res.61，3698-3703)。
适合的***瘤病毒融合配偶体可以是任何***瘤病毒多肽，晚期或早期，或其任何片段。优选地融合配偶体来源于早期HPV多肽，其选自E1，E2，E4，E5，E6和E7或其混合物。E2多肽和***瘤病毒融合配偶体可来源于相同的***瘤病毒基因型，如HPV-16E1和E2多肽的融合体。可选择地，E2多肽和***瘤病毒融合配偶体可来源于不同***瘤病毒基因型，代表性的实例是HPV-16E2和HPV-18E2多肽的融合体。
单独或联合上述所定义的修饰，本发明使用的核酸分子还包括另外的修饰，其有利于编码的E2多肽的加工，稳定性和/或可溶性，例如潜在的切割位点的抑制，潜在的糖基化位点的抑制和/或编码的E2多肽在表达宿主细胞表面的呈递。例如，通过识别潜在的N糖基化位点(例如包含Asn-Val-Ser-Val基序)和被不同残基替代一或多个氨基酸残基(例如用Gly或Ala残基替代Ser残基)以提供在真核宿主细胞或生物体内表达时不能被糖基化的E2多肽可实现潜在的糖基化位点的抑制。
在一个优选的实施方案中，本发明使用的核酸分子被修饰以编码膜呈递的E2多肽以改善MHC I类和/或MHC II类呈递以及因此其在宿主细胞或生物体内潜在的免疫原性。先前已显示膜呈递允许改善HPV-16E6和E7多肽的治疗功效(见例如WO99/03885)。***瘤病毒E2多肽是核蛋白，虽然未确定典型的核定位信号。通过融合E2多肽到分泌的(例如信号肽)和膜锚定序列可实现膜呈递。本领域已知这样的序列。简要地，分泌序列通常存在于膜呈递的或分泌的多肽的N末端并且起始它们进入内质网(ER)。它们基本上包含15到35个疏水氨基酸，之后氨基酸被特异性ER定位内肽酶移除产生成熟多肽。自然界中膜锚定序列通常具有高疏水性并用于在细胞膜上锚定多肽(见例如Branden and Tooze，1991，Introduction toProtein Structure p.202-214，NY Garland)。
用于本发明的膜锚定和/或分泌序列的选择是大量的。它们可得自任何膜锚定和/或分泌多肽(例如细胞或病毒多肽)如狂犬病毒糖蛋白，HIV病毒包膜糖蛋白或麻疹病毒F蛋白或可以是合成的。分泌序列***的优选位点是翻译起始密码子的N末端下游，膜锚定序列***的优选位点是C末端，例如终止密码子的立即上游。此外，接头肽可被用于连接分泌序列和/或膜锚定序列到E2多肽。
本发明使用的核酸编码的膜靶向E2多肽优选通过融合到狂犬病毒糖蛋白的分泌和膜锚定序列而修饰，如所附实施例部分所述。
本发明使用的优选载体包含：
-包含编码HPV-16E2多肽的核酸分子的载体；
-包含编码HPV-18E2多肽的核酸分子的载体；
-包含编码HPV-33E2多肽的核酸分子的载体；
-包含编码HPV-52E2多肽的核酸分子的载体；
依据一个特别优选的实施方案，编码E2多肽的核酸分子包含、基本上由或者由SEQ ID NO：2所示氨基酸序列组成。为了参考，SEQ ID NO：2的多肽包含复制和反式激活活性缺陷的HPV-16E2多肽(从24位到387位)(通过在分别相当于天然E2多肽的39位和73位Glu和Ile残基的61位的Glu残基和95位的Ile残被Ala残基取代而修饰)融合到狂犬病毒糖蛋白分泌(从第2位到23位)和膜锚定序列(从388位到453位)上。
本发明也涉及包含编码至少2种来源于不同***瘤病毒基因型的E2多肽的核酸分子的载体或感染性颗粒以及这种载体或感染性颗粒用于制备治疗***瘤病毒感染、特别是HR-HPV的持续性感染的药物的应用。在一个有利的实施方案中，“至少2个”是2、3或4且每一个编码的E2多肽来源于不同基因型的HR-HPV。单独或联合地，优选如上述修饰E2多肽(例如复制和/或转录激活和/或膜呈递缺陷)。编码至少2个E2多肽的核酸分子可被置于独立的调控序列之下或可以相互融合以便以单多肽链形式表达。正如本文所述，代表性的实例包括一个载体，其包含编码HPV-16和HPV-18E2多肽的核酸分子，以及包含编码HPV-16，HPV-18，HPV-33和HPV-52E2多肽的核酸分子、置于独立的调控序列控制下的载体。当本发明或本发明使用的载体包含编码E2多肽的2个或更多的核酸分子，推荐编码E2的核酸序列被简并以显示相互之间同源性百分比低于75％。优选地，所述编码E2的核酸分子不包含40个或更多(例如50，55，59，70或甚至更多)显示相同性百分比为75％或大于75％的连续核苷酸部分。
在本发明一个特殊的实施方案中，在此所述的核酸分子，载体或感染性颗粒也可以与一或多个另外多肽或一或多个编码这种另外多肽的核酸，载体或感染性颗粒联合使用。期望地，另外多肽能够加强由上述活性剂提供的治疗活性。编码这种另外多肽的核酸可***本发明使用的载体或例如在此所述的独立载体并且其表达可置于例如在此所述的适当的调控序列控制之下。另外多肽可以是***瘤病毒来源或非***瘤病毒来源。
适合的非***瘤病毒另外多肽包括但不限于细胞因子(例如IL-2，IL-7，IL-15，IL-18，IL-21，IFNg)和***基因产物(例如Caruso et al，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90，20 7024-7028等描述的HSV-1胸苷激酶；WO99/54481描述的FCU-1)。
适合的***瘤病毒另外多肽包括但不限于任何早期HPV多肽(或片段)，选自E1，E2，E4，E5，E6和E7或其任意混合物。
在本发明的一个方面，***瘤病毒另外多肽可来源于与上述核酸编码的E2多肽相同的***瘤病毒基因型(例如E1和E2多肽来源于HPV-16)。
可选择地，在本发明的另一方面，***瘤病毒另外多肽可来源于与上述核酸编码的E2多肽不同的***瘤病毒基因型。有利地，所述E2多肽来源于HPV-16和所述另外***瘤病毒多肽来源于HPV-18。
***瘤病毒另外多肽与相应天然序列比较可以是天然的或修饰的。例如，当保持抗原活性时，另外多肽可被修饰以减少或去除其各自的生物学活性(例如酶活性)。如下阐述的示例修饰是关于HPV-16***瘤病毒多肽，但是技术人员能够将这些示例性突变转换至其他***瘤病毒基因型的相应多肽。而且***瘤病毒另外多肽可被进一步修饰以如上述和WO99/03885所描述在细胞膜上与E2一起呈递。
***瘤病毒另外多肽的适合实例是修饰的E1多肽，与相应天然E1多肽比较其包含一或多个突变以对于刺激病毒复制是缺陷的。期望地，修饰的E1多肽包含天然E1多肽的412，439，482和/或496位的任意一个残基的突变，例如Yasugi et al.(1997，J.Virol 71，5942-5951)等描述的HPV-16E1的变体W439R，Y412F，G482D和G496R，特别优选G482D变体，其包含天然HPV-16E1多肽的氨基酸序列，除了在482位使用Asp残基替代Gly残基(例如修饰的E1多肽具有SEQ ID NO：3所示序列)。另一个示范的修饰的E1多肽包含HPV-18E1多肽，在489位用Asp残基替代Gly残基。
***瘤病毒另外多肽的另一个适合的实例是修饰的E6多肽，其是非致癌的且与细胞肿瘤阻抑物基因产物p53的结合被改变。***瘤病毒另外多肽另一个适合的实例是修饰的E7多肽，其是非致癌的且与细胞肿瘤阻抑物基因产物Rb的结合被改变。这样的非致癌变体被Pim et al.(1994，Oncogene9，1869-1876)，Munger et al.(1989，EMBO J.8，4099-4105)，Crook et al.(1991，Cell 67，547-556)，Heck et al.(1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89，4442-4446)和Phelps et al.(1992，J.Virol.66，2148-2427)描述。一个优选的非致瘤性E6多肽来源于HPV-16并缺失118到122残基(CPEEK)(+1表示天然HPV-16E6多肽从第一个Met残基开始的第一个氨基酸)。一个优选地非致癌E7多肽来源于HPV-16和缺失残基21到26(DLYCYE)(+1表示天然HPV-16E7多肽的第一个氨基酸)。
优选地，本发明使用的***瘤病毒另外多肽独立地或联合地选自由包含SEQ ID NO：3-5所示的任何氨基酸序列的多肽组成的一组。更特别地，SEQ ID NO：3提供复制活性缺陷(G482D)的膜呈递HPV-16E1多肽的氨基酸序列。SEQ ID NO：4提供膜呈递和非致癌HPV-16E1多肽的氨基酸序列，SEQ ID NO：5提供膜呈递和非致癌HPV-16E7多肽的氨基酸序列。
在天然背景序列中(例如HPV-16或HPV-18基因组)，编码E1的核酸分子的3’端与编码E2的核酸分子的5’端重叠59个核苷酸。依据一个优选的实施方案，与编码E2的核酸分子重叠的编码E1的核酸分子部分被修饰以显示与重叠E2序列少于75％的相同性百分比。期望地，通过简并密码子使用在核苷酸水平在编码E1的核酸分子上进行修饰并在氨基酸水平沉默，即这样的修饰在编码的***瘤病毒E1多肽中不翻译。一个代表性的修饰实例是在编码HPV-16E1的核酸分子的3’末端存在的59bp部分中导入并且与SEQ ID NO：6所示编码HPV-16E2的核酸分子5’部分在天然背景序列中重叠。
本发明也涉及载体或感染性病毒颗粒(例如用于治疗在此描述的持续性***瘤病毒感染)，其包含编码***瘤病毒E1多肽的至少一个核酸分子和编码***瘤病毒E2多肽的至少一个核酸分子，其中在天然背景序列中与所述编码E2的核酸分子的5’部分具有100％相同的、所述编码E1的核酸分子的3’部分被修饰以与所述编码E2的核酸分子的所述部分显示小于75％的相同性百分比。在另一个实施方案中，本发明也涉及载体或感染性颗粒，其包含编码***瘤病毒E1多肽的至少一个核酸分子和编码***瘤病毒E2的至少一个核酸分子，其中编码E1的核酸分子和编码E2的核酸分子不包含40或更多个(例如45，50，55，59，70个)显示75％或大于75％相同性百分比的连续核苷酸部分。
这个实施方案的优选载体包含选自以下一组的载体：
-包含(i)编码HPV-16E2多肽的核酸分子并且还包含(ii)编码HPV-18E2多肽的核酸分子的载体；
-包含(i)编码HPV-16E2多肽的核酸分子(ii)编码HPV-18E2多肽的核酸分子和(iii)编码HPV-33E2多肽的核酸分子的载体；
-包含(i)编码HPV-16E2多肽的核酸分子(ii)编码HPV-18E2多肽的核酸分子和(iii)编码HPV-52E2多肽的核酸分子的载体；
-包含(i)编码HPV-16E2多肽的核酸分子(ii)编码HPV-33E2多肽的核酸分子和(iii)编码HPV-52E2多肽的核酸分子的载体；
-包含(i)编码HPV-16E2多肽的核酸分子(ii)编码HPV-18E2多肽的核酸分子(iii)编码HPV-33E2多肽的核酸分子和(iv)编码HPV-52E2多肽的核酸分子的载体；
-包含(i)编码HPV-16E2多肽的核酸分子(ii)编码HPV-16E1多肽的核酸分子的载体；
-包含(i)编码HPV-16E2多肽的核酸分子(ii)编码HPV-16E1多肽的核酸分子(iii)编码HPV-18E2多肽的核酸分子和(iv)编码HPV-18E1多肽的核酸分子的载体；
-包含(i)编码HPV-16E2多肽的核酸分子(ii)编码HPV-16E6多肽的核酸分子的载体；
-包含(i)编码HPV-16E2多肽的核酸分子(ii)编码HPV-16E7多肽的核酸分子的载体；
-包含(i)编码HPV-16E2多肽的核酸分子，(ii)编码HPV-16E1多肽的核酸分子；(iii)编码HPV-16E6多肽的核酸分子，(iv)编码HPV-16E7多肽的核酸分子的载体；
-包含编码HPV-16E1，E2，E6和E7多肽和HPV-18E1，E2，E6和E7多肽的核酸分子的载体。
期望地，编码的E2多肽是膜呈递的和复制和转录激活活性缺陷的。优选地，HPV-16E2多肽包含、或者基本上由或由SEQ ID NO：2所示氨基酸组成；和/或HPV-18E2多肽包含、或基本上由或由SEQ ID NO：29所示氨基酸组成；和/或HPV-33E2多肽包含、或基本上由或由SEQ ID NO：30所示氨基酸组成；和/或HPV-52E2多肽包含、或基本上由或由SEQ ID NO：31所示氨基酸组成。
独立地或联合地，编码的E1多肽是膜呈递的和复制活性缺陷的。优选地，HPV-16E1多肽包含、或基本上由或由SEQ ID NO：3所示氨基酸序列组成；和/或HPV-18E1包含、或基本上由或由SEQ ID NO：32所示氨基酸序列组成。编码的E6和/或E7多肽是膜呈递的和非致癌的。优选地，HPV-16E6多肽包含、或基本上由或由SEQ ID NO：4所示氨基酸序列组成；和/或HPV-16E7多肽包含、或基本上由或由SEQ ID NO：5所示氨基酸序列组成。
更优选地，编码HPV-16E2多肽的核酸分子包含、或基本上由或由SEQID NO：8所示核苷酸组成；和/或编码HPV-18E2多肽的核酸分子包含、或基本上由或由SEQ ID NO：33所示核苷酸序列组成；和/或编码HPV-33E2多肽的核酸分子包含、或基本上由或由SEQ ID NO：34或SEQ ID NO：35所示核苷酸序列组成；和/或编码HPV-52E2多肽的核酸分子包含、或基本上由或由SEQ ID NO：36或SEQ ID NO：37所示核苷酸序列组成；和/或编码HPV-16E1多肽的核酸分子包含、或基本上由或由SEQ ID NO：7所示核苷酸序列组成(简并序列以减少与HPV-16E2重叠部分的同源性)；和/或编码HPV-18E1多肽的核酸分子包含、或基本上由或由SEQ ID NO：38所示核苷酸序列组成(简并序列以减少与编码HPV-16E1序列的同源性)。
在此讨论的涉及包含编码E2多肽的2个或更多个核酸分子的载体的实施方案，值得推荐的是编码E2的核苷酸序列被简并以相互之间、优先在全长序列上显示小于75％的同源性百分比。优先所述编码E2的核酸分子不包含40个或更多(例如45、50、55、59、70或更多个)显示75％或大于75％相同性百分比的连续核苷酸部分。上述核苷酸序列能满足这个实施方案。
使用本领域可获得的序列数据和在此提供的序列信息可以生成本发明的载体或感染性病毒颗粒中使用或包括的核酸分子。通过常规分子生物学或PCR技术其可从含有HPV的细胞(例如从ATCC获得的登记号CRL-1550的CaSki细胞)或以上确定的任何***瘤病毒来源分离，和如果需要通过常规诱变技术(例如在特殊宿主细胞内最优化表达生成缺陷变体等)还可以进行如本文所述进一步被修饰。可选择地，也可以通过自动化过程化学合成生产本发明使用的核酸分子(例如从重叠合成寡核苷酸组装，如Edge，1981，Nature 292，756；Nambair et al，1984，Science 223，1299；Jay et al，1984，J.Biol.Chem.259，6311描述)。
在另一个实施方案中，本发明使用的或包含于本发明载体或感染性病毒颗粒内的核酸分子是在宿主细胞或生物体内以适合于编码的多肽表达的形式，其意味着核酸分子置于一或多个其表达必须的调控序列控制之下。
如本文所用，术语“调控序列”指任何在给定宿主细胞内允许、有助于或调节核酸分子表达的序列，包括复制，重复，转录，剪接，翻译，稳定性和/或核酸转运或其任一衍生物(例如mRNA)进入宿主细胞。在本领域内已知这样的调控序列(见例如Goeddel，1990，Gene Expression Technology：Methods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego)。本领域技术人员知道调控序列的选择可依赖于这样的因素如载体类型，宿主细胞，所需表达水平等。在本发明中，调控序列与被表达的核酸分子可操纵地连接。“可操纵地连接”指核酸分子与调控序列以允许其在宿主细胞或生物体内表达的方式连接。
启动子是特别重要的，本发明包含组成型启动子的使用，其在许多类型的宿主细胞内指导表达核酸分子并且仅在某些宿主细胞内指导表达或对应答特殊事件或外源因子(例如温度，营养添加，激素或其他配体)。文献中广泛的描述了适合的启动子并且可以更特别地引证病毒启动子如RSV(劳斯氏肉瘤病毒)，SV40(猴病毒-40)，CMV(巨细胞病毒)和MLP(主要晚期启动子)启动子。在痘病毒载体内使用的优选启动子包括但不限于痘启动子7.5K，H5R，TK，p28，p11和K1L，在早期和晚期痘病毒启动子之间的嵌合启动子以及合成启动子如Chakrabarti等(1997，Biotechniques 23，1094-1097)，Hammond等(1997，J.Virological Methods 66，135-138)和Kumar和Boyle(1990，Virology 179，151-158)描述。
本领域的技术人员知道控制核酸分子表达的调控序列还包括另外元件用于正确起始，调控和/或转录终止(例如polyA转录终止序列)，mRNA转运(例如核定位信号序列)，加工(例如剪接信号)，稳定性(例如内含子和非编码5′和3′序列)和翻译(例如三联前导序列，核糖体结合位点，SD序列等)进入宿主细胞或生物体。
在本发明中，一或多个核酸分子拷贝可包含于本发明使用的所述载体或感染性病毒颗粒内。
在此使用的术语“载体”定义病毒载体和非病毒载体(例如质粒DNA)，包括染色体外(例如游离体)、多拷贝和整合载体(即被整合进宿主染色体)。在本发明中特别重要的是用于基因治疗的载体(例如其能够输送核酸分子到宿主生物体)以及用于多种表达***的表达载体。当提及病毒载体时，在此使用的术语“载体”指任何包含至少一种病毒来源的元件的核酸分子，所述元件包括完整病毒基因组、其一部分或如下描述的修饰的病毒基因组以及其产生的病毒颗粒(例如病毒载体包装进入病毒衣壳产生感染性病毒颗粒)。
适合的非病毒载体包括质粒例如pREP4，pCEP4(Invitrogene)，pCI(Promega)，pCDM8(Seed，1987，Nature 329，840)，pVAX和pgWiz(GeneTherapy System Inc；Himoudi et al，2002，J.Virol.76，12735-12746)。
病毒载体可来源于大量不同病毒，特别来自于选自逆转录病毒，腺病毒，腺病毒相关病毒(AAV)，痘病毒，疱疹病毒，麻疹病毒和泡沫病毒的病毒。病毒载体可以具有复制能力，或丧失遗传能力以至于复制缺陷或复制消弱。在此使用的术语“有复制能力”包含复制选择性和条件性复制的病毒载体，其被工程化以更好复制或选择性在特殊宿主细胞(例如肿瘤细胞)内复制。
在一方面，本发明使用的载体是腺病毒载体(综述见″Adenoviral vectorsfor gene therapy″，2002，Ed D.Curiel and J.Douglas，Academic Press)。其可来源于大量人类或动物来源，可使用腺病毒血清型从1到51的任何血清型。特别优选人腺病毒2(Ad2)，5(Ad5)，6(Ad6)，11(Ad11)，24(Ad24)和35(Ad35)。这样的腺病毒可获得自美国典型培养物保藏中心(ATCC，Rockville，Md.)和已被众多的出版物描述了它们的序列，生产组织和方法，允许本领域技术人员应用它们(见例如US 6,133,028；US 6,110,735；WO 02/40665；WO00/50573；EP 1016711；Vogels et al.，2003，J.Virol.77，8263-8271)。
本发明使用的腺病毒载体可具有复制能力。本领域技术人员可容易地获得具有复制能力腺病毒载体的众多实例(Hernandez-Alcoceba et al.，2000，Human Gene Ther.11，2009-2024；Nemunaitis et al.，2001，Gene Ther.8，746-759；Alemany et al.，2000，Nature Biotechnology 18，723-727)。例如，它们可以从野生型腺病毒基因组通过在ElA CR2结构域(例如WO00/24408)内的缺失和/或使用组织、肿瘤或细胞状态特异性启动子(例如US5,998,205，WO99/25860，US5,698,443，WO00/46355，WO00/15820和WO01/36650)替代天然E1和/或E4启动子被工程化。
可选择地，本发明使用的腺病毒载体是复制缺陷型的(见例如WO94/28152；Lusky et al，1998，J.Virol 72，2022-2032)。优选的复制缺陷腺病毒载体是E1缺陷的(例如US 6,136,594和US 6,013,638)，有从大约459位延伸到3328位或从大约459位延伸到3510位的E1缺失(参考GeneBank中揭示的登记号M73260的人腺病毒类型5序列和Chroboczek et al.，1992，Virol.186，280-285)。通过缺失腺病毒基因组另外部分(例如在非必需E3区或在其他必需E2，E4区中)可进一步改善克隆能力。如Chartier et al.(1996，J.Virol.70，4805-4810)描述通过在腺病毒基因组任何位置的同源重组进行本发明使用的核酸分子的***。优选地，它***到替代E1区。其可以与被讨论区域的天然转录方向以有义或反义方向放置。
在另一个和优选的方面，本发明使用的载体是痘病毒载体(见例如Coxet al.in″Viruses in Human Gene Therapy″Ed J.M.Hos，Carolina AcademicPress)。其可得自任何痘病毒科成员，特别是金丝雀痘(例如WO95/2778O描述的ALVAC)，鸡痘(例如Paoletti et al.，1995，Dev.Biol.Stand.84，159-163等描述的TROVAC)或痘苗病毒，后者是优选的。适合的痘苗病毒包括但不限于Copenhagen株(Goebel et al.，1990，Virol.179，247-266and 517-563；Johnson et al.，1993，Virol.196，381-401)，Wyeth株，NYVAC(见WO92/15672和Tartaglia et al.，1992，Virology 188，217-232)和高度弱化的修饰的安卡拉(MVA)株(Mayr et al.，1975，Infection 3，6-16)。
本领域技术人员可获得的大量文件中已描述在痘病毒基因组内***核酸分子和表达所需的相关调控元件的基础技术(Paul et al.，2002，Cancergene Ther.9，470-477；Piccini et al.，1987，Methods of Enzymology 153，545-563；US 4,769,330；US 4,772,848；US 4,603,112；US 5,100,587and US5,179,993)。通常，通过存在于病毒基因组和带有***核酸的质粒之间的重叠序列(例如所需***位点侧翼)间的同源重组进行。本发明使用的核酸分子优选***痘病毒基因组的非必需基因座以便于重组痘病毒保持活性和感染性。非必需区是非编码基因间区域或任何基因，其失活或缺失不能显著消弱病毒生长，复制或感染。只要在生产病毒颗粒过程中反式提供了缺陷的功能例如通过使用带有相应于痘病毒基因组缺失的互补序列的辅助细胞系，就可以在必需病毒基因座***。
当使用Copenhagen痘苗病毒，核酸分子优选***胸苷激酶基因(tk)(Hruby et al.，1983，Proc.Natl.Acad.Sci USA 80，3411-3415；Weir et al.，1983，J.Virol.46，530-537)。但是其他***位点也是适当的，例如在血凝素基因(Guo et al.，1989，J.Virol.63，4189-4198)、K1L基因座、u基因中(Zhou et al.，1990，J.Gen.Virol.71，2185-2190)或在痘苗病毒基因组左边末端，其中在文献中已报道多种自发的或工程化的缺失(Altenburger et al.，1989，ArchivesVirol.105，15-27；Moss et al.1981，J.Virol.40，387-395；Panicali et al.，1981，J.Virol.37，1000-1010；Perkus et al，1989，J.Virol.63，3829-3836；Perkus et al，1990，Virol.179，276-286；Perkus et al，1991，Virol.180，406-410)。
当使用MVA时，核酸分子可***MVA基因组出现的任一个鉴定的缺失I到VII(Antoine et al.，1998，Virology 244，365-396)以及D4R基因座中，但是***缺失II或III是优选的(Meyer et al.，1991，J.Gen.Virol.72，1031-1038；Sutter et al.，1994，Vaccine 12，1032-1040)。
当使用鸡痘病毒时，虽然可以考虑在胸苷激酶基因内***，优选核酸分子导入位于ORF 7和9之间的基因间区域(见例如EP 314 569和US5,180,675)。
优选地，本发明的或本发明使用的载体是痘苗病毒载体，特别优选MVA载体。更优选地，核酸分子***缺失III和最终以相反方向***，特别当所述核酸分子置于相同启动子控制之下时。优选编码E2和/或E7的核酸分子置于痘H5R启动子之下和编码E1和/或E6的核酸分子置于p7.5K启动子控制之下。
本发明也包含复合到脂质或聚合体以形成颗粒结构例如脂质体、脂复合物或纳米颗粒的载体的应用。在本领域可获得这样的技术(见例如Arangoa et al.，2003，Gene Ther.10：5-14；Eliaz et al.，2002，Gene Ther.9，1230-1237and Betageri et al.，1993，″Liposome drug delivery systems″，Technomic Publishing Company，Inc)。
本发明也涉及包含上述核酸分子或载体的感染性病毒颗粒及其在此定义的应用。
典型地，这样的病毒颗粒在适当的条件下在培养的合适细胞系内和使用本领域已知的技术产生。在此未尝试详细描述用于生产感染性病毒颗粒的多种已知方法。
当病毒载体是缺陷的时，通常感染性颗粒在互补细胞系或通过使用反式提供非功能性病毒基因的辅助病毒来生产。例如，互补缺失E1的腺病毒载体的适合细胞系包括293细胞(Graham et al.，1997，J.Gen.Virol.36，59-72)以及PER-C6细胞(Fallaux et al.，1998，Human Gene Ther.9，1909-1917)和PER-C6衍生物。繁殖痘病毒载体的适当细胞是禽细胞，最优选从已受精卵获得的从鸡胚制备的原代鸡胚成纤维细胞(CEF)。生产细胞可在常规的发酵生物反应器、培养瓶和培养板中在适当的温度、pH和氧容量条件下培养。
感染性病毒颗粒可从培养的上清液或裂解后的细胞中回收。依据标准技术可进一步纯化它们(如例如WO96/27677，WO98/00524，WO98/22588，WO98/26048，WO00/40702，EP1016700和WO00/50573所描述的层析，超速离心)。
本发明也包含已被修饰以允许优先靶向特殊靶细胞的核酸分子、载体或病毒颗粒的应用(见例如Wickam et al.，1997，J.Virol.71，8221-8229；Arnberg et al.，1997，Virol.227，239-244；Michael et al.，1995，Gene Therapy 2，660-668；WO94/10323；WO02/96939和EP 1 146 125)。靶向的载体和病毒颗粒的一个特征是在它们表面存在能够识别和结合细胞和表面暴露成分如细胞特异性标记物(例如HPV感染细胞)、组织特异性标记物(例如上皮细胞特异性标记物)以及病毒抗原(例如HPV)的配体。适合配体的实例包括针对HPV抗原结构域的抗体或其片段。可以通过将配体遗传***病毒表面存在的多肽(例如腺病毒尾丝，五邻体，pIX或痘p14基因产物)进行细胞靶向。
本发明也涉及宿主细胞，其包含上述用于本文的核酸分子、载体或感染性病毒颗粒。
通过任何本领域已知的方法可以将本发明使用的核酸分子、载体和感染性病毒颗粒导入宿主细胞。这种方法包括但不限于显微注射(Capechi et al，1980，Cell 22，479-488)，CaPO4介导的转染(Chen and Okayama，1987，Mol.Cell Biol.7，2745-2752)，DEAE-葡聚糖-介导的转染，电穿孔(Chu et al.，1987，Nucleic Acid Res.15，1311-1326)，脂转染/脂质体融合(Feigner et al.，1987，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84，7413-7417)，粒子轰击(Yang et al.，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87，9568-9572)，基因枪，转导，病毒感染以及经多种手段直接施用宿主生物体。而且，如上所讨论，它们可与转染试剂联合使用以促使它们导入宿主细胞或生物体，例如聚阳离子聚合物(例如壳聚糖，聚甲基丙烯酸酯，PEI等)和阳离子脂质(例如DC-Chol/DOPE，现可从Promega获得的transfectam lipofectin)。
在本发明的另一方面，上述核酸分子、载体或感染性病毒颗粒(在此也称为“活性剂”)或其任意组合包含于组合物中。这种组合物可包括编码不同基因型E2多肽的载体或病毒颗粒。
有利地，组合物是药物组合物，其还包含治疗有效量的活性剂，药物可接受的载体。本文所用“治疗有效量”是足够缓解一或多个与需要治疗的疾病或病症相关的症状的剂量。例如，治疗有效量可以是诱导免疫反应或激活免疫***产生抗HPV反应进展的必需量。如本文所用，“药物可接受载体”包括与药物施用相容的任何和所有载体，溶剂，稀释剂，赋形剂，佐剂，分散介质，包被剂，抗菌剂和抗真菌剂，和吸收延迟剂等。
期望地，本发明使用的组合物是为人类或动物使用配制的。优选包括在等渗、低渗或微弱高渗的稀释剂中并具有相对低的离子强度。适合的稀释剂的代表性实例包括灭菌水，生理盐水(例如氯化钠)，Ringer′s溶液，葡萄糖，海藻糖或蔗糖溶液，Hank′s溶液和其他生理平衡盐溶液(见例如最新版Remington：The Science and Practice of Pharmacy，A.Gennaro，Lippincott，Williams&Wilkins)。此外组合物可以是在生理或微碱性pH(例如大约pH7到大约pH9之间)下缓冲。适合的缓冲液包括但不限于磷酸盐缓冲液(例如PBS)，碳酸氢盐缓冲液和Tris-HCl缓冲液。为了阐述说明，特别适合于本发明的配方包括：
Figure A20088000365000321
1M蔗糖，150mM NaCl，1mM MgCl2，54mg/l Tween 80，10mMTris-HCl pH 8.5(特别当活性剂是腺病毒载体时)；
Figure A20088000365000322
10mg/ml甘露醇，1mg/ml HAS，20mM Tris，pH 7.2，和150mMNaCl；和
生理盐水。
这样的配方特别适合于保持本发明使用的组合物在冷冻(例如-70℃，-20℃)、冷藏(例如4℃)或环境稳定下的稳定性。本发明使用的组合物也可以是以固体形式配制。通过真空干燥和冷冻干燥过程可获得固体组合物(例如干粉或冻干的)。它们通常在使用前在合适的载体中重构(reconstitute)。
组合物也可含一或多个药物可接受的赋形剂以提供所需的药学或药动学特性，包括例如修饰或维持pH、同渗容摩、粘性、澄清、颜色、无菌、稳定性、配方的溶解率，修饰或维持进入人或动物生物体的释放或吸收，促进经粘膜屏障的转运或渗透进入特定器官。例如，适合***施用的组合物最终可包括一或多个吸收增强子用于增加粘膜孔径大小。
此外，本发明使用的组合物可包括一或多个适合人体全身或粘膜应用的佐剂。优选地，佐剂能够刺激对于活性剂的免疫性，特别是T细胞介导的免疫性例如通过toll样受体(TLR)如TLR-7、TLR-8和TLR-9。有用的佐剂代表性实例包括但不限于明矾，矿物油乳液如费氏完全和不完全佐剂(IFA)，脂多糖或其衍生物(Ribi et al，1986，Immunology andImmunopharmacology of Bacterial Endotoxins，Plenum Publ.Corp.，NY，p407-419)。皂角苷例如QS21(Sumino et al.，1998，J.Virol.72，4931-4939；WO98/56415)，咪唑喹啉化合物例如咪喹莫特(Suader，2000，J.Am AcadDermatol.43，S6-S11)，1H-咪唑(4，5-c)喹诺酮-4-胺衍生物(AldaraTM)和相关化合物S-27609(Smorlesi，2005，Gene Ther.12，1324-1332)，胞嘧啶磷酸鸟嘌呤寡脱氧核苷酸如CpG(Chu et al.，1997，J.Exp.Med.186：1623；Tritel etal.，2003，J.Immunol.171：2358-2547)和阳离子肽如IC-31(Kritsch et al.，2005，J.Chromatogr Anal.Technol Biomed Life Sci 822，263-270)。
经多种施用模式施用本发明使用的组合物，包括全身、局部和粘膜施用。经任何方式进行全身施用，例如皮下，皮内，肌肉内，静脉内，腹膜腔内，血管内，动脉内注射。注射可以使用常规注射器或针头，或本领域可用的任何其他适当的设备。经口，鼻，气管内，肺内，***内或直肠内途径进行粘膜施用。使用透皮方式(例如贴剂等)进行局部施用。本发明使用的组合物优选配制成适合注射的形式，肌肉内或皮下施用是优选的。
适当的剂量可为不同参数的函数，特别是施用模式；使用的活性剂；宿主生物体的年龄，健康和体重；协同治疗的种类；和/或治疗频率。依据有关情况，从业者可以常规地精确计算需要确定用于治疗的适当剂量。一般指导是腺病毒颗粒适合的剂量从大约105到大约1013iu(感染单位)，期望从大约107到大约1012iu和优选从大约108到大约1011iu。MVA颗粒适合的剂量从大约104到大约1010pfu(噬斑形成单位)，期望从大约105到大约109pfu和优选从大约106到大约108pfu。施用的载体质粒剂量在10μg和20mg之间并且优选在100μg和2mg之间。
进一步地，施用可以是单剂量或依据标准方案的多剂量和几小时，几天和/或几星期的剂量和方案。此外，施用可以是大剂量注射或连续输注。例如至少2次(例如从2到10)施用上述核酸分子，载体，感染性颗粒或组合物治疗宿主生物体。优选地，在从几天到4个星期的一段时间内连续进行第一系列施用，之后是在1到6个月内进行的第二系列连续施用(例如1次或2次施用)，随后是最后一次施用第一系列。第二系列的每次施用之间的时间可以从几天到4个星期。在一个优选的实施方案中，第一系列施用包含以周间隔的3次顺序施用以及第二系列施用包含在第一系列后的4到6个月内的一次施用。一个常规的指导是当本发明使用MVA感染颗粒时，优选用包含106到5×108pfu的MVA颗粒的剂量经皮下途径施用。
如上所提及，在宿主生物体(病人)暴露于至少一种***瘤病毒之后和检测/出现***瘤病毒相关病变之前优选施用在此描述的核酸分子，载体，感染性病毒颗粒或组合物或其组合。在其他术语中，具有HPV感染但尚未进展为瘤的宿主生物体是用于本发明以防止或减少进展为瘤和最终成为癌症的机会的合适候选。
“暴露”表示宿主生物体遭遇至少一种导致感染的***瘤病毒。本领域可获得大量能够诊断***瘤病毒感染的诊断方法。例如，从处于***瘤病毒感染风险的宿主生物体收集生物学样品并分析***瘤病毒，病毒核酸(例如DNA或mRNA)和/或病毒抗原的存在。这样的方法包括但不限于PCR，原位杂交，免疫荧光，ELISA和现在可获得的大量诊断检验。适当检验的代表性实例包括LiPA system(WO99/14377；Labo Biomedical products，Netherlands)，Hybrid Capture
Figure A20088000365000341
test(HCII；Digene Corp，USA可以检测13个HR-HPV的DNA)，the Linear
Figure A20088000365000342
-test(Roche可以对37个HPV基因型进行DNA基因分型)，Thin Prep System(Cytyc Corporate；Marlborough，MA)，PreTect-HPV
Figure A20088000365000343
(NorChip AS，Norway可以检测HPV-16，HPV-18，HPV-31，HPV-33和HPV-45的E6/E7mRNA)，PCR/RT-PCR***，和Pretet等(2004，J.Clin.Virol.31，140-147)或Monnier-Benoit等(2006，J.Clin.Virol.31，140-147)描述的实时定量PCR。本领域技术人员已知适合的引物或基于检测的***瘤病毒核苷酸序列可以容易地合成该引物。
在此使用的“***瘤病毒相关病变”指***瘤病毒感染引起的任何疾病或病症。这个术语包含恶变前以及恶性病变。恶变前病变的代表性实例包括但不限于在多种组织内可检测到的低，中或高等级的上皮内瘤样病变，例如CIN，外阴上皮内瘤形成(VIN)，***上皮内瘤样病变(AIN)，***上皮内瘤样病变(PIN)和***上皮内瘤形成(VaIN)。恶性病变的代表性实例包括但不限于子***，***癌，***癌，***癌和口腔癌。通过直接检测(例如醋酸后***镜检)或通过临床医生常规实践的诊断方法(例如宫颈涂片检查，从细胞学样品检测非正常细胞)可观察到***瘤病毒相关恶变前和恶性病变。例如，可以收集通过***镜可见的嗜酸细胞区或病变区局部活检组织并检测形态学异常(例如上皮增生，标记的核异常等)。在本发明中***瘤病毒相关病变不包含轻度异常，例如ASCUS(不明确意义的非典型鳞状细胞)。
依据一个优选的实施方案，在此描述的核酸分子，载体，感染性病毒颗粒或组合物或其组合被用于治疗由至少一种***瘤病毒、尤其是一种HR-HPV、特别优选HPV-16，HPV-18，HPV-33或HPV-52或其任意组合(例如HPV-16和HPV-18两种)导致的持续性感染。在本发明中E2多肽可来源于感染性***瘤病毒或与感染性***瘤病毒交叉反应的***瘤病毒。
由于多种HR-HPV的E2多肽之间氨基酸序列的保守性，可以预期特别是在HPV 16和HPV31，HPV33，HPV35，HPV52以及HPV58之间的交叉反应性。一方面，本发明使用编码来源于HPV-16的E2多肽的核酸分子，载体，感染性病毒颗粒或组合物治疗患有由HPV16，HPV31，HPV33，HPV35，HPV52和HPV58的至少一种导致感染的病人。
同样地，可以预期在HPV-18和HPV-39，HPV-45，HPV-51，HPV-56，HPV-59，HPV-68，HPV-70以及HPV-85之间的交叉反应性。另一个方面，本发明使用编码来源于HPV-18的E2多肽的核酸分子，载体，感染性病毒颗粒或组合物治疗患有由HPV-18，HPV-39，HPV-45，HPV-51，HPV-56，HPV-59，HPV-68，HPV-70和HPV-85的至少一种导致感染的病人。
如在此所使用，“持续性***瘤病毒感染”相应于在暴露于***瘤病毒之后未完成自发病毒去除的宿主生物体中的***瘤病毒感染的无症状阶段。在间隔几个月例如至少6个月、有利地至少8个月、优选地至少10个月和更优选地至少12个月的2次连续检测中在宿主生物体中检测到***瘤病毒或其至少一个元件(例如核酸，抗原等)而未观察到临床症状(例如恶变前和/或恶性***瘤病毒相关病变)时就建立了持续性***瘤病毒感染。由正常细胞学(虽然轻度异常例如ASCUS是耐受的)确定无症状阶段特征。例如，在大约6个月间隔显示阳性HCII测试但宫颈涂片正常的病人中建立了持续性***瘤病毒感染。
在一个实施方案中，依据在此所述形式使用上述核酸分子，载体，感染性病毒颗粒或组合物以诱导或激活治疗的宿主生物体内的免疫反应，与未使用这种活性剂相比较。
诱导的或激活的免疫反应可以是特异性和/或非特异性的，可以是体液和/或细胞介导的。体液反应包括产生抗至少一种***瘤病毒多肽的抗体，而细胞反应包括T辅助细胞和/或CTL反应和/或刺激细胞因子产生。优选地，诱导的或激活的免疫反应有效提供抗至少一种感染性***瘤病毒的抗病毒反应。
在体外或体内通过本领域内标准的多种化验(可用于评价免疫反应出现和激活的技术的常规描述见例如Coligan et al.，1992和1994，CurrentProtocols in Immunology；ed J Wiley & Sons Inc，National Institute of Health)可以评价上述核酸分子，载体，感染性病毒颗粒或组合物在治疗的宿主生物体中诱导或激活免疫反应的能力。通过测量由活化的效应细胞包括那些来源于CD4+和CD8+T细胞(例如经ELIspot量化产生IL-10或IFNg的细胞)分泌的细胞因子谱，通过确定免疫效应细胞(例如经经典的[3H]胸苷吸收的T细胞增殖化验)的激活状态，通过在敏华对象内分析抗原特异性T淋巴细胞(例如细胞毒性分析中的肽特异性裂解)可进行细胞免疫的测量。通过ELISPOT，基于四聚物的分析技术或其他标准技术分析T细胞介导的免疫也可以例如在同系小鼠(例如H2Db)或转基因小鼠(例如HLAA2和HLA B7)内评价刺激细胞反应的能力。通过抗体结合和/或竞争分析(例如见Harlow，1989，Antibodies，Cold Spring Harbor Press)也可以确定体液反应。例如，可发展免疫学工具例如ELISA检测治疗的宿主生物体的抗E2抗体。
在另一个实施方案中，与未使用活性剂比较，依据在此描述的形式使用上述核酸分子，载体，感染性病毒颗粒或组合物以提供抗至少一种感染性***瘤病毒的抗病毒反应。
如本文所用，“抗病毒反应”指在治疗的生物体内通常与***瘤病毒感染相关的症状的减少或去除。例如通过上述活化剂控制病毒感染的能力可以确定减少或清除至少一种感染性***瘤病毒，和/或减少或清除感染的细胞或表达***瘤病毒基因序列的细胞(特别是潜在致癌性E6和E7基因)的抗病毒反应。这可以通过在收集自治疗的宿主生物体的生物学样品中与使用前比较，指示***瘤病毒感染的标记物例如***瘤病毒，病毒核酸，和/或病毒抗原的可测水平的显著减少或缺乏来评价。检测比较本发明在停止使用后的时间点处测量的这种标记物的水平与代表未治疗感染的这种使用之前测量的同样标记物的水平可以指示减少或去除。在一个优选的实施方案中，抗病毒反应是在本发明使用停止后，从被治疗几个月的宿主生物体收集的生物学样品中不存在可测的***瘤病毒，病毒核酸和/或抗原。
通过上述活性剂显著减少在***瘤病毒感染生物体内典型发展的病变的发生，大小和/或严重性的能力也可以确定抗病毒反应。如本文所用，“减少”指本文定义的***瘤病毒相关病变的出现，大小和/或严重性的预防，延迟，阻碍，减慢，阻止和/或推迟发展。通过常规追踪治疗的宿主生物体可评价上述活性剂减少***瘤病毒相关病变的出现，大小和/或严重性的能力。优选地，减少是指本发明使用之后，治疗的宿主生物体不发展任何***瘤病毒相关病变(例如组织学确认的CIN病变)至少一年，有利地至少2年，优选至少3年和更优选至少5年。更优选地，本发明的使用允许延迟或去除治疗的宿主生物体所需要的切除程序(例如锥形切除术)。
一个常规的指示是在宿主生物体内最后施用活性剂的间隔时间段和抗病毒反应的检测可以根据***瘤病毒感染史，使用的形式和/或治疗的宿主生物体而变化。优选地，是3个月到几年，特殊优选至少3个月，有利地至少4个月，期望至少5个月，优选至少6个月和更优选至少1年。例如，如果在治疗前子宫颈样品中例如通过Digen HCII检测的HPV DNA是阳性的宿主生物体在最后一次施用上述活性剂至少6个月后对于同样的***瘤病毒是阴性的，则可以确定抗病毒反应。
本发明也涉及诱导或激活或扩大抗宿主生物体内至少一种感染的***瘤病毒的免疫反应的方法，所述方法包括给所述生物体施用治疗有效量的上述核酸分子，载体，感染性病毒颗粒或组合物以诱导或激活或扩大所述免疫反应，其中在暴露于***瘤病毒之后和检测/出现***瘤病毒相关病变之前施用所述核酸分子，载体，感染性病毒颗粒或组合物。优选地，诱导的或激活的免疫反应提供抗至少一种如上所定义的感染的***瘤病毒的抗病毒反应。
在一个实施方案中，联合一或多个常规治疗形式可进行本发明的方法或使用。多重治疗方法提供宿主生物体更广泛的干预。其施用可以先于、伴随或后于施用本发明使用的核酸分子，载体，感染性病毒颗粒或组合物。
在另一个实施方案中，依据引发加强治疗形式(prime boost therapeuticmodality)可进行本发明的方法或使用，其包括依次施用一或多个引发剂(primer)和一或多个加强剂。典型地，引发剂和加强剂使用包含或编码至少一个共有免疫原结构域的不同载体。最初给宿主生物体施用引发剂并且在一天至12个月后施用相同的宿主生物体加强剂。本发明的方法或使用可包含1到10次依次施用引发剂，之后是1到10次依次施用加强剂。此外，可在同一位点或可选位点经相同施用途径或不同施用途径施用引发剂和加强剂，例如皮下注射MVA载体，肌肉内注射DNA质粒和腺病毒载体。
在本发明中，上述核酸分子，载体，感染性病毒颗粒或组合物可用于引发或加强或同时引发和加强抗***瘤病毒免疫反应。例如，上述定义的腺病毒载体或颗粒可被用作引发剂并且上述定义的MVA载体或颗粒可用作加强剂，反之亦然。也可能使用上述核酸分子，载体，感染性病毒颗粒或组合物联合编码或包含与本发明组合物有共同抗原结构域的任何现有技术材料。这样材料的来源是广泛的，包括但不限于肽，蛋白质(例如重组产生的E2多肽)，病毒载体，质粒DNA，蛋白质颗粒例如病毒样颗粒，细胞材料例如受辐射细胞等。
本发明以说明方式描述，可以理解使用的术语是描述而不是限制性的。显然，依据以上教导可以对本发明进行许多修饰和变化。因此应理解在所附的权利要求书范围内，可采用与在此特异性描述的不同方法实施本发明。
所有上述公开的专利、出版物和数据库条目中如果每种专利、出版物或条目特异指出并入参考择以其全部并入本文作参考。
附图说明
图1说明编码膜呈递和缺陷HPV-16E2多肽的pTG17408质粒。
图2说明编码膜呈递和复制缺陷HPV-16E1多肽的pTG17409质粒，其与HPV-16E2编码序列共同的59个核苷酸部分已被简并。
图3说明注射了MVATG17408(MVA-E2)或阴性对照MVA-N33的小鼠中ELISPOT检测的E2特异性IFNg Th1反应。
以下实施例用于举例说明本发明。
实施例
依据Maniatis et al.(1989，Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor NY)详述的常规遗传工程和分子克隆技术或当使用商购试剂盒时依据厂商推荐进行以下构建。本领域技术人员已知PCR扩增技术(见例如PCR protocols-A guide to methods andapplications，1990，published by Innis，Gelfand，Sninsky andWhite，AcademicPress)。带有氨苄青霉素抗性基因的重组质粒在大肠杆菌(E.coli)C600(Stratagene)，BJ5183(Hanahan，1983，J.Mol.Biol.166，557-580)和NM522内在添加100μg/ml抗生素的琼脂或液体培养基上复制。通过同源重组进行克隆时优选使用BJ5183株(Bubek et al.，1993，Nucleic acid Res.21，3601-3602)。
依据上述引用文献和Mackett et al.(1982，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79，7415-7419)和Mackett et al.(1984，J.Virol.49，857-864)提及的常规技术构建重组痘苗病毒。使用大肠杆菌的选择基因gpt(黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶)(Falkner and Moss，1988，J.Virol.62，1849-1854)以促进重组痘苗病毒的选择。
实施例1：构建表达HPV-16E2基因的重组MVA载体
克隆HPV16E2基因
从CaSki细胞(ATCC CRL-1550)分离的基因组DNA克隆编码HPV-16E2的核苷酸序列。使用引物OTG 16809(SEQ ID NO：9)和OTG 16810(SEQID NO：10)扩增E2基因。生成的片段被BamHI和EcoRI消化并***用相同的酶限制的pGEX2T(Amersham Bio sciences)，产生pTG17239。克隆的E2基因的测序显示与HPV 16E2原型序列(在Genbank NC-01526中描述)比较有5个突变。2个突变是沉默的，使用QuikChange Site Directed Mutagenesis试剂盒(Stratagene)校正3个非沉默突变(T210I，S219P，K310T)，产生pTG17268。
修饰HPV-16E2多肽
通过定点诱变修饰掺入pTG 17268的E2核苷酸序列以产生HPV-16E2变体(E39A和I73A)，命名为E2*。更特异地，通过用Ala替代39位的Glu残基，E2复制功能被去除，用Ala替代73位的Ile残基，反式激活功能被去除。产生的质粒pTG17318包含编码HPV-16E2*的修饰序列。
通过在其N末端与肽信号融合和在其C末端与来自狂犬病毒分离物(Genbank ay009097)的糖蛋白的膜锚定序列融合还可修饰HPV-16E2*以在表达的宿主细胞指导呈递HPV-16E2*到质膜表面。命名为SS-E2*-TMR的编码膜呈递E2缺陷变体的核苷酸序列(SEQ ID NO：8)用如下引物通过三重PCR被重新组装：OTG17500(SEQ ID NO：11)，OTG17501(SEQ ID NO：12)，OTG17502(SEQ ID NO：13)，OTG17503(SEQ ID NO：14)，OTG17504(SEQ ID NO：15)和OTG17505(SEQ ID NO：16)。重新组装的序列被***pBS来源的载体(Stratagene)，产生pTG 17360，然后克隆到牛痘转移质粒pH5R启动子下游(Rosel et al，1986，J Virol.60，436-449)生成pTG17408(图1)。
转移质粒被设计为在MVA基因组的缺失III中允许经同源重组***转移的核苷酸序列。其来源于质粒pTG1E(Braun et al.，2000，Gene Ther.7，1447-1457描述)，该质粒被克隆了围绕MVA缺失III的侧翼序列(BRG3和BRD3)，该序列经PCR从MVATGN33.1DNA获得(Sutter and Moss，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89，10847-10851)。转移质粒也包含在早期晚期痘苗病毒合成启动子p11K7.5(R.Wittek，University of Lausanne惠赠)控制下的Aequorea victoria增强的绿色荧光蛋白(eGFP基因，分离自pEGP-C1，Clontech)和大肠杆菌黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因(gpt基因)之间的融合。合成黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶能使GPT+重组MVA在含有霉酚酸，黄嘌呤和次黄嘌呤的选择培养基中形成噬斑(Falkner et al，1988，J.Virol.62，1849-1854)，eGFP使重组MVA噬斑可观察到。选择标记物eGPP-GPT以相同方向置于2个同源序列之间。当克隆选择完成时，通过不选择允许eGPP-GPT重组MVA生长经几次传代很容易去除选择标记物。
构建表达HPV-16SS-E2*-TMR基因的重组MVA
在感染MVATGN33.1(MOI 0.1pfu/细胞)和用pTG17408转染(依据标准磷酸钙DNA沉淀)的原代鸡胚成纤维细胞(CEF)中经同源重组进行MVATG 17408病毒的制备。当含有霉酚酸，黄嘌呤和次黄嘌呤的选择培养基存在时，经三轮噬斑纯化进行病毒选择。如上所述，然后在非选择培养基中通过传代可去除选择标记物。PCR验证亲代MVA未被污染。
通过Western-blot进行E2表达分析。使用MVATG17408在MOI为0.2时感染CEF和24小时后收获细胞。使用购买的抗E2抗体TVG271(Abeam)进行Western-blot分析。检测到表观分子量55kDa的蛋白质的表达，而理论上E2*-TMR的分子量是48.9kDa。使用endoglycosydase F处理细胞提取物后观察到重组蛋白大小减少，提示E2*-TMR通过N-糖基化被修饰。
实施例2：构建表达HPV-16E1基因的重组MVA
从CaSki细胞DNA(ATCC CRL-1550)克隆编码HPV16E1多肽的核苷酸序列。更特异地，在2个部分E1a(nt 1-1102)和E1b(nt 1001到1950)扩增E1基因。使用引物OTG16811(SEQ ID NO：17)和OTG 16814(SEQ ID NO：18)扩增E1a片段，其被BamRI和EcoRI消化并***同样酶限制的pGEX2T，产生pTG17240。使用OTG16813(SEQ ID NO：19)和OTG 16812(SEQ IDNO：20)产生E1b片段并被BamHI和EcoRI消化后***pGEX2T，产生pTG17241。测序显示与HPV-16E1原型序列(Genbank NC-01526中描述)比较有4个突变。一个突变是沉默的，存在于E1a的3个非沉默突变(K130Q，N185T和T220S)通过定点诱变校正。然后通过在由BsrGI和EcoRI消化的pTG17241中克隆正确的E1a片段重装配完全的E1基因。产生的质粒命名为pTG17289。
在HPV-16基因组中，E1基因的最后59个核苷酸与E2基因的最初59个核苷酸相同。这些同源序列的存在可产生同样重组事件及因此在E1和E2编码MVA载体的生产步骤中的不稳定性。因此通过简并密码子使用修饰编码E1的序列的这部分以减少与编码E2序列的序列同源性。使用简并引物OTG 17408(SEQ ID NO：21)和OTG 17409(SEQ ID NO：22)扩增E1基因的3’末端获得简并序列。NsiI和BglII消化扩增的片段并***使用同样酶消化的pTG17289中，产生pTG17340。
HPV-16简并E1序列通过定点诱变以去除编码的E1多肽的复制功能，通过用Asp残基替代在HPV-16E1的482位的Gly残基(G482D；在此也指定为E1*)被突变，产生pTG17373。
通过融合肽信号和来源于狂犬病毒分离物(Genbank n°M38452中描述)的糖蛋白的膜锚定序列也修饰HPV-16Eldeg*序列以在浆细胞表面指导表达编码的多肽。使用以下引物OTG17560(SEQ ID NO：23)，OTG17561(SEQ ID NO：24)，OTG17562(SEQ ID NO：25)，OTG17563(SEQ ID NO：26)，OTG17564(SEQ ID NO：27)和OTG17565(SEQ ID NO：28)采用三重PCR重建SS-Eldeg*-TMR序列。产生的序列(SEQ ID NO：7)被***pBS来源的载体(Stratagene)，产生pTG17404。然后SS-Eldeg*-TMR序列被克隆进入实施例1描述的转移质粒，p7.5K启动子下游(Cochran et al，1985，J.Virol.54：30-37)，产生pTG17409(图2)。
通过如实施例1描述的同源重组在CEF中产生MVATG17409病毒。
实施例3：构建表达HPV-16E1和E2基因的重组MVA。
由p7.5K启动子控制的SS-Eldeg*-TMR序列分离自pTG17409并被***pTG17408，产生pTG17410。
通过如实施例1描述的同源重组在CEF中产生MVATG17410病毒。
实施例4：构建表达HPV-16E1，E2，E6和E7基因的重组MVA。
如WO99/03885所述分离并修饰HPV-16E7基因以编码SEQ ID NO：5中所示的非致癌膜定位E7多肽。通过缺失氨基酸残基21-26(DLYCYE)以及通过融合肽信号和狂犬病毒糖蛋白的膜锚定序列进行膜定位进行非致癌性突变。产生的序列克隆到早期-晚期pH5R启动子控制之下。然后表达盒导入pTG17410，产生pTG17482。
如WO99/03885所述分离并修饰HPV-16E6基因以编码SEQ ID NO：4中所示的非致癌膜定位E6多肽。通过缺失氨基酸残基118-122(CPEEK)以及通过融合肽信号和麻疹病毒F蛋白的膜锚定序列进行膜定位进行非致癌性突变。产生的序列克隆到p7.5K启动子控制之下。然后表达盒导入pTG17482，产生pTG17483。
如实施例1所述进行MVATG 174783的制备。
实施例5：在小鼠中评价HPV-16E2特异性Th1反应
在注射MVATG 17408(MVA-E2)的小鼠中采用ELISPOT评价HPV-16E2特异性Th1反应。选择SYFPEITHI和预测的BIMAS，基因型特异的，H2b限制的和人HLA-A0201限制的MHC I类肽分析在抗E2反应中IFNγ产生细胞。在下表1中显示这些肽。
用5×107pfu的MVATGN33(阴性对照)或MVATG17408(MVA-E2)皮下免疫C57B1/6雌鼠3次(在0，7和14天)。在第一次免疫21天后取脾脏并且使用5μg/ml上述肽进行γ-IFN ELISPOT。依据厂商指导用MabtechAB mouse IFNγELISPOTPLUS试剂盒(Mabtech，France)进行Elispot。使用Elispot reader Bioreader 4000Pro-X(BIOSYS-Gmbh；Serlabo France)计算点。减去不相关肽背景后获得结果。
如图3所示，与接种MVA-N33动物中测量的背景反应比较，4个肽导致大量产生IFNγ的脾细胞。所有这些肽均是HPV16特异性的。在小鼠H2-Db背景序列中定义F9V和N9I，在人HLA-A201序列中定义A9L和T9V。值得注意的是描述A9L肽可诱导特异性CTL反应(Konya et al，1997，JGen Virol.782615-20)。
总之，如ELISPOT所示，在接种小鼠体内皮下注射MVATG17408诱导抗HPV16的T细胞反应。
实施例6：构建表达HPV-18E1和E2基因(MVATG17582)的重组MVA载体
HPV-18E1和E2基因被重建为合成基因并设计寡核苷酸以减少存在于天然HPV-18E1序列3’末端和HPV-18E2序列5’末端的59个核苷酸部分之间同源性至小于75％并导入突变去除HPV-18E1和E2基因产物的酶功能(E1：G489D，E2：E43A和I77A)。也设计合成的HPV-18E1序列以减少天然HPV-16和HPV-18序列共享的同源部分之间的同源性百分比至小于75％。为此，排列对比HPV-16和HPV-18E1和E2基因的核苷酸序列并且设计寡核苷酸以减少同源性到小于6个连续核苷酸。
通过装配50个寡核苷酸重建HPV-18degE1*序列并被克隆到pBS载体中，产生pTG 17473。然后采用三重PCR使用引物OTG15315(SEQ ID NO：39)，OTG17881(SEQ ID NO：40)，OTG17882(SEQ ID NO：41)，OTG17883(SEQ ID NO：42)，OTG17884(SEQ ID NO：43)和OTG17885(SEQ ID NO：44)将E1序列融合到编码麻疹病毒F蛋白信号肽的核苷酸序列(SS-18Eldeg*-TMF)。产生的编码SS18degE1*-TMF多肽的片段(SEQ ID NO：38)被克隆到MVA转移载体在p7.5K启动子控制之下，生成pTG17521。
通过装配26个寡核苷酸重建HPV-18degE2*序列并被克隆到pBS载体中，产生pTG17498。采用三重PCR使用引物OTG 17875(SEQ ID NO：45)，OTG17876(SEQ ID NO：46)，OTG17877(SEQ ID NO：47)，OTG17878(SEQID NO：48)，OTG17879(SEQ ID NO：49)和OTG17880(SEQ ID NO：50)进行与狂犬病毒(ERA株；Genbank n°M38452)糖蛋白的信号和膜锚定肽的融合。产生的编码SS-18E2*-TMR多肽的片段(SEQ ID NO：33)被***MVA转移质粒pH5R启动子下游，生成pTG17552。最终，p7.5K-SS-E1deg*-TMF盒从pTG17521分离并***pTG17552，生成pTG 17582。
如上所述产生重组MVATG17521，MVATG17552和MVATG17582。感染培养的细胞之后使用得自免疫兔的血清采用Western blot确定MVA构建体表达HPV-18E1多肽。
实施例7：构建表达HPV-16和HPV-18E1和E2基因(MVATG17583)的多价重组MVA载体
p7.5K-SS-18E1deg*-TMF盒和pH5R-SS-18E2*-TMR盒被导入pTG17410(含p7.5K-SS-16E1deg*-TMR盒和pH5R-SS-16E2*-TMR)并且产生的转移质粒被命名为pTG17583。如上所述产生MVATG17583。MVATG17583感染培养细胞后使用得自免疫兔的血清采用Western blot确定HPV-16E1，HPV-16E2和HPV-18E1多肽的表达。
实施例8：构建表达HPV-33E2基因的重组MVA载体
经Geneart(Regensburg，Germany)合成编码HPV-33E2多肽的合成基因。设计合成序列以(i)减少与HPV-16，HPV-18和HPV-52的E2基因的同源性百分比至小于75％(若可能同源性部分减少到小于6个连续核苷酸)和(ii)导入突变去除HPV-33基因产物(E39A和I73A)的酶功能。
然后HPV-33degE2*序列与编码狂犬病毒(ERA株，Genbank n°M38452)糖蛋白的信号和膜锚定肽的核苷酸序列融合。这通过三重PCR使用引物OTG18962(SEQ ID NO：51)，OTG18963(SEQ ID NO：52)，OTG18964(SEQID NO：53)，OTG18965(SEQ ID NO：54)，OTG18966(SEQ ID NO：55)和OTG18967(SEQ ID NO：56)进行。产生的编码SS-33degE2*-TMR多肽的片段(SEQ ID NO：35)被克隆到MVA转移载体在p7.5K启动子控制之下，如上所述生成病毒颗粒。
实施例9：构建表达HPV-52E2基因的重组MVA载体
经Geneart(Regensburg，Germany)合成编码HPV-52E2多肽的合成基因。设计合成序列以(i)减少与HPV-16，HPV-18和HPV-33的E2基因的同源性百分比至小于75％(若可能同源性部分减少到小于6个连续核苷酸)和(ii)导入突变去除HPV-52基因产物(E39A和I73A)的酶功能。
然后采用三重PCR使用引物OTG18968(SEQ ID NO：57)，OTG18969(SEQ ID NO：58)，OTG18970(SEQ ID NO：59)，OTG18971(SEQ ID NO：60)，OTG18972(SEQ ID NO：61)和OTG18973(SEQ ID NO：62)将合成的HPV-52E2*deg序列与编码麻疹病毒F蛋白的信号和膜锚定肽的核苷酸序列融合(产生SS-52E2*deg-TMF)。
产生的编码SS-52E2*deg-TMF多肽的片段(SEQ ID NO：37)被***MVA转移质粒的p7.5K启动子下游，如上所述生成病毒颗粒。
实施例10：构建表达HPV-16，HPV-18，HPV-33和HPV-52E2基因的多价重组MVA载体
编码膜呈递和酶缺陷HPV-18E2多肽(分离自pTG17552)的pH5R-SS-18E2*-TMR盒，编码膜呈递和酶缺陷HPV-33E2多肽的p7.5K-SS-33degE2*-TMR盒和编码膜呈递和酶缺陷HPV-52E2多肽的p7.5K-SS-52degE2*-TMF盒被导入pTG17408(含pH5R-SS-16E2*-TMR盒)，如上所述生成病毒颗粒。
实施例11：评价重组MVA构建体治疗功效的动物模型
CRPV模式仅仅是实验室模型，其中病毒诱导的***状瘤持续，尽管具有免疫活性能力，在选择宿主压力下进化为浸润性转移性鳞状细胞癌(Brandsma，1994，Intervirology 37，189-190and Brandsma，1996，Animalmodels for human papillomavirus development，p.69-78.In C.Lacey(ed.)，Papillomavirus reviews：current research on papillomaviruses.Leeds UniversityPress，Leeds，United Kingdom)。在这个模型中可检测MVA表达E2以评价它们关于持续性***瘤病毒的治疗效力。但是，由于缺少HPV和CRPV抗原之间的交叉保护，使用CRPV抗原(在Genbank登记号NC 001541揭示)代替它们的HPV-16对应物产生重组的CRPV特异性MVA构建体。更特异地，构建如下重组MVA：MVATG17535，包含***缺失III的表达盒，其包含置于pH5R启动子控制之下的与麻疹病毒F糖蛋白(SR-CRPVE2-TMF)的信号和膜锚定肽融合的编码CRPV E2多肽(ref序列)的核苷酸序列；MVATG17534，包含***缺失III的表达盒，其包含置于p7.5K启动子控制之下的与狂犬病毒糖蛋白(SR-CRPVE1-TMR)的信号和膜锚定肽融合的编码CRPV E1多肽(ref序列)的核苷酸序列；和MVATG17562，包含***缺失III的CRPV E2(pH5R-SR-CRPVE2-TMF)和CRPV E1(p7.5K-SR-CRPVE1-TMR)表达盒。
用Helios基因枪***(Biorad)使用颗粒介导的DNA转移在第1天用CRPV DNA接种新西兰雌白兔。按厂商指示将1.6μm金颗粒包被病毒DNA并在兔背部的3个部位每个部位施用0.1μg和在另3个部位每个部位施用0.5μg。在2，9和16天，候选的CRPV重组MVA在兔背部经皮内途径注射。每周监测疣的发展共8-12周。
在实验结束时，处死兔，切割冷冻已被注射CRPV DNA且无***状瘤存在的表皮部位。抽提DNA并经PCR分析CRPV DNA的存在，确定是否MVA免疫诱导了病毒清除。
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Met Glu Thr Leu Cys Gln Arg Leu Asn Val Cys Gln Asp Lys Ile Leu
1               5                   10                  15
Thr His Tyr Glu Asn Asp Ser Thr Asp Leu Arg Asp His Ile Asp Tyr
            20                  25                  30
Trp Lys His Met Arg Leu Glu Cys Ala Ile Tyr Tyr Lys Ala Arg Glu
        35                  40                  45
Met Gly Phe Lys His Ile Asn His Gln Val Val Pro Thr Leu Ala Val
    50                  55                  60
Ser Lys Asn Lys Ala Leu Gln Ala Ile Glu Leu Gln Leu Thr Leu Glu
65                  70                  75                  80
Thr Ile Tyr Asn Ser Gln Tyr Ser Asn Glu Lys Trp Thr Leu Gln Asp
                85                  90                  95
Val Ser Leu Glu Val Tyr Leu Thr Ala Pro Thr Gly Cys Ile Lys Lys
            100                 105                 110
His Gly Tyr Thr Val Glu Val Gln Phe Asp Gly Asp Ile Cys Asn Thr
        115                 120                 125
Met His Tyr Thr Asn Trp Thr His Ile Tyr Ile Cys Glu Glu Ala Ser
    130                 135                 140
Val Thr Val Val Glu Gly Gln Val Asp Tyr Tyr Gly Leu Tyr Tyr Val
145                 150                 155                 160
His Glu Gly Ile Arg Thr Tyr Phe Val Gln Phe Lys Asp Asp Ala Glu
                165                 170                 175
Lys Tyr Ser Lys Asn Lys Val Trp Glu Val His Ala Gly Gly Gln Val
            180                 185                 190
Ile Leu Cys Pro Thr Ser Val Phe Ser Ser Asn Glu Val Ser Ser Pro
        195                 200                 205
Glu Ile Ile Arg Gln His Leu Ala Asn His Pro Ala Ala Thr His Thr
    210                 215                 220
Lys Ala Val Ala Leu Gly Thr Glu Glu Thr Gln Thr Thr Ile Gln Arg
225                 230                 235                 240
Pro Arg Ser Glu Pro Asp Thr Gly Asn Pro Cys His Thr Thr Lys Leu
                245                 250                 255
Leu His Arg Asp Ser Val Asp Ser Ala Pro Ile Leu Thr Ala Phe Asn
            260                 265                 270
Ser Ser His Lys Gly Arg Ile Asn Cys Asn Ser Asn Thr Thr Pro Ile
        275                 280                 285
Val His Leu Lys Gly Asp Ala Asn Thr Leu Lys Cys Leu Arg Tyr Arg
    290                 295                 300
Phe Lys Lys His Cys Thr Leu Tyr Thr Ala Val Ser Ser Thr Trp His
305                 310                 315                 320
Trp Thr Gly His Asn Val Lys His Lys Ser Ala Ile Val Thr Leu Thr
                325                 330                 335
Tyr Asp Ser Glu Trp Gln Arg Asp Gln Phe Leu Ser Gln Val Lys Ile
            340                 345                 350
Pro Lys Thr Ile Thr Val Ser Thr Gly Phe Met Ser Ile
        355                 360                 365
<210>2
<211>453
<212>PRT
<213>artificial sequence
<220>
<223>membrane presented and defective HPV-16E2 variant
<400>2
Met Val Pro Gln Ala Leu Leu Leu Val Pro Leu Leu Gly Phe Ser Leu
1               5                   10                  15
Cys Phe Gly Lys Phe Pro Ile Glu Thr Leu Cys Gln Arg Leu Asn Val
            20                  25                  30
Cys Gln Asp Lys Ile Leu Thr His Tyr Glu Asn Asp Ser Thr Asp Leu
        35                  40                  45
Arg Asp His Ile Asp Tyr Trp Lys His Met Arg Leu Ala Cys Ala Ile
    505                  5                  60
Tyr Tyr Lys Ala Arg Glu Met Gly Phe Lys His Ile Asn His Gln Val
65                  70                  75                  80
Val Pro Thr Leu Ala Val Ser Lys Asn Lys Ala Leu Gln Ala Ala Glu
                85                  90                  95
Leu Gln Leu Thr Leu Glu Thr Ile Tyr Asn Ser Gln Tyr Ser Asn Glu
            100                 105                 110
Lys Trp Thr Leu Gln Asp Val Ser Leu Glu Val Tyr Leu Thr Ala Pro
        115                 120                 125
Thr Gly Cys Ile Lys Lys His Gly Tyr Thr Val Glu Val Gln Phe Asp
    130                 135                 140
Gly Asp Ile Cys Asn Thr Met His Tyr Thr Asn Trp Thr His Ile Tyr
145                 150                 155                 160
Ile Cys Glu Glu Ala Ser Val Thr Val Val Glu Gly Gln Val Asp Tyr
                165                 170                 175
Tyr Gly Leu Tyr Tyr Val His Glu Gly Ile Arg Thr Tyr Phe Val Gln
            180                 185                 190
Phe Lys Asp Asp Ala Glu Lys Tyr Ser Lys Asn Lys Val Trp Glu Val
        195                 200                 205
His Ala Gly Gly Gln Val Ile Leu Cys Pro Thr Ser Val Phe Ser Ser
    210                 215                 220
Asn Glu Val Ser Ser Pro Glu Ile Ile Arg Gln His Leu Ala Asn His
225                 230                 235                 240
Pro Ala Ala Thr His Thr Lys Ala Val Ala Leu Gly Thr Glu Glu Thr
                245                 250                 255
Gln Thr Thr Ile Gln Arg Pro Arg Ser Glu Pro Asp Thr Gly Asn Pro
            26                 026                 5270
Cys His Thr Thr Lys Leu Leu His Arg Asp Ser Val Asp Ser Ala Pro
        275                 280                 285
Ile Leu Thr Ala Phe Asn Ser Ser His Lys Gly Arg Ile Asn Cys Asn
    290                 295                 300
Ser Asn Thr Thr Pro Ile Val His Leu Lys Gly Asp Ala Asn Thr Leu
305                 310                 315                 320
Lys Cys Leu Arg Tyr Arg Phe Lys Lys His Cys Thr Leu Tyr Thr Ala
                325                 330                 335
Val Ser Ser Thr Trp His Trp Thr Gly His Asn Val Lys His Lys Ser
            340                 345                 350
Ala Ile Val Thr Leu Thr Tyr Asp Ser Glu Trp Gln Arg Asp Gln Phe
        355                 360                 365
Leu Ser Gln Val Lys Ile Pro Lys Thr Ile Thr Val Ser Thr Gly Phe
    370                 375                 380
Met Ser Ile Tyr Val Leu Leu Ser Ala Gly Thr Leu Ile Ala Leu Met
385                 390                 395                 400
Leu Ile Ile Phe Leu Ile Thr Cys Cys Lys Arg Val Asp Arg Pro Glu
                405                 410                 415
Ser Thr Gln Arg Ser Leu Arg Gly Thr Gly Arg Asn Val Ser Val Thr
            420                 425                 430
Ser Gln Ser Gly Lys Phe Ile Ser Ser Trp Glu Ser His Lys Ser Gly
        435                 440                 445
Gly Glu Thr Arg Leu
    450
<210>3
<211>737
<212>PRT
<213>artificial sequence
<220>
<223>membrane-presented and replication-defective HPV-16E1
     variant
<400>3
Met Val Pro Gln Ala Leu Leu Phe Val Pro Leu Leu Val Phe Pro Leu
1               5                   10                  15
Cys Phe Gly Lys Phe Pro Ile Ala Asp Pro Ala Gly Thr Asn Gly Glu
            20                  25                  30
Glu Gly Thr Gly Cys Asn Gly Trp Phe Tyr Val Glu Ala Val Val Glu
        35                  40                  45
Lys Lys Thr Gly Asp Ala Ile Ser Asp Asp Glu Asn Glu Asn Asp Ser
    50                  55                  60
Asp Thr Gly Glu Asp Leu Val Asp Phe Ile Val Asn Asp Asn Asp Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Thr Gln Ala Glu Thr Glu Thr Ala His Ala Leu Phe Thr Ala Gln
                85                  90                  95
Glu Ala Lys Gln His Arg Asp Ala Val Gln Val Leu Lys Arg Lys Tyr
            100                 105                 110
Leu Gly Ser Pro Leu Ser Asp Ile Ser Gly Cys Val Asp Asn Asn Ile
        115                 120                 125
Ser Pro Arg Leu Lys Ala Ile Cys Ile Glu Lys Gln Ser Arg Ala Ala
    130                 135                 140
Lys Arg Arg Leu Phe Glu Ser Glu Asp Ser Gly Tyr Gly Asn Thr Glu
145                 150                 155                 160
Val Glu Thr Gln Gln Met Leu Gln Val Glu Gly Arg His Glu Thr Glu
                165                 170                 175
Thr Pro Cys Ser Gln Tyr Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Cys Ser Gln
            180                 185                 190
Tyr Ser Ser Gly Ser Gly Gly Glu Gly Val Ser Glu Arg His Thr Ile
        195                 200                 205
Cys Gln Thr Pro Leu Thr Asn Ile Leu Asn Val Leu Lys Thr Ser Asn
    210                 215                 220
Ala Lys Ala Ala Met Leu Ala Lys Phe Lys Glu Leu Tyr Gly Val Ser
225                 230                 235                 240
Phe Ser Glu Leu Val Arg Pro Phe Lys Ser Asn Lys Ser Thr Cys Cys
                245                 250                 255
Asp Trp Cys Ile Ala Ala Phe Gly Leu Thr Pro Ser Ile Ala Asp Ser
            260                 265                 270
Ile Lys Thr Leu Leu Gln Gln Tyr Cys Leu Tyr Leu His Ile Gln Ser
        275                 280                 285
Leu Ala Cys Ser Trp Gly Met Val Val Leu Leu Leu Val Arg Tyr Lys
    290                 295                 300
Cys Gly Lys Asn Arg Glu Thr Ile Glu Lys Leu Leu Ser Lys Leu Leu
305                 310                 315                 320
Cys Val Ser Pro Met Cys Met Met Ile Glu Pro Pro Lys Leu Arg Ser
                325                 330                 335
Thr Ala Ala Ala Leu Tyr Trp Tyr Lys Thr Gly Ile Ser Asn Ile Ser
            340                 345                 350
Glu Val Tyr Gly Asp Thr Pro Glu Trp Ile Gln Arg Gln Thr Val Leu
        355                 360                 365
Gln His Ser Phe Asn Asp Cys Thr Phe Glu Leu Ser Gln Met Val Gln
    370                 375                 380
Trp Ala Tyr Asp Asn Asp Ile Val Asp Asp Ser Glu Ile Ala Tyr Lys
385                 390                 395                 400
Tyr Ala Gln Leu Ala Asp Thr Asn Ser Asn Ala Ser Ala Phe Leu Lys
                405                 410                 415
Ser Asn Ser Gln Ala Lys Ile Val Lys Asp Cys Ala Thr Met Cys Arg
            420                 425                 430
His Tyr Lys Arg Ala Glu Lys Lys Gln Met Ser Met Ser Gln Trp Ile
        435                 440                 445
Lys Tyr Arg Cys Asp Arg Val Asp Asp Gly Gly Asp Trp Lys Gln Ile
    450                 455                 460
Val Met Phe Leu Arg Tyr Gln Gly Val Glu Phe Met Ser Phe Leu Thr
465                 470                 475                 480
Ala Leu Lys Arg Phe Leu Gln Gly Ile Pro Lys Lys Asn Cys Ile Leu
                485                 490                 495
Leu Tyr Gly Ala Ala Asn Thr Asp Lys Ser Leu Phe Gly Met Ser Leu
            500                 505                 510
Met Lys Phe Leu Gln Gly Ser Val Ile Cys Phe Val Asn Ser Lys Ser
        515                 520                 525
His Phe Trp Leu Gln Pro Leu Ala Asp Ala Lys Ile Gly Met Leu Asp
    530                 535                 540
Asp Ala Thr Val Pro Cys Trp Asn Tyr Ile Asp Asp Asn Leu Arg Asn
545                 550                 555                 560
Ala Leu Asp Gly Asn Leu Val Ser Met Asp Val Lys His Arg Pro Leu
                565                 570                 575
Val Gln Leu Lys Cys Pro Pro Leu Leu Ile Thr Ser Asn Ile Asn Ala
            580                 585                 590
Gly Thr Asp Ser Arg Trp Pro Tyr Leu His Asn Arg Leu Val Val Phe
        595                 600                 605
Thr Phe Pro Asn Glu Phe Pro Phe Asp Glu Asn Gly Asn Pro Val Tyr
    610                 615                 620
Glu Leu Asn Asp Lys Asn Trp Lys Ser Phe Phe Ser Arg Thr Trp Ser
625                 630                 635                 640
Arg Leu Ser Leu His Glu Asp Glu Asp Lys Glu Asn Asp Gly Asp Ser
                645                 650                 655
Leu Pro Thr Phe Lys Cys Val Ser Gly Gln Asn Thr Asn Thr Leu Tyr
            660                 665                 670
Val Leu Leu Ser Ala Gly Thr Leu Ile Ala Leu Met Leu Ile Ile Phe
        675                 680                 685
Leu Ile Thr Cys Cys Lys Arg Val Asp Arg Pro Glu Ser Thr Gln Arg
    690                 695                 700
Ser Leu Arg Gly Thr Gly Arg Asn Val Ser Val Thr Ser Gln Ser Gly
705                 710                 715                 720
Lys Phe Ile Ser Ser Trp Glu Ser His Lys Ser Gly Gly Glu Thr Arg
                725                 730                 735
Leu
<210>4
<211>243
<212>PRT
<213>artificial sequence
<220>
<223>membrane-presented and non oncogenic HPV-16E6variant
<400>4
Met Gly Leu Lys Val Asn Val Ser Ala Ile Phe Met Ala Val Leu Leu
1               5                   10                  15
Thr Leu Gln Thr Pro Thr Gly Gln Ile His Trp Gly Met His Gln Lys
            20                  25                  30
Arg Thr Ala Met Phe Gln Asp Pro Gln Glu Arg Pro Arg Lys Leu Pro
        35                  40                  45
Gln Leu Cys Thr Glu Leu Gln Thr Thr Ile His Asp Ile Ile Leu Glu
    50                  55                  60
Cys Val Tyr Cys Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg Glu Val Tyr Asp Phe
65                  70                  75                  80
Ala Phe Arg Asp Leu Cys Ile Val Tyr Arg Asp Gly Asn Pro Tyr Ala
                85                  90                  95
Val Cys Asp Lys Cys Leu Lys Phe Tyr Ser Lys Ile Ser Glu Tyr Arg
            100                 105                 110
His Tyr Cys Tyr Ser Leu Tyr Gly Thr Thr Leu Glu Gln Gln Tyr Asn
        115                 120                 125
Lys Pro Leu Cys Asp Leu Leu Ile Arg Cys Ile Asn Cys Gln Lys Pro
    130                 135                 140
Leu Gln Arg His Leu Asp Lys Lys Gln Arg Phe His Asn Ile Arg Gly
145                 150                 155                 160
Arg Trp Thr Gly Arg Cys Met Ser Cys Cys Arg Ser Ser Arg Thr Arg
                165                 170                 175
Arg Glu Thr Gln Leu Gly Leu Ser Ser Thr Ser Ile Val Tyr Ile Leu
            180                 185                 190
Ile Ala Val Cys Leu Gly Gly Leu Ile Gly Ile Pro Ala Leu Ile Cys
        195                 200                 205
Cys Cys Arg Gly Arg Cys Asn Lys Lys Gly Glu Gln Val Gly Met Ser
    210                 215                 220
Arg Pro Gly Leu Lys Pro Asp Leu Thr Gly Thr Ser Lys Ser Tyr Val
225                 230                 235                 240
Arg Ser Leu
<210>5
<211>185
<212>PRT
<213>artificial sequence
<220>
<223>membrane-presented and non oncogenic HPV-16E7variant
<400>5
Met Val Pro Gln Ala Leu Leu Phe Val Pro Leu Leu Val Phe Pro Leu
1               5                   10                  15
Cys Phe Gly Lys Phe Pro Ile Gly Ser Met His Gly Asp Thr Pro Thr
            20                  25                  30
Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln Pro Glu Thr Thr Gln Leu Asn
        35                  40                  45
Asp Ser Ser Glu Glu Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala
    50                  55                  60
Glu Pro Asp Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys
65                  70                  75                  80
Asp Ser Thr Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val Asp Ile Arg
                85                  90                  95
Thr Leu Glu Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro Ile
            100                 105                 110
Cys Ser Gln Lys Pro Arg Ser Tyr Val Leu Leu Ser Ala Gly Ala Leu
        115                 120                 125
Thr Ala Leu Met Leu Ile Ile Phe Leu Met Thr Cys Cys Arg Arg Val
    130                 135                 140
Asn Arg Ser Glu Pro Thr Gln His Asn Leu Arg Gly Thr Gly Arg Glu
145                 150                 155                 160
Val Ser Val Thr Pro Gln Ser Gly Lys Ile Ile Ser Ser Trp Glu Ser
                165                 170                 175
His Lys Ser Gly Gly Glu Thr Arg Leu
            180                 185
<210>6
<211>59
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>portionof 59nt of HPV-16E1-encoding sequence degenerated
     to decrease homology with the overlapping HPV-16
     E2-encoding sequence
<400>6
atggtgattc attacctaca ttcaagtgcg tatctggtca gaacacaaat actttgtga       59
<210>7
<211>2214
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>sequence encoding a membrane-addressed and defective
     HPV-16E1polypeptide which includes the 59nt degenerated
     sequence
<400>7
atggtaccgc aagccctgct attcgtacct ttattggtct ttcccctctg tttcggtaag    60
tttcctatag ctgatcctgc aggtaccaat ggggaagagg gtacgggatg taatggatgg    120
ttttatgtag aggctgtagt ggaaaaaaaa acaggggatg ctatatcaga tgacgagaac    180
gaaaatgaca gtgatacagg tgaagatttg gtagatttta tagtaaatga taatgattat    240
ttaacacagg cagaaacaga gacagcacat gcgttgttta ctgcacagga agcaaaacaa    300
catagagatg cagtacaggt tctaaaacga aagtatttgg gtagtccact tagtgatatt    360
agtggatgtg tagacaataa tattagtcct agattaaaag ctatatgtat agaaaaacaa    420
agtagagctg caaaaaggag attatttgaa agcgaagaca gcgggtatgg caatactgaa    480
gtggaaactc agcagatgtt acaggtagaa gggcgccatg agactgaaac accatgtagt    540
cagtatagtg gtggaagtgg gggtggttgc agtcagtaca gtagtggaag tgggggagag    600
ggtgttagtg aaagacacac tatatgccaa acaccactta caaatatttt aaatgtacta    660
aaaactagta atgcaaaggc agcaatgtta gcaaaattta aagagttata cggggtgagt    720
ttttcagaat tagtaagacc atttaaaagt aataaatcaa cgtgttgcga ttggtgtatt    780
gctgcatttg gacttacacc cagtatagct gacagtataa aaacactatt acaacaatat    840
tgtttatatt tacacattca aagtttagca tgttcatggg gaatggttgt gttactatta    900
gtaagatata aatgtggaaa aaatagagaa acaattgaaa aattgctgtc taaactatta    960
tgtgtgtctc caatgtgtat gatgatagag cctccaaaat tgcgtagtac agcagcagca    1020
ttatattggt ataaaacagg tatatcaaat attagtgaag tgtatggaga cacgccagaa    1080
tggatacaaa gacaaacagt attacaacat agttttaatg attgtacatt tgaattatca    1140
cagatggtac aatgggccta cgataatgac atagtagacg atagtgaaat tgcatataaa    1200
tatgcacaat tggcagacac taatagtaat gcaagtgcct ttctaaaaag taattcacag    1260
gcaaaaattg taaaggattg tgcaacaatg tgtagacatt ataaacgagc agaaaaaaaa    1320
caaatgagta tgagtcaatg gataaaatat agatgtgata gggtagatga tggaggtgat    1380
tggaagcaaa ttgttatgtt tttaaggtat caaggtgtag agtttatgtc atttttaact    1440
gcattaaaaa gatttttgca aggcatacct aaaaaaaatt gcatattact atatggtgca    1500
gctaacacag ataaatcatt atttggtatg agtttaatga aatttctgca agggtctgta    1560
atatgttttg taaattctaa aagccatttt tggttacaac cattagcaga tgccaaaata    1620
ggtatgttag atgatgctac agtgccctgt tggaactata tagatgacaa tttaagaaat    1680
gcattggatg gaaatttagt ttctatggat gtaaagcata gaccattggt acaactaaaa    1740
tgccctccat tattaattac atctaacatt aatgctggta cagattctag gtggccttat    1800
ttacataata gattggtggt gtttacattt cctaatgagt ttccatttga cgaaaacgga    1860
aatccagtgt atgagcttaa tgataagaac tggaaatcct ttttctcaag gacgtggtcc    1920
agattaagtt tgcacgagga cgaggacaag gaaaacgatg gtgattcatt acctacattc    1980
aagtgcgtat ctggtcagaa cacaaatact ttgtacgtac tgctatcggc aggcacgttg    2040
atcgcactaa tgcttatcat cttcctaata acctgctgca agcgggttga taggcccgaa    2100
agtacccaaa ggtccttgag aggtaccgga cgcaacgtat cggtaacgtc gcaaagcggc    2160
aagttcatta gcagttggga gtcgcacaaa tcaggtggag agacccgcct gtga          2214
<210>8
<211>1362
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>nt sequence encoding the membrane-addressed and defective
     HPV-16E2polypeptide
<400>8
atggtaccac aagcgctgtt acttgtccca ctgcttggtt tctctttatg ttttggaaaa    60
ttcccaatag agactctttg ccaacgttta aatgtgtgtc aggacaaaat actaacacat    120
tatgaaaatg atagtacaga cctacgtgac catatagact attggaaaca catgcgccta    180
gcatgtgcta tttattacaa ggccagagaa atgggattta aacatattaa ccaccaggtg    240
gtgccaacgc tggctgtatc aaagaataaa gcattacaag cagctgaact gcaactaacg    300
ttagaaacaa tatataactc acaatatagt aatgaaaagt ggacattaca agacgttagc    360
cttgaagtgt atttaactgc accaacagga tgtataaaaa aacatggata tacagtggaa    420
gtgcagtttg atggagacat atgcaataca atgcattata caaactggac acatatatat    480
atttgtgaag aagcatcagt aactgtggta gagggtcaag ttgactatta tggtttatat    540
tatgttcatg aaggaatacg aacatatttt gtgcagttta aagatgatgc agaaaaatat    600
agtaaaaata aagtatggga agttcatgcg ggtggtcagg taatattatg tcctacatct    660
gtgtttagca gcaacgaagt atcctctcct gaaattatta ggcagcactt ggccaaccac    720
cccgccgcga cccataccaa agccgtcgcc ttgggcaccg aagaaacaca gacgactatc    780
cagcgaccaa gatcagagcc agacaccgga aacccctgcc acaccactaa gttgttgcac    840
agagactcag tggacagtgc tccaatcctc actgcattta acagctcaca caaaggacgg    900
attaactgta atagtaacac tacacccata gtacatttaa aaggtgatgc taatacttta    960
aaatgtttaa gatatagatt taaaaagcat tgtacattgt atactgcagt gtcgtctaca    1020
tggcattgga caggacataa tgtaaaacat aaaagtgcaa ttgttacact tacatatgat    1080
agtgaatggc aacgtgacca atttttgtct caagttaaaa taccaaaaac tattacagtg    1140
tctactggat ttatgtctat atatgttctt ctctctgctg gaactttaat agctttaatg    1200
ttaataatat tcttaataac gtgctgtaaa agggtagacc gtccagagtc aactcagcgc    1260
agccttaggg gtactgggag aaatgtttcc gtgacatcac agagtggaaa atttatctcg    1320
tcttgggaat ctcataagag tggaggcgaa acacgtcttt ga                         1362
<210>9
<211>34
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>sens primer
<400>9
aaacccggat ccatggagac tctttgccaa cgtt                                  34
<210>10
<211>49
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>antisense primer
<400>10
aaacccgaat tcaagcttag atcttcatat agacataaat ccagtagac                  49
<210>11
<211>33
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>sens primer
<400>11
aaacccggat ccatggtacc acaagcgctg tta                                   33
<210>12
<211>53
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>sens primer
<400>12
tctctttatg ttttggaaaa ttcccaatag agactctttg ccaacgttta aat             53
<210>13
<211>53
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>antisense primer
<400>13
atttaaacgt tggcaaagag tctctattgg gaattttcca aaacataaag aga             53
<210>14
<211>49
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>sens primer
<400>14
cagtgtctac tggatttatg tctatatatg ttcttctctc tgctggaac                   49
<210>15
<211>49
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>antisense primer
<400>15
gttccagcag agagaagaac atatatagac ataaatccag tagacactg                   49
<210>16
<211>44
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>sens primer
<400>16
aaacccagat cttcaaagac gtgtttcgcc tccactctta tgag                        44
<210>17
<211>34
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>sens primer
<400>17
aaacccggat ccatggctga tcctgcaggt acca                                   34
<210>18
<211>34
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>antisense primer
<400>18
aaacccgaat tccattatcg taggcccatt gtac                                   34
<210>19
<211>32
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>sens primer
<400>19
aaacccggat ccgagacacg ccagaatgga ta                                     32
<210>20
<211>50
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>antisense primer
<400>20
aaacccgaat tcaagcttag atcttcataa tgtgttagta ttttgtcctg                  50
<210>21
<211>88
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>antisense primer
<400>21
aaacccagat cttcacaaag tatttgtgtt ctgaccagat acgcacttga atgtaggtaa       60
tgaatcacca tcgttttcct tgtcctcg                                          88
<210>22
<211>21
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>sens primer
<400>22
gatgctacag tgccctgttg g                                                 21
<210>23
<211>35
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>sens primer
<400>23
aaacccaagg atccatggta ccgcaagccc tgcta                                  35
<210>24
<211>52
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>sens primer
<400>24
ttcccctctg tttcggtaag tttcctatag ctgatcctgc aggtaccaat gg               52
<210>25
<211>52
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>antisens primer
<400>25
ccattggtac ctgcaggatc agctatagga aacttaccga  aacagagggg  aa             52
<210>26
<211>50
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>sens primer
<400>26
tatctggtca gaacacaaat actttgtacg tactgctatc ggcaggcacg                  50
<210>27
<211>50
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>antisense primer
<400>27
cgtgcctgcc gatagcagta cgtacaaagt atttgtgttc tgaccagata                  50
<210>28
<211>42
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>antisens primer
<400>28
aaacccaaag atcttcacag gcgggtctct ccacctgatt tg                          42
<210>29
<211>453
<212>PRT
<213>artificial sequence
<220>
<223>HPV-18membrane-presented and replication-defective E2
     polypeptide(SS-18E2＊-TMR)
<400>29
Met Val Pro Gln Ala Leu Leu Phe Val Pro Leu Leu Val Phe Pro Leu
1               5                   10                  15
Cys Phe Gly Lys Phe Pro Ile Gln Thr Pro Lys Glu Thr Leu Ser Glu
            20                  25                  30
Arg Leu Ser Cys Val Gln Asp Lys Ile Ile Asp His Tyr Glu Asn Asp
        35                  40                  45
Ser Lys Asp Ile Asp Ser Gln Ile Gln Tyr Trp Gln Leu Ile Arg Trp
    50                  55                  60
Ala Asn Ala Ile Phe Phe Ala Ala Arg Glu His Gly Ile Gln Thr Leu
65                  70                  75                  80
Asn His Gln Val Val Pro Ala Tyr Asn Ile Ser Lys Ser Lys Ala His
                85                  90                  95
Lys Ala Ala Glu Leu Gln Met Ala Leu Gln Gly Leu Ala Gln Ser Arg
            100                 105                 110
Tyr Lys Thr Glu Asp Trp Thr Leu Gln Asp Thr Cys Glu Glu Leu Trp
        115                 120                 125
Asn Thr Glu Pro Thr His Cys Phe Lys Lys Gly Gly Gln Thr Val Gln
    130                 135                 140
Val Tyr Phe Asp Gly Asn Lys Asp Asn Cys Met Thr Tyr Val Ala Trp
145                 150                 155                 160
Asp Ser Val Tyr Tyr Met Thr Asp Ala Gly Thr Trp Asp Lys Thr Ala
                165                 170                 175
Thr Cys Val Ser His Arg Gly Leu Tyr Tyr Val Lys Glu Gly Tyr Asn
            180                 185                 190
Thr Phe Tyr Ile Glu Phe Lys Ser Glu Cys Glu Lys Tyr Gly Asn Thr
        195                 200                 205
Gly Thr Trp Glu Val His Phe Gly Asn Asn Val Ile Asp Cys Asn Asp
    210                 215                 220
Ser Met Cys Ser Thr Ser Asp Asp Thr Val Ser Ala Thr Gln Leu Val
225                 230                 235                 240
Lys Gln Leu Gln His Thr Pro Ser Pro Tyr Ser Ser Thr Val Ser Val
                245                 250                 255
Gly Thr Ala Lys Thr Tyr Gly Gln Thr Ser Ala Ala Thr Arg Pro Gly
            260                 265                 270
His Cys Gly Leu Ala Glu Lys Gln His Cys Gly Pro Val Asn Pro Leu
        275                 280                 285
Leu Gly Ala Ala Thr Pro Thr Gly Asn Asn Lys Arg Arg Lys Leu Cys
    290                 295                 300
Ser Gly Asn Thr Thr Pro Ile Ile His Leu Lys Gly Asp Arg Asn Ser
305                 310                 315                 320
Leu Lys Cys Leu Arg Tyr Arg Leu Arg Lys His Ser Asp His Tyr Arg
                325                 330                 335
Asp Ile Ser Ser Thr Trp His Trp Thr Gly Ala Gly Asn Glu Lys Thr
            340                 345                 350
Gly Ile Leu Thr Val Thr Tyr His Ser Glu Thr Gln Arg Thr Lys Phe
        355                 360                 365
Leu Asn Thr Val Ala Ile Pro Asp Ser Val Gln Ile Leu Val Gly Tyr
    370                 375                 380
Met Thr Met Tyr Val Leu Leu Ser Ala Gly Ala Leu Thr Ala Leu Met
385                 390                 395                 400
Leu Ile Ile Phe Leu Met Thr Cys Cys Arg Arg Val Asn Arg Ser Glu
                405                 410                 415
Pro Thr Gln His Asn Leu Arg Gly Thr Gly Arg Glu Val Ser Val Thr
            420                 425                 430
Pro Gln Ser Gly Lys Ile Ile Ser Ser Trp Glu Ser His Lys Ser Gly
        435                 440                 445
Gly Glu Thr Arg Leu
    450
<210>30
<211>441
<212>PRT
<213>artificial sequence
<220>
<223>HPV-33membrane-presented and replication-defective E2
     polypeptide(SS-33E2＊-TMR)
<400>30
Met Val Pro Gln Ala Leu Leu Phe Val Pro Leu Leu Val Phe Pro Leu
1               5                   10                  15
Cys Phe Gly Lys Phe Pro Ile Glu Glu Ile Ser Ala Arg Leu Asn Ala
            20                  25                  30
Val Gln Glu Lys Ile Leu Asp Leu Tyr Glu Ala Asp Lys Thr Asp Leu
        35                  40                  45
Pro Ser Gln Ile Glu His Trp Lys Leu Ile Arg Met Ala Cys Ala Leu
    50                  55                  60
Leu Tyr Thr Ala Lys Gln Met Gly Phe Ser His Leu Cys His Gln Val
65                  70                  75                  80
Val Pro Ser Leu Leu Ala Ser Lys Thr Lys Ala Phe Gln Val Ala Glu
                85                  90                  95
Leu Gln Met Ala Leu Glu Thr Leu Ser Lys Ser Gln Tyr Ser Thr Ser
            100                 105                 110
Gln Trp Thr Leu Gln Gln Thr Ser Leu Glu Val Trp Leu Cys Glu Pro
        115                 120                 125
Pro Lys Cys Phe Lys Lys Gln Gly Glu Thr Val Thr Val Gln Tyr Asp
    130                 135                 140
Asn Asp Lys Lys Asn Thr Met Asp Tyr Thr Asn Trp Gly Glu Ile Tyr
145                 150                 155                 160
Ile Ile Glu Glu Asp Thr Cys Thr Met Val Thr Gly Lys Val Asp Tyr
                165                 170                 175
Ile Gly Met Tyr Tyr Ile His Asn Cys Glu Lys Val Tyr Phe Lys Tyr
            180                 185                 190
Phe Lys Glu Asp Ala Ala Lys Tyr Ser Lys Thr Gln Met Trp Glu Val
        195                 200                 205
His Val Gly Gly Gln Val Ile Val Cys Pro Thr Ser Ile Ser Ser Asn
    210                 215                 220
Gln Ile Ser Thr Thr Glu Thr Ala Asp Ile Gln Thr Asp Asn Asp Asn
225                 230                 235                 240
Arg Pro Pro Gln Ala Ala Ala Lys Arg Arg Arg Pro Ala Asp Thr Thr
                245                 250                 255
Asp Thr Ala Gln Pro Leu Thr Lys Leu Phe Cys Ala Asp Pro Ala Leu
            260                 265                 270
Asp Asn Arg Thr Ala Arg Thr Ala Thr Asn Cys Thr Asn Lys Gln Arg
        275                 280                 285
Thr Val Cys Ser Ser Asn Val Ala Pro Ile Val His Leu Lys Gly Glu
    290                 295                 300
Ser Asn Ser Leu Lys Cys Leu Arg Tyr Arg Leu Lys Pro Tyr Lys Glu
305                 310                 315                 320
Leu Tyr Ser Ser Met Ser Ser Thr Trp His Trp Thr Ser Asp Asn Lys
                325                 330                 335
Asn Ser Lys Asn Gly Ile Val Thr Val Thr Phe Val Thr Glu Gln Gln
            340                 345                 350
Gln Gln Met Phe Leu Gly Thr Val Lys Ile Pro Pro Thr Val Gln Ile
        355                 360                 365
Ser Thr Gly Phe Met Thr Leu Tyr Val Leu Leu Ser Ala Gly Thr Leu
    370                 375                 380
Ile Ala Leu Met Leu Ile Ile Phe Leu Ile Thr Cys Cys Lys Arg Val
385                 390                 395                 400
Asp Arg Pro Glu Ser Thr Gln Arg Ser Leu Arg Gly Thr Gly Arg Asn
                405                 410                 415
Val Ser Val Thr Ser Gln Ser Gly Lys Phe Ile Ser Ser Trp Glu Ser
            420                 425                 430
His Lys Ser Gly Gly Glu Thr Arg Leu
        435                 440
<210>31
<211>457
<212>PRT
<213>artificial sequence
<220>
<223>HPV-52membrane-presented and replication-defective E2
     polypeptide
<400>31
Met Gly Leu Lys Val Asn Val Ser Ala Ile Phe Met Ala Val Leu Leu
1               5                   10                  15
Thr Leu Gln Thr Pro Thr Gly Gln Ile His Trp Gly Glu Ser Ile Pro
            20                  25                  30
Ala Arg Leu Asn Ala Val Gln Glu Lys Ile Leu Asp Leu Tyr Glu Ala
        35                  40                  45
Asp Ser Asn Asp Leu Asn Ala Gln Ile Glu His Trp Lys Leu Thr Arg
    50                  55                  60
Met Ala Cys Val Leu Phe Tyr Lys Ala Lys Glu Leu Gly Ile Thr His
65                  70                  75                  80
Ile Gly His Gln Val Val Pro Pro Met Ala Val Ser Lys Ala Lys Ala
                85                  90                  95
Cys Gln Ala Ala Glu Leu Gln Leu Ala Leu Glu Ala Leu Asn Lys Thr
            100                 105                 110
Gln Tyr Ser Thr Asp Gly Trp Thr Leu Gln Gln Thr Ser Leu Glu Met
        115                 120                 125
Trp Arg Ala Glu Pro Gln Lys Tyr Phe Lys Lys His Gly Tyr Thr Ile
    130                 135                 140
Thr Val Gln Tyr Asp Asn Asp Lys Asn Asn Thr Met Asp Tyr Thr Asn
145                 150                 155                 160
Trp Lys Glu Ile Tyr Leu Leu Gly Glu Cys Glu Cys Thr Ile Val Glu
                165                 170                 175
Gly Gln Val Asp Tyr Tyr Gly Leu Tyr Tyr Trp Cys Asp Gly Glu Lys
            180                 185                 190
Ile Tyr Phe Val Lys Phe Ser Asn Asp Ala Lys Gln Tyr Cys Val Thr
        195                 200                 205
Gly Val Trp Glu Val His Val Gly Gly Gln Val Ile Val Cys Pro Ala
    210                 215                 220
Ser Val Ser Ser Asn Glu Val Ser Thr Thr Glu Thr Ala Val His Leu
225                 230                 235                 240
Cys Thr Glu Thr Ser Lys Thr Ser Ala Val Ser Val Gly Ala Lys Asp
                245                 250                 255
Thr His Leu Gln Pro Pro Gln Lys Arg Arg Arg Pro Asp Val Thr Asp
            260                 265                 270
Ser Arg Asn Thr Lys Tyr Pro Asn Asn Leu Leu Arg Gly Gln Gln Ser
        275                 280                 285
Val Asp Ser Thr Thr Arg Gly Leu Val Thr Ala Thr Glu Cys Thr Asn
    290                 295                 300
Lys Gly Arg Val Ala His Thr Thr Cys Thr Ala Pro Ile Ile His Leu
305                 310                 315                 320
Lys Gly Asp Pro Asn Ser Leu Lys Cys Leu Arg Tyr Arg Val Lys Thr
                325                 330                 335
His Lys Ser Leu Tyr Val Gln Ile Ser Ser Thr Trp His Trp Thr Ser
            340                 345                 350
Asn Glu Cys Thr Asn Asn Lys Leu Gly Ile Val Thr Ile Thr Tyr Ser
        355                 360                 365
Asp Glu Thr Gln Arg Gln Gln Phe Leu Lys Thr Val Lys Ile Pro Asn
    370                 375                 380
Thr Val Gln Val Ile Gln Gly Val Met Ser Leu Gly Leu Ser Ser Thr
385                 390                 395                 400
Ser Ile Val Tyr Ile Leu Ile Ala Val Cys Leu Gly Gly Leu Ile Gly
                405                 410                 415
Ile Pro Ala Leu Ile Cys Cys Cys Arg Gly Arg Cys Asn Lys Lys Gly
            420                 425                 430
Glu Gln Val Gly Met Ser Arg Pro Gly Leu Lys Pro Asp Leu Thr Gly
        435                 440                 445
Thr Ser Lys Ser Tyr Val Arg Ser Leu
    450                 455
<210>32
<211>746
<212>PRT
<213>artificial sequence
<220>
<223>HPV-18membrane-presented and replication defective E1
     polypeptide
<400>32
Met Gly Leu Lys Val Asn Val Ser Ala Ile Phe Met Ala Val Leu Leu
1               5                   10                  15
Thr Leu Gln Thr Pro Thr Gly Gln Ile His Trp Gly Ala Asp Pro Glu
            20                  25                  30
Gly Thr Asp Gly Glu Gly Thr Gly Cys Asn Gly Trp Phe Tyr Val Gln
        35                  40                  45
Ala Ile Val Asp Lys Lys Thr Gly Asp Val Ile Ser Asp Asp Glu Asp
    50                  55                  60
Glu Asn Ala Thr Asp Thr Gly Ser Asp Met Val Asp Phe Ile Asp Thr
65                  70                  75                  80
Gln Gly Thr Phe Cys Glu Gln Ala Glu Leu Glu Thr Ala Gln Ala Leu
                85                  90                  95
Phe His Ala Gln Glu Val His Asn Asp Ala Gln Val Leu His Val Leu
            100                 105                 110
Lys Arg Lys Phe Ala Gly Gly Ser Thr Glu Asn Ser Pro Leu Gly Glu
        115                 120                 125
Arg Leu Glu Val Asp Thr Glu Leu Ser Pro Arg Leu Gln Glu Ile Ser
    130                 135                 140
Leu Asn Ser Gly Gln Lys Lys Ala Lys Arg Arg Leu Phe Thr Ile Ser
145                 150                 155                 160
Asp Ser Gly Tyr Gly Cys Ser Glu Val Glu Ala Thr Gln Ile Gln Val
                165                 170                 175
Thr Thr Asn Gly Glu His Gly Gly Asn Val Cys Ser Gly Gly Ser Thr
            180                 185                 190
Glu Ala Ile Asp Asn Gly Gly Thr Glu Gly Asn Asn Ser Ser Val Asp
        195                 200                 205
Gly Thr Ser Asp Asn Ser Asn Ile Glu Asn Val Asn Pro Gln Cys Thr
    210                 215                 220
Ile Ala Gln Leu Lys Asp Leu Leu Lys Val Asn Asn Lys Gln Gly Ala
225                 230                 235                 240
Met Leu Ala Val Phe Lys Asp Thr Tyr Gly Leu Ser Phe Thr Asp Leu
                245                 250                 255
Val Arg Asn Phe Lys Ser Asp Lys Thr Thr Cys Thr Asp Trp Val Thr
            260                 265                 270
Ala Ile Phe Gly Val Asn Pro Thr Ile Ala Glu Gly Phe Lys Thr Leu
        275                 280                 285
Ile Gln Pro Phe Ile Leu Tyr Ala His Ile Gln Cys Leu Asp Cys Lys
    290                 295                 300
Trp Gly Val Leu Ile Leu Ala Leu Leu Arg Tyr Lys Cys Gly Lys Ser
305                 310                 315                 320
Arg Leu Thr Val Ala Lys Gly Leu Ser Thr Leu Leu His Val Pro Glu
                325                 330                 335
Thr Cys Met Leu Ile Gln Pro Pro Lys Leu Arg Ser Ser Val Ala Ala
            340                 345                 350
Leu Tyr Trp Tyr Arg Thr Gly Ile Ser Asn Ile Ser Glu Val Met Gly
        355                 360                 365
Asp Thr Pro Glu Trp Ile Gln Arg Leu Thr Ile Ile Gln His Gly Ile
    370                 375                 380
Asp Asp Ser Asn Phe Asp Leu Ser Glu Met Val Gln Trp Ala Phe Asp
385                 390                 395                 400
Asn Glu Leu Thr Asp Glu Ser Asp Met Ala Phe Glu Tyr Ala Leu Leu
                405                 410                 415
Ala Asp Ser Asn Ser Asn Ala Ala Ala Phe Leu Lys Ser Asn Cys Gln
            420                 425                 430
Ala Lys Tyr Leu Lys Asp Cys Ala Thr Met Cys Lys His Tyr Arg Arg
        435                 440                 445
Ala Gln Lys Arg Gln Met Asn Met Ser Gln Trp Ile Arg Phe Arg Cys
    450                 455                 460
Ser Lys Ile Asp Glu Gly Gly Asp Trp Arg Pro Ile Val Gln Phe Leu
465                 470                 475                 480
Arg Tyr Gln Gln Ile Glu Phe Ile Thr Phe Leu Gly Ala Leu Lys Ser
                485                 490                 495
Phe Leu Lys Gly Thr Pro Lys Lys Asn Cys Leu Val Phe Cys Gly Pro
            500                 505                 510
Ala Asn Thr Asp Lys Ser Tyr Phe Gly Met Ser Phe Ile His Phe Ile
        515                 520                 525
Gln Gly Ala Val Ile Ser Phe Val Asn Ser Thr Ser His Phe Trp Leu
    530                 535                 540
Glu Pro Leu Thr Asp Thr Lys Val Ala Met Leu Asp Asp Ala Thr Thr
545                 550                 555                 560
Thr Cys Trp Thr Tyr Phe Asp Thr Tyr Met Arg Asn Ala Leu Asp Gly
                565                 570                 575
Asn Pro Ile Ser Ile Asp Arg Lys His Lys Pro Leu Ile Gln Leu Lys
            580                 585                 590
Cys Pro Pro Ile Leu Leu Thr Thr Asn Ile His Pro Ala Lys Asp Asn
        595                 600                 605
Arg Trp Pro Tyr Leu Glu Ser Arg Ile Thr Val Phe Glu Phe Pro Asn
    610                 615                 620
Ala Phe Pro Phe Asp Lys Asn Gly Asn Pro Val Tyr Glu Ile Asn Asp
625                 630                 635                 640
Lys Asn Trp Lys Cys Phe Phe Glu Arg Thr Trp Ser Arg Leu Asp Leu
                645                 650                 655
His Glu Glu Glu Glu Asp Ala Asp Thr Glu Gly Asn Pro Phe Gly Thr
            660                 665                 670
Phe Lys Leu Arg Ala Gly Gln Asn His Arg Pro Leu Gly Leu Ser Ser
        675                 680                 685
Thr Ser Ile Val Tyr Ile Leu Ile Ala Val Cys Leu Gly Gly Leu Ile
    690                 695                 700
Gly Ile Pro Ala Leu Ile Cys Cys Cys Arg Gly Arg Cys Asn Lys Lys
705                 710                 715                 720
Gly Glu Gln Val Gly Met Ser Arg Pro Gly Leu Lys Pro Asp Leu Thr
                725                 730                 735
Gly Thr Ser Lys Ser Tyr Val Arg Ser Leu
            740                 745
<210>33
<211>1362
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>nucleotide sequence encoding a membrane-presented and
     replication-defective HPV-18 E2 polypeptide
     (degenerated to reduce homology with HPV-16
     E2-encoding sequence)
<400>33
atggttcctc aggctctcct gtttgtaccc cttctggttt ttccattgtg ttttgggaaa       60
ttccctattc agacaccgaa ggaaaccctt tcggaacgat taagttgcgt gcaagataag    120
atcatagacc actacgagaa cgacagtaaa gacatagaca gccaaataca gtactggcaa    180
ctaatacgtt gggcaaatgc aatattcttt gcagcaaggg aacatggcat acagacatta    240
aatcatcagg tagtcccagc ctataacatt tcgaaaagta aggcacataa agctgccgag    300
ctccaaatgg ccctacaagg ccttgcacaa agtcgataca aaaccgagga ttggactctg    360
caggacacat gcgaggaact atggaataca gaacctactc actgctttaa gaaaggtggc    420
caaaccgtac aagtatattt cgacggcaac aaagacaatt gtatgaccta tgtagcatgg    480
gacagtgtgt attatatgac tgatgcagga acatgggaca aaaccgctac ctgtgtaagt    540
cacaggggat tgtactacgt aaaggagggg tacaacacgt tttatataga attcaaaagt    600
gaatgtgaga agtatgggaa cacaggtacg tgggaggtac attttgggaa taatgtcatt    660
gattgtaatg actctatgtg cagtaccagt gacgacacgg tctccgctac tcagcttgtt    720
aaacagctac agcacacccc ctcaccgtat tccagcaccg tgtccgtggg aaccgcaaag    780
acctacggcc agacgtcggc tgctacacga cctggccact gtggactcgc ggagaagcag    840
cattgtggac ctgtcaaccc acttctcggt gcagctacac ctacaggcaa caacaagaga    900
cgaaaactct gcagtggtaa tacgacgcct ataatacact tgaagggaga cagaaacagt    960
ttgaagtgct tacggtacag gttgcgaaaa catagcgacc actatagaga tatatcatcc    1020
acctggcact ggaccggtgc aggcaatgaa aaaacaggaa tactgactgt aacctaccat    1080
agcgaaacac aaagaacaaa attcttaaat actgttgcaa ttccagatag tgtacaaata    1140
ttggtgggat acatgacaat gtatgtatta ctgagtgcag gggccctgac tgccttgatg    1200
ttgataattt tcctgatgac atgttgtaga agagtcaatc gatcagaacc tacgcaacac    1260
aatctcagag ggacagggag ggaggtgtca gtcactcccc aaagcgggaa gatcatatct    1320
tcatgggaat cacacaagag tgggggtgag accagactgt ga                       1362
<210>34
<211>1062
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>nucleotide sequence encoding a replication-defective
     HPV-33 E2 polypeptide(degenerated sequence)
<400>34
atggaggaaa tatcagcacg cttgaatgca gtccaagaga aaattctaga tctttacgaa    60
gcagataaaa ctgatttacc atctcaaatt gaacactgga aattgatacg catggcctgc    120
gctttattgt atacagccaa acagatgggc ttttcacatt tatgtcacca agtggtacct    180
tctttgttag catccaaaac caaagcgttt caagtagcgg aactacagat ggcattagag    240
acattaagta aatcacagta tagcacaagc caatggacgt tgcaacagac aagcttagag    300
gtttggcttt gtgaaccacc aaaatgtttt aaaaagcaag gagaaacagt aactgtgcaa    360
tatgacaatg acaaaaaaaa taccatggac tatactaact ggggtgaaat atacattata    420
gaggaagata catgtactat ggttacaggg aaagtagatt atataggtat gtattacata    480
cataactgtg aaaaggtata ctttaaatat tttaaggagg atgctgccaa atactctaaa    540
acacaaatgt gggaagtcca tgtaggtggc caggttattg tttgccctac gtctatatct    600
agcaatcaaa tatccactac tgagactgct gacatacaga cagacaacga taaccgacca    660
ccacaagcag cggccaaacg acgacgacct gcagacacta ctgacaccgc ccagcccctt    720
acaaagctgt tctgtgcaga ccccgccttg gataatagaa cagcacgtac agcaactaac    780
tgcacaaata agcagcggac tgtgtgtagt tctaacgttg caccaatagt gcatttgaaa    840
ggcgaatcaa atagcttaaa gtgtttgaga tacagattaa aaccttataa agagttgtac    900
agttctatgt cttcaacttg gcactggact agtgacaaca aaaatagtaa aaatggcata    960
gtaaccgtga catttgtaac tgaacagcaa caacaaatgt tcttgggtac cgtaaagata    1020
cctcctactg tgcagataag taccggattc atgaccttat aa                       1062
<210>35
<211>1326
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>nucleotide sequence encoding a membrane-presented and
     replication-defective HPV-33 E2 polypeptide(SS-33E2＊-TMR)
     (degenerated sequence)
<400>35
atggtaccgc aagccctgct attcgtacct ttattggtct ttcccctctg tttcggtaag    60
tttcctatag aggaaatatc agcacgcttg aatgcagtcc aagagaaaat tctagatctt    120
tacgaagcag ataaaactga tttaccatct caaattgaac actggaaatt gatacgcatg    180
gcctgcgctt tattgtatac agccaaacag atgggctttt cacatttatg tcaccaagtg    240
gtaccttctt tgttagcatc caaaaccaaa gcgtttcaag tagcggaact acagatggca    300
ttagagacat taagtaaatc acagtatagc acaagccaat ggacgttgca acagacaagc    360
ttagaggttt ggctttgtga accaccaaaa tgttttaaaa agcaaggaga aacagtaact    420
gtgcaatatg acaatgacaa aaaaaatacc atggactata ctaactgggg tgaaatatac    480
attatagagg aagatacatg tactatggtt acagggaaag tagattatat aggtatgtat    540
tacatacata actgtgaaaa ggtatacttt aaatatttta aggaggatgc tgccaaatac    600
tctaaaacac aaatgtggga agtccatgta ggtggccagg ttattgtttg ccctacgtct    660
atatctagca atcaaatatc cactactgag actgctgaca tacagacaga caacgataac    720
cgaccaccac aagcagcggc caaacgacga cgacctgcag acactactga caccgcccag    780
ccccttacaa agctgttctg tgcagacccc gccttggata atagaacagc acgtacagca    840
actaactgca caaataagca gcggactgtg tgtagttcta acgttgcacc aatagtgcat    900
ttgaaaggcg aatcaaatag cttaaagtgt ttgagataca gattaaaacc ttataaagag    960
ttgtacagtt ctatgtcttc aacttggcac tggactagtg acaacaaaaa tagtaaaaat    1020
ggcatagtaa ccgtgacatt tgtaactgaa cagcaacaac aaatgttctt gggtaccgta    1080
aagatacctc ctactgtgca gataagtacc ggattcatga ccttatacgt actgctatcg    1140
gcaggcacgt tgatcgcact aatgcttatc atcttcctaa taacctgctg caagcgggtt    1200
gataggcccg aaagtaccca aaggtccttg agaggtaccg gacgcaacgt atcggtaacg    1260
tcgcaaagcg gcaagttcat tagcagttgg gagtcgcaca aatcaggtgg agagacccgc    1320
ctgtga                                                               1326
<210>36
<211>1107
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>nucleotide sequence encoding a HPV-52replication-defective E2
     polypeptide((52degE2＊)(degenerated sequence)
<400>36
atggaatcga taccggcacg gttaaacgct gtgcaggaaa agatactcga tctatatgag    60
gctgacagca atgatctaaa cgcacaaatc gagcattgga agttgactcg aatggcttgt    120
gttttgtttt ataaagcaaa ggaactggga ataactcata taggccatca agtagtgcct    180
ccaatggcag tgtctaaggc aaaggcctgc caagccgcag agcttcaatt ggctttggag    240
gcattgaaca aaactcaata cagtacagat ggctggacct tacagcaaac aagtctagaa    300
atgtggcgtg cagagccaca aaaatacttc aagaagcacg ggtacacaat aacagtccaa    360
tacgataatg ataaaaacaa cactatggat tacacaaatt ggaaggaaat ttatttactt    420
ggtgagtgtg aatgcacaat tgtagaagga caagtggatt actatgggtt atactattgg    480
tgtgatggag aaaaaatcta tttcgtaaaa tttagtaacg acgcaaagca atattgtgta    540
acaggagtct gggaggtgca cgtgggcggt caagtaatcg tgtgtccagc atcggtatca    600
agtaacgagg tttctactac agaaacagct gtccacctat gcaccgaaac ctccaagacc    660
tccgcagtgt ccgtgggtgc caaagacaca cacctacaac caccacagaa gcgacgtcga    720
ccagatgtca cagattccag aaacaccaag taccccaaca accttttgcg gggacaacaa    780
tccgttgaca gcactacacg gggactcgta actgccactg agtgcactaa taaaggtcgg    840
gttgcacata caacttgtac tgctcctatt attcacctaa agggtgaccc caacagcttg    900
aaatgcctaa ggtatagggt aaaaacacat aaaagtttat atgttcaaat ttcatctacg    960
tggcattgga cgagtaatga atgtacaaat aataaactag gtattgtaac aataacgtac    1020
agtgatgaga cacagcgtca acagttttta aaaactgtca aaatcccaaa taccgtccaa    1080
gttatacaag gtgtcatgtc attgtaa                                        1107
<210>37
<211>1374
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>nucleotide sequence encoding a membrane-presented and
     replication defective HPV-52 E2 polypeptide
     SS-52degE2＊-TMF)(degenrated sequence)
<400>37
atgggtctca aggtgaacgt ctctgccata ttcatggcag tactgttaac tctccaaaca    60
cccaccggtc aaatccattg gggcgaatcg ataccggcac ggttaaacgc tgtgcaggaa    120
aagatactcg atctatatga ggctgacagc aatgatctaa acgcacaaat cgagcattgg    180
aagttgactc gaatggcttg tgttttgttt tataaagcaa aggaactggg aataactcat    240
ataggccatc aagtagtgcc tccaatggca gtgtctaagg caaaggcctg ccaagccgca    300
gagcttcaat tggctttgga ggcattgaac aaaactcaat acagtacaga tggctggacc    360
ttacagcaaa caagtctaga aatgtggcgt gcagagccac aaaaatactt caagaagcac    420
gggtacacaa taacagtcca atacgataat gataaaaaca acactatgga ttacacaaat    480
tggaaggaaa tttatttact tggtgagtgt gaatgcacaa ttgtagaagg acaagtggat    540
tactatgggt tatactattg gtgtgatgga gaaaaaatct atttcgtaaa atttagtaac    600
gacgcaaagc aatattgtgt aacaggagtc tgggaggtgc acgtgggcgg tcaagtaatc    660
gtgtgtccag catcggtatc aagtaacgag gtttctacta cagaaacagc tgtccaccta    720
tgcaccgaaa cctccaagac ctccgcagtg tccgtgggtg ccaaagacac acacctacaa    780
ccaccacaga agcgacgtcg accagatgtc acagattcca gaaacaccaa gtaccccaac    840
aaccttttgc ggggacaaca atccgttgac agcactacac ggggactcgt aactgccact    900
gagtgcacta ataaaggtcg ggttgcacat acaacttgta ctgctcctat tattcaccta    960
aagggtgacc ccaacagctt gaaatgccta aggtataggg taaaaacaca taaaagttta    1020
tatgttcaaa tttcatctac gtggcattgg acgagtaatg aatgtacaaa taataaacta    1080
ggtattgtaa caataacgta cagtgatgag acacagcgtc aacagttttt aaaaactgtc    1140
aaaatcccaa ataccgtcca agttatacaa ggtgtcatgt cattgggttt atcgagcact    1200
agcatagtct acatcctgat tgcagtgtgt cttggagggt tgatagggat ccccgcttta    1260
atatgttgct gcagggggcg ttgtaacaaa aagggagaac aagttggtat gtcaagacca    1320
ggcctaaagc ctgatcttac gggaacatca aaatcctatg taaggtcgct ctga          1374
<210>38
<211>2241
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>nucleotide sequence encoding a membrane-presented and
     replication-defective HPV-18E1(SS-18E1＊-TMF)(degenerated
     to decrease homology with E1-encoding HPV-16nucleotide
     sequence)
<400>38
atgggtctca aggtgaacgt ctctgccata ttcatggcag tactgttaac tctccaaaca    60
cccaccggtc aaatccattg gggcgcagac ccagaaggca cagacggaga aggcacgggt    120
tgcaacggct ggttctacgt acaagctatt gtagacaaga agaccggaga tgtaatttct    180
gacgatgagg acgagaatgc aacagacaca gggtcggata tggttgactt cattgataca    240
caaggaacat tttgtgaaca agccgagcta gaaactgctc aggcattgtt ccatgcgcag    300
gaggtccaca atgatgcaca agtgttgcat gttttaaagc ggaagtttgc aggaggcagc    360
acagaaaaca gtccattagg ggagcggctg gaggtggata cagagttaag cccacggtta    420
caagaaatat ctttaaatag tgggcagaaa aaggctaaga ggcggctgtt tacaatatca    480
gatagtggct acggctgttc tgaggtggaa gcaacacaga ttcaggtaac tacaaatggc    540
gaacatggcg gcaatgtatg cagtggcggc agtacggagg ctatagacaa cggaggcaca    600
gagggcaaca acagcagtgt agacggtaca agcgacaata gcaatataga aaatgtaaat    660
ccacaatgta ccatagcaca attaaaagac ttgttaaaag taaacaataa acaaggagct    720
atgcttgcag tattcaagga cacatatggg ctatcattta cagatttagt tagaaatttc    780
aagagtgaca aaaccacatg tacagactgg gttacagcta tattcggagt aaacccaaca    840
atcgcagaag gatttaagac tctaatacag ccatttatat tgtatgccca tatacaatgt    900
ctagactgta agtggggtgt attaatatta gccctgttgc gttacaagtg cggtaagagt    960
agactaacag ttgctaaagg tttaagtacg ttgttacacg tacctgaaac ttgcatgtta    1020
attcaaccac ctaagttacg aagtagtgtt gctgcactat actggtacag aactggaatt    1080
tctaacataa gcgaggtaat gggtgacaca cctgagtgga ttcagagact tactattata    1140
cagcatggaa tagacgatag caatttcgat ttgtcagaaa tggttcagtg ggcatttgac    1200
aacgagctga cagatgaaag cgatatggca tttgaatacg ccttattagc tgacagcaac    1260
agcaacgcag ctgcattttt aaagagcaat tgccaagcta aatatttaaa agactgtgcc    1320
actatgtgca aacactatag gcgtgcccag aaacgacaga tgaatatgtc acagtggatt    1380
cgatttaggt gttcaaaaat agacgaaggg ggagactgga gaccaatagt gcaattcctg    1440
cgataccaac aaatagaatt cataacattc ttaggagcct tgaaatcatt cttaaaagga    1500
acccccaaga agaactgttt agtattttgt ggaccagcaa atactgacaa gtcatatttc    1560
ggaatgagct ttatacactt tatacaagga gcagttatat cattcgtgaa ctccactagt    1620
cacttctggc tggaaccgtt aacagacact aaggtggcca tgctagacga cgcaacgacc    1680
acgtgctgga catactttga tacctatatg aggaacgcgt tagacggcaa tccaataagt    1740
attgatagaa aacacaaacc tttaatacag cttaagtgtc cgccaatact actaaccaca    1800
aatatacatc cagcaaagga taatagatgg ccatacttag aaagtagaat aacagtattt    1860
gaattcccaa atgcattccc gttcgataaa aatggcaacc ctgtatacga aataaacgac    1920
aaaaattgga agtgtttctt tgaaagaaca tggtcaaggt tagatttaca tgaagaagaa    1980
gaagatgctg atacagaggg taatccattt ggtactttca aattacgagc tggacagaat    2040
cacaggcctc ttggtttatc gagcactagc atagtctaca tcctgattgc agtgtgtctt    2100
ggagggttga tagggatccc cgctttaata tgttgctgca gggggcgttg taacaaaaag    2160
ggagaacaag ttggtatgtc aagaccaggc ctaaagcctg atcttacggg aacatcaaaa    2220
tcctatgtaa ggtcgctctg a                                              2241
<210>39
<211>33
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>primer oTG15315 for reconstituting sequence encoding HPV-18
     SS-6E1＊deg-TMF
<400>39
ggggagatct atgggtctca aggtgaacgt ctc                                            33
<210>40
<211>39
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>primer oTG17881 for reconstituting sequence encoding HPV-18
     SS-E1＊deg-TMF
<400>40
gtgccttctg ggtctgcgcc ccaatggatt tgaccggtg                                      39
<210>41
<211>37
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>primer oTG17882for reconstituting sequence encoding HPV-18
     SS-E1＊deg-TMF
<400>41
ggtcaaatcc attggggcgc agacccagaa ggcacag                                        37
<210>42
<211>42
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>primer oTG17883 for reconstituting sequence encoding HPV-18
     SS-E1＊deg-TMF
<400>42
cagaatcaca ggcctcttgg tttatcgagc actagcatag tc                                  42
<210>43
<211>39
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>primer oTG17884 for reconstituting sequence encoding HPV-18
     SS-E1＊deg-TMF
<400>43
gctagtgctc gataaaccaa gaggcctgtg attctgtcc                                      39
<210>44
<211>32
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>primer oTG17885 for reconstituting sequence encoding HPV-18
     SS-E1＊de g-TMF
<400>44
gggggcggcc gctcagagcg accttacata gg                                        32
<210>45
<211>31
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>sense primer oTG17875 for reconstituting sequence encoding
     HPV-18SS-E2＊deg-TMR
<400>45
ggggagatct atggttcctc aggctctcct g                                         31
<210>46
<211>39
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>sense primer oTG17876 for reconstituting sequence encoding
     HPV-18SS-E2＊deg-TMR
<400>46
gttttgggaa attccctatt cagacaccga aggaaaccc                                 39
<210>47
<211>43
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>antisense primer oTG17877 for reconstituting sequence
     encoding HPV-18SS-E2＊deg-TMR
<400>47
gtttccttcg gtgtctgaat agggaatttc ccaaaacaca atg                            43
<210>48
<211>39
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>sense primer oTG17878 for reconstituting sequence encoding
     HPV-18SS-E2＊deg-TMR
<400>48
gtgggataca tgacaatgta tgtattactg agtgcaggg                                 39
<210>49
<211>38
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>antisense primer oTG17879 for reconstituting sequence
    encoding HPV-18SS-E2＊deg-TMR
<400>49
ctgcactcag taatacatac attgtcatgt atcccacc                                  38
<210>50
<211>29
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>antisense primer oTG17880for reconstituting sequence
     encoding HPV-18SS-E2＊deg-TMR
<400>50
gggggcggcc gctcacagtc tggtctcac                                            29
<210>51
<211>36
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>primer oTG18962 for reconstituting sequence encoding
     SS-33E2＊-TMR
<400>51
cccaaaggat ccaccatggt accgcaagcc ctgcta                                    36
<210>52
<211>52
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>primer oTG18963 for reconstituting sequence encoding
     SS-33E2＊-TMR
<400>52
ttcccctctg tttcggtaag tttcctatag aggaaatatc agcacgcttg aa                  52
<210>53
<211>52
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>primer oTG18964 for reconstituting sequence encoding
     SS-33E2＊-TMR
<400>53
ttcaagcgtg ctgatatttc ctctatagga aacttaccga aacagagggg aa                  52
<210>54
<211>49
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>primer oTG18965 for reconstituting sequence  encoding
     SS-33E2＊-TMR
<400>54
gataagtacc ggattcatga ccttatacgt actgctatcg gcaggcacg                      49
<210>55
<211>49
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>primer oTG18966 for reconstituting sequence encoding
     SS-33E2＊-TMR
<400>55
cgtgcctgcc gatagcagta cgtataaggt catgaatccg gtacttatc                    49
<210>56
<211>56
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>primer oTG18967for reconstituting sequence encoding
     SS-33E2＊-TMR
<400>56
aaaaccccgc atgcgcggcc gcaagctatc acaggcgggt ctctccacct gatttg            56
<210>57
<211>37
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>primer oTG18968 for reconstituting sequence encoding
     SS-52E2＊-TMF
<400>57
aaacccgaga tctaccatgg gtctcaaggt gaacgtc                                 37
<210>58
<211>46
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>primer oTG18969 for reconstituting sequence encoding
     SS-52E2＊-TMF
<400>58
cccaccggtc aaatccattg gggcgaatcg ataccggcac ggttaa                       46
<210>59
<211>46
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>primer oTG18970 for reconstituting sequence encoding
     SS-52E2＊-TMF
<400>59
ttaaccgtgc cggtatcgat tcgccccaat ggatttgacc ggtggg                       46
<210>60
<211>43
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>primer oTG18971 for reconstituting sequence encoding
     SS-52E2＊-TMF
<400>60
gttatacaag gtgtcatgtc attgggttta tcgagcacta gca                          43
<210>61
<211>43
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>primer oTG18972 for reconstituting sequence encoding
     SS-52E2＊-TMF
<400>61
tgctagtgct cgataaaccc aatgacatga caccttgtat aac                            43
<210>62
<211>53
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>primer oTG18973 for reconstituting sequence encoding
     SS-52E2＊-TMF
<400>62
aagcttgcta gccaccggtg gggccgcggc cgctcagagc gaccttacat agg                 53

Claims (49)

1.编码至少一种***瘤病毒E2多肽的核酸分子或包含所述核酸分子的载体或感染性病毒颗粒在制备用于治疗患有由至少一种***瘤病毒所致的持续性***瘤病毒感染的宿主生物体的药物中的应用。
2.权利要求1的应用，其中在暴露于至少一种***瘤病毒之后和检测/出现***瘤病毒相关损害之前施用所述核酸分子、载体或感染性病毒颗粒。
3.权利要求1或2的应用，其中所述至少一种***瘤病毒E2多肽来源于选自如下一组中的HR-HPV：HPV-16，HPV-18，HPV-30，HPV-31，HPV-33，HPV-35，HPV-39，HPV-45，HPV-51，HPV-52，HPV-56，HPV-58，HPV-59，HPV-66，HPV-68，HPV-70和HPV-85。
4.权利要求3的应用，其中所述至少一种***瘤病毒E2多肽来源于HPV-16、HPV-18、HPV-33或HPV-52或其任意组合。
5.权利要求1到4任一项的应用，其中所述核酸分子被修饰以编码对于至少复制和/或转录激活活性是缺陷的E2多肽。
6.权利要求5的应用，其中所述E2多肽来源于HPV-16并包含SEQ IDNO：1所示的氨基酸序列，但其中至少在39位的Glu残基(E39)和/或在73位的Ile残基(I73)分别在39位和73位被是除Glu和Ile之外的任意氨基酸残基取代。
7.权利要求6的应用，其中所述在39位的Glu残基和/或在73位的Ile残基被Ala残基取代。
8.权利要求1到7任一项的应用，其中所述核酸分子被修饰以编码膜呈递E2多肽。
9.权利要求8的应用，其中所述膜呈递E2多肽通过融合所述***瘤病毒E2多肽到分泌和膜锚定序列被修饰。
10.权利要求9的应用，其中所述分泌和/或膜锚定序列来源于狂犬病糖蛋白，HIV病毒包膜糖蛋白或麻疹病毒F蛋白或是合成的。
11.权利要求4到10任一项的应用，其中所述载体选自如下一组：
-包含编码HPV-16 E2多肽的核酸分子的载体；
-包含编码HPV-18 E2多肽的核酸分子的载体；
-包含编码HPV-33 E2多肽的核酸分子的载体；
-包含编码HPV-52 E2多肽的核酸分子的载体。
12.权利要求10或11的应用，其中所述核酸分子编码包含SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的E2多肽。
13.权利要求1到12任一项的使用，其中所述载体或感染性病毒颗粒包含编码至少2个来源于不同***瘤病毒基因型的E2多肽的核酸分子。
14.权利要求1到13任一项的应用，其中所述核酸、载体、感染性病毒颗粒与一或多个另外的多肽或编码所述另外的多肽的一或多个核酸、载体或感染性病毒颗粒联合使用。
15.权利要求14的应用，其中所述另外的多肽是早期HPV多肽，其选自由E1、E2、E4、E5、E6和E7组成的一组。
16.权利要求15的应用，其中所述***瘤病毒另外多肽来源于与所述核酸分子编码的E2多肽相同的***瘤病毒基因型。
17.权利要求15的应用，其中所述***瘤病毒另外多肽来源于与所述核酸分子编码的E2多肽不同的***瘤病毒基因型。
18.权利要求15到17任一项的应用，其中所述***瘤病毒另外多肽是修饰的E1多肽，与相应天然E1多肽比较其包含一或多个修饰以使其对于刺激病毒复制是缺陷的，特别优选下述修饰的E1多肽，所述修饰的E1多肽包含天然HPV-16 E1多肽的氨基酸序列，但其中在482位的Gly残基被Asp残基取代。
19.权利要求15到17任一项的使用，其中所述***瘤病毒另外多肽是修饰的E6多肽，其是非致癌的并且与细胞肿瘤阻抑物基因产物p53的结合被改变。
20.权利要求15到17任一项的使用，其中所述***瘤病毒另外多肽是修饰的E7多肽，其是非致癌的并且与细胞肿瘤阻抑物基因产物Rb的结合被改变。
21.权利要求15到20任一项的使用，其中所述***瘤病毒另外多肽选自由包含SEQ ID NO：3-5所示任一氨基酸序列的多肽组成的组。
22.载体，包含编码***瘤病毒E1多肽的核酸分子和编码***瘤病毒E2多肽的核酸分子，其中在天然背景序列中与所述E2编码核酸分子的5’部分100％相同的所述E1编码核酸分子3’部分被修饰以显示与所述E2编码核酸分子的所述部分小于75％的相同性百分比。
23.载体，包含编码***瘤病毒E1多肽的核酸分子和编码***瘤病毒E2多肽的核酸分子，其中所述E1编码核酸分子和所述E2编码核酸分子不包含显示相同性百分比是75％或大于75％的40个或更多个连续核苷酸的部分。
24.载体，包含编码至少2种***瘤病毒E2多肽的核酸分子，其中所述E2编码核酸分子不包含显示相同性百分比是75％或大于75％的40个或更多个连续核苷酸部分。
25.权利要求22-24任一项的载体，其中所述E1编码核酸分子包含SEQID NO：6或SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列。
26.权利要求22-25任一项的载体，其中所述E2编码核酸分子编码权利要求3-10和12任一项所定义的E2多肽。
27.权利要求22到26任一项的载体，其中所述载体选自以下一组：
-包含(i)编码HPV-16 E2多肽的核酸分子并还包含(ii)编码HPV-18 E2多肽的核酸分子的载体；
-包含(i)编码HPV-16 E2多肽的核酸分子，(ii)编码HPV-18 E2多肽的核酸分子和(iii)编码HPV-33 E2多肽的核酸分子的载体；
-包含(i)编码HPV-16 E2多肽的核酸分子，(ii)编码HPV-18 E2多肽的核酸分子和(iii)编码HPV-52 E2多肽的核酸分子的载体；
-包含(i)编码HPV-16 E2多肽的核酸分子，(ii)编码HPV-33 E2多肽的核酸分子和(iii)编码HPV-52 E2多肽的核酸分子的载体；
-包含(i)编码HPV-16 E2多肽的核酸分子，(ii)编码HPV-18 E2多肽的核酸分子(iii)编码HPV-33 E2多肽的核酸分子和(iv)编码HPV-52 E2多肽的核酸分子的载体；
-包含(i)编码HPV-16 E2多肽的核酸分子，(ii)编码HPV-16 E1多肽的核酸分子的载体；
-包含(i)编码HPV-16 E2多肽的核酸分子，(ii)编码HPV-16 E1多肽的核酸分子，(iii)编码HPV-18 E2多肽的核酸分子和(iv)编码HPV-18 E1多肽的核酸分子的载体；
-包含(i)编码HPV-16 E2多肽的核酸分子，(ii)编码HPV-16 E6多肽的核酸分子的载体；
-包含(i)编码HPV-16 E2多肽的核酸分子，(ii)编码HPV-16 E7多肽的核酸分子的载体；
-包含(i)编码HPV-16 E2多肽的核酸分子，(ii)编码HPV-16 E1多肽的核酸分子；(iii)编码HPV-16 E6多肽的核酸分子，(iv)编码HPV-16 E7多肽的核酸分子的载体；
-包含编码HPV-16 E1、E2、E6和E7多肽和HPV-18 E1、E2、E6和E7多肽的核酸分子的载体。
28.权利要求11的应用或权利要求27的载体，其中所述HPV-16 E2多肽包含SEQ ID NO：2所示氨基酸序列；和/或所述HPV-18 E2多肽包含SEQ ID NO：29所示氨基酸序列；和/或所述HPV-33 E2多肽包含SEQ ID NO：30所示氨基酸序列；和/或所述HPV-52 E2多肽包含SEQ ID NO：31所示氨基酸序列。
29.权利要求15-20的应用或权利要求27或28的载体，其中所述HPV-16 E1多肽包含SEQ ID NO：3所示氨基酸序列；和/或所述HPV-18 E1多肽包含SEQ ID NO：32所示氨基酸序列；和/或所述HPV-16 E6多肽包含SEQ ID NO：4所示氨基酸序列；和/或所述HPV-16 E7多肽包含SEQ ID NO：5所示氨基酸序列。
30.权利要求1-21任一项的应用或权利要求27-29任一项的载体，其中编码HPV-16 E2多肽的所述核酸分子包含SEQ ID NO：8所示核苷酸序列；和/或编码HPV-18 E2多肽的所述核酸分子包含SEQ ID NO：33所示核苷酸序列；和/或编码HPV-33 E2多肽的所述核酸分子包含SEQ ID NO：34或SEQ ID NO：35所示核苷酸序列；和/或编码HPV-52 E2多肽的所述核酸分子包含SEQ ID NO：36或SEQ ID NO：37所示核苷酸序列；和/或编码HPV-16 E1多肽的所述核酸分子包含SEQ ID NO：7所示核苷酸序列；和/或编码HPV-18 E1多肽的所述核酸分子包含SEQ ID NO：38所示核苷酸序列。
31.权利要求22到30任一项的载体或包含所述载体的感染性病毒颗粒在制备用于治疗患有由至少一种***瘤病毒导致的持续性***瘤病毒感染的宿主生物体的药物中的应用。
32.权利要求1到21和28到31任一项的应用或权利要求22-30任一项的载体，其中所述载体是从金丝雀痘病毒、鸡痘病毒或痘苗病毒生产的痘病毒载体。
33.权利要求32的应用，其中所述痘苗病毒是Copenhagen株，Wyeth株，NYVAC或修饰的Ankara(MVA)株。
34.权利要求33的应用，其中所述病毒载体来源于Copenhagen痘苗病毒且其中所述核酸分子被***胸苷激酶基因。
35.权利要求33的应用，其中所述病毒载体来源于MVA痘苗病毒且其中所述核酸分子被***缺失III。
36.权利要求33到35任一项的应用，其中所述E2和/或E7编码核酸分子被置于痘苗H5R启动子控制之下以及E1和/或E6编码核酸分子置于p7.5K启动子控制之下。
37.权利要求1到21和28到36任一项的应用，其中所述核酸分子，载体，或感染性病毒颗粒或其任意组合包含于组合物中。
38.权利要求37的应用，其中所述组合物以适合注射的形式配制。
39.权利要求38的应用，其中所述注射是肌肉内或皮下施用。
40.权利要求1到39任一项的应用，治疗由至少一种HR-HPV导致的持续性感染。
41.权利要求40的应用，用于治疗患有由HPV16，HPV31，HPV33，HPV35，HPV52和HPV58组成的一组中的至少一种病毒导致的感染的宿主生物体，其中所述核酸分子编码来源于HPV-16的E2多肽。
42.权利要求40的应用，治疗患有由HPV-18，HPV-39，HPV-45，HPV-51，HPV-56，HPV-59，HPV-68，HPV-70和HPV-85组成的一组中的至少一种病毒导致的感染的宿主生物体，其中所述核酸分子编码来源于HPV-18的E2多肽。
43.权利要求1到21和28-42任一项的应用，其中所述应用包含在几天到4周的时间段内连续进行的第一次系列施用，随后在第一个系列最后一次施用之后的1到6个月内进行的第二次系列施用。
44.权利要求43的应用，其中第一次系列施用包含以周间隔的连续3次施用并且第二次系列施用包含在第一次系列施用之后5到6个月内的一次施用。
45.权利要求1到21和28-44任一项的应用，其中所述核酸分子，载体，感染性病毒颗粒或组合物用于提供抗至少一种感染性***瘤病毒的抗病毒反应。
46.权利要求1到21和28-45任一项的应用，其中所述核酸分子，载体，感染性病毒颗粒或组合物用于诱导或激活动物或人生物体内的免疫反应。
47.权利要求22-30任一项的载体或感染性病毒颗粒或组合物或权利要求1-21和28-46任一项的应用，用于治疗动物或人生物体内的持续性***瘤病毒感染。
48.权利要求22-30任一项的载体或感染性病毒颗粒或组合物或权利要求1-21和28-46任一项的应用，用于诱导或激活动物或人生物体内的免疫反应。
49.权利要求22-30任一项的载体或感染性病毒颗粒或组合物或权利要求1-21和28-46任一项的应用，用于在动物或人生物体内提供抗病毒反应。
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