KR101514473B1 - 다중 유전자 발현용 벡터 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 40 또는 그 이상의 연속적인 뉴클레오티드 부분에서 약 80% 또는 80% 이상의 상동성을 나타내는 적어도 제1의 핵산 분자와 제2의 핵산 분자를 발현하는 벡터로서, 상기 제1의 핵산 분자 및/또는 상기 제2의 핵산 분자는 75% 미만으로 상동성을 감소시키기 위하여 변형되는 벡터를 제공한다. 또한, 본 발명은 서열번호: 9~15와 서열번호: 66~69의 어느 하나로 정의되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 실질적으로 분리된 핵산 분자와 관련된다. 또한, 본 발명은 이러한 핵산 분자 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포와 약학적 조성물뿐만 아니라, 치료 또는 예방 목적의 이들의 사용을 제공한다.

Description

다중 유전자 발현용 벡터{VECTORS FOR MULTIPLE GENE EXPRESSION}
본 발명은 동일한 생명체 또는 밀접하게 관련된 생명체들로부터 얻어진 흥미로운 다중 뉴클레오티드 서열을 독립적으로 발현시키기 위하여 조작된 재조합 벡터에 관한 것이다. 본 발명은 치료 또는 예방 목적을 위하여 다양한 원핵생물뿐만 아니라 진핵생물 인 비트로 시스템 또는 동물 또는 인간 개체에서 서로 상보성을 나타내는 다중 뉴클레오티드 서열을 발현시키기 위한 재조합 핵산 기술의 분야와 관련된다. 특히, 본 발명은 파필로마 바이러스와 헤파티티스 바이러스와 같은 감염성 생명체에 의하여 유발되는 병리학적 상태의 치료 또는 예방을 위한 면역치료의 분야에 유용하다.
제조합 DNA 기술은 배양된 숙주 세포 또는 살아있는 생명체에서 뉴클레오티드 서열을 발현하는 것을 가능하게 하였다. 몇 가지의 플라스미드 DNA와 바이러스성 벡터가 얻어졌고, 백신화, 유전자 치료, 면역 치료 및 배양된 세포에서의 발현을 포함하는 다양한 목적에 적용되었다. 아데노바이러스 벡터와 폭스바이러스 벡터와 같은 벡터들은 광범위한 숙주 세포들에서 다중 뉴클레오티드 서열을 발현하는 잠재성과 거대한 클로닝 공간을 갖는 이점을 갖는다. 다중 뉴클레오티드 서열의 발현은 (예를 들어, 체액성 면역과 세포성 면역을 결합하는) 코딩된 폴리펩티드에 의 하여 제공되는 치료 효율성을 향상시키는데 유익할 수 있다. 원하는 뉴클레오티드 서열 각각을 발현시키기 위하여 분리되어 조작된 복수의 재조합 벡터를 생산하는 것 보다, 적어도 생산 단계 및 조절 허가(regulatory approval)를 촉진시키기 위하여 단일 재조합 벡터를 생산하는 것이 이로울 수 있다.
예를 들어, 파필로마 바이로스 감염에 있어서, 예를 들어, HPV-16과 KPV-18과 같은 다중 감염의 위험에 놓인 개체에서 특히 숙주의 면역 반응을 넓히거나 강화시키기 위하여, 몇 가지 파필로마 바이러스 유전형들(genotypes)로부터 면역원 폴리펩티드들을 발현시키는 것이 흥미로울 수 있다. 그러나, 뉴클레오티드 서열을 코딩하는 상기 면역원 폴리펩티드들은 상관된 HPV 유전형 간에 높은 상동성을 나타낸다. 예를 들어, 뉴클레오티드 수준에서 전체적으로 63%의 상동성을 나타내는 HPV-16 E6와 HPV-18 E6 서열은, 그럼에도 불구하고, 단일 벡터로부터 HPV-16과 HPV-18 유전자의 발현을 위태롭게 할 수 있는 75%를 넘는 매우 높은 상동성의 특정 지역을 포함한다.
더구나, 바이러스 오리진의 폴리펩티드를 발현하는 경우, 상동성 뉴클레오티드 서열들이 전체적인 바이러스 게놈으로부터 나타날 수 있다. 바이러스는 동일한 뉴클레오티드 서열을 사용하여 내부 번역 개시 또는 리딩 프레임 시프트, 즉, 동일한 DNA 서열이 하나의 리딩 프레임 이상으로 번역되는 것과 같은 생물학적 메커니즘을 통한 두 개의 다른 단백질들을 코딩하는 것이 오히려 빈번하게 일어난다. 예를 들어, HPV-16 게놈에 있어서, 인접한 E1과 E2 유전자는 다른 리딩 프레임으로 번역되는 59 뉴클레오티드가 오버래핑되어 있다. 다시 말하면, E1 유전자의 마지막 59 뉴클레오티드는 E2 유전자의 첫 59 뉴클레오티드와 오버래핑되어 있다.
그러나, 벡터에서 상동성 서열의 존재는, 벡터 생산 단계 중에 상동성 서열 간에 발생하는 재조합 발생(event)에 기인하는 유전자 서열의 손실을 이끄는, 특히 벡터의 안정성에 나쁜 영향을 주는 것으로 기대된다. 그러므로, 단일 벡터에서 HPV-16 E1과 E2 유전자들의 발현은 상동성 재조합 발생을 강력하게 일으키고, 마침내는 E1과 E2 상동성 서열 간에 포함되는 서열의 손실을 야기하는 59 뉴클레오티드의 공통 부분의 존재와 관련된다. 또한, 이러한 원하지 않는 상동성 재조합 발생은 동일한 벡터에서 HPV-16과 HPV-18 유전자 서열을 발현시킬 때 발생할 수 있다. 이러한 불안정성 문제는, 특히 인간 임상 적용을 위한 벡터 스톡(stock)을 불안정하게 할 수 있다.
이러한 측면에 있어서, WO92/16636은 재조합 발생의 가능성을 감소시키기 위하여, 재조합 벡터에 상동성 뉴클레오티드 서열들을 각각에 대하여 반대 방향으로 삽입시키는 것을 제안하고 있다. 그러나, 이러한 전략은 백시니아 바이러스와 연관되며, 아데노 바이러스와 같은 다른 재조합 벡터들에 대하여는 설명하고 있지 못한다. 더구나, 프로모터 간섭(promoter interference) 가능성과 구조적 제한(construction constraint)때문에, 반대 방향으로의 배열은 항상 가능한 것도 아니다.
원 상태(native context)에 있어서, 높은 상동성 부분들을 포함하는, 동일한 것으로부터 또는 관련된 생명체로부터 얻어진 뉴클레오티드 서열들을 숙주 세포 또는 개체에서 발현할 수 있는 재조합 벡터들을 생산하는 기술이 요구되어 진다. 본 발명은 유전자 코드의 축퇴성(degeneracy)을 이용하여, 코딩되는 아미노산 서열을 변화시키지 않거나, 크게 변화시키지 않으면서도, 상동성 뉴클레오티드 서열들의 어느 한쪽 또는 양쪽을 수식 전보다 상동성이 적어지게 변화시키는 재조합 발생의 가능성을 최소화시키기 위하여 디자인된 신규한 전략을 제공하여 이러한 요구를 충족시킨다. 본 발명은 상동성 서열들 사이에서, 특히 벡터 생산 단계에서 발생하며, 이들 사이에 포함된 뉴클레오티드 서열의 손실을 이끌 수 있는 상동성 재조합의 결실 효과를 회피하는 것을 가능하게 한다. 본 발명의 벡터는 원 상태에서 59 뉴클레오티드의 100%의 상동 부분을 공유하는 El 및 E2 파필로마 바이러스 유전자를 발현하는데 있어서 놀라울 정도로 효과적이고, 벡터 생산 단계 동안 놀라울 정도로 안정된 것으로 알려졌다. 또한, 본 발명의 벡터는 밀접하게 관련된 HPV- 16 및 HPV- 18 유전자형으로부터 얻어진 E6 및 E7 유전자를 발현하는데 있어서도 놀라울 정도로 효율적인 것으로 알려졌다.
여러 기술적 문제점들은 청구항들에 의해 정의된 발명을 구현한 구체예로서 해결된다.
본 발명의 또 다른 측면과 특성 및 이점들은 하기 기술된 본 발명의 바람직한 구체예들에 의해 명확해 질 것이다. 이들 구체예들은 개시의 목적으로 제공된다.
따라서, 본 발명의 첫 번째 측면에 있어서, 본 발명은 제1의 폴리펩티드를 코딩하는 제1의 핵산 분자와 제2의 폴리펩티드를 코딩하는 제2의 핵산 분자를 포함하는 벡터를 제공하며,
- 상기 제1의 핵산 분자 및 제2의 핵산 분자들은 40 또는 그 이상의 연속된 뉴클레오티드 부분에서 약 80%, 또는 80% 이상의 상동성을 보이는 제1의 원(native) 핵산 서열 및 제2의 원 핵산 서열로부터 각각 얻어지고,
- 벡터를 구성하는 상기 제1의 핵산 분자 및/또는 제2의 핵산 분자는 상기 상동성을 75% 미만으로 감소시키도록 수식(modified)된다.
본 명세서 전체에서 사용된 표현 "하나"는 문맥상 다른 의미로 사용되지 않는한 참조된 조성물 또는 과정의 "최소한 하나", "최소한 첫 번째", "하나 또는 그 이상", "다수"를 의미하는 것으로 사용되었다. 예를 들어, "하나의 세포"는 그 혼합물을 포함하는 다수의 세포들을 포함한다.
본 명세서에서 사용된 표현 "및/또는"은 "및", "또는" 및 "상기 용어에 의해 연결되는 요소 전체 또는 일부의 조합"의 의미를 포함한다. 예를 들어, "제1의 핵산 분자 및/또는 제2의 핵산 분자"는 제1의 핵산 분자 또는 제2의 핵산 분자, 또는 제1의 핵산 분자와 제2의 핵산 분자 모두를 의미한다.
본 명세서에서 표현 "약" 또는 "대략"은 주어진 값 또는 범위에서 5% 이내, 바람직하게는 4% 이내, 보다 바람직하게는 2% 이내를 의미한다.
본 명세서에서 생산물, 조성물 및 방법을 정의하기 위해 사용되는 "포함한다"는 표현은 생산물이나 조성물, 방법 등이 참조된 성분이나 단계를 포함하되 다른 요소를 배제하지는 않는다는 것을 의미하기 위해 사용되었다. "본질적으로 구성된다"는 표현은 본질적인 의미를 가지는 다른 성분 또는 과정을 배제하는 것을 가르키는 것으로 사용된다. 따라서, 본질적으로 인용된 성분들로 구성되는 성분은 소량의 오염 물질이나 의약적으로 수용가능한 매개체를 배제하지는 않는다. "구성된다"는 표현은 다른 성분이나 과정의 사소한 요소 이상을 배제하는 것을 의미한다. 예를 들어, 어떠한 아미노산 서열로 "구성된" 폴리펩티드라 함은 상기 폴리펩티드가 인용된 아미노산 서열 이외의 다른 아미노산 서열은 포함하지 않음을 의미한다. 어떠한 아미노산 서열로 "본질적으로 구성된" 폴리펩티드라 함은 인용된 아미노산 서열이 소수의 아미노산 잔기, 즉 1 내지 약 50 정도의 잔기만을 부가적으로 포함하며 존재함을 의미한다. 어떠한 아미노산 서열을 "포함하는" 폴리펩티드라 함은 인용된 아미노산 서열이 폴리펩티드의 최종 아미노산 서열의 최소한 일부분임을 의미한다. 이러한 폴리펩티드는 수백 개에 달할 수 있는 부가적인 아미노산 잔기들을 다소 포함할 수 있다. 이러한 부가적인 아미노산 잔기들은 여러 작용을 하며 특히 폴리펩티드 트래픽킹(trafficking)에서 역할을 할 수 있고, 폴리펩티드 생성이나 정제를 촉진하며, 반감기를 증가시킨다. 이들은 핵산 서열을 위해서도 동일하게 적용할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 표현 "벡터"는 숙주 세포 또는 개체 내에서 최소한 제1의 핵산 분자 및 제2의 핵산 분자를 전달하고 발현시킬 수 있는 작용 인자이다. 이 벡터는 비염색체성이거나 (예를 들어, 에피좀(episome)), 통합되거나 (숙주 염색체에 통합되기 위하여), 자체적으로 복제될 수도 아닐 수도 있으며, 다중 또는 낮은 사본(low copy)이거나, 이중 나선 또는 단일 나선이거나, 원 형태(naked) 또는 다른 분자와의 복합체 (예를 들어, 다른 지질 또는 폴리머와 복합되어 리포솜(liposome), 리포플렉스(lipoplex) 또는 나노 입자와 같은 특정 구조를 형성하는 벡터, 바이러스 캡시드에 패키징된 벡터, 및 고체 입자 상에 고정된 벡터 등)일 수 있다. 용어 "벡터"의 정의는 또한 특정 숙주 세포로의 바람직한 타겟팅을 허용하기 위해 수식된 벡터들까지를 포함한다. 타겟팅된 벡터의 특징적 성질은 그 표면에 세포 특이적 마커 (예를 들어, HPV 감염 세포), 조직 특이적 마커 또는 종양 특이적 마커와 같은 표면 노출(surface-exposed) 성분을 인식하고 이에 결합되는 리간드가 존재한다는 것이다. 리간드는 벡터의 표면에 존재하는 폴리펩티드(예를 들어, WO94/10323 와 WO02/96939에 기술된 아데노 바이러스 섬유, 펜톤(penton), pIX, 또는 EP 1 146 125에 기술된 백시니아 pl4 유전자 생산물)에 유전공학적으로 삽입될 수 있다.
본 발명의 맥락과 관련하여, 용어 "핵산", "핵산 분자", "폴리뉴클레오티드" 및 "뉴클레오티드 서열"은 교차적으로 사용되어 임의의 길이를 가지는 폴리데옥시리보뉴클레오티드 (DNA) 또는 폴리리보뉴클레오티드 (RNA) 분자의 폴리머, 또는 이들의 임의의 조합으로 정의된다. 이러한 정의는 단일 또는 이중 나선의, 선형 또는 원형의 자연적으로 발생하거나 합성된 폴리뉴클레오티드를 모두 포함한다. 또한, 이러한 폴리뉴클레오티드는 핵산의 인 비보(in vivo) 안정성을 증가시키고, 이의 전달을 향상시키거나, 또는 숙주 개체로부터의 제거율(clearance rate)을 감소시키기 위해 화학적 변이들 (예를 들어, WO 92/03568; US 5,118,672)뿐만 아니라 자연적으로 발생하지 않는 뉴클레오티드들 (예를 들어, 메틸화 뉴클레오티드와 US 5,525,711, US 4,711,955 또는 EPA 302 175에 기술된 것과 같은 뉴클레오티드 유사물)을 포함한다. 변이가 존재하는 경우에는 중합의 이전 또는 이후에 적용될 수 있다.
본 명세서에서 용어 "폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 9 또는 그 이상의 펩티드 결합으로 결합된 아미노산을 포함하는 아미노산 잔기 폴리머를 가르키는 것으로 교차적으로 사용되었다. 이 폴리머는 선형 또는 분기된 형태이거나 원형일 수 있다. 본 발명의 문맥에 있어, "폴리펩티드"는 L 스테레오아이소머 (원 발생 형태) 또는 D 스테레오아이소머인 아미노산을 포함하며, [베타]-알라닌, 오르니틴(ornithine), 또는 메티오닌 설폭사이드(methionine sulfoxide)와 같은 20개의 통상의 자연적으로 발생하는 아미노산 이외의 아미노산, 또는 알파-아미노, 알파-카르복실 또는 사이드체인(side-chain)에서 예를 들어, 메틸, 포르밀, 아세틸, 글리코실, 포스포릴 등을 부가하여 수식된 하나 또는 그 이상의 아미노산 등을 포함할 수 있다. 일반적인 기술을 따르면, 아미노산 폴리머의 길이가 긴 경우 (예를 들어, 50이 넘는 아미노산 잔기들)에는 바람직하게는 폴리펩티드 또는 단백질로 지칭된다. 결과적으로, "펩티드"는 길이에 있어 약 9 내지 약 50의 아미노산을 가지는 단편을 지칭하다. 본 발명의 문맥에 있어, 펩티드는 바람직하게는 원 발생 형태의 (또는 원래의) 단백질의 선택된 영역, 예를 들어, 에피토프를 포함하는 이들의 면역원 단편을 포함한다.
본 명세서에서 정의된 용어 "폴리펩티드"는 수식된 폴리펩티드뿐만 아니라 원 폴리펩티드까지를 포함한다. 본 명세서에서 사용된 용어 "원"은 자연계의 소스로부터 회수된 물질을 의미하며 인공적으로 수정되거나 실험실에서 사람에 의해 변경된 물질과 구분된다. 예를 들어, 원 폴리펩티드는 야생 형태의 생명체 또는 세포의 게놈에 존재하는 유전자에 의해 코딩된다. 반대로, 수식된 폴리펩티드는 원 폴리펩티드와 달라지도록 실험실에서 수식된 핵산 분자에 의해 코딩되며, 이는 예를 들어, 하나 또는 그 이상의 아미노산을 삽입, 제거 또는 치환하거나 이들 가능한 방법들의 조합을 통해 이루어진다. 여러 단계의 수식이 예상되는 경우에는, 이들은 연속적인 잔기들 및/또는 비연속적인 잔기들과 관련될 수 있다. 본 발명에 의하여 구상된 수식의 예는 자연 폴리펩티드에서 보여지는 생물학적 활성의 변화를 가져올 수 있다. 주어진 생물학적 활성을 위해 중요한 아미노산들은 구조 및 기능 분석에 의해 일반적인 방법으로 알아낼 수 있으며 본 발명의 분야에 숙련된 사람은 이러한 생물학적 활성을 감소시키거나 제거할 수 있는 변이의 종류를 결정할 수 있을 것이다. 이러한 변이는 현장 환경에 적절한 돌연변이 생성과 같은 일반적인 기술을 사용하여 수행될 수 있다. 다른 방법으로, 자동화된 공정에서 화학적 합성을 통해 수식된 폴리펩티드를 코딩하는 합성된 핵산 분자를 생성할 수 있다 (예를 들어, 실시예 부분에 기술된 상호 겹치는 올리고뉴클레오티드로부터 조합될 수 있다).
본 명세서에서 사용된 "얻어졌다"는 표현은 물질이 자연계의 소스로부터 발견되거나, 분리되거나, 정제되거나, 유도되었음을 의미한다. "분리되었다"는 것은 원래의 자연적 환경으로부터 제거되었음을 의미한다. "정제된다"는 것은 물질이 원래는 상호 연관되어 있는 하나 이상의 다른 성분으로부터 실질적으로 자유로움을 나타낸다. "유도된다"는 것은 원 물질과 비교하여 하나 또는 그 이상이 변형된 것을 나타낸다(특히, 치환, 결실 및/또는 삽입 등과 같은 변형). 분리, 정제 및 변형 기술들은 해당 분야에서 일반적이며 목표로하는 물질에 따라 달라진다(예를 들어, 핵산 분자의 클로닝은 제한 효소를 이용하여, PCR 또는 화학적 합성을 통해 자연계의 소스를 사용하여 수행할 수 있다).
본 발명에서 사용된 용어 "상동성"은 일반적으로 백분율로 표시되며 최소한 40개의 연속된 뉴클레오티드들(예를 들어, 약 40, 45, 50, 55, 57, 58, 59, 60, 70 또는 그 이상의 연속된 뉴클레오티드들)의 영역에서 상호간에 주어진 정도의 동일성을 보유하는 뉴클레오티드 서열들을 나타낸다. "최소한 80%"라 함은 대략 80% 또는 80% 보다 큰 것을 나타낸다 (예를 들어, 80% 보다 큰 어떤 값, 유리하게는 최소한 85%, 다소 바람직하게는 최소한 87%, 바람직하게는 최소한 90%, 좀 더 바람직하게는 최소한 95%, 더욱더 바람직하게는 최소한 97% 내지 100%의 서열 상동성). "75% 보다 작다"라고 함은 75 보다 작은 임의의 값을 의미한다(예를 들어, 대략 74, 72, 70, 68, 65, 62, 60% 또는 그보다 작은 값). 두 개의 뉴클레오티드 서열들 간의 상동성 비율은 각 서열들에 의해 공유되는 동일한 위치들의 갯수의 함수이며, 최적의 배열을 위해 도입될 필요가 있는 간격들의 갯수와 각 간격의 길이를 고려해야 한다. 뉴클레오티드 서열들 간의 상동 비율을 결정하기 위하여, GCG Wisconsin 팩키지, BLAST(Basic Local alignment Search Tool) 프로그램과 같은 본 발명 분야의 다양한 컴퓨터 프로그램 및 수학적 알고리즘을 사용할 수 있으며 이들은 국립 바이오 기술 정보 센터(National Center for Biotechnology Information: NCBI)에서 공개적으로 이용 가능하고 여러 인쇄 매체(예를 들어, Altschul 등, 1990, J. Mol. Biol. 215, 403~410)에 기술되어 있다.
출발점으로서, 수식 이전에, 80% 또는 80% 이상의 상동성 비율, 즉 "상동성" 부분들을 공유하는 40 또는 그 이상의 연속된 뉴클레오티드들의 하나 또는 그 이상의 부분들을 나타내기 위해, 제1의 핵산 분자 및 제2의 핵산 분자 사이의 서열 얼라인먼트가 사용될 수 있다. 특정 구체예에서, 상동성 비율을 75% 이하(예를 들어, 약 74, 72, 70, 68, 65, 62, 60% 또는 그 이상)로 감소시키기 위해서, 최소한 상기 40 또는 그 이상 부분(예를 들어, 약 40, 45, 50, 55, 57, 58, 59, 60, 70 또는 그 이상)의 상동성 연속 뉴클레오티드에서 제1의 핵산 분자 또는 제2의 핵산 분자 또는 제1의 핵산 분자 및 제2의 핵산 분자 모두의 코돈 사용 패턴은 수정될 수 있다 (예를 들어, 코돈 사용 패턴의 축퇴화를 통해).
메티오닌(methionine)과 트립토판(tryptophane) 잔기들이 각각 독특한 핵산 트리플릿(즉, 코돈)에 의해 코딩되는 반면에, 다른 코돈들은 18개의 다른 아미노산(유전 코드의 축퇴(degeneracy))의 코딩을 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 아미노산은 다음의 코돈들에 의해 코딩된다: 알라닌(alanine) (Ala 또는 A)은 코돈 GCA, GCC, GCG 및 GCU에 의해 코딩된다; 시스테인(cysteine) (C 또는 Cys)은 코돈 UGC 및 UGU에 의해 코딩된다; 아스파라긴산(D 또는 Asp)은 코돈 GAC 와 GAU에 의해 코딩된다; 글루탐산(E 또는 Glu)은 코돈 GAA와 GAG에 의해 코딩된다; 페닐알라닌(F 또는 Phe)은 코돈 UUC 와 UUU에 의해 코딩된다; 글리신(G 또는 Gly)은 코돈 GGA, GGC, GGG, 와 GGU에 의해 코딩된다; 히스티딘(H 또는 His)은 코돈 CAC 와 CAU에 의해 코딩된다; 이소류신(I 또는 Ile)은 코돈 AUA, AUC 와 AUU에 의해 코딩된다; 리신(K 또는 Lys)은 코돈 AAA 와 AAG에 의해 코딩된다; 류신(L 또는 Leu)은 코돈 UUA, UUG, CUA, CUC, CUG 와 CUU에 의해 코딩된다; 메티오닌(M 또는 Met)은 코돈 AUG에 의해 코딩된다; 아스파라긴(N 또는 Asn)은 코돈 AAC 와 AAU에 의해 코딩된다; 프롤린(P 또는 Pro)은 코돈 CCA, CCC, CCG 와 CCU에 의해 코딩된다; 글루타민(Q 또는 GIn)은 코돈 CAA 와 CAG에 의해 코딩된다; 아르기닌(R 또는 Arg)은 코돈 AGA, AGG, CGA, CGC, CGG 와 CGU에 의해 코딩된다; 세린(S 또는 Ser)은 코돈 AGC, AGU, UCA, UCC, UCG 와 UCU에 의해 코딩된다; 트레오닌(T 또는 Thr)은 코돈 ACA, ACC, ACG 와 ACU에 의해 코딩된다; 발린(V 또는 Val)은 코돈 GUA, GUC, GUG 와 GUU에 의해 코딩된다; 트립토판(W 또는 Trp)은 코돈 UGG에 의해 코딩된다; 티로신(Y 또는 Tyr)은 코돈 UAC 와 UAU에 의해 코딩된다.
상기 제1의 핵산 분자 및 제2의 핵산 분자 내에 존재하는 하나 또는 그 이상의 상동 부분 내의 상동성 비율을 감소시키는 것은 유전자 코드의 축퇴를 이용하여 제1의 핵산 분자 및/또는 제2의 핵산 분자 내의 코돈 사용 패턴을 변경시킴으로써 성취될 수 있다. 코돈 사용 패턴의 변경은 일반적으로 하나 또는 그 이상의 "원" 코돈을 다른 코돈으로 대체함으로써 수행된다. 예를 들어, Arg로 코딩한 AGA 코돈을 Arg으로 코딩한 CGC 코돈으로 대체함으로써 코돈의 3 위치 중 2 위치에서의 상동성 비율이 낮아지게 된다. 상동성은 부분 치환에 의해 충분히 감소하므로 원 코돈 모두를 축퇴시킬 필요는 없다. 또한, 코돈 사용 패턴의 수정은 핵산 분자 전체에 대하여 수행되거나 또는 수식 이전에 존재하는 상동성 부분으로 한정될 수도 있다. 바람직하게는, 본 발명의 문맥에 있어, 축퇴화는 제1의 핵산 분자에서 수행되고 상동성 부분으로 제한된다. 바람직하게는, 코돈 사용 패턴은 뉴클레오티드 수준에서 수정되고 아미노산 수준에서는 나타나지 않는데, 즉 가능한 경우에, 각각의 "원" 코돈은 동일한 아미노산을 코딩하는 코돈으로 대체되어 이러한 수정이 코딩된 폴리펩티드에서는 번역되지 않게 된다. 좀더 바람직하게는, 가능한 경우에, 코돈 사용 패턴은 제1의 핵산 분자 및 제2의 핵산 분자 사이의 상동성 부분이 9 미만으로 또는 8 연속 뉴클레오티드들로, 유용하게는 7 미만의 연속한 뉴클레오티드들로, 바람직하게는 6 연손 뉴클레오티드들로, 그리고 좀더 바람직하게는 5 미만의 연속한 뉴클레오티드들로 제한되도록 수식된다. 코돈 사용 패턴의 수식은 본 발명 기술 분야에 숙련된 사람에게 알려진 여러 방법으로 수행될 수 있으며, 현장 환경에 적합한 돌연변이화(mutagenesis) (예를 들어, Sculptor™ 인 비트로(in vitro) 돌연변이 시스템, Amersham, Les Ullis, France), PCR 돌연변이화, DNA 셔플링(shuffling) 및 화학적 합성 기술(예를 들어, 합성 핵산 분자의 생성).
본 발명에 따른 벡터가 2개를 초과하는 핵산 분자를 포함하는 경우에는, 벡터에 포함되고, 연속 뉴클레오티드로서 다른 핵산 분자가 얻어질 수 있는 최소한 하나의 다른 원 핵산 서열을 가지는 뉴클레오티드의 40 또는 그 이상 부분에서 약 80% 또는 80%를 초과하는 상동 비율을 보이는 원 핵산 서열에서 얻어지는 어떠한 핵산 분자도 수식되어 상동성 비율을 75% 미만으로, 즉 벡터에 포함되는 어떠한 핵산 분자들의 쌍도 75% 이상의 동일 비율을 보이는 연속 뉴클레오티드의 40 또는 그 이상의 부분을 포함하지 않도록 하게 된다.
80% 또는 80%를 초과하는 상동성을 보이는 하나 또는 그 이상의 부분들을 나타내기 위해 핵산 분자가 얻어지는 각 (쌍의) 원 서열들의 서열 배열이 사용될 수 있다. 그리고, 최소한 상동 부분의 상동성 비율을 75% 미만으로 감소시키기 위해 하나 또는 그 이상의 원 서열들의 서열이 특히 코돈 사용을 축퇴시킴으로써 수식된다. 결국에는, 벡터에 포함되는 어떤 핵산 분자도 상기 벡터의 다른 핵산 분자와 75%를 초과하는 동일 비율을 보이는 40 또는 그 이상(예를 들어,, 45, 50, 55, 57, 58, 59, 60, 70 또는 그 이상) 부분의 연속 뉴클레오티드를 포함할 수 없다.
상기 기술한 바와 같이, 벡터를 구성하는 핵산 분자에 의해 코딩된 폴리펩티드는 원 폴리펩티드와 같은 아미노산 서열을 가질 수도 있고 그렇지 않을 수도 있다. 특히, 최소한 벡터에 포함되는 핵산 분자의 상동 부분에서 상동성을 감소시키기 위한 코돈 사용의 축퇴를 위한 변이와 함께, 벡터에 포함되는 상기 핵산 분자는 또한 코딩된 폴리펩티드의 아미노산 서열의 수식을 초래하거나 초래하지 않을 수 있는 부가적인 변이를 포함할 수 있다.
본 발명의 벡터는 비바이러스 벡터(예를 들어, 플라스미드 DNA)뿐만 아니라 바이러스 벡터까지를 포함한다. 적절한 비바이러스 벡터는 pREP4, pCEP4 (Invitrogene), pCI (Promega), pCDM8 (Seed, 1987, Nature 329, 840), pVAX 및 pgWiz와 같은 플라스미드를 포함한다 (Gene Therapy System Inc; Himoudi 등, 2002, J. Virol. 76, 12735~12746). 본 명세서에서 "바이러스 벡터"는 본 발명의 분야에서 인식되는 의미로 사용된다. 이는 완전한 바이러스 게놈, 이의 일부분, 또는 하기 기술된 수식된 바이러스 게놈과 이로부터 생성되는 바이러스 입자(예를 들어, 감염 바이러스 입자를 생산하기 위해 바이러스 캡시드에 패키징된 바이러스 벡터)까지를 포함하여 최소한 하나의 바이러스 유래 요소를 가지는 임의의 벡터를 나타낸다. 본 발명의 바이러스 벡터들은 복제 능력을 가지거나, 또는 복제 능력 결핍을 위해 이 능력이 제거되거나 또는 복제 능력이 손상될 수 있다. 본 명세서에서 사용된 용어 "복제 능력"은 특정 숙주 세포 (예를 들어, 종양 세포) 내에서 우수하게 또는 선택적으로 복제할 수 있도록 조작된 복제 선택적이고 조건적으로 복제할 수 있는 바이러스 벡터들을 포함한다. 바이러스 벡터는 다양한 다른 바이러스들로부터, 특히 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노 연관 바이러스 (AAV), 수두 바이러스, 간염 바이러스, 홍역 바이러스 및 포미(foamy) 바이러스로 이루어지는 군으로부터 선택된 바이러스로부터 얻을 수 있다.
하나의 구체예에서, 본 발명의 벡터는 아데노 바이러스 벡터이다(리뷰에 관하여는 다음을 참조: "유전자 치료를 위한 아데노 바이러스 벡터", 2002, Ed D. Curiel, J. Douglas, Academic Press). 이는 어떠한 인간 또는 동물의 아데노 바이러스로부터도 유도될 수 있다. 어떠한 혈청형 및 하위군들도 본 발명의 문맥에 맞게 채용될 수 있다. 보다 많은 특정한 하위군 A (예를 들어, 혈청형 12, 18 및 31), 하위군 B (예를 들어, 혈청형 3, 7, 11, 14, 16, 21, 34 및 35), 하위군 C (예를 들어, 혈청형 1, 2, 5 및 6), 하위군 D (예를 들어, 혈청형 8, 9, 10, 13, 15, 17, 19, 20, 22-30, 32, 33, 36-39 및 42-47), 하위군 E (혈청형 4), 및 하위군 F (혈청형 40 및 41)이 인용될 수 있다. 인간 아데노 바이러스 2 (Ad2), 5 (Ad5), 6 (Ad6), 11 (Ad11), 24 (Ad24) 및 35 (Ad35)가 특별히 바람직하다. 이러한 아데노 바이러스는 ATCC (American Type Culture Collection, Rockville, Md.)에서 구할 수 있으며, 많은 출판물들이 이들의 서열, 조직 및 제조 방법을 기술하고 있어 기술자들이 이들을 응용할 수 있다(예를 들어, US 6,133,028; US 6,110,735; WO 02/40665; WO 00/50573; EP 1016711; Vogels 등, 2003, J. Virol. 77, 8263~8271 참조).
본 발명의 아데노 바이러스 벡터는 복제 능력을 가질 수 있다. 복제 능력을 가지는 아데노 바이러스 벡터들의 많은 예가 본 발명의 분야에 숙련된 사람들에게 잘 알려져 있다 (예를 들어, Hernandez-Alcoceba 등, 2000, Human Gene Ther. 11, 2009~2024; Nemunaitis 등, 2001, Gene Ther. 8, 746~759; Alemany 등, 2000, Nature Biotechnology 18, 723~727; WO00/24408; US 5,998,205, WO99/25860, US 5,698,443, WO00/46355, WO00/15820 및 WO01/36650).
다른 경우에 있어, 본 발명의 아데노 바이러스 벡터는 복제 능력이 결핍된 벡터이다(예를 들어, WO94/28152 참조). 바람직한 복제 결핍 아데노 바이러스 벡터는 El-결핍(El-defective) (예를 들어, US 6,136,594 및 US 6,013,638)으로 El 결핍이 위치 약 459에서 3328까지, 또는 위치 약 459에서 3510까지 연장된다(인간 아데노 바이러스 5형 서열에 대한 참조: GeneBank, accession number M 73260, 및 Chroboczek 등, 1992, Virol. 186, 280~285). 클로닝 능력 및 안정성은 아데노 바이러스 게놈의 부가 부분(예를 들어, Lusky 등, 1998, J. Virol 72, 2022~2032에 기술된 것과 같은 비필수적인 E3 영역 또는 다른 필수적인 E2, E4 영역)을 제거함으로써 더욱 향상될 수 있다.
제1의 핵산 분자 및 제2의 핵산 분자는, Chartier 등 (1996, J. Virol. 70, 4805~4810)에 기술된 바와 같이, 본 발명의 아데노 바이러스 벡터의 어느 위치에나 독립적으로 삽입될 수 있으며, 삽입 영역의 원 전사 방향에 대해 센스 및/또는 안티센스 방향으로 독립적으로 위치할 수 있다. 예를 들어, 이들은 El 영역을 대신하여 삽입되거나, 다른 경우에는 하나가 El 영역을 대신하여 삽입되고 다른 하나는 E3 영역을 대신하여 삽입된다.
다른 구체예에서, 본 발명의 벡터는 수두 바이러스 벡터이다 (참조예: Cox 등 "Viruses in Human Gene Theraphy" Ed J. M. Hos, Carolina Academic Press). 폭스비리데(poxviridae), 특히 카나리폭스(canarypox) (예를 들어, WO95/2778O에 기술된 ALVAC), 파울폭스(fowlpox)(예를 들어, Paoletti 등, 1995, Dev. Biol. Stand. 84, 159~163에 기술된 TROVAC) 또는 백시니아 바이러스 등으로부터 얻을 수 있으며 바람직한 것은 마지막에 인용된 것이다, 적절한 백시니아 바이러스 코펜하겐 종 (Goebel 등, 1990, Virol. 179, 247~266 및 517~563; Johnson 등, 1993, Virol. 196, 381~401), 와이어스 종, NYVAC (WO92/15672 및 Tartaglia 등, 1992, Virology 188, 217~232 참조) 및 고도로 완화되어 수식된 앙카라 종(Ankara (MVA) strain) (Mayr 등, 1975, Infection 3, 6~16)으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 이러한 벡터 및 그 제조 방법은 본 발명의 분야에 숙달한 사람이 구할 수 있는 여러 문헌에 기술되어 있다(예를 들어, Paul 등, 2002, Cancer gene Ther. 9, 470~477; Piccini 등, 1987, Methods of Enzymology 153, 545~563; US 4,769,330; US 4,772,848; US 4,603,112; US 5,100,587 및 US 5,179,993). 본 발명에서 사용된 제1의 핵산 분자 및 제2의 핵산 분자는 재조합 수두 바이러스가 활동적이고 감염력을 가지도록 하기 위해 바람직하게는 수두 바이러스 게놈의 비본질적인 유전자좌(locus)에 삽입될 수 있다. 비본질적인 영역은 코딩되지 않는 유전자간 영역이거나 활동성 저하나 제거가 바이러스 성장이나 복제 또는 감염력에 큰 영향을 미치지 않는 임의의 유전자이다. 결핍된 기능이 바이러스 입자 생성 시 전달 공급되는 경우라면, 예를 들어, 수두 바이러스 게놈에서 제거된 것에 해당하는 보완서열을 가지는 헬퍼 세포주를 이용하여, 본질적인 바이러스 유전자좌에 삽입하는 것도 생각할 수 있다.
코펜하겐 백시니아 바이러스를 사용할 때, 상기 최소한 제1의 핵산 분자 및 제2의 핵산 분자는 바람직하게는 티미딘 키나아제(thymidine kinase)(tk) 유전자 (Hruby 등, 1983, Proc. Natl. Acad. Sci USA 80, 3411~3415; Weir 등, 1983, J. Virol. 46, 530~537)에 삽입된다. 그러나, 다른 삽입 위치도 또한 적절하며, 예를 들어, 헤마글루티닌(hemagglutinin) 유전자 내부(Guo 등, 1989, J. Virol. 63, 4189~4198), K1L 유전자좌 내부, u 유전자 내부(Zhou 등, 1990, J. Gen. Virol. 71, 2185~2190) 또는 자발적 또는 조작된 결핍이 문헌에 보고된 백시니아 바이러스 게놈의 왼쪽 말단(Altenburger 등, 1989, Archives Virol. 105, 15~27 ; Moss 등 1981, J. Virol. 40, 387~395 ; Panicali 등, 1981, J. Virol. 37, 1000~1010; Perkus 등, 1989, J. Virol. 63, 3829~3836; Perkus 등, 1990, Virol. 179, 276~286 ; Perkus 등, 1991, Virol. 180, 406~410) 등을 들 수 있다.
MVA를 사용할 때, 최소한 제1의 핵산 분자 및 제2의 핵산 분자가 D4R 유전자좌뿐만 아니라 MVA 게놈에서 발생하는 결핍의 밝혀진 I 내지 VII의 어디에나 삽입될 수 있으나(Antoine 등, 1998, Virology 244, 365~396), 결핍 II 및/또는 III으로의 삽입이 바람직하다(Meyer 등, 1991, J. Gen. Virol. 72, 1031~1038; Sutter 등, 1994, Vaccine 12, 1032~1040).
가금 수두 바이러스를 사용하는 경우, 티미딘 키나아제 유전자 내의 삽입이 고려될 수도 있지만, 최소한 제1의 핵산 분자 및 제2의 핵산 분자를 ORF 7 와 9 사이에 위치하는 유전자간 영역에 도입하는 것이 바람직하다(예를 들어, EP 314 569 및 US 5,180,675 참조).
본 발명의 또 다른 실시예에서, 최소한 제1의 및 제2의 핵산 분자는 병리학적 조건을 보이거나 병리학적 조건을 보이기에 민감한 개체에서 치료적 또는 예방적 활동을 제공할 수 있는 폴리펩티드를 독립적으로 코딩한다. 본 명세서에서 사용된 용어 "개체"는 척추동물을 나타내며, 상세하게는 포유류의 일원이며 특정하게는 애완 동물, 농장 동물, 스포츠용 동물 및 사람을 포함하는 영장류이다. 이러한 폴리펩티드는 바람직하게는 면역성 폴리펩티드 와 반-종양 폴리펩티드으로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
"면역원성" 폴리펩티드는 이 폴리펩티드가 발현될 개체에서 면역 시스템을 유도하거나, 자극하거나, 발전 또는 촉진시킬 수 있는 폴리펩티드를 나타낸다. 이러한 면역 반응은 체액성 또는 세포성 또는 체액성 및 세포성 모두일 수 있다. 세포성 반응은 T-헬퍼 세포 및/또는 CTL 반응 및/또는 사이토킨(cytokine) 생산의 촉진을 유도하는 반면에 체액성 반응은 문제가 되는 폴리펩티드에 대하여 항체 생성을 유도한다. 전형적으로, 폴리펩티드의 면역 유전적 성질은 인 비트로 또는 인 비보를 통해 해당 분야에 표준적인 다양한 시험으로써 측정할 수 있다 (면역 반응의 시작과 활성화를 위한 기술들의 일반적인 기재가 이용 가능하며, 예를 들어, Coligan 등, Current Protocols in Immunology의 최종판; ed J Wiley & Sons Inc, National Institute of Health 등이 있다). 예를 들어, 색상측정(colorimetric), 형광측정(fluorometric) 또는 방사측정(radioactive) 등을 통해 탐지할 수 있으며 적절한 기술들에는 ELISA, 웨스텐 블랏, 방사면역시험(radioimmunoassay) 및 면역 침전시험(immunoprecipitation assay) 등이 포함된다. 세포성 면역성의 측정은 CD4+ 및 CD8+ T-세포에서 유도된 세포(예를 들어, ELIspot의 정량 IFNg-생성 세포)를 포함하는 활성화된 이펙터(effector) 세포에서 분비된 사이토킨 프로필을 측정하여 면역 이펙터 세포의 활성 상태를 결정하고(예를 들어, 고전적인 [3H] 티미딘 포획(uptake)에 의한 T 세포 확산 시험), 민감하게 된 개체에서의 항원에 특정한 T 림프구 시험을 통해(예를 들어, 세포 독성 시험에서 펩티드-특이적 분해(lysis)) 수행될 수 있다. 폴리펩티드의 면역 유전적 성질은 또한 ELIspot에 의한 적절한 동물 모델, 테트라머-기반 분석 기술 또는 T 세포-매개에 의한 면역 분석을 위한 기타 표준적 기술들에 의해 측정될 수 있다. 적절한 면역성 폴리펩티드들은 간염 B 바이러스 (HBV) (예를 들어, EP 414 374; EP 304 578 또는 EP 198 474에 기술된 S, preS2 또는 preSl-폴리펩티드); 간염 C 바이러스 (HCV) (예를 들어, Core (C), 외피(envelop) 당단백질 El, E2, 비구조적 폴리펩티드 NS2, NS3, NS4, 또는 NS5 또는 이들의 임의의 조합); 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV) (예를 들어, gp120 또는 gp160), 및 파필로마 바이러스(하기에 예시됨)로부터 얻을 수 있다.
"항-종양" 폴리펩티드는 종양 세포에서 억제 또는 종양 확산의 순감소를 제공할 수 있는 폴리펩티드를 나타낸다. 이러한 폴리펩티드의 항종양 특성은 적절한 동물 모델 또는 치료된 개체에서 일정 기간 동안 실제 종양 크기의 감소를 통해 결정할 수 있다. 방사성 방법(예를 들어, 단일 포톤 및 양전자 방출에 의한 컴퓨터 단층 촬영; 일반적인 방법은 "Nuclear Medicine in Clinical Oncology" Winkler, C. (ed.) Springer-Verlag, New York, 1986 참조)을 포함하여 종양 크기를 측정하기 위해 초음파 방법("Ultrasonic Differential Diagnosis of Tumors", Kossoff와 Fukuda, (eds.), Igaku-Shoin, New York, 1984 참조)을 포함하여 다양한 방법이 사용될 수 있으며, 종래의 이미지 시약(예를 들어, 갈륨-67 구연산)을 채용하는 방법, 면역학적 방법 (예를 들어, 방사성 동위원소에 의한 특이적 종양 마커에 관계된 단일 클론 항체 식별) 등이 있다. 다른 방법으로, 폴리펩티드의 항종양 특성이 종양 마커의 감소에 기반하여 결정될 수 있다. 예로써, 전립선암 탐지를 위한 PSA 및 결장암과 특정 유방암 탐지를 위한 CEA 등이 있다. 또한, 폴리펩티드의 항종양 특성은 적절한 동물 모델로써, 예를 들어, 대표적인 인간 암 세포주를 투여한 마우스를 이용하여 결정할 수 있다. 감지할 수 있는 종양이 진전된 후에는, 마우스에 본 발명의 벡터를 투여하여 종양 성장율의 감소와 생존 기간의 증가를 관찰할 수 있다. 부가적으로, 다양한 인 비트로 방법을 이용하여 인 비보 종양 억제를 예측할 수 있다. 적절한 항종양 폴리펩티드는 종양-유도 가능성을 가지는 바이러스로부터의 바이러스 폴리펩티드(예를 들어, 파필로마 바이러스)를 포함하여, MUC-1 (WO92/07000; Acres 등, 2005, Exp. Rev. Vaccines 4(4)), BRCA-1, BRCA-2 (Palma 등, 2006, Critical Reviews in Oncology/haematology 27, 1~23), 암배항원 CEA (Conroy 등, 1995, Gene Ther; 2, 59~65), MAGE (WO99/40188; De Plaen 등, 1994, Immunogenetics 40, 360~369), MART-1, gp 100 (Bakker 등, 1994, J. Exp. Med. 179, 1005~9), PRAME, BAGE, Lage (또는 NY Eos 1으로 알려진) SAGE, HAGE (WO99/53061), GAGE (Robbins와 Kawakami, 1996. Current Opinions in Immunol. 8, 628~36) 및 전립선 특이적 항체 (PSA) (Ferguson 등, 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96, 3114~9; WO98/12302, WO98/20117, WO00/04149)와 같은 종양 관련 항체(TAA)를 포함한다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 제1의 핵산 분자 및 제2의 핵산 분자는 동일한 생명체 또는 밀접하게 관련된 생명체로부터 얻어졌다.
본 명세서에서 사용된 표현 "생명체"는 보다 고등의 진핵생물뿐만 아니라 바람직하게는 병리학적 가능성을 가지는 미생물까지를 포함한다. 표현 "미생물"은 균류, 박테리아, 원생동물 및 바이러스를 나타낸다. 바이러스의 대표적인 예는 제한 없이 다음을 포함한다: HIV (HIV-1 또는 HIV-2), 인간 헤르페스 바이러스(예를 들어, HSV1 또는 HSV2), 사이토메갈로바이러스(CMV), 엡스타인 바르 바이러스(Epstein Barr virus) (EBV), 간염 바이러스(예를 들어, 간염 A 바이러스(HAV), HBV, HCV 및 간염 E 바이러스), 플라비 바이러스(flavi virus)(예를 들어, 황열(Yellow Fever) 바이러스), 바리셀라 조스터(varicella-zoster) 바이러스(VZV), 파라믹소 바이러스(paramyxo virus), 합포성 폐염 바이러스(respiratory syncytial virus), 파라인플루엔자(parainfluenza) 바이러스, 홍역 바이러스, 인플루엔자 바이러스 및 파필로마 바이러스 (상기 정의됨). 적절한 박테리아의 대표적인 예는 제한 없이 다음을 포함한다: 나이세리아(Neisseria) (예를 들어, N. 고노리어(N. gonorrhea)와 N. 메닝기티디스(N. meningitides)); 보데텔라(Bordetella) (예를 들어, B. 퍼투시스(pertussis), B. 파라퍼투시스(parapertussis) 와 B. 브롱키셉티카(bronchiseptica), 마이코박테리아(Mycobacteria) (예를 들어, M. 투베르쿨로시스(tuberculosis), M. 보비스(bovis), M. 레프리(leprae), M. 아빔(avium), M. 파라투베르쿨로시스(paratuberculosis), M. 스메그마티스(smegmatis)); 레지오넬라(Legionella) (예를 들어, L. 뉴모필라(pneumophila)); 대장균(Escherichia) (예를 들어, 엔테로톡식(enterotoxic) 대장균, 엔테로헤모리직(enterohemorragic) 대장균, 엔테로파소제닉(enteropathogenic) 대장균); 시젤라(Shigella) (예를 들어, S. 소나이(sonnei), S. 다이센테리(dysenteriae), S. 플렉스네리(flexnerii)); 살모넬라(Salmonella) (예를 들어, S. 타이피(typhi), S. 파라티피(paratyphi), S. 콜레라이수스(choleraesuis), S. 엔테리티디스(enteritidis)); 리스테리아(Listeria) (예를 들어, L. 모노사이토진스(monocytogenes)); 헬리코박터(Helicobacter) (예를 들어, H. 필로리(pylori)); 슈도모나스(Pseudomonas) (예를 들어, P. 에루기노사(aeruginosa)); 스타필로코커스(Staphylococcus) (예를 들어, S. 아우레우스(aureus), S. 에피데르미디스(epidermidis)); 엔테르코커스(Enterococcus) (예를 들어, E. 패칼리스(faecalis), E. 패시움(faecium)); 바실러스(Bacillus) (예를 들어, B. 안트라시스(anthracis)); 코리네박테리움(Corynebacterium) (예를 들어, C. 디피세리에(diphtheria)), 및 클라미디아(Chlamydia) (예를 들어, C. 트라코마티스(trachomatis), C. 뉴모니아(pneumonia), C. 시타시(psittaci)). 기생충의 대표적인 예는 제한 없이 플라스모디움(Plasmodium) (예를 들어, P. 팔시파럼(falciparum)); 톡소플라스마(Toxoplasma) (예를 들어, T. 곤디(gondii)); 레쉬마니아(Leshmania) (예를 들어, L. 메이저(major)); 뉴모시스티스(Pneumocystis) (예를 들어, P. 카리니(carinii)); 및 취조스토마(Schisostoma) (예를 들어, S. 만소니(mansoni))를 포함한다. 균류의 대표적인 예는 제한 없이 칸디다(Candida) (예를 들어, C. 알비칸스(albicans))와 아스페르지러스(Aspergillus)를 포함한다. 고등 진핵생물은 바람직하게는 인간을 포함하는 포유류이다.
"동일한 생명체"는 공통된 조상에서 유래되어 동일한 진화 경로를 따른 생명체로 정의된다. 대표적인 예는 같은 혈청형 또는 유전형을 가지는 바이러스들의 다양한 분리물들을 포함한다. 예를 들어, HPV-16의 두 분리물이 이러한 카테고리로 분류된다. "밀접하게 관련된 생명체"는 공통된 조상으로부터 기원되나, 진화동안 분화된 생명체를 말한다. 대표적인 예로는 다른 혈청형 또는 유전형을 갖는 바이러스를 포함한다. 예를 들어, HPV-16과 HPV-18이 이 카테고리로 분류된다.
바람직한 구체예에서, 최소한 제1의 핵산 분자 및 제2의 핵산 분자가 얻어지는 목적이 되는 생명체는 파필로마 바이러스이고 각각은 파필로마 바이러스 폴리펩티드를 코딩한다. "파필로마 바이러스"는 파필로마 바이러스 하위 패밀리에 속하는 바이러스로서 이 용어는 인간 파필로마 바이러스 (HPV)뿐만 아니라 인간 외로부터 유래하는 동물 파필로마 바이러스를 포함하며 가축, 말, 토끼, 양, 개, 인간 이외의 영장류 및 설치류를 포함하여 정의되지만 반드시 이에 한정되지는 않는다. 현재 100개 이상의 HPV 유전형이 발견되었으며 (Van Ranst 등, 1992, J. Gen. Virol. 73, 2653; De Villiers 등, 2004, Virology 324, 17~27), 이는 그 종양 발생 가능성에 따라 "저위험" (LR) 및 "고위험" (HR) 혈청형으로 분류된다. HR이 악성으로 진행하는 악성 종양을 일으키는 반면에 LR HPV은 감염된 개체에 양성 종양을 유발시킨다.
일반적으로 설명하면, 파필로마 바이러스들은 단백질 캡시드로 둘러싸인 약 7900 기반의 쌍으로된 이중 나선의 원형 DNA를 가진다 (예를 들어, Pfister, 1987, The papovaviridae : The Papillomaviruses, Salzman과 Howley edition, Plenum Press, New Yolk, p 1~38 참조). 이들의 게놈은 3개의 기능 영역으로 구성되는데, 이는 초기 (E), 말기 (L) 및 장기 제어 (LCR) 영역을 말한다. LCR은 인핸서(enhancer)와 프로모터와 같은 전사 조절 서열을 포함한다. 초기 영역이 바이러스 복제, 전사 및 세포성 변환을 제어하는 핵에서 주로 발견되는 조절 단백질 (E1-E7)을 코딩하는데 반하여, 말기 영역은 구조적 L1 및 L2 단백질을 코딩하는데 이들 단백질은 각각 메이저 또는 마이너 캡시드 단백질이다. 좀더 상세하게는, E1 단백질은 ATP-의존 헬리카아제성을 가지는 DNA 결합 인산단백질이다(Desaintes와 Demeret, 1996, Semin. Cancer Biol. 7, 339~347; Wilson 등, 2002, 바이러스 유전자 24, 275~290). E2 단백질은 바이러스 유전자 전사를 조절하고 DNA 복제를 제어하는 다기능 DNA 결합 인산 단백질이다 (Bechtold 등, 2003, J. Virol. 77, 2021~8). E4-코딩 단백질은 세포질 케라틴 네트워크를 결합하고 교란하며 바이러스 성숙을 담당한다. E5 단백질을 위한 기능은 아직 논란이 되고 있으며 그 발현은 가끔 바이러스 숙주 염색체로의 통합 과정에서 소실된다. HR HPV 유전자형의 E6 및 E7-코딩 유전자 생성물은 감염된 세포의 종양성 변환에 관련되며 이는 이들 바이러스 단백질들이 세포성 종양 억제제 또는 유전 생성물 p53과 레티노블라스토마(retinoblastoma :Rb)에 각각 결합되기 때문인 것으로 추정된다(Kanda 등, 1988, J. Virol. 62, 610~3; Vousden 등, 1988, Oncogene Res. 3, 1~9; Bedell 등, 1987, J. Virol. 61, 3635~40) (리뷰는 Howley, 1996, 파필로마 바이러스와 그 복제, p 2045~2076. B.N. Fields, D. M. Knipe와 P.M. Howley (ed), Virology, 3rd ed. Lippincott-Raven Press, New York, N.Y.를 참조). 원 HPV-16 E6 폴리펩티드가 p53에 결합하는데 관련되는 아미노산 잔기는 잔기 118 내지 122 (+1는 첫번째 Met 잔기 또는 바람직하게는 두번째 Met 잔기에 사용되는 잔기로부터 시작하여 잔기 111 내지 115로부터이다) (Crook 등, 1991, Cell 67, 547~556)로 명확하게 정의되며, 원 HPV-16 E7 폴리펩티드에서 Rb로의 결합에 관련된 것들은 잔기 21 내지 26로부터 시작한다(Munger 등, 1989, EMBO J. 8, 4099~4105; Heck 등, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 4442~4446).
바람직하게는, 최소한 제1의 핵산 분자 및 제2의 핵산 분자는 HPV-16, HPV-18, HPV-30, HPV-31, HPV-33, HPV-35, HPV-39, HPV-45, HPV-51, HPV-52, HPV-56, HPV-58, HPV-59, HPV-66, HPV-68, HPV-70 및 HPV-85로 구성되는 군에서 선택되는 고위험 파필로마 바이러스로부터 독립적으로 얻어진다.
본 명세서에서 사용된 "파필로마 바이러스 폴리펩티드"는 관련 분야에서 알려진, 파필로마 바이러스 게놈/소스로부터 얻어진 핵산 분자에 의해 코딩된 폴리펩티드를 나타낸다. 상기에서 표현 "폴리펩티드"와 관련하여 정의된 바와 같이, "파필로마 바이러스 폴리펩티드"는 원 또는 수식된 파필로마 바이러스 폴리펩티드와 이로부터 형성된 펩티드를 모두 포함한다. 파필로마 바이러스의 소스는 기탁 기관, 상업용 카탈로그 또는 문헌의 기술에서 얻을 수 있는 재조합 물질뿐만 아니라 생물학적 샘플들(예를 들어, 파필로마 바이러스에 노출된 개체로부터 수집된 생물학적 샘플, 조직부, 생체 표본 및 조직 배양물), 배양된 세포 (예를 들어, ATCC에서 얻을 수 있는 CaSki 세포)들을 제한 없이 포함한다. 다수의 파필로마 바이러스 게놈의 뉴클레오티드 서열과 코딩된 폴리펩티드의 아미노산 서열이 문헌에 기재되어 있으며 전문 데이터 뱅크에서 사용할 수 있는데, 예를 들어, Genbank가 있다. 일반적인 정보로서, HPV-16 게놈이 Genbank에 accession number NC 01526와 K02718로 기술되어 있으며; HPV-18은 NC 001357과 X05015; HPV-31은 J04353; HPV-33은 M12732; HPV-35은 NC 001529; HPV-39은 NC 001535; HPV-45은 X74479; HPV-51은 NC 001533; HPV-52은 NC 001592; HPV-56은 X74483; HPV-58은 D90400; HPV-59은 NC 001635; HPV-68은 X67160과 M73258; HPV-70은 U21941; 그리고 HPV-85은 AF131950의 accession number로 기술되어 있다.
제1의 핵산 분자 및/또는 제2의 핵산 분자에 의해 코딩된 파필로마 바이러스 폴리펩티드들은 초기, 말기 또는 이들의 조합일 수 있다. 말기 폴리펩티드가 L1 또는 L2일 수 있는 반면에 초기 파필로마 바이러스 폴리펩티드는 E1, E2, E4, E5, E6 및 E7을 포함한다. 매우 많은 수의 파필로마 바이러스 혈청형의 초기 및 말기 폴리펩티드의 뉴클레오티드와 아미노산 서열들이 본 발명 분야에 숙련된 사람들이 사용 가능한 문헌에 기술되어 있다.
바람직하게는, 최소한 제1의 핵산 분자 및 제2의 핵산 분자들은 E1, E2, E6 및 E7로 구성된 군으로부터 선택된 초기 폴리펩티드를 독립적으로 코딩한다. 예시를 위한 목적으로, 원 HPV-16 E1, E2, E6 및 E7 폴리펩티드의 아미노산 서열들은 각각 서열번호: 1~4로 주어진다. 그러나, 본 발명은 이러한 표본적인 서열들에 제한되지 않는다. 실제로 뉴클레오티드와 아미노산 서열들은 다른 파필로마 바이러스 분리물 사이에서 다양하며 이러한 원 유전적 다양성은 하기 기술된 원 변이된 것들과 함께 본 발명의 범위에 포함된다. 적절한 파필로마 바이러스 폴리펩티드 변이의 표본적 예시가 이후에 기술되지만(예를 들어, 서열번호: 5~8 및 64~65), 본 발명의 분야에 숙련된 사람이라면 본 명세서에 기술된 변형을 채용할 수 있을 것이다(예를 들어, 다른 파필로마 바이러스 유전자형에서 서열 비교에 의해 유래되는 폴리펩티드 등).
본 발명에서 사용하기에 적절한 파필로마 바이러스 E1 폴리펩티드는 바이러스 복제를 자극하기 위해 결핍된 변이들을 포함하며 이는 바이러스 복제를 자극하기 위한 능력이 E1 폴리펩티드에 해당하는 것보다 통계적으로 매우 낮음을 의미한다 (예를 들어, 75% 미만, 유용하게는 50% 미만, 바람직하게는 10% 미만, 그리고 좀더 바람직하게는 5% 미만). 일반적인 설명으로서, 바이러스 복제의 자극을 담당하는 도메인은 E1의 중앙 부분에 위치한다(예를 들어, Hugues와 Romanos, 1993, Nucleic Acids Res.21, 5817~23 참조). 복제 결핍 E1 폴리펩티드의 대표적인 예가 본 발명 분야에 숙련된 사람이 이용가능한 문헌에 기술되어 있는데, 예를 들어, Yasugi 등, (1997, J. Virol 71, 5942~51)이 있다. 본 발명의 문맥에서 바람직한 변형은 Gly 잔기를 HPV-16 E1 폴리펩티드의 482 위치에서 다른 잔기(바람직하게는 Asp 잔기) (예를 들어, 서열번호: 5 참조)로 치환하거나, Gly 잔기를 HPV-18 E1 폴리펩티드의 489 위치에서 또 다른 잔기(바람직하게는 Asp 잔기 (예를 들어, 서열번호: 6 참조)로 치환하는 것을 포함한다.
본 발명에서 사용하기 적절한 E2 폴리펩티드는 원 E2 폴리펩티드에 비교하여 전사 활성 및/또는 복제 활성이 결핍된 것을 포함한다(예를 들어, 75% 미만, 유용하게는 50% 미만, 바람직하게는 10% 미만, 그리고 더욱 바람직하게는 5% 미만). 일반적인 설명으로서, 전사 활성화와 복제 자극을 담당하는 도메인은 E2의 N-말단 부분에 위치하며(Seedorf 등, 1985, Virology, 145,181~185; Kennedy 등, 1991, J. Virol. 65, 2093~2097; Cole 등, 1987, J. Mol. Biol. 193, 599~608 ; McBride 등, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 510~514) 복제 및 전사 E2 활성은 표준적인 방법(예를 들어, Sakai 등, 1996, J. Virol. 70, 1602~1611)을 통해 쉽게 결정된다. 본 발명에서 사용하기에 적절한 결핍 E2 변이체는 본 발명 분야에 숙련된 사람이 이용가능한 문헌에 기술되어 있는데, 예를 들어 Demeret 등 (1995, Nucleic Acids Res. 23, 4777~4784), Sakai 등 (1996, J. Virol. 70, 1602~1611), Brokaw 등 (1996, J. Virology 70, 23~29) 및 Ferguson 등 (1996, J. Virology 70, 4193~4199) 등이 있다. 본 발명의 문맥에 있어 바람직한 변형은 Glu 잔기를 HPV-16 E2의 39위치에서 바람직하게는 Ala 잔기(E39A)로 치환하는 것 및/또는 Ile 잔기를 73 위치에서 바람직하게는 Ala 잔기(I73A) (예를 들어, 서열번호: 7 참조)로 치환하는 것을 포함한다. 예시의 목적으로, Glu 및 Ile 잔기는 HPV-16 E2의 39 및 73 위치에 위치하며 이는 각각 HPV-18 E2의 43 및 77 위치의 Glu 및 Ile 잔기에 해당한다(예를 들어, 서열번호: 8 참조).
본 발명에서 사용하기에 적절한 E6 폴리펩티드는 세포성 종양 억제제 유전자 산물 p53으로의 결합이 결핍된 비종양 변이체를 포함한다. 대표적인 예로서 비종양 E6 폴리펩티드가 문헌에 기술되어 있는데 예를 들어, Pirn 등 (1994, Oncogene 9, 1869~1876), 및 Crook 등 (1991, Cell 67, 547~556)이 있다. 본 발명의 문맥에 있어 바람직한 변이는 HPV-16 E6에서 잔기 118 내지 122 (CPEEK)의 결실(예를 들어, 서열번호: 64) 또는 HPV-18 E6에서 잔기 113 내지 117 (NPAEK)의 결실을 포함한다.
본 발명에서 사용하기에 적절한 E7 폴리펩티드는 세포성 종양 억제 유전자 산물 Rb로의 결합이 결핍된 비종양 변이체를 모두 포함한다. 비종양 E7 폴리펩티드의 대표적인 예들이, 예를 들어, Munger 등 (1989, EMBO J. 8, 4099~4105), Heck 등 (1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 4442~4446) 및 Phelps 등 (1992, J. Virol. 66, 2148~2427) 등에 기술되어 있다. 이와 관련한 바람직한 변이는 HPV-16 E7에서 잔기 21 내지 26의 결실 (DLYCYE) (예를 들어, 서열번호: 65) 또는 HPV-18 E7 에서 잔기 24 내지 28의 결실(DLLCH)을 포함한다.
나아가, 최소한 제1의 핵산 분자 및/또는 제2의 핵산 분자에 의해 코딩된 폴리펩티드 (예를 들어, 파필로마 바이러스 폴리펩티드)는 과정, 안정성 및/또는 코딩된 폴리펩티드의 용해성이 유용한 부가적인 변형들을 더 포함할 수 있으며, 예를 들어, 가능한 절단(cleavage) 부분의 억제, 가능한 글리코실 부분의 억제 및/또는 발현 세포 표면에서의 표현 등이 있다. 예를 들어, 코딩된 폴리펩티드는 발현 세포의 플라스마 멤브레인 내에 앵커링되기 위한 적절한 신호를 포함할 수 있다. 실제로, 멤브레인 표현으로 MHC class I 및/또는 MHC class II 표현이 개선되며 이는 숙주의 면역 시스템 인식에 도움이 되는 것으로 이미 밝혀져 있다(예를 들어, WO99/0388 참조). 원 초기 파필로마 바이러스 폴리펩티드들(E1, E2, E6 및 E7)은 핵 단백질이기 때문에 (전형적인 핵 위치 신호를 명확히 식별할 수는 없다고 해도), 면역학적 가능성을 개선하고 숙주 개체의 치료 효율을 높이기 위하여 이들을 멤브레인에 부착하는 것이 유용할 수 있다.
폴리펩티드의 발현 숙주 세포 표면에서의 효과적인 멤브레인 표현은 폴리펩티드를 시그널 펩티드와 멤브레인 앵커링 펩티드에 융합함으로써 수행될 수 있다. 이러한 펩티드들은 본 발명의 분야에서 알려져 있다. 요약하면, 시그널 펩티드는 일반적으로 멤브레인에서 표현되거나 분비된 폴리펩티드의 N-말단에 존재하며 이로부터 소포체 망상 조직 (ER)으로의 움직임을 시작한다. 이들은 15 내지 35의 본질적으로 소수성(hydrophobic) 아미노산들로서 이후에 특정 ER-위치하는 엔도펩티다아제(endopeptidase)에 의해 제거되어 숙성된 폴리펩티드를 생성한다. 멤브레인에 앵커링하는 펩티드들은 원래는 보통 고도의 소수성이며 폴리펩티드들을 세포 멤브레인에 부착하는데 도움이 된다(예를 들어, Branden과 Tooze, 1991, 단백질 구조 입문 p. 202~214, NY Garland 참조). 본 발명의 문맥에 맞게 사용할 수 있는 시그널 펩티드 및 멤브레인 앵커링 펩티드의 선택은 매우 방대하다. 이들은 분비되거나 멤브레인에 앵커링된 폴리펩티드(예를 들어, 세포성 또는 바이러스 폴리펩티드)로부터 독립적으로 얻을 수 있으며 래비스(rabies) 당단백질, HIV 바이러스 외피(envelope) 당단백질 또는 홍역 바이러스 F 단백질 또는 합성물 등이 있다. 시그널 펩티드에서 번역을 시작하기 위한 바람직한 삽입 위치는 코돈의 N-말단 하류 부분이고, 멤브레인 앵커링 펩티드의 바람직한 삽입 위치는 C-말단, 예를 들어 정지 코돈의 바로 위이다. 필요하다면, 시그널 펩티드 및/또는 멤브레인 앵커링 펩티드를 코딩된 폴리펩티드에 연결하기 위하여 링커 펩티드가 사용될 수 있다.
본 발명에서 사용하기 적절한 멤브레인 앵커링된 결핍 E1 폴리펩티드의 대표적인 예는 서열번호: 5 (HPV-16 SS-E1*-TMR 폴리펩티드를 정의하며 실시예 부분에 예시됨) 및 서열번호: 6(HPV- 18 SS-E1*-TMF 폴리펩티드를 정의하며 실시예 부분에 예시됨)으로 주어진다. 본 발명에서 사용하기에 적절한 대표적인 멤브레인 앵커링된 결핍 E2 폴리펩티드의 예는 서열번호: 7 (HPV-16 SS-E2*-TMR 폴리펩티드 정의하며 실시예 부분에 예시됨) 및 서열번호: 8 (HPV-18 SS-E2*-TMR 폴리펩티드를 정의하며 실시예 부분에 예시됨)로 주어진다. 본 발명에서 사용하기에 적절한 대표적인 멤브레인 앵커링 및 비종양 E6 및 E7 폴리펩티드의 예는 각각 서열번호: 64 (HPV-16 SS-E6*-TMF 폴리펩티드 정의하며 실시예 부분에 예시됨) 및 서열번호: 65 (HPV- 16 SS-E7*-TMR 폴리펩티드 정의하며 실시예 부분에 예시됨)로 주어진다.
특별히 바람직한 구체예에서, 최소한 제1의 핵산 분자와 제2의 핵산 분자는 동일한 HPV 혈청형으로부터 얻어진 두 개의 다른 파필로마 바이러스 폴리펩티드를 코딩한다.
본 구체예의 바람직한 측면에서, 제1의 핵산 분자는 E1 폴리펩티드를 코딩하며, 제2의 핵산 분자는 E2 폴리펩티드를 코딩하며, 또는 그 반대도 가능하다. 바람직하게는, E1 및 E2-코딩 핵산 분자들은 HPV-16 또는 HPV-18로부터 얻어진다. 바람직하게는, 제1의 핵산 분자는 서열번호: 5에 나타낸 아미노산 서열로 본질적으로 이루어지거나 또는 이루어지거나 또는 그를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하며, 제2의 핵산 분자는 서열번호: 7에 나타낸 아미노산 서열로 본질적으로 이루어지거나 또는 이루어지거나 또는 그를 포함하는 폴리펩티드를 코딩한다. 다르게는, 제1의 핵산 분자는 서열번호: 6에 나타낸 아미노산 서열로 본질적으로 이루어지거나 또는 이루어지거나 또는 그를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하며, 제2의 핵산 분자는 서열번호: 8에 나타낸 아미노산 서열로 본질적으로 이루어지거나 또는 이루어지거나 또는 그를 포함하는 폴리펩티드를 코딩한다.
원 상태에 있어서 (예로서, HPV-16 또는 HPV-18 게놈), E1-코딩 서열의 3' 부분은 E2-코딩 서열의 5' 부분과 59 뉴클레오티드에 걸쳐 오버래핑된다. 100% 상동성인 이들 59 뉴클레오티드들의 존재는 E1 및 E2-코딩 핵산 분자들을 모두 발현하는 벡터의 안정성에 나쁜 영향을 주는 것으로 기대된다. 상동성 재조합은 동일 부분들 사이에서 일어날 수 있으며, 이는 그 사이에 포함된 뉴클레오티드 서열들의 손실을 일으킨다.
본 발명에 따라, E1 및 E2-코딩 핵산 분자들에서 수식 전에 존재하는 59 뉴클레오티드들의 오버래핑 부분간의 100% 상동성은, 핵산 분자들 중 하나에서 코돈 사용 패턴을 축퇴시킴에 의해 75% 미만으로 감소될 수 있다. 축퇴된 서열들의 대표적인 예를 서열번호: 9에 나타내었으며, 여기에서 E1/E2 오버래핑 59 뉴클레오티드들에서의 상동성이 69%로 감소되며 (도 1 에 나타냄), HPV-16 E1 및 E2 폴리펩티드들을 코딩하는 본 발명의 바람직한 벡터는 서열번호: 9에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 동일한 전략을 HPV-18 E1 및 E2-코딩 서열들에 존재하는 오버래핑 부분에 적용할 수 있다. 그러한 축퇴된 서열들은 원 오버래핑하는 59 뉴클레오티드들 대신 E1-코딩 제1의 핵산 분자에 도입될 수 있다 (예로서, 각각 서열번호: 10 및 11).
따라서, 본 발명의 바람직한 벡터는 서열번호: 10에 나타낸 뉴클레오티드 서열로 본질적으로 이루어지거나, 또는 이루어지거나 또는 그를 포함하는 제1의 핵산 분자 (이는 서열번호: 5의 HPV-16 E1 폴리펩티드를 코딩한다) 및 서열번호: 12에 나타낸 뉴클레오티드 서열로 본질적으로 이루어지거나 또는 이루어지거나 또는 그를 포함하는 제2의 핵산 분자 (이는 서열번호: 7의 HPV-16 E2 폴리펩티드를 코딩한다)를 포함한다. 본 발명의 또 다른 바람직한 벡터는 서열번호: 11에 나타낸 뉴클레오티드 서열로 본질적으로 이루어지거나, 또는 이루어지거나 또는 그를 포함하는 제1의 핵산 분자 (이는 서열번호: 6의 HPV-18 E1 폴리펩티드를 코딩한다) 및 서열번호: 13에 나타낸 뉴클레오티드 서열로 본질적으로 이루어지거나 또는 이루어지거나 또는 그를 포함하는 제2의 핵산 분자 (이는 서열번호: 8의 HPV-18 E2 폴리펩티드를 코딩한다)를 포함한다. 더욱 바람직하게는, 본 발명의 벡터는 MVA 벡터로, 제1의 (E1-코딩) 핵산 분자가 백시니아 7.5K 프로모터의 조절 하에 위치하며, 제2의 (E2-코딩) 핵산 분자가 백시니아 H5R 프로모터의 조절 하에 위치하고, 상기 제1의 핵산 분자 및 제2의 핵산 분자들은 모두 상기 MVA 벡터의 결실 III에 삽입된다.
본 발명은 HPV-16 E1 폴리펩티드를 코딩하는 제1의 핵산 분자, HPV-16 E2 폴리펩티드를 코딩하는 제2의 핵산 분자, HPV-18 E1 폴리펩티드를 코딩하는 제3의 핵산 분자 및 HPV-18 E2 폴리펩티드를 코딩하는 제4의 핵산 분자를 포함하는 벡터에 관한 것으로, 여기에서 상기 제1의 핵산 분자, 제2의 핵산 분자, 제3의 핵산 분자 및 제4의 핵산 분자들은 75% 또는 그 이상의 상동성 비율을 나타내는 40개 이상의 연속된 뉴클레오티드 부분을 포함하지 않는다. 바람직하게는, 상기 HPV-16 E1 폴리펩티드는 서열번호: 5에 나타낸 아미노산 서열을 포함하고, 상기 HPV-16 E2 폴리펩티드는 서열번호: 7에 나타낸 아미노산 서열을 포함하고, 상기 HPV-18 E1 폴리펩티드는 서열번호: 6에 나타낸 아미노산 서열을 포함하고, 및/또는 상기 HPV-18 E2 폴리펩티드는 서열번호: 8에 나타낸 아미노산 서열을 포함한다.
원 상태에 있어서, HPV-16 및 HPV-18 E1-코딩 서열들은 80% 또는 그 이상의 상동성 서열을 나타내는 40 개 이상의 연속된 뉴클레오티드의 몇몇 부분들을 포함한다. 이는 HPV-16 및 HPV-18 E2-코딩 서열의 경우에도 동일하다. 또한, 인접하는 E1 및 E2-코딩 서열들은 HPV-16 및 HPV-18 게놈에서 약 59 뉴클레오티드의 부분에 걸쳐 오버래핑된다. 이와 관련하여, 상기 HPV-18 E1 및 E2-코딩 핵산 분자 서열들의 HPV-16 카운터파트(counterpart)와의 상동성, 특히 두 혈청형 모두가 공유하는 상동성 부분에서의 상동성이 75% 미만으로 감소되도록, 상기 HPV-18 E1 및 E2-코딩 핵산 분자 서열들을 수식하는 것이 권장된다. 이러한 목적을 위하여, HPV-16 및 HPV-18 E1 및 E2 유전자들의 뉴클레오티드 서열들은 얼라인될 수 있으며, 상동성이 8, 7, 6 또는 바람직하게는 5 개의 연속된 뉴클레오티드 미만으로 감소되도록 뉴클레오티드 수준에서 수식되게 설계할 수 있다. 또한, HPV-18 E1 서열은 HPV-18 E2 서열의 5' 말단과 오버래핑되는 59 뉴클레오티드 부분과의 상동성이 75% 미만으로 감소되도록 하기 위하여 더욱 수식될 수 있다. 바람직하게는, 코돈 사용은 수식되지만, 여기에서 정의된 것과 같은 생성 수식들, 예로서 효소 기능 결함을 초래하는 수식들을 제외하고는, 이러한 수식들은 아미노산 수준에서는 번역되지 않는다. 제3의 핵산 분자 및 제4의 핵산 분자로서 적당하게 사용될 수 있는 "축퇴된" HPV-18 E1- 및 HPV-18 E2-코딩 뉴클레오티드 서열들의 대표적인 예들을 서열번호: 11 및 서열번호: 13에 각각 나타내었다. 본 발명의 바람직한 벡터는 서열번호: 10에 나타낸 뉴클레오티드 서열로 본질적으로 이루어지거나 또는 이루어지거나 또는 그를 포함하는 제1의 핵산 분자 (서열번호: 5에 나타낸 HPV-16 E1 폴리펩티드를 코딩함), 서열번호: 12에 나타낸 뉴클레오티드 서열로 본질적으로 이루어지거나 또는 이루어지거나 또는 그를 포함하는 제2의 핵산 분자 (서열번호: 7에 나타낸 HPV-16 E2 폴리펩티드를 코딩함), 서열번호: 11에 나타낸 뉴클레오티드 서열로 본질적으로 이루어지거나 또는 이루어지거나 또는 그를 포함하는 제3의 핵산 분자 (서열번호: 6에 나타낸 HPV-18 E1 폴리펩티드를 코딩함) 및 서열번호: 13 에 나타낸 뉴클레오티드 서열로 본질적으로 이루어지거나 또는 이루어지거나 또는 그를 포함하는 제4의 핵산 분자 (서열번호: 8에 나타낸 HPV-18 E2 폴리펩티드를 코딩함)를 포함한다. 바람직하게는, 상기 벡터는 MVA 벡터이며, 상기 제1의 핵산 분자, 제2의 핵산 분자, 제3의 핵산 분자 및 제4의 핵산 분자들은 상기 MVA 벡터의 결실 III 내로 도입되며, 상기 제1의 및 제3의 (El-코딩) 핵산 분자들은, 각각 백시니아 p7.5K 프로모터의 조절 하에, 반대 방향으로 위치되며, 상기 제2의 및 제4의 (E2-코딩) 핵산 분자들은, 각각 백시니아 pH5R 프로모터의 조절 하에, 반대 방향으로 위치된다.
또 다른 특히 바람직한 구체예에서, 적어도 제1의 핵산 분자 및 제2의 핵산 분자는 밀접하게 관련된 생명체들로부터 얻어진 동일한 폴리펩티드, 예로서 HPV- 16, HPV-18, HPV-33 및/또는 HPV-52와 같은 밀접하게 관련된 HPV 혈청형들을 코딩한다.
본 구체예의 제1의 측면에서, 밀접하게 관련된 생명체들로부터 얻어진 동일한 폴리펩티드는 바람직하게는 E2 폴리펩티드이다. 코딩된 E2 폴리펩티드들은 바람직하게는, 여기 정의된 것과 같이, 메므레인-앵커링된 바이러스 복제에 대해 결함이 있도록 수식된다. 원 상태에 있어서, 각종 유전형의 E2-코딩 서열들은, 특히 가장 보존된 부분들에서, 뉴클레오티드 수준에서 높은 정도의 상동성을 나타낸다. 이들 상동성 서열들의 존재는 둘 이상의 (예로서, 3, 4 또는 그 이상) E2 유전자들, 예로서 HPV-16, HPV-18, HPV-33 및 HPV-52와 같은 HR HPV로부터의 E2 유전자들을 공발현하는 벡터의 안정성에 나쁜 영향을 주는 것으로 기대된다. 상동성 재조합은 이들 상동성 유전자 서열들 사이에서 일어날 수 있으며, 이는 그들 사이에 포함된 뉴클레오티드 서열들의 손실을 일으켜, 유전자 사일런싱(gene silencing)을 일으킨다.
본 발명에 따른, 본 발명의 벡터 내에 포함된 E2 폴리펩티드들을 코딩하는 상기 핵산 분자는, 특히 상동성이 높은 부분에서 상동성이 75% 미만으로 감소되도록 코돈 사용 패턴을 축퇴시킴에 의해 수식될 수 있다. E2 폴리펩티드들을 코딩하는 축퇴된 핵산 분자의 대표적인 예들을 서열번호: 13, 66, 67, 68 및 69에 나타내었다. 보다 구체적으로, 서열번호: 13은 멤브레인에 발현된 결함 HPV-18 E2 폴리펩티드를 코딩하며, 이 뉴클레오티드 서열은 그의 E2-코딩 카운터파트와의 상동성이 8 또는 7 개의 연속적인 뉴클레오티드 미만으로 감소되도록 설계되었다. 서열번호: 66 및 67 은 모두 복제-결함 HPV-33 E2 폴리펩티드를 코딩하며 (이는 또한 서열번호: 67에서 멤브레인에 발현된다), 이 뉴클레오티드 서열들은 그의 다른 E2-코딩 카운터파트와의 상동성이 8 또는 7 개의 연속적인 뉴클레오티드 미만으로 감소되도록 설계되었다. 서열번호: 68 및 69 는 모두 복제-결함 HPV-52 E2 폴리펩티드를 코딩하며 (이는 또한 서열번호: 69에서 멤브레인에 발현된다), 이 뉴클레오티드 서열들은 그의 다른 E2-코딩 카운터파트들과의 상동성이 8 또는 7 개의 연속적인 뉴클레오티드 미만으로 감소되도록 설계되었다. 그러나, 본 발명은 이들 예시적인 서열들에 한정되지 않으며, 상기 정의된 것과 같은, E2 파필로마 바이러스 폴리펩티드들을 코딩하는 축퇴된 핵산분자의 다른 형태들이, 이러한 원리에 따라 설계될 수 있다.
본 발명의 바람직한 벡터는, 본 발명에서 정의된 것과 같은 HPV-16 E2 폴리펩티드를 코딩하는 제1의 핵산 분자 (예로서, 서열번호: 7에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 멤브레인-발현 및 복제-결함 E2 폴리펩티드), 본 발명에서 정의된 것과 같은 HPV-18 E2 폴리펩티드를 코딩하는 제2의 핵산 분자(예로서, 서열번호: 8에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 멤브레인-발현 및 복제-결함 E2 폴리펩티드), 본 발명에서 정의된 것과 같은 HPV-33 E2 폴리펩티드를 코딩하는 제3의 핵산 분자 (예로서, 서열번호: 70에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 멤브레인-발현 및 복제-결함 E2 폴리펩티드), 및 본 발명에서 정의된 것과 같은 HPV-52 E2 폴리펩티드를 코딩하는 제4의 핵산 분자 (예로서, 서열번호: 71에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 멤브레인-발현 및 복제-결함 E2 폴리펩티드)를 포함한다. 더욱 바람직하게는, 상기 제1의 핵산 분자는 서열번호: 12에 나타낸 뉴클레오티드 서열로 본질적으로 이루어지거나 또는 그를 포함하고; 상기 제2의 핵산 분자는 서열번호: 13에 나타낸 뉴클레오티드 서열로 본질적으로 이루어지거나 또는 그를 포함하고; 상기 제3의 핵산 분자는 서열번호: 67에 나타낸 뉴클레오티드 서열로 본질적으로 이루어지거나 또는 그를 포함하고; 및/또는 상기 제4의 핵산 분자는 서열번호: 69에 나타낸 뉴클레오티드 서열로 본질적으로 이루어지거나 또는 그를 포함한다. 더욱 바람직하게는, 본 발명의 벡터는 MVA 벡터이고, 상기 4개의 E2-코딩 핵산 분자들은 결실 III에 위치된다. 보다 더욱 바람직하게는, 상기 제1의 핵산 분자 및 제2의 핵산 분자들은 백시니아 H5R 프로모터의 조절 하에 있으며, 서로 역의 방향으로 위치되는 반면, 제3의 및 제4의 핵산 분자들은 백시니아 p7.5K 프로모터의 조절 하에 있으며, 서로 역의 방향으로 위치된다.
본 구체예의 또 다른 측면에서, 밀접하게 관련된 생명체들로부터 얻어진 동일한 폴리펩티드는 바람직하게는, E6 폴리펩티드, E7 폴리펩티드 또는 E6 및 E7 폴리펩티드들 모두이다. E6 및 E7은 독립적으로 또는 융합 폴리펩티드로서 발현될 수 있다. 코딩된 E6 및/또는 E7 폴리펩티드들은 바람직하게는, 여기에서 정의된 것과 같이 벱브레인-앵커되고 비-종양성이 되도록 수식된다.
원 상태에 있어서, HPV-16 및 HPV-18 원 E6 서열들은 뉴클레오티드 수준에서 63%의 상동성을 갖는 반면, HPV-16 및 HPV-18 원 E7 서열들은 서로 57% 상동성이다. 그러나, 두 경우 모두에서, HPV-16 및 HPV-18 원 서열들은 80% 이상의 상동성을 나타내는 40개 이상의 뉴클레오티드들의 일부 부분들을 공유한다 (도 2 참조). 이들 상동성 부분들의 존재는 HPV-16 및 HPV-18 E6 및/또는 E7 유전자들을 공발현하는 벡터의 안정성에 나쁜 영향을 주는 것으로 기대된다. 상동성 재조합은 이들 상동성 부분들 사이에서 일어날 수 있으며, 그들 사이에 포함된 뉴클레오티드 서열들의 손실을 일으켜, 그에 따라 유전자 사일런싱을 일으킨다.
본 발명에 따라, HPV-16 및/또는 HPV-18 E6 및 E7 폴리펩티드들을 코딩하는 핵산 분자들은, 특히 상동성 부분들에서 상동성이 75% 미만으로 감소되도록 코돈 사용 패턴을 축퇴함에 의해 수식될 수 있다. HPV-18 E6 폴리펩티드를 코딩하는 축퇴된 핵산 분자의 대표적인 예를 서열번호: 14에 나타내었으며; HPV-18 E7 폴리펩티드를 코딩하는 축퇴된 수식 핵산 분자의 대표적인 예는 서열번호: 15에 나타내었다. 보다 구체적으로, 서열번호: 14 및 서열번호: 15 는, HPV-18 멤브레인-앵커되고 비-종양성인 E6 및 E7 폴리펩티드들을 코딩하는 한편, HPV-16 카운터파트와의 상동성이 8, 7, 6 또는 바람직하게는 5 개 미만의 연속적인 뉴클레오티드로 감소되도록 설계된다. 그러나, 상기 정의된 것과 같은 E6 및/또는 E7 파필로마 바이러스 폴리펩티드들을 코딩하는 축퇴된 핵산 분자들의 또 다른 형태들이 이러한 원리에 따라 설계될 수 있다.
본 발명의 바람직한 벡터는 여기에서 정의된 것과 같은 HPV-16 E6 폴리펩티드를 코딩하는 제1의 핵산 분자 (예로서, 멤브레인-앵커되고 비종양성) 및 여기에서 정의된 것과 같은 HPV-18 E6 폴리펩티드를 코딩하는 제2의 핵산 분자 (예로서, 멤브레인-앵커되고 비종양성)를 포함하며, 여기에서 상기 제2의 핵산 분자는 서열번호: 14에 나타낸 뉴클레오티드 서열로 본질적으로 이루어지거나 또는 그를 포함한다. 본 발명의 또 다른 바람직한 벡터는 여기에서 정의된 것과 같은 HPV-16 E7 폴리펩티드를 코딩하는 제1의 핵산 분자 (예로서, 멤브레인-앵커되고 비종양성) 및 여기에서 정의된 것과 같은 HPV-18 E7 폴리펩티드를 코딩하는 제2의 핵산 분자 (예로서, 멤브레인-앵커되고 비종양성)를 포함하고, 여기에서 상기 제2의 핵산 분자는 서열번호: 15에 나타낸 뉴클레오티드 서열로 본질적으로 이루어지거나 또는 그를 포함한다. 더욱 바람직하게는, 본 발명의 벡터는 MVA 벡터로, 상기 제1의 핵산 분자가 백시니아 7.5K 프로모터의 조절 하에 위치되고, 상기 제2의 핵산 분자가 백시니아 H5R 프로모터의 조절 하에 위치되며, 상기 제1의 및 제2의 핵산 분자 모두 상기 MVA 벡터의 결실 III에 삽입된다.
또한, 본 발명은 HPV-16 E6 폴리펩티드와 HPV-16 E7 폴리펩티드와의 융합물을 코딩하는 제1의 핵산 분자 및 HPV-18 E6 폴리펩티드와 HPV-18 E7 폴리펩티드의 융합물을 코딩하는 제2의 핵산 분자를 포함하는 벡터에 관한 것으로, 상기 제1의 및 제2의 핵산 분자는 약 75% 이상의 상동성 비율을 나타내는 40 개 이상의 연속된 뉴클레오티드 부분을 포함하지 않는다.
또한, 본 발명은 HPV-16 E6 폴리펩티드를 코딩하는 제1의 핵산 분자, HPV-18 E6 폴리펩티드를 코딩하는 제2의 핵산 분자, HPV-16 E7 폴리펩티드를 코딩하는 제3의 핵산 분자 및 HPV-18 E7 폴리펩티드를 코딩하는 제4의 핵산 분자를 포함하는 벡터에 관한 것으로, 여기에서 상기 제1의, 제2의, 제3의 및 제4의 핵산 분자는 75% 이상의 상동성 비율을 나타내는 40 개 이상의 연속된 뉴클레오티드들의 부분을 포함하지 않는다. 바람직하게는, 상기 제2의 핵산 분자는 서열번호: 14로 본질적으로 이루어지거나 또는 이루어지거나 또는 그를 포함하고 및/또는 제4의 핵산 분자는 서열번호: 15로 본질적으로 이루어지거나 또는 이루어지거나 또는 그를 포함한다. 더욱 바람직하게는, 본 발명의 벡터는 MVA 벡터로, 제1의 핵산 분자 및 제2의 핵산 분자는 백시니아 7.5K 프로모터의 조절 하에 각각 역으로 배향되어 위치되며, 제3의 핵산 분자 및 제4의 핵산 분자는 백시니아 H5R 프로모터의 조절 하에 각각 역으로 배향되고, 상기 제1의, 제2의, 제3의 및 제4의 핵산 분자는 상기 MVA 벡터의 결실 III에 삽입된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 또한 실질적으로 분리된 서열번호: 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 66, 67, 68 또는 69 중 어느 하나에 나타낸 뉴클레오티드 서열로 본질적으로 이루어지거나 또는 이루어지거나 또는 그를 포함하는 핵산 분자를 제공한다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 본 발명의 벡터에 포함된 제1의 및 제2의, 그리고 존재하는 경우, 제3의 및 제4의 핵산 분자는 숙주 세포 또는 개체에서 코딩된 폴리펩티드들의 발현에 적당한 형태로 존재하며, 이는 그들이 그들의 발현에 필요한 조절 서열들의 조절 하에 위치된다는 것을 의미한다.
여기 사용된 것과 같은, "조절 서열들"이라는 용어는 소정의 숙주 세포에서 핵산 분자의 발현을 가능하게 하거나, 그에 기여하거나 또는 그를 조절하는 임의의 서열을 의미하는 것으로, 핵산 또는 그의 유도체 (즉, mRNA) 중 하나의 숙주 세포 내로의 복제, 복사(duplication), 전사, 스플라이싱, 번역, 안정성 및/또는 수송을 포함한다. 본 발명의 맥락에서, 상기 조절 서열들은 발현될 핵산 분자에 "작동가능하게 연결"되며, 이는, 이들이 숙주 세포 또는 개체에서의 발현을 가능하게 하는 기능적 관계로 위치된다는 것을 의미한다. 그러한 조절 서열들은 본 기술 분야에서 공지이다 (예로서, Goeddel, 1990, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego 참조). 조절 서열들의 선택은 벡터 유형, 숙주 세포, 원하는 발현 수준 등과 같은 인자들에 따라 달라질 수 있음을 본 기술 분야의 당업자들은 이해할 것이다.
프로모터가 특히 중요하며, 본 발명은 여러 유형의 숙주 세포들에서 상기 핵산 분자의 발현을 지시하는 구성(constitutive) 프로모터들 및 특정 숙주 세포들에서만 발현을 지시하거나 (예로서, 조직-특이적 조절 서열들), 또는 특별한 경우들 또는 외생 인자들 (예로서, 온도, 영양소 첨가물, 호르몬 또는 기타 리간드에 의해)에 반응하여 발현을 지시하는 것들의 이용을 포괄한다. 진핵생물계에서의 구성적 발현에 적당한 프로모터들은 바이러스성 프로모터들, 예컨대 SV40 프로모터, 사이토메갈로 바이러스 즉시 초기 프로모터 (cytomegalovirus (CMV) immediate early promoter) 또는 인핸서 (Boshart 등, 1985, Cell 41, 521-530), 아데노바이러스 초기 및 후기 프로모터들, 헤르페스 심플렉스 (herpes simplex) 바이러스의 티미딘 키나아제 (TK) 프로모터 (HSV)-I 및 레트로바이러스성 긴-말단 반복부들 (예로서 MoMuLV 및 라우스 육종 바이러스 (Rous sarcoma virus (RSV) LTRs), 또한 세포성 프로모터들, 예컨대 포스포글리세로키나아제 (phosphoglycero kinase (PGK)) 프로모터 (Hitzeman 등, 1983, Science 219, 620-625; Adra 등, 1987, Gene 60, 65~74)를 포함한다. 폭스 바이러스성 (poxviral) 벡터에서 상기 핵산 분자의 발현을 이끄는데 유용한 적당한 프로모터들은 백시니아 바이러스의 7.5K, H5R, TK, p28, p11 또는 K1L 프로모터들을 포함한다. 선택적으로, Chakrabarti 등 (1997, Biotechniques 23, 1094~1097), Hammond 등 (1997, J. Virological Methods 66, 135~138) 및 Kumar 및 Boyle (1990, Virology 179, 151~158)에 기재된 것들과 같은 합성 프로모터 및 초기 및 후기 폭스바이러스성 프로모터들간의 키메라성 (chimeric) 프로모터들이 사용될 수 있다.
유도성 (inducible) 프로모터들은 외생적으로 공급된 화합물들에 의해 조절되며, 제한됨이 없이 다음을 포함한다: 아연-유도성 메탈로티오닌 (zinc-inducible metallothionein (MT)) 프로모터 (Mc Ivor 등, 1987, Mol. Cell Biol. 7, 838~848), 덱사메타손 (Dex)-유도성 마우스 유방 종양 바이러스 (MMTV) 프로모터, T7 폴리머라아제 프로모터계 (WO 98/10088), 엑디손 (ecdysone) 곤충 프로모터 (No 등, 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 3346~3351), 테트라사이클린-억제성 프로모터 (Gossen 등, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 5547~5551), 테트라사이클린-유도성 프로모터 (Kim 등, 1995, J. Virol. 69, 2565~2573), RU486-유도성 프로모터 (Wang 등, 1997, Nat. Biotech. 15, 239- 243 및 Wang 등, 1997, Gene Ther. 4, 432~441), 라파마이신-유도성 (rapamycin-inducible) 프로모터 (Magari 등, 1997, J. Clin. Invest. 100, 2865~2872) 및 대장균으로부터의 lac, TRP, 및 TAC 프로모터들.
본 발명의 맥락에서 사용되는 조절 서열들은 또한 치료가 필요한 특이적 조직에서의 상기 핵산 분자들의 발현을 이끌기 위하여 조직-특이적일 수 있다. 적당한 프로모터들은 종양 세포들에서 우선적으로 발현되는 유전자들로부터 취할 수 있다. 그러한 유전자들은 예로서 디스플레이(display) 및 비교되는 게놈 혼성화에 의해 확인할 수 있다(예로서 US 5,759,776 및 5,776,683 참조).
본 기술 분야의 당업자들은 본 발명의 벡터에 포함된 핵산 분자의 발현을 제어하는 조절 성분들이, 숙주 세포 또는 개체 내로의, 적절한 개시, 전사의 조절 및/또는 종료 (예로서, polyA 전사 종료 서열들), mRNA 수송 (예로서 핵 위치 시그널 (nuclear localization signal) 서열들), 가공 (예로서, 스플라이싱 시그널들), 안정화 (예로서, 인트론 및 비-코딩 5' 및 3' 서열들), 및 번역 (예로서 삼조 (tripartite) 리더 서열들, 리보솜 결합 자리들, 신-달가모(Shine-Dalgamo) 서열들 등)을 위한 추가 성분들을 더 포함할 수 있음을 알 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 상기-기재된 벡터를 포함하는 감염성 바이러스 입자들을 제공한다. 감염성 바이러스 입자들의 제조를 위한 알려진 여러 방법들을 여기에서 상세하게 기재하지는 않을 것이다. 전형적으로, 그러한 바이러스 입자들은 다음 단계들을 포함하는 공정에 의해 생산될 수 있다: (a) 바이러스 벡터를 적절한 세포주 내로 도입하는 단계, 및 (b) 상기 세포주를 상기 감염성 바이러스 입자 생산을 가능하게 하는 적당한 환경 하에서 배양하여, 상기 세포주의 배양물로부터 제조된 감염성 바이러스 입자들을 회수하고, 상기 회수된 감염성 바이러스 입자를 임의로 정제하는 단계.
상기 바이러스 벡터가 결함이 있는 경우, 감염성 입자들은 대개 상보성 세포주 내에서 생산되거나 또는 비-기능성 바이러스 유전자를 인-트랜스 (in trans) 공급하는 헬퍼 바이러스를 사용하여 생산된다. 예로서, 상보적 E1-결실 아데노바이러스성 벡터들에 적당한 세포주들은 293 세포 (Graham 등, 1997, J. Gen. Virol. 36, 59~72), PER-C6 세포 (Fallaux 등, 1998, Human Gene Ther. 9, 1909~1917) 및 HER96 세포를 포함한다. 폭스바이러스 벡터들의 번식에 적당한 세포들은 조류 세포들로, 유정란으로부터 얻어진 병아리 배로부터 제조된 일차 병아리 배 섬유아세포들 (primary chicken embryo fibroblasts (CEF))이 가장 바람직하다. 상기 생산자 세포들은, 적절한 온도, pH 및 산소량 조건 하에서, 통상의 발효 생물반응기 (bioreactor), 플라스크 및 페트리 접시에서 배양될 수 있다.
감염성 바이러스 입자들은 배양 상등액으로부터 또는 용균 후 세포들로부터 회수될 수 있다. 이들은 표준 기술들 (예로서 WO96/27677, WO98/00524, WO98/22588, WO98/26048, WO00/40702, EP1016700 및 WO00/50573에 기재된 것과 같은 크로마토그래피, 초원심분리)에 따라 더욱 정제될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 기재된 핵산 분자, 벡터들 또는 감염성 바이러스 입자들을 포함하는 숙주 세포들을 제공한다. 여기 사용된 "숙주 세포"라는 용어는 본 발명의 벡터 또는 감염성 바이러스 입자 및 그러한 세포들의 자손의 수령자이거나 또는 수령자여왔던 임의의 세포로 정의된다. 이 용어는 분리된 세포, 세포들의 군, 및 예로서 조직 또는 기관 내의 세포들의 특정 조직체를 포괄하는 것으로 넓게 이해되어야 한다. 그러한 세포들은 일차, 형질변환되거나 또는 배양된 세포들일 수 있다.
본 발명의 맥락에서 숙주 세포들은 원핵세포들 (예로서, 대장균, 바실러스, 리스테리아), 효모와 같은 하등 진핵 세포들 (예로서, 사카로마이세스 세레비시에, 사카로마이세스 폼베 (Saccharomyces pombe) 또는 피키아 파스토리스 (Pichia pastoris)), 및 곤충 세포들, 식물 및 고등 진핵 세포들과 같은 기타 진핵 세포들을 포함하며, 특히 포유동물 세포들 (예로서 인간 또는 인간이 아닌 세포들)이 바람직하다. 적당한 숙주 세포들의 대표적인 예들은 이에 제한됨이 없이 다음을 포함한다: BHK (새끼 햄스터 신장) 세포, MDCK 세포 (마딘-다비 (Madin-Darby) 개 신장 세포주), CRFK 세포 (크랜델 (Crandell) 고양이 신장 세포주), CV-I 세포 (아프리카 원숭이 신장 세포주), COS (예로서, COS-7) 세포, 중국 햄스터 난자 (CHO) 세포들, 마우스 NIH/3T3 세포들, HeLa 세포들 및 Vero 세포들. "숙주 세포"라는 용어는 상기 언급된 것과 같은 본 발명의 복제-결함 벡터의 (예로서 아데노바이러스성 벡터) 적어도 하나의 결함 기능을 보완할 수 있는 상보성 세포들을 포괄한다.
숙주 세포들은 본 발명의 벡터 또는 감염성 입자들에 포함된 핵산 분자들에 의해 코딩된 폴리펩티드들을, 재조합 수단들에 의해, 제조하기 위해 사용될 수 있다. 그러한 기술들은 본 기술 분야에서 공지이다 (예로서, Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley, 1987-2002; 및 Sambrook 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual 최신판, Cold Spring Harbor Laboratory Press 참조).
또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 기재된 핵산 분자, 벡터, 감염성 바이러스 입자 또는 숙주 세포를 포함하는 조성물 (여기에서 "활성제"로서도 언급됨) 또는 그들의 임의의 조합을 제공한다. 유리하게는, 상기 조성물은 치료적 유효량의 상기 활성제(들) 및 약학적으로 허용가능한 비히클을 포함하는 약학 조성물이다.
여기에서 사용된 것과 같은 "약학적으로 허용가능한 비히클"이라는 표현은, 약학 투여에 적합한, 임의의 모든 담체들, 용매들, 희석제들, 부형제들, 어쥬번트들, 분산 매질들, 코팅들, 항균 및 항진균제들, 및 흡수 지연제들 등을 포함하고자 하는 것이다. 여기 사용된 것과 같은 "치료 유효량"이라는 표현은 개체에서 치료 또는 예방하고자 하는 병리학적 상태와 일반적으로 관련된 하나 이상의 증상들을 경감시키기에 충분한 도스(dose)를 말한다. 예방 용도와 관련하여서는, 상기 표현은 개체에서 병리학적 상태의 확립을 예방 또는 지연시키기에 충분한 도스를 의미한다. 예로서, 치료 유효량은 치료된 개체에서의 면역 반응을 유도 또는 증진시키기 충분한 양, 또는 병리학적 사태의 진전을 경감, 개선, 안정화, 역전, 완화 또는 지연시키기에 (예로서, 개체에서 병변 또는 종양의 크기 감소 또는 퇴행, 감염된 개체에서 바이러스성 감염의 역전) 충분한 양일 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 조성물은 사용된 투여량(dosage) 및 농도에서 비독성인 담체 및/또는 희석제를 하나 이상 포함한다. 그러한 담체 및/또는 희석제는 바람직하게는 전신 또는 점막 투여용 단위 투여량 또는 다중-도스 형태 중 한 형태의 조성물을 조제하는데 일반적으로 사용되는 것으로부터 선택된다. 적당한 담체는 용매, 예로서, 물, 에탄올, 폴리올 (예로서, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액상 폴리에틸렌 글리콜 등)을 함유하는 분산 매질, 식물성 오일 또는 그의 적당한 혼합물들일 수 있다. 희석제는 바람직하게는 등장성, 저장성 또는 약간 고장성이며, 비교적 낮은 이온 강도를 갖는다. 적당한 희석제들의 대표적인 예들은 멸균수, 생리학적 식염수 (예로서, 염화나트륨), 링거액, 글루코오스, 트레할로스 또는 사카로오스액, 행크 용액 (Hank's solution) 및 기타 생리학적 균형 염 용액을 포함한다 (예로서, Remington: The Science and Practice of Pharmacy 최신판, A. Gennaro, Lippincott, Williams&Wilkins 참조). 본 발명의 조성물의 pH는, 인간 또는 동물에서의 이용에 적절하도록, 바람직하게는 생리학적 또는 약간 염기성 pH (약 pH 7.5 내지 약 pH 9 사이로, 특히 바람직하게는 pH 약 8 또는 8.5)로 적당히 조절 및 버퍼화한다. 적당한 버퍼들은 포스페이트 버퍼 (예로서 PBS), 바이카보네이트 버퍼 및/또는 트리스 (Tris) 버퍼를 포함한다.
본 발명의 조성물은 다양한 형태, 예로서 동결, 고체 (예로서, 건조 분말화 또는 동결건조 형태), 또는 액상 (예로서, 수용액)일 수 있다. 활성제와 임의의 추가적인 바람직한 성분(들)의 고체 조성물은 그의 미리 멸균-여과된 용액을 진공 건조 및 동결 건조에 투입하여 얻을 수 있다. 바람직한 경우, 이는 사용 전에 적당한 비히클을 첨가하여 재구성하도록 기성화된 멸균 앰플 내에 저장될 수 있다.
특히 바람직한 조성물은 (특히 활성제가 아데노바이러스성 벡터인 경우), 1M 사카로오스, 150 mM NaCl, 1mM MgCl2, 54 mg/l Tween 80, 10 mM Tris pH 8.5 중에 제형화된다. 또 다른 바람직한 조성물은 10 mg/ml 만니톨, 1 mg/ml HSA, 20 mM Tris, pH 7.2 및 150 mM NaCl 중에 제형화된다. 이러한 제형들은 본 발명의 조성물을, 동결 (예로서, -70℃, -40℃, -20℃), 또는 냉장 (예로서, 4℃) 온도에서 적어도 두 달의 기간에 걸쳐 안정성을 보존하는데 특히 적당하다.
상기 조성물은, 예로서 pH, 삼투압, 점도, 투명도, 색상, 멸균성, 안정성, 인간 또는 동물 개체 내로의 방출 또는 흡수의 변경 또는 유지를 포함하는 바람직한 약학적 또는 약물동력학적 성질들을 제공하기 위하여, 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 부형제들도 함유할 수 있다. 안정화 성분들의 대표적인 예들은 바람직한 용해도, 안정성 및 반감기의 성질들을 얻기 위하여 사용될 수 있는, 폴리소르베이트 80, L-아르기닌, 폴리비닐피롤린돈, 트레할로스 및 폴리에틸렌 글리콜과 같은 폴리머들을 포함한다 (Davis 등, 1978, Enzyme Eng. 4, 169-173; Burnham 등, 1994, Am. J. Hosp. Pharm. 51, 210-218). 점도 개선제들은 나트륨 카르복시메틸셀룰로오스, 소르비톨 및 덱스트란을 포함한다. 상기 조성물은 점막 장벽을 통한 또는 특정 기관에서의 침투 또는 수송을 촉진하기 위한, 본 기술분야에서 알려진 물질들도 함유할 수 있다. 예로서, 질 투여에 적합한 조성물은 결국은 점막들의 공극 크기를 증가시키는데 유용한 하나 이상의 흡수 증진제들을 포함할 수 있다.
부가적으로, 본 발명의 조성물은 인간에서 전신 또는 점막 투여에 적당한 하나 이상의 어쥬번트(들)을 포함할 수 있다. "어쥬번트"라는 용어는 특정 항원에 대한 면역 반응을 증진시킬 수 있는 능력을 갖는 화합물을 의미한다. 어쥬번트는 항원의 위치에 또는 그에 가깝게 전달될 수 있다. 체액성 면역의 증진은 전형적으로, 항원에 대해 상승된 항원 역가에서의 현저한 증가 (대개 10 배보다 큼)에 의해 표시된다. 세포성 면역의 증진은 예로서, 양성 피부 시험, 세포독성 T-세포 분석, IFNg 또는 IL-2에 대한 ELIspot 분석에 의해 측정될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에서 사용되는 어쥬번트는, 특히 TLR-7, TLR-8 및 TLR-9와 같은 톨-유사(toll-like) 수용체들 (TLR)을 통해 활성제에 대한 면역성을 자극할 수 있다. 유용한 어쥬번트들의 대표적인 예들은, 이에 제한되지 않지만, 명반, 프로인드 완전 및 불완전 어쥬번트 (IFA)와 같은 광유 에멀션, 지당질 또는 그의 유도체 (Ribi 등, 1986, Immunology and Immunopharmacology of Bacterial Endotoxins, Plenum Publ. Corp., NY, p407-19), QS21과 같은 사포닌류 (Sumino 등, 1998, J.Virol. 72, 4931-9; WO 98/56415), 이미퀴모드 (Imiquimod)와 같은 아미다조퀴놀린 화합물들 (Suader, 2000, J. Am Acad Dermatol. 43, 56-S11), 1H-이미다조 (4, 5-c) 퀴놀론--4-아민 유도체 (Aldara™) 및 관련 화합물 (Smorlesi, 2005, Gene Ther. 12, 1324-32), CpG와 같은 시토신 포스페이트 구아노신 올리고데옥시뉴클레오티드 (Chu 등, 1997, J. Exp. Med. 186: 1623; Tritel 등, 2003, J. Immunol. 171: 2358-2547) 및 IC-31와 같은 양이온 펩티드류 (Kritsch 등, 2005, J. Chromatogr Anal. Technol Biomed Life Sci 822, 263-70)를 포함한다.
본 발명의 핵산 분자, 벡터, 감염성 분자 또는 조성물은, 전신, 국소 및 점막 투여를 포함하는 각종 투여 방법들에 의해 투여될 수 있다. 전신 투여는 예로서 피하, 경피, 근육내, 정맥, 복강내, 혈관내, 동맥내 주사에 의한 임의의 수단에 의해 수행될 수 있다. 주사들은 통상적인 주사와 바늘, 또는 본 기술 분야에서 사용가능한 임의의 기타 적당한 장치들을 이용하여 이루어질 수 있다. 점막 투여는 경구, 코, 기관지내, 폐내, 질내 또는 직장내 경로에 의해 수행될 수 있다. 국소 투여는 경피 수단 (예로서, 패치 등)을 사용하여 수행될 수 있다. 근육내 또는 피하 투여는 활성제로서 바이러스 벡터들 및 감염성 입자들을 이용하는 경우 특히 바람직하다.
적절한 투여량은 특정 활성제의 약물동력학적 특성, 개체의 연령, 건강 및 체중, 치료될 병리학적 상태(들), 증상의 성질 및 정도, 병행치료의 종류, 치료의 빈도, 예방 또는 치료에 대한 필요성 및/또는 원하는 효과와 같은 알려진 인자들에 따라 다를 수 있다. 투여량은 선택된 특정 투여 경로에 따라 다르게 계산될 수도 있다. 치료에 적당한 투여량을 결정하는데 필요한 정밀한 계산은, 관련 상황에 비추어, 실시자에 의해 기계적으로 이루어진다. 일반적인 지침으로, 아데노바이러스 입자들의 경우 적당한 투여량은 약 105 내지 약 1013 iu, 바람직하게는 약 107 내지 약 1012 iu 이고, 바람직하게는 약 108 내지 약 1011 iu의 범위에서 변화한다. 백시니아 바이러스 입자들의 경우 적당한 투여량은 약 104 내지 약 1010 pfu, 바람직하게는 약 105 내지 109 pfu 이고, 바람직하게는 약 106 내지 약 5x108 pfu에서 변화한다. 벡터 플라스미드들은 10 μg 내지 20 mg 사이, 바람직하게는 100μg 내지 2mg 사이의 도스로 투여될 수 있다.
또한, 투여는 몇 시간, 일 및/또는 주에 걸쳐, 단일 도스 또는 선택적으로 표준 프로토콜, 투여량 및 섭생에 따른 다중 도스로 이루어질 수 있다. 또한, 투여는 볼러스(bolus) 주사 또는 연속 주입에 의할 수 있다. 예로서, 개체는 상기 기재된 핵산 분자, 벡터, 감염성 입자 또는 조성물의 적어도 2 (예로서 2 내지 10)회의 투여로 치료될 수 있다. 바람직하게는, 첫 번째 시리즈의 투여는 몇 일 내지 4 주까지 변화하는 기간 내에 순차적으로 수행되고, 이어서 두 번째 시리즈의 투여는 (예로서 1 또는 2 회의 투여) 첫 번째 시리즈의 마지막 투여 이후 1 내지 6 달 내에 수행된다. 두 번째 시리즈의 각각의 투여사이의 기간은 몇 일 내지 4 주일 수 있다. 바람직한 구체예에서, 첫 번째 시리즈의 투여는 주 간격으로 3 회의 순차적인 투여를 포함하고, 두 번째 시리즈의 투여는 첫 번째 시리즈 후 4 내지 6 달 내에 1 회의 투여를 포함한다. 일반적인 지침으로서, MVA 벡터를 이용하는 경우, 바람직한 투여 경로는 106 내지 5x108 pfu 사이에 포함되는 도스의 MVA 입자들의 도스를 피하투여하는 것이다.
본 발명의 핵산 분자, 벡터, 감염성 입자, 숙주 세포 또는 조성물은, 유전 질환, 선천성 질환 및 후천성 질환들을 포함하는 각종 병리학적 상태들의 치료 또는 예방을 위해 개체에 도입될 수 있다. 본 발명은 또한 본 발명의 핵산 분자, 벡터, 감염성 입자, 숙주 세포 또는 조성물의, 그러한 병리학적 상태들의 치료 또는 예방을 위한 약물 제조에의 이용에 관한 것이다. 본 발명은 감염성 질환들 (예로서, 바이러스 및/또는 세균 감염), 암 및 면역 결핍 질환들을 치료 또는 예방하는데 특히 적절하다. 여기 사용된 "암"이라는 용어는 퍼진 또는 국재화된 종양, 전이, 암성 폴립들(polyps) 및 전-종양 병변들 (preneoplastic lesions) (예로서, 신생물형성)을 포함하는 원치않는 세포 증식에서 기인하는 임의의 암성 상태를 포괄한다.
본 발명의 맥락에서 고려되는 감염성 질환들은 상기 기재된 것과 같은 병원성 미생물들에 의한 감염과 관련된 임의의 상태를 포괄한다. 본 발명의 맥락에서 고려되는 암들은 이에 제한되지는 않지만, 다음을 포함한다: 신경교아세포종 (glioblastoma), 육종, 흑색종, 마스토사이토마 (mastocytoma), 암종 및 유방암, 전립선암, 고환암, 난소암, 자궁내막암, 자궁경부암 (특히 파필로마바이러스 감염과 관련된 것들), 폐암 (예로서, 대세포, 소세포, 편평상피 및 아데노-암종들 포함), 신장암, 방광암, 간암, 결장암, 항문암, 췌장암, 위암, 위장암, 구강암, 후두암, 뇌 및 CNS암, 피부암 (예로서, 흑색종 및 비-흑색종), 혈액암 (림프종, 백혈병, 특히 고형 덩어리로 진행된 경우), 뼈암, 망막아종 및 갑상선암.
바람직한 구체예에서, 본 발명은 지속적 (persistent) 감염과 같은 파필로마바이러스 (특히 HR HPV)에 의한 감염, 전-악성 및 악성 병변과 관련된 상태의 예방 또는 치료 처리에 사용된다. "지속적 감염"이라는 표현은 바이러스 근절이 달성되지 않은 감염된 개체에서 파필로마 바이러스 감염의 자각증상이 없는 상태를 의미한다. 전형적으로 어떤 임상적 징후도 관찰되지 않는다. 전-악성 병변의 예들은, 이에 제한되지는 않지만, CIN (경부 상피내 신생물), 음문 상피내 신생물 (VIN), 항문 상피내 신생물 (AIN), 음경 상피내 신생물 (PIN) 및 질 상피내 신생물 (VaIN)과 같은 각종 조직들에서 검출될 수 있는 낮은, 중간 또는 높은 수준의 상피내 신생물을 포함한다. 악성 병변의 예들은 이에 제한되지는 않지만, 자궁경부 암종, 항문 암종, 질암, 음경암 및 구강암을 포함한다. 파필로마 바이러스 폴리펩티드들을 코딩하는 본 발명의 핵산 분자, 벡터, 감염성 입자, 숙주 세포 또는 조성물은 특히 전-악성, 특히 CIN2/3 병변들, 또는 악성 병변들, 특히 자궁경부 암종 치료용이다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 지속적 감염과 같은 간염 바이러스 (예로서, HBV 또는 HCV)에 의한 감염, 만성 또는 전격성 (fulgurant) 간염 및 간암과 관련된 상태의 예방 또는 치료 처리에도 사용될 수 있다.
활성제는 단독으로, 또는 바람직한 경우 통상적인 치료 방식들 (예로서, 방사선, 화학치료 및/또는 수술)과 함께 사용될 수 있다. 통상적인 치료 방식들은, 표준 약제들, 투여량 및 섭생을 사용하는 표준 프로토콜들에 따라 동물 또는 인간 개체에 전달되며, 그러한 방식들은 본 발명의 활성제(들)의 투여 전, 동안, 및/또는 후에 수행될 수 있다. 예로서, HCV 감염과 관련된 상태들의 치료를 위하여, 본 발명의 방법 또는 용도는 바람직하게는, 예로서 HCV-관련 간세포암종들의 치료에 통상적으로 사용되는 프로테아제 저해제들 (예로서, Vertex 의 VX950와 같은 세린 프로테아제 저해제들), 폴리머라아제 저해제들, 헬리카제 저해제들, 항섬유화제들 (antifibrotics), 뉴클레오시드 유사체들, TLR 아고니스트들, siRNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 항-HCV 항체들, 면역 조절제들, 치료용 백신 및 항종양제 (예로서, 아드리아마이신 또는 간동맥에서 화학색전술 (chimioembolisation)에 의해 일반적으로 투여되는 아드리아마이신 리피돌 및 스폰겔 (spongel)의 화합물)와 연합된다. 특히 적당한 조합은, 바람직하게는 본 발명의 활성제(들)의 투여 전 24 내지 48 주 동안, 페길화(pegylated) IFN-α (IFN-α2a 또는 IFN-α2b) 및/또는 리바비린 (ribavirin)를 이용한 치료를 포함한다. 파필로마 바이러스 감염과 관련된 상태들의 치료를 위하여, 본 발명의 방법 또는 이용은, 루프 전기절제수술 (loop electrosurgical excision)과 같은 탈격(ablative) 절차들과 연합될 수 있다. 본 발명에 따른 방법 또는 이용은 시토카인 (예로서, IL-2, IL-7, IL-15, IL- 18, IL-21, IFNg)과 같은 면역증강제(들) 또는 자살 유전자 생성물 (예로서, Caruso 등, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 7024-28에 기재된 HSV-I의 티미딘키나아제; WO 99/54481에 기재된 FCU-I) 또는 그러한 폴리펩티드(들)을 발현하는 벡터(들)과 함께 실시될 수도 있다.
다른 구체예에서, 본 발명의 방법 또는 이용은 프라임 부스트 (prime boost) 치료 방식에 따라 실시되며, 이는 프라이머 조성물(들) 및 부스터 조성물(들)의 순차적인 투여를 포함한다. 전형적으로, 상기 프라이밍(priming) 및 부스팅 조성물은, 적어도 하나의 항원성 도메인을 공통으로 포함하거나 또는 코딩하는 상이한 비히클들을 이용한다. 본 발명의 방법 또는 이용은 프라이밍 조성물의 1 내지 10 회 투여 후, 부스팅 조성물의 1 내지 10 회 투여를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 주사 간격은 1일 내지 12 달이다. 바람직한 방식은 3 내지 10일에서 변화하는 기간 (예로서, 1주)에 의해 독립적으로 구분된 프라이머의 3 또는 4 회의 순차적인 투여들 후, 마지막 프라이머를 투여한 지 1 내지 수 주 후 부스터의 1 또는 2 회 투여(들)를 포함한다. 또한, 프라이밍 및 부스팅 조성물들은 동일한 자리에 또는 다른 자리에, 동일한 투여 경로 또는 상이한 투여 경로에 의해 투여될 수 있다. 예로서, 폴리펩티드를 기초로 한 조성물은 점막 경로에 의해 투여될 수 있는 반면, 벡터들을 기초로 한 조성물은 바람직하게는 주사되는데, 예로서 MVA 벡터의 경우 피하 주사, DNA 플라스미드 및 아데노바이러스 벡터의 경우 근육내 주사로 투여될 수 있다. 본 발명의 벡터, 감염 입자 또는 조성물은 치료된 개체에서 면역반응을 프라이밍하거나 부스트하는데 사용될 수 있거나 또는 프라이밍 및 부스트 모두를 위해 사용될 수 있다. 한 구체예에서, 프라이밍은 본 발명의 플라스미드 벡터를 이용하여 수행되고, 부스팅은 본 발명의 백시니아 바이러스 감염 입자를 이용하여 수행된다. 또 다른 구체예에서, 프라이밍은 본 발명의 아데노바이러스 감염 입자를 이용하여 수행되고, 부스팅은 본 발명의 백시니아 바이러스 감염 입자를 이용하여 수행된다. 또 다른 구체예에서, 프라이밍은 본 발명의 백시니아 바이러스 감염 입자를 이용하여 수행되고, 부스팅은 본 발명의 아데노바이러스 감염성 입자를 이용하여 수행된다.
본 발명은 예시적인 방법으로 기재되었으며, 사용된 용어는 단어들의 성질을 한정하기보다는 설명을 위한 것임을 이해하여야 한다. 본 발명의 많은 변경 및 변화들이 상기 교시의 관점에서 가능하다는 것이 명백하다. 따라서, 첨부된 청구의 범위의 범주 내에서, 본 발명은 여기 특이적으로 기재된 것과 상이한 방식으로 시행될 수 있음을 이해하여야 한다.
상기 인용된 특허, 간행물 및 데이타베이스 기재사항들의 개시는 모두 여기에 참조로서, 그들 전체가 그러한 개별적인 특허, 간행물 또는 기재사항들 각각이 참조로 포함되어짐을 특이적 및 개별적으로 나타낸 것과 같이 동일한 정도로, 특이적으로 포함된다.
도 1a는 (a) 원 HPV-16 E1 서열의 말단과 (b) 원 HPV-16 E2 서열의 시작점에 존재하는 59 뉴클레오티드들 간의 서열 얼라인먼트를 도시화한 것이다.
도 1b는 (a) 원 HPV-16 E1 서열의 말단 또는 원 HPV-16 E2 서열의 시작점과 (b) 서열번호: 9에 존재하는 59 뉴클레오티드들 간의 서열 얼라인먼트를 도시화한 것이다.
도 2a는 HPV-16과 HPV-18 E6 코딩 서열 간의 서열 얼라인먼트를 도시화한 것이다.
도 2b는 HPV-16 E6 코딩 서열과 서열번호:14 간의 서열 얼라인먼트를 도시화한 것이다.
다음의 실시예는 본 발명을 설명하기 위하여 제공된다.
다음에 설명된 구축물들은 Maniatis 등 (1989, Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY)에 설명된 일반적인 유전공학 및 분자 클로닝 기술 또는 상업적인 키트가 사용되는 경우 제조사의 추천에 따라 수행되었다. PCR 증폭 기술은 당업자에 알려져 있다 (예를 들어, PCR protocols - A guide to methods and applications, 1990, published by Innis, Gelfand, Sninsky andWhite, Academic Press 참조). 앰피실린 저항 유전자를 운반하는 재조합 플라스미드는 100μg/ml의 항생물질이 공급된 한천 또는 액체 배치 상에서 대장균 C600 (Stratagene), BJ5183 (Hanahan, 1983, J. MoI. Biol. 166, 557~580) 및 NM522에서 복제되었다. 재조합 백시니아 바이러스의 구축물은 상기 인용된 문헌과 Mackett 등 (1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 7415~7419) 및 Mackett 등 (1984, J. Virol. 49, 857~864)의 분야에서의 일반화된 기술에 따라 수행되었다. 대장균의 선택 유전자 gpt (산틴 구아닌 포스포리보실트랜스페라아제)(Falkner와 Moss, 1988, J. Virol. 62, 1849~1854)는 재조합 백시니아 바이러스의 선발을 촉진시키기 위하여 사용되었다.
실시예 1: HPV-16 E1과 E2 유전자를 발현하는 MVA 벡터 (MVATG17410)의 구축
a) HPV -16 E2 유전자를 코딩하는 재조합 MVA 벡터 ( MVATG17408 )의 구축
HPV16 E2 유전자의 클로닝
HPV-16 E2를 코딩하는 뉴클레오티드 서열들을 CaSki 세포 (ATCC CRL-1550)로부터 분리된 게놈 DNA로부터 클로닝하였다. E2 유전자를 프라이머 OTG16809 (서열번호: 16)과 OTG16810 (서열번호: 17)를 사용하여 증폭시켰다. 결과의 단편을 BamHⅠ과 EcoRⅠ으로 절단하고, 동일한 제한효소에 의하여 절단된 pGEX2T (Amersham Biosciences)에 삽입하여, pTG17239를 얻었다. 클로닝된 E2 유전자의 서열은 HPV16 E2 원형(prototype) 서열 (Genbank NC-01526에서 설명됨)과 비교하여 5개의 돌연변 이를 나타내었다. 두 개의 돌연변이는 사일런스이며, 나머지 세 개의 비-사일런스 돌연변이 (T210I, S219P, K310T)를 QuickChange Site Directed Mutagenesis kit (Stratagene)를 사용하여 모으고, pTG17268을 얻었다.
HPV-16 E2 폴리펩티드의 수식
E2*로 명명된 HPV-16 E2 변종 (E39A와 I73A)을 얻기 위하여, pTG17268에 통합된 E2 뉴클레오티드 서열을 특정부위 돌연변이 유발(site directed mutagenesis)로 수식하였다. 보다 구체적으로, E2 복제 기능을 위치 39의 Glu 기를 Ala 기로 치환하여 제거시키고, 트랜스활성(transactivation) 기능을 위치 73의 Ile 기를 Ala 기로 치환하여 제거시켰다. 결과의 플라스미드 pTG17318은 HPV-16 E2*를 코딩하는 수식된 서열을 포함한다.
발현 숙주 세포의 플라스마 멤브레인 표면에서 HPV-16 E2*의 제시를 지정하기 위하여, HPV-16 E2*는 그것의 N-말단에서 펩티드 시그날과 융합하고, 그것의 C-말단에서 래비 바이러스의 당단백질(PG 종; Genebank ay009097)로부터 유래된 멤브레인-앵커링 서열과 융합하여 추가적으로 수식되었다. SS-E2*-TMR로 명명되는 멤브레인-제시 E2 결손 변종을 코딩하는 뉴클레오티드 서열(서열번호: 12)은 다음의 프라이머들을 사용한 트리플 PCR에 의하여 리어셈블리되었다: OTG17500 (서열번호: 18), OTG17501 (서열번호: 19), OTG17502 (서열번호: 20), OTG17503 (서열번호: 21), OTG17504 (서열번호: 22) 및 OTG17505 (서열번호: 23). 리어셈블리된 서열은 pBS-유래 벡터 (Stratagene)로 삽입되어, pTG17360를 얻었고, 다음으로 백시니아 트랜스퍼 플라스미드 다운스트림 pH5R 프로모터(vaccinia transfer plasmid downstream the pH5R promoter) (Rosel 등, 1986, J Virol. 60, 436~449)로 클로닝되어, pTG17408를 얻었다.
트랜스퍼 플라스미드는 뉴클레오티드 서열의 삽입이 MVA 게놈의 결실 Ⅲ에서 상동성 재조합에 의하여 트랜스퍼되는 것을 가능하게 디자인되었다. 그것은 플라스미드 pTGlE (Braun 등, 2000, Gene Ther. 7, 1447~57에서 설명됨)로부터 기원이 된 것으로, 상기 플라스미드 내로 MVATGN33.1 DNA (Sutter와 Moss, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 10847~51)로부터 PCR에 의하여 얻어진 서열인, MVA 결실 Ⅲ를 둘러싸는 플랭킹 서열 (BRG3와 BRD3)을 클로닝시켰다. 또한, 상기 트랜스퍼 플라스미드는 늦은 초기 백시니아 바이러스 합성 프로모터(early late vaccinia virus synthetic promoter) p11K7.5 (R. Wittek에 의하여 제공됨, University of Lausanne)의 조절하에 아쿠오레아 빅토리아 증강 녹색 형광 단백질(Aequorea victoria enhanced Green Fluorescent protein) (eGFP gene, pEGP-C1로부터 분리됨, Clontech)와 대장균 산틴-구아닌 포스포리보실트랜스페라아제 유전자(Escherichia coli xanthine-guanine phosphoribosyltransferase gene) (gpt gene) 간의 융합을 포함한다. 산틴-구아닌 포스포리보실트랜스페라아제의 합성은 GPT+ 재조합 MVA가 미코페놀산, 산틴, 및 하이포산틴을 포함하는 선택 배지에서 플라크를 형성하는 것을 가능하게 하고 (Falkner 등, 1988, J. Virol. 62, 1849~54), eGFP가 재조합 MVA 플라크의 시각화하는 것을 가능하게 한다. 선택 마커 eGPP-GPT는 동일한 방향으로 두 상동성 서열 간에 놓여진다. 클론 선택이 이루어지면, 선택 마커는 선택 없이 몇 번의 패시지로 쉽게 제거되어, eGPP - GPT 재조합 MVA의 증식을 가능하게 한다.
HPV-16 SS-E2 * -TMR 유전자를 발현하는 재조합 MVA의 구축
MVATG 17408 바이러스의 생산은 MVATGN33.1 (0.1pfu/cell의 MOI)로 감염된 프라이머리 치킨 앰브리오스 피브로블라스트(CEF)에서 상동성 재조합에 의하여 수행되며, (표준 칼슘 포스페이트 DNA 침전에 따라) pTG17408로 트랜스펙션하였다. 바이러스 선택은 미코페놀산, 산틴 및 하이포산틴을 함유하는 선택 배지에서 3회의 플라크 정제로 수행하였다. 위에서 언급된 바와 같이, 선택 마커는 비-선택 배지에서 패시지에 의하여 제거되었다. 부계(parental) MVA에 의한 오염의 부재는 PCR에 의하여 확인되었다.
E2 발현의 분석을 웨스텐-블랏으로 수행하였다. CEF를 MOI 0.2에서 MVATG17408로 트랜스펙션시키고, 24시간 후, 세포들을 수거하였다. 웨스턴-블랏 분석을 상업적 모노클로날 안티-E2 항체 TVG271 (abeam)을 사용하여 수행하였다. 55kDa의 뚜렷한 분자량을 갖는 단백질의 발현이 검출되었으며, E2*-TMR의 이론적인 분자량은 48.9kDa이다. 엔도글리코시다아제 F로 세포 추출물의 처리 후, 재조합 단백질의 크기의 감소가 관찰되었으며, 이는 MVATG17408로부터 발현된 E2* TMR 폴리펩티드가 N-당화되었음을 나타낸다.
b) HPV -16 E2 유전자 ( MVATG17409 )와 오버래핑된 부분에서 축퇴된 HPV -16 E1 유전자를 코딩하는 재조합 MVA 의 구축
HPV-16 E1 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 CaSki 세포 DNA (ATCC CRL-1550)으로부터 클로닝하였다. 보다 상세하게는, E1 유전자를 E1a(뉴클레오티드 1~1102)와 E1b(뉴클레오티드 1001~1950)의 두 부분으로 증폭하였다. E1a 단편을 증폭시키기 위하여 프라이머 OTG 16811 (서열번호: 24)와 OTG 16814 (서열번호: 25)가 사용되었고, BamHⅠ과 EcoRⅠ으로 절단하여, 동일한 제한효소로 처리된 pGEX2T에 삽입되어 pTG17240를 얻었다. E1b 단편은 OTG16813 (서열번호: 26)와 OTG 16812 (서열번호: 27)를 사용하였고, pGEX2T로 삽입하기 전에 BamHⅠ과 EcoRⅠ으로 절단하여, pTG17241를 얻었다. 서열은 HPV-16 E1 원형 서열 (Genbank NC-01526에 설명)과 비교하여 4개의 돌연변이를 나타내었다. 하나의 돌연변이는 사일런스이고, E1a (K130Q, N185T 및 T220S)에 존재하는 세 개의 비-사일런스 돌연변이는 특정부위 돌연변이 유발로 교정하였다. 완전한 E1 유전자를 BsrGⅠ과 EcoRⅠ으로 처리된 pTG 17241에 교정된 E1a 단편을 클로닝하여 리어셈블리하였다. 결과의 플라스미드를 pTG17289로 명명하였다.
HPV-16 게놈에 있어서, E1 유전자의 마지막 59 뉴클레오티드는 E2 유전자의 첫 59 뉴클레오티드와 동일하였다. E1과 E2-코딩 MVA 벡터의 생산 단계 동안의 불안정성의 문제를 피하기 위하여, E1-코딩 서열의 상기 부분을 E2-코딩 서열과의 서열 상동성을 감소시키기 위하여 코돈 이용 수식(codon usage modification)으로 수식하였다. 축퇴된 서열(서열번호: 9)을 축퇴된 프라이머 OTG17408 (서열번호: 28) 와 OTG17409 (서열번호: 29)를 사용하여 E1 유전자의 3' 말단의 증폭에 의하여 얻었다. 증폭된 단편을 NsiⅠ과 BglⅡ로 절단하고, 동일한 제한효소로 절단된 pTG 17289에 삽입하여 pTG17340를 얻었다.
또한, HPV-16 E1의 위치 482에서 Gly 잔기를 Asp 잔기로 치환함으로써 (G482D; 또한, 본 발명에서 E1*로 명명) 코딩된 E1 폴리펩티드의 복제 기능을 폐지하기 위하여, HPV-16 축퇴된 E1 서열을 특정부위 돌연변이 유발로 돌연변이시켜, pTG17373를 얻었다.
또한, 래비스 바이러스 (ERA 분리물; Genebank NO M38452)의 당단백질로부터 유래된 시그날 및 메브레인-앵커링 펩티드로 융합함으로써, 세포막 표면에 코딩된 폴리펩티드를 발현시키기 위하여, HPV-16 E1deg* 서열을 수식하였다. SS-E1deg*-TMR 서열 (서열번호: 10)을 다음의 프라이머 OTG17560 (서열번호: 30), OTG17561 (서열번호: 31), OTG17562 (서열번호: 32), OTG17563 (서열번호: 33), OTG17564 (서열번호: 34) 및 OTG17565 (서열번호: 35)를 사용하여 트리플 PCR로 재구축하였다. 결과의 단편을 pBS-유래 벡터 (Stratagene)에 삽입하고, pTG17404를 얻었다. 다음으로 SS-E 1deg*-TMR 서열을 백시니아 프랜스퍼 플라스미드의 p7.5K 프로모터 다운스트림에 클로닝하여 (Cochran 등, 1985, J. Virol. 54, 30~7), pTG17409를 얻었다.
MVATG17409 바이러스의 생산은 상기 설명된 바와 같이 상동성 제조합에 의하여 CEF에서 수행하였다.
c) 재조합 MVA 코딩 HPV -16 E1 과 E2 유전자 ( MVATG 17410)의 구축
p7.5K 프로모터에 의하여 조정되는 SS-E1deg*-TMR 서열을 pTG17409로부터 분리하여, pTG17408에 삽입하고, pTG17410를 얻었다.
MVATG17410 바이러스의 생산은 상기 설명된 바와 같이 상동성 재조합에 의하여 CEF를 수행하였다.
실시예 2: HPV -18 E1 과 E2 유전자 ( MVATG17582 )를 코딩하는 MVA 벡터의 구축
HPV-18 E1과 E2 유전자를 합성 유전자로 재구축하고, (i) 원 HPV-16과 HPV-18 서열에 의하여 공유되는 상동성 부분 간의 상동성이 75% (HPV-16과 HPV-18 E1 및 E2 유전자를 얼라인하고, 5 보존적 뉴클레오티드 미만으로 상동성을 감소시키기 위하여 올리고뉴클레오티드를 디자인하였다) 미만으로 감소되고, (ⅱ) 원 HPV-18 E1 서열의 3' 말단과 HPV-18 E2 서열의 5' 말단의 양쪽에 존재하는 59 뉴클레오티드의 부분 간의 75% ㅁ미만으로 상동성을 감소시키며, (ⅲ) HPV-18 E1과 E2 유전자 생산물 (E1: G489D, E2: E43A 및 I77A)의 효소적 작용을 폐지하는 돌연변이를 유도하기 위하여, 올리고뉴클레오티드를 디자인하였다.
HPV-18 degE1* 서열을 50 올리고뉴클레오티드를 어셈블링하여 재구축하고, pBS 벡터로 클로닝하여 pTG 17473를 얻었다. 다음으로, E1 서열을 프라이머 OTG15315 (서열번호: 36), OTG17881 (서열번호: 37), OTG17882 (서열번호: 38), OTG17883 (서열번호: 39), OTG17884 (서열번호: 40) 및 OTG17885 (서열번호: 41)를 사용하여 트리플 PCR로 미즐즈 바이러스 F 단백질로부터의 시그널링 클론 (SS- 18Eldeg*-TMF)과 융합시켰다. 결과의 단편 (서열번호: 11)을 p7.5K 프로모터 조절하의 MVA 트랜스퍼 벡터로 클로닝하여 pTG17521를 얻었다.
HPV-18 degE2* 서열을 26 올리고뉴클레오티드로 어셈블링하여 재구축하고, pBS 벡터에 클로닝하여 pTG17498를 얻었다. 래비스 바이러스 (ERA 종; Genbank n° M38452)의 당단백질의 시그널 및 멤브레인-앵커링 펩티드와의 융합을 프라이머 OTG17875 (서열번호: 42), OTG17876 (서열번호: 43), OTG17877 (서열번호: 44), OTG17878 (서열번호: 45), OTG17879 (서열번호: 46) 및 OTG17880 (서열번호: 47)를 사용하여 트리플 PCR로 수행하였다. SS-18 E2*-TMR 카세트를 MVA 트랜스퍼 플라스미드 다운스트림의 pH5R 프로모터에 삽입하고, pTG17552를 얻었다. 마지막으로, p7.5K-SS-E1deg*-TMF 카세트를 pTG17521로부터 분리하고, pTG17552에 삽입하여 pTG17582를 얻었다.
재조합 MVATG17521, MVATG17552 및 MVATG17582의 생산을 상기 설명된 바와 같이 수행하였다.
실시예 3: HPV -16과 HPV -18 E1 및 E2 유전자 ( MVATG17583 )를 발현하는 다가( multivalent ) MVA 벡터의 구축
p7.5K-SS-18E1deg*-TMF 카세트 및 pH5R-SS-18E2*-TMR 카세트를 (p7.5K-SS-16Eldeg*-TMR 카세트 및 pH5R-SS-16E2*-TMR를 포함하는) pTG17410에 도입하고, 결과의 트랜스퍼 플라스미드를 pTG17583로 명명하였다. MVATG17583의 생산을 상기 설명 된 바와 같이 수행하였다.
실시예 4: HPV16 과 HPV18 E6 및 E7 유전자를 발현하는 다가 재조합 바이러스의 구축
MVATG 16327는 HPV-16와 HPV-18 E6 및 E7 폴리펩티드의 멤브레인 앵커된 비-종양성 변이종을 발현하는 재조합 MVA 바이러스이다. E6 및 E7 뉴클레오티드 서열은 이들의 종양 특성을 제거하기 위하여 돌연변이화되고 (E6* 및 E7*), 적절한 시그널 및 멤브레인 앵커링 펩티드를 코딩하는 서열 (E6*tm, E7*tm)과 융합된다. 보다 구체적으로는, HPV-18 E7*는 그것의 N- 과 C-말단에 미즐즈 바이러스의 F 당단백질의 시그널 및 멤브레인-앵커링 펩티드와 각각 융합되고, HPV-16 E6*, HPV-16 E7* 및 HPV-18 E6*은 래비즈 바이러스 당단백질로부터 유래된 시그널 및 멤브레인-앵커링 펩티드와 융합된다. 나아가, HPV-18 E6 및 E7 뉴클레오티드 서열은 HPV16 카운터파트와의 상동성을 감소시키기 위하여 코돈 이용 수식에 의하여 더 수식된다. 이러한 목적을 위하여, 원 HPV 16과 HPV 18 유전자의 서열을 얼라인하고, 5 보존 뉴클레오티드 미만의 상동성으로 감소시키기 위하여 코돈 축퇴를 수행하였다. 벡터에서, HPV-16과 HPV-18 E6 서열은 각각 반대 방향으로 p7.5K 프로모터의 조절하여 놓이고, HPV-16과 HPV-18 E7 서열은 H5R 프로모터에 의하여 작동되며, 모든 발현 카세트는 MVA 게놈의 절단 III 부위로 삽입된다.
a) HPV -16 E7 * tm 발현 카세트의 구축
HPV-16 E7 유전자를 Caski 세포로부터 분리하고, WO99/03885에서 설명된 바와 같이, 비-종양성인 멤브레인-발현 E7 폴리펩티드 (16E7*tmR)를 코딩하기 위하여 수식하였다. 비-종양성 돌연변이를 아미노산 잔기 21~26 (ΔDLYCYE)의 결실과 E7* 돌연변이된 서열을 래비스 바이러스 당단백질로부터 클로닝된 시그널 및 멤브레인-앵커링 펩티드를 코딩하는 서열 (ERA 종; Genbank accession number M38452)과 상기 돌연변이된 서열의 5'과 3' 말단에서 각각 융합하여 멤브레인에 발현시켜 수행하였다. 결과의 서열을 초기-후기 pH5R 프로모터의 조절하에 클로닝하고 (Rosel 등, 1986. J. Virol. 60, 436~9), 상기 카세트를 pBS 유래 벡터에 도입하여 pTG16161를 얻었다.
b) HPV -16 E6 * tm 과 HPV -18 E6 * tm 발현 카세트의 클로닝
WO99/03885에서 설명된 바와 같은 미-종양성인 멤브레인 발현 E6 폴리펩티드를 코딩하기 위하여 HPV-16 E6 유전자가 분리되고, 수식되었다. 비-종양성 돌연변이를 아미노산 잔기 118~122 (ΔCPEEK)의 결실과 E6*-돌연변이된 서열을 래비스 바이러스 당단백질로부터 유래된 시그널 및 멤브레인-앵커링 펩티드를 코딩하는 서열 (PG 종; Genbank accession number ay009097)에 상기 돌연변이된 서열의 5' 및 3' 말단 각각에 융합하며 멤브레인 발현함으로써 수행하였다. 이것은 BamHI 부위에 의하여 분리된 시그널 펩티드 및 멤브레인-앵커링 펩티드 서열을 ㅍ포함하는 벡터에 E6*-돌연변이된 서열을 삽입함으로써 수행하였고, pTG 16097를 얻었다.
합성 HPV-18 E6 서열을 올리고뉴클레오티드 OTG15174 (서열번호: 48), OTG15175 (서열번호: 49), OTG15176 (서열번호: 50), OTG15177 (서열번호: 51), OTG15178 (서열번호: 52), OTG15179 (서열번호: 53), OTG15180 (서열번호: 54) 및 OTG15181 (서열번호: 55)을 어셈블링하여 생산하였다. 상기 올리고뉴클레오티드는, 아미노산 잔기 113~117 (비-종양성 돌연변이 ΔNPAEK)을 코딩하는 코돈의 결실을 도입하고, HPV-16 E6 유전자 (축퇴된 서열)와의 상동성을 감소시키기 위한 코돈 이용을 축퇴시키기 위하여 디자인되었다. 결과의 합성 서열을 그것의 5' 및 3' 말단에서 래비스 바이러스 당단백질 유전자로부터 유래된 시그널 및 멤브레인-앵커링 펩티드를 코딩하는 서열과 각각 융합하여 서열번호: 14로 표시되는 pTG16160를 얻었다. HPV-16 E6*tmR 및 HPV-18 degE6*tmR 서열을 각각 p7.5K 프로모터의 조절하에서 반대 방향으로 삽입하였다. 다음으로 카세트를 pTG16161에 도입히고, pTG 16215를 생산하였다.
c) HPV -18 E7 * tmF 발현 카세트의 클로닝
합성 HPV-18 E7 서열을 올리고뉴클레오티드 OTG14773 (서열번호: 56), OTG14774 (서열번호: 57), OTG14775 (서열번호: 58), OTG14776 (서열번호: 59), OTG14777 (서열번호: 60) 및 OTG14778 (서열번호: 61)를 어셈블링하여 생산하였다. 상기 올리고뉴클레오티드는 아미노산 잔기 24~28 (비-종양성 돌연변이 ΔDLLCH)를 코딩하는 코돈의 결실을 도입하고, HPV-16 E7 유전자 (축퇴된 서열)와의 상동성을 감소시키기 위한 코돈 이용을 축퇴시키기 위하여 디자인되었다. 다음으로, 결과의 합성 서열을 그것의 5' 및 3' 말단에서 미즐즈 바이러스의 F 유전자로부터 클로닝된 시그널 및 멤브레인-앵커링 펩티드에 대한 코딩 서열 (EP 0305229에서 설명)과 융합시켰다. 결과의 서열 (서열번호: 15)을 pH5R 프로모터의 조절하에서 클로닝하고, 상기 카세트를 pBS 유래 벡터에 도입하여 pTG 16015를 얻었다.
d) 트랜스퍼 플라스미드 pTG 16327의 구축
트랜스퍼 플라스미드 pTG6019 (WO99/03885의 실시예 2에서 설명)는 MVA 결실 III에 인접한 상동성 서열을 포함한다. 이것은 다음과 같이 수식되었다. A synthetic polylinker, obtained by hybridation of 프라이머 OTG15040 (서열번호: 62)과 OTG15041 (서열번호: 63)의 혼성화에 의하여 얻어진 합성 폴리링커를 BamHⅠ과 SacⅠ으로 절단된 pTG6019에 도입하고, pTG 16007를 얻었다. 초기-후기 pH5R 프로모터의 조절하에 놓인 대장균 gpt를 코딩하는 발현 카세트를 포함하는 SacⅠ-SacⅠ 단편을 pTG14033 (EP 1 146 125의 실시예 2에서 설명)으로부터 분리하고, SacⅠ 절단에 의하여 pTG 16007로 도입하여 pTG16093를 얻었다. 산틴-구아닌 포스포리브실트랜스페라아제의 합성은 GPT+ 재조합 MVA가 미코페놀산, 산틴, 및 하이포산틴을 함유하는 선택 배지에서 플라크를 생성시키는 것을 가능하게 한다 (Falkner 등, 1988. J.Virol. 62, 1849~54). 선택 마커 GPT를 동일한 방향으로 두 상동성 서열 간에 두었다. 클론 선택이 이루어지면, 선택 마커는 선택 없이, 몇몇 패시지에 의하여 제거되고, GTP 재조합 MVA의 성장을 가능하게 한다.
HindⅢ-SmaⅠ 단편을 함유하는 HPV-18 degE7*TMF 발현 카세트를 pTG16015로 부터 분리하고, 동일한 제한효소로 처리한 pTG 16093에 도입하여, pTG16105를 얻었다. 보다 구체적으로는, pTG16215를 SalⅠ과 EcoRⅠ으로 처리하고, T4 DNA 중합효소로 처리하여, 결과의 단편을 포함하는 HPV-16 E7*tmR, HPV-16 E6*tmR 및 HPV-18 degE6*TMR 발현 카세트를 SmaⅠ으로 절단된 pTG16105에 도입하여 pTG16327를 얻었다 (도 2).
e) MVATG16327 의 생산
MVATG16327의 생산을 프라이머리 치킨 엠브리오스 피브로블라스트 (CEF)에서 상동성 재조합으로 수행하였다. 이러한 목적을 위하여, pTG 16327를 0.1pfu/cell의 MOI에서 MVATGN33.1로 이전에 감염된 CEF 상에서 표준 칼슘 포스페이트 DNA 침전법에 따라 트랜스펙션시켰다. 바이러스 선택을 미코페놀산, 산틴 및 하이포산틴을 함유하는 선택 배지의 존재 하의 CEF 상에서 3회의 플라크 정제로 수행하였다. 다음으로, 선택 마커를 비-선택 배지에서 패시지로 제거시켰다. 부계 MVA의 의한 오염의 부재를 PCR로 확인하였다.
유전자 발현의 분석을 웨스턴-블랏으로 수행하였다. CEF를 MOI 0.2에서 MVATG16327로 감염시키고, 24시간 후, 세포들을 수거하였다. 웨스턴-블랏 분석을 HPV-16과 HPV-18 E6 및 E7 단백질에 대한 토끼 폴리클로날 항체를 각각 사용하여 수행하였다. 결과는 모든 HPV 폴리펩티드가 MVATG16327로부터 정확하게 발현되었다.
f) MVATG16327 의 유전적 안정성 연구
MVATG16327의 5 패시지가 10-2 pfu/cell와 10-4 pfu/cell의 MOI에서 감염된 CEF 상에서 수행되었다. 유전적 안정성을 연구 스톡의 5회 패시지로부터 분리된 100 바이러스 클론으로 평가하였다. 두 가지 방법이 사용되었다: 발현 카세트의 구조를 결정하기 위한 PCR 증폭 및 웨스턴 블랏에 의한 항원 검출. PCR 분석의 결과는 흥미로운 20 발현 카세트를 함유하는 클론이 99%임을 보여주었다. 면역 검출은 네 가지 항원: HPV-16와 HPV-18 E6*tm 및 E7*tm 폴리펩티드가 발현된 클론이 97%임을 보여주었다.
이러한 분석은 MVATG 16327로부터 유래된 97%의 클론이 5 패시지 후 형성되었으며, 이러한 구축물의 우수한 유전적 안정성을 보여준다.
실시예 5: HPV -16, HPV -18, HPV -33 및 HPV -52 E2 유전자를 발현하는 다가 MVA 벡터의 구축
HPV-33 E2 폴리펩티드를 코딩하는 합성 유전자를 Geneart (Regensburg, Germany)에서 합성하였다. 합성 서열은, (i) HPV-16, HPV-18 및 HPV-52로부터의 E2 유전자와 75% 미만의 상동성으로 감소시키고 (만약 가능하다면, 상동성 부분이 6 보존 뉴클레오티드 미만으로 감소된다), (ii) HPV-33 유전자 생산물 (E39A 와 I73A)의 효소적 작용을 폐지시키는 돌연변이를 도입하기 위하여, 디자인되었다.
다음으로, HPV-33 degE2* 서열을 래비스 바이러스의 당단백질의 시그널 및 멤브레인-앵커링 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 (ERA 종, Genbank n° M38452)과 융합하였다. 이것은 프라이머 OTG18962 (서열번호: 72), OTG18963 (서열 번호: 73), OTG18964 (서열번호: 74), OTG18965 (서열번호: 75), OTG18966 (서열번호: 76) 및 OTG18967 (서열번호: 77)을 사용한 트리플 PCR로 수행하였다. SS-33degE2*-TMR 폴리펩티드를 코딩하는 결과의 단편 (서열번호: 67)을 p7.5K 프로모터 조절하의 MVA 트랜스퍼 벡터에 클로닝하고, 바이러스 입자를 상기 설명된 바와 같이 생산하였다.
HPV-52 E2 폴리펩티드를 코딩하는 합성 유전자를 Geneart (Regensburg, Germany)에서 합성하였다. 합성 서열은, (i) HPV-16, HPV-18 및 HPV-33으로부터의 E2 유전자와 75% 미만의 상동성으로 감소시키고 (만약 가능하다면, 상동성 부분이 6 보존 뉴클레오티드 미만으로 감소된다), (ii) HPV-52 유전자 생산물 (E39A 와 I73A)의 효소적 작용을 폐지시키는 돌연변이를 도입하기 위하여, 디자인되었다.
다음으로, 합성 HPV-52 E2*deg 서열을 프라이머 OTG18968 (서열번호: 78), OTG18969 (서열번호: 79), OTG18970 (서열번호: 80), OTG18971 (서열번호: 81), OTG18972 (서열번호: 82) 및 OTG18973 (서열번호: 83)를 사용한 트리플 PCR로 미즐즈 바이러스 F 단백질의 시그널 및 멤브레인-앵커링 펩티드르 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 융합시켰다 (SS-52E2*deg-TMF를 제공).
SS-52E2*deg-TMF 폴리펩티드를 코딩하는 결과의 단편 (서열번호: 69)를 MVA 트랜스퍼 플라스미드의 p7.5K 프로모터에 삽입하고, 바이러스 입자를 상기 설명한 바와 같이 생산하였다.
(pTG17552로부터 분리된) 멤브레인-발현된 효소적 결실 HPV-18 E2 폴리펩티드를 코딩하는 pH5R-SS-18E2*-TMR 카세트, 멤브레인-발현된 효소적 결실 HPV-33 E2 폴리펩티드를 코딩하는 p7.5K-SS-33degE2*-TMR 카세트 및 멤브레인-발현된 효소적 결실 HPV-52 E2 폴리펩티드를 코딩하는 p7.5K-SS-52degE2*-TMF 카세트를 (pH5R-SS-16E2*-TMR 카세트를 포함하는) pTG17408에 도입하고, 바이러스 입자를 상기 설명된 바와 같이 생산하였다.
SEQUENCE LISTING <110> TRANSGENE S.A. SILVESTRE Nathalie SCHMITT Doris <120> Vectors for multiple gene expression <130> TG183 EXT <150> EP07360019.9 <151> 2007-05-15 <160> 83 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 649 <212> PRT <213> Human papillomavirus type 16 <400> 1 Met Ala Asp Pro Ala Gly Thr Asn Gly Glu Glu Gly Thr Gly Cys Asn 1 5 10 15 Gly Trp Phe Tyr Val Glu Ala Val Val Glu Lys Lys Thr Gly Asp Ala 20 25 30 Ile Ser Asp Asp Glu Asn Glu Asn Asp Ser Asp Thr Gly Glu Asp Leu 35 40 45 Val Asp Phe Ile Val Asn Asp Asn Asp Tyr Leu Thr Gln Ala Glu Thr 50 55 60 Glu Thr Ala His Ala Leu Phe Thr Ala Gln Glu Ala Lys Gln His Arg 65 70 75 80 Asp Ala Val Gln Val Leu Lys Arg Lys Tyr Leu Gly Ser Pro Leu Ser 85 90 95 Asp Ile Ser Gly Cys Val Asp Asn Asn Ile Ser Pro Arg Leu Lys Ala 100 105 110 Ile Cys Ile Glu Lys Gln Ser Arg Ala Ala Lys Arg Arg Leu Phe Glu 115 120 125 Ser Glu Asp Ser Gly Tyr Gly Asn Thr Glu Val Glu Thr Gln Gln Met 130 135 140 Leu Gln Val Glu Gly Arg His Glu Thr Glu Thr Pro Cys Ser Gln Tyr 145 150 155 160 Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Cys Ser Gln Tyr Ser Ser Gly Ser Gly 165 170 175 Gly Glu Gly Val Ser Glu Arg His Thr Ile Cys Gln Thr Pro Leu Thr 180 185 190 Asn Ile Leu Asn Val Leu Lys Thr Ser Asn Ala Lys Ala Ala Met Leu 195 200 205 Ala Lys Phe Lys Glu Leu Tyr Gly Val Ser Phe Ser Glu Leu Val Arg 210 215 220 Pro Phe Lys Ser Asn Lys Ser Thr Cys Cys Asp Trp Cys Ile Ala Ala 225 230 235 240 Phe Gly Leu Thr Pro Ser Ile Ala Asp Ser Ile Lys Thr Leu Leu Gln 245 250 255 Gln Tyr Cys Leu Tyr Leu His Ile Gln Ser Leu Ala Cys Ser Trp Gly 260 265 270 Met Val Val Leu Leu Leu Val Arg Tyr Lys Cys Gly Lys Asn Arg Glu 275 280 285 Thr Ile Glu Lys Leu Leu Ser Lys Leu Leu Cys Val Ser Pro Met Cys 290 295 300 Met Met Ile Glu Pro Pro Lys Leu Arg Ser Thr Ala Ala Ala Leu Tyr 305 310 315 320 Trp Tyr Lys Thr Gly Ile Ser Asn Ile Ser Glu Val Tyr Gly Asp Thr 325 330 335 Pro Glu Trp Ile Gln Arg Gln Thr Val Leu Gln His Ser Phe Asn Asp 340 345 350 Cys Thr Phe Glu Leu Ser Gln Met Val Gln Trp Ala Tyr Asp Asn Asp 355 360 365 Ile Val Asp Asp Ser Glu Ile Ala Tyr Lys Tyr Ala Gln Leu Ala Asp 370 375 380 Thr Asn Ser Asn Ala Ser Ala Phe Leu Lys Ser Asn Ser Gln Ala Lys 385 390 395 400 Ile Val Lys Asp Cys Ala Thr Met Cys Arg His Tyr Lys Arg Ala Glu 405 410 415 Lys Lys Gln Met Ser Met Ser Gln Trp Ile Lys Tyr Arg Cys Asp Arg 420 425 430 Val Asp Asp Gly Gly Asp Trp Lys Gln Ile Val Met Phe Leu Arg Tyr 435 440 445 Gln Gly Val Glu Phe Met Ser Phe Leu Thr Ala Leu Lys Arg Phe Leu 450 455 460 Gln Gly Ile Pro Lys Lys Asn Cys Ile Leu Leu Tyr Gly Ala Ala Asn 465 470 475 480 Thr Gly Lys Ser Leu Phe Gly Met Ser Leu Met Lys Phe Leu Gln Gly 485 490 495 Ser Val Ile Cys Phe Val Asn Ser Lys Ser His Phe Trp Leu Gln Pro 500 505 510 Leu Ala Asp Ala Lys Ile Gly Met Leu Asp Asp Ala Thr Val Pro Cys 515 520 525 Trp Asn Tyr Ile Asp Asp Asn Leu Arg Asn Ala Leu Asp Gly Asn Leu 530 535 540 Val Ser Met Asp Val Lys His Arg Pro Leu Val Gln Leu Lys Cys Pro 545 550 555 560 Pro Leu Leu Ile Thr Ser Asn Ile Asn Ala Gly Thr Asp Ser Arg Trp 565 570 575 Pro Tyr Leu His Asn Arg Leu Val Val Phe Thr Phe Pro Asn Glu Phe 580 585 590 Pro Phe Asp Glu Asn Gly Asn Pro Val Tyr Glu Leu Asn Asp Lys Asn 595 600 605 Trp Lys Ser Phe Phe Ser Arg Thr Trp Ser Arg Leu Ser Leu His Glu 610 615 620 Asp Glu Asp Lys Glu Asn Asp Gly Asp Ser Leu Pro Thr Phe Lys Cys 625 630 635 640 Val Ser Gly Gln Asn Thr Asn Thr Leu 645 <210> 2 <211> 365 <212> PRT <213> Human papillomavirus type 16 <400> 2 Met Glu Thr Leu Cys Gln Arg Leu Asn Val Cys Gln Asp Lys Ile Leu 1 5 10 15 Thr His Tyr Glu Asn Asp Ser Thr Asp Leu Arg Asp His Ile Asp Tyr 20 25 30 Trp Lys His Met Arg Leu Glu Cys Ala Ile Tyr Tyr Lys Ala Arg Glu 35 40 45 Met Gly Phe Lys His Ile Asn His Gln Val Val Pro Thr Leu Ala Val 50 55 60 Ser Lys Asn Lys Ala Leu Gln Ala Ile Glu Leu Gln Leu Thr Leu Glu 65 70 75 80 Thr Ile Tyr Asn Ser Gln Tyr Ser Asn Glu Lys Trp Thr Leu Gln Asp 85 90 95 Val Ser Leu Glu Val Tyr Leu Thr Ala Pro Thr Gly Cys Ile Lys Lys 100 105 110 His Gly Tyr Thr Val Glu Val Gln Phe Asp Gly Asp Ile Cys Asn Thr 115 120 125 Met His 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16 <400> 4 Met His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln 1 5 10 15 Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser 20 25 30 Glu Glu Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp 35 40 45 Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr 50 55 60 Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val Asp Ile Arg Thr Leu Glu 65 70 75 80 Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro Ile Cys Ser Gln 85 90 95 Lys Pro <210> 5 <211> 737 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> HPV-16 membrane-presented and replication-defective E1 polypeptide <400> 5 Met Val Pro Gln Ala Leu Leu Phe Val Pro Leu Leu Val Phe Pro Leu 1 5 10 15 Cys Phe Gly Lys Phe Pro Ile Ala Asp Pro Ala Gly Thr Asn Gly Glu 20 25 30 Glu Gly Thr Gly Cys Asn Gly Trp Phe Tyr Val Glu Ala Val Val Glu 35 40 45 Lys Lys Thr Gly Asp Ala Ile Ser Asp Asp Glu Asn Glu Asn Asp Ser 50 55 60 Asp Thr Gly Glu Asp Leu Val Asp Phe Ile Val Asn Asp Asn Asp Tyr 65 70 75 80 Leu Thr Gln Ala Glu Thr Glu 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aagccctgct attcgtacct ttattggtct ttcccctctg tttcggtaag 60 tttcctatag ctgatcctgc aggtaccaat ggggaagagg gtacgggatg taatggatgg 120 ttttatgtag aggctgtagt ggaaaaaaaa acaggggatg ctatatcaga tgacgagaac 180 gaaaatgaca gtgatacagg tgaagatttg gtagatttta tagtaaatga taatgattat 240 ttaacacagg cagaaacaga gacagcacat gcgttgttta ctgcacagga agcaaaacaa 300 catagagatg cagtacaggt tctaaaacga aagtatttgg gtagtccact tagtgatatt 360 agtggatgtg tagacaataa tattagtcct agattaaaag ctatatgtat agaaaaacaa 420 agtagagctg caaaaaggag attatttgaa agcgaagaca gcgggtatgg caatactgaa 480 gtggaaactc agcagatgtt acaggtagaa gggcgccatg agactgaaac accatgtagt 540 cagtatagtg gtggaagtgg gggtggttgc agtcagtaca gtagtggaag tgggggagag 600 ggtgttagtg aaagacacac tatatgccaa acaccactta caaatatttt aaatgtacta 660 aaaactagta atgcaaaggc agcaatgtta gcaaaattta aagagttata cggggtgagt 720 ttttcagaat tagtaagacc atttaaaagt aataaatcaa cgtgttgcga ttggtgtatt 780 gctgcatttg gacttacacc cagtatagct gacagtataa aaacactatt acaacaatat 840 tgtttatatt tacacattca aagtttagca tgttcatggg gaatggttgt gttactatta 900 gtaagatata aatgtggaaa aaatagagaa acaattgaaa aattgctgtc taaactatta 960 tgtgtgtctc caatgtgtat gatgatagag cctccaaaat tgcgtagtac agcagcagca 1020 ttatattggt ataaaacagg tatatcaaat attagtgaag tgtatggaga cacgccagaa 1080 tggatacaaa gacaaacagt attacaacat agttttaatg attgtacatt tgaattatca 1140 cagatggtac aatgggccta cgataatgac atagtagacg atagtgaaat tgcatataaa 1200 tatgcacaat tggcagacac taatagtaat gcaagtgcct ttctaaaaag taattcacag 1260 gcaaaaattg taaaggattg tgcaacaatg tgtagacatt ataaacgagc agaaaaaaaa 1320 caaatgagta tgagtcaatg gataaaatat agatgtgata gggtagatga tggaggtgat 1380 tggaagcaaa ttgttatgtt tttaaggtat caaggtgtag agtttatgtc atttttaact 1440 gcattaaaaa gatttttgca aggcatacct aaaaaaaatt gcatattact atatggtgca 1500 gctaacacag ataaatcatt atttggtatg agtttaatga aatttctgca agggtctgta 1560 atatgttttg taaattctaa aagccatttt tggttacaac cattagcaga tgccaaaata 1620 ggtatgttag atgatgctac agtgccctgt tggaactata tagatgacaa tttaagaaat 1680 gcattggatg gaaatttagt ttctatggat gtaaagcata gaccattggt acaactaaaa 1740 tgccctccat tattaattac atctaacatt aatgctggta cagattctag gtggccttat 1800 ttacataata gattggtggt gtttacattt cctaatgagt ttccatttga cgaaaacgga 1860 aatccagtgt atgagcttaa tgataagaac tggaaatcct ttttctcaag gacgtggtcc 1920 agattaagtt tgcacgagga cgaggacaag gaaaacgatg gtgattcatt acctacattc 1980 aagtgcgtat ctggtcagaa cacaaatact ttgtacgtac tgctatcggc aggcacgttg 2040 atcgcactaa tgcttatcat cttcctaata acctgctgca agcgggttga taggcccgaa 2100 agtacccaaa ggtccttgag aggtaccgga cgcaacgtat cggtaacgtc gcaaagcggc 2160 aagttcatta gcagttggga gtcgcacaaa tcaggtggag agacccgcct gtga 2214 <210> 11 <211> 2241 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> nucleotide sequence encoding a membrane-anchored and replication-defective HPV-18 E1 polypeptide degenerated to decrease homology with E1-encoding HPV-16 sequence <400> 11 atgggtctca aggtgaacgt ctctgccata ttcatggcag tactgttaac tctccaaaca 60 cccaccggtc aaatccattg gggcgcagac ccagaaggca cagacggaga aggcacgggt 120 tgcaacggct ggttctacgt acaagctatt gtagacaaga agaccggaga tgtaatttct 180 gacgatgagg acgagaatgc aacagacaca gggtcggata tggttgactt cattgataca 240 caaggaacat tttgtgaaca agccgagcta gaaactgctc aggcattgtt ccatgcgcag 300 gaggtccaca atgatgcaca agtgttgcat gttttaaagc ggaagtttgc aggaggcagc 360 acagaaaaca gtccattagg ggagcggctg gaggtggata cagagttaag cccacggtta 420 caagaaatat ctttaaatag tgggcagaaa aaggctaaga ggcggctgtt tacaatatca 480 gatagtggct acggctgttc tgaggtggaa gcaacacaga ttcaggtaac tacaaatggc 540 gaacatggcg gcaatgtatg cagtggcggc agtacggagg ctatagacaa cggaggcaca 600 gagggcaaca acagcagtgt agacggtaca agcgacaata gcaatataga aaatgtaaat 660 ccacaatgta ccatagcaca attaaaagac ttgttaaaag taaacaataa acaaggagct 720 atgcttgcag tattcaagga cacatatggg ctatcattta cagatttagt tagaaatttc 780 aagagtgaca aaaccacatg tacagactgg gttacagcta tattcggagt aaacccaaca 840 atcgcagaag gatttaagac tctaatacag ccatttatat tgtatgccca tatacaatgt 900 ctagactgta agtggggtgt attaatatta gccctgttgc gttacaagtg cggtaagagt 960 agactaacag ttgctaaagg tttaagtacg ttgttacacg tacctgaaac ttgcatgtta 1020 attcaaccac ctaagttacg aagtagtgtt gctgcactat actggtacag aactggaatt 1080 tctaacataa gcgaggtaat gggtgacaca cctgagtgga ttcagagact tactattata 1140 cagcatggaa tagacgatag caatttcgat ttgtcagaaa tggttcagtg ggcatttgac 1200 aacgagctga cagatgaaag cgatatggca tttgaatacg ccttattagc tgacagcaac 1260 agcaacgcag ctgcattttt aaagagcaat tgccaagcta aatatttaaa agactgtgcc 1320 actatgtgca aacactatag gcgtgcccag aaacgacaga tgaatatgtc acagtggatt 1380 cgatttaggt gttcaaaaat agacgaaggg ggagactgga gaccaatagt gcaattcctg 1440 cgataccaac aaatagaatt cataacattc ttaggagcct tgaaatcatt cttaaaagga 1500 acccccaaga agaactgttt agtattttgt ggaccagcaa atactgacaa gtcatatttc 1560 ggaatgagct ttatacactt tatacaagga gcagttatat cattcgtgaa ctccactagt 1620 cacttctggc tggaaccgtt aacagacact aaggtggcca tgctagacga cgcaacgacc 1680 acgtgctgga catactttga tacctatatg aggaacgcgt tagacggcaa tccaataagt 1740 attgatagaa aacacaaacc tttaatacag cttaagtgtc cgccaatact actaaccaca 1800 aatatacatc cagcaaagga taatagatgg ccatacttag aaagtagaat aacagtattt 1860 gaattcccaa atgcattccc gttcgataaa aatggcaacc ctgtatacga aataaacgac 1920 aaaaattgga agtgtttctt tgaaagaaca tggtcaaggt tagatttaca tgaagaagaa 1980 gaagatgctg atacagaggg taatccattt ggtactttca aattacgagc tggacagaat 2040 cacaggcctc ttggtttatc gagcactagc atagtctaca tcctgattgc agtgtgtctt 2100 ggagggttga tagggatccc cgctttaata tgttgctgca gggggcgttg taacaaaaag 2160 ggagaacaag ttggtatgtc aagaccaggc ctaaagcctg atcttacggg aacatcaaaa 2220 tcctatgtaa ggtcgctctg a 2241 <210> 12 <211> 1362 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> nucleotide sequence encoding a membrane-anchored and replication-defective HPV-16 E2 polypeptide <400> 12 atggtaccac aagcgctgtt acttgtccca ctgcttggtt tctctttatg ttttggaaaa 60 ttcccaatag agactctttg ccaacgttta aatgtgtgtc aggacaaaat actaacacat 120 tatgaaaatg atagtacaga cctacgtgac catatagact attggaaaca catgcgccta 180 gcatgtgcta tttattacaa ggccagagaa atgggattta aacatattaa ccaccaggtg 240 gtgccaacgc tggctgtatc aaagaataaa gcattacaag cagctgaact gcaactaacg 300 ttagaaacaa tatataactc acaatatagt aatgaaaagt ggacattaca agacgttagc 360 cttgaagtgt atttaactgc accaacagga tgtataaaaa aacatggata tacagtggaa 420 gtgcagtttg atggagacat atgcaataca atgcattata caaactggac acatatatat 480 atttgtgaag aagcatcagt aactgtggta gagggtcaag ttgactatta tggtttatat 540 tatgttcatg aaggaatacg aacatatttt gtgcagttta aagatgatgc agaaaaatat 600 agtaaaaata aagtatggga agttcatgcg ggtggtcagg taatattatg tcctacatct 660 gtgtttagca gcaacgaagt atcctctcct gaaattatta ggcagcactt ggccaaccac 720 cccgccgcga cccataccaa agccgtcgcc ttgggcaccg aagaaacaca gacgactatc 780 cagcgaccaa gatcagagcc agacaccgga aacccctgcc acaccactaa gttgttgcac 840 agagactcag tggacagtgc tccaatcctc actgcattta acagctcaca caaaggacgg 900 attaactgta atagtaacac tacacccata gtacatttaa aaggtgatgc taatacttta 960 aaatgtttaa gatatagatt taaaaagcat tgtacattgt atactgcagt gtcgtctaca 1020 tggcattgga caggacataa tgtaaaacat aaaagtgcaa ttgttacact tacatatgat 1080 agtgaatggc aacgtgacca atttttgtct caagttaaaa taccaaaaac tattacagtg 1140 tctactggat ttatgtctat atatgttctt ctctctgctg gaactttaat agctttaatg 1200 ttaataatat tcttaataac gtgctgtaaa agggtagacc gtccagagtc aactcagcgc 1260 agccttaggg gtactgggag aaatgtttcc gtgacatcac agagtggaaa atttatctcg 1320 tcttgggaat ctcataagag tggaggcgaa acacgtcttt ga 1362 <210> 13 <211> 1362 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> nucleotide sequence encoding a membrane-anchored and replication-defective HPV-18 E2 polypeptide degeneratde to reduce homology with native HPV-16 E2-encoding sequence <400> 13 atggttcctc aggctctcct gtttgtaccc cttctggttt ttccattgtg ttttgggaaa 60 ttccctattc agacaccgaa ggaaaccctt tcggaacgat taagttgcgt gcaagataag 120 atcatagacc actacgagaa cgacagtaaa gacatagaca gccaaataca gtactggcaa 180 ctaatacgtt gggcaaatgc aatattcttt gcagcaaggg aacatggcat acagacatta 240 aatcatcagg tagtcccagc ctataacatt tcgaaaagta aggcacataa agctgccgag 300 ctccaaatgg ccctacaagg ccttgcacaa agtcgataca aaaccgagga ttggactctg 360 caggacacat gcgaggaact atggaataca gaacctactc actgctttaa gaaaggtggc 420 caaaccgtac aagtatattt cgacggcaac aaagacaatt gtatgaccta tgtagcatgg 480 gacagtgtgt attatatgac tgatgcagga acatgggaca aaaccgctac ctgtgtaagt 540 cacaggggat tgtactacgt aaaggagggg tacaacacgt tttatataga attcaaaagt 600 gaatgtgaga agtatgggaa cacaggtacg tgggaggtac attttgggaa taatgtcatt 660 gattgtaatg actctatgtg cagtaccagt gacgacacgg tctccgctac tcagcttgtt 720 aaacagctac agcacacccc ctcaccgtat tccagcaccg tgtccgtggg aaccgcaaag 780 acctacggcc agacgtcggc tgctacacga cctggccact gtggactcgc ggagaagcag 840 cattgtggac ctgtcaaccc acttctcggt gcagctacac ctacaggcaa caacaagaga 900 cgaaaactct gcagtggtaa tacgacgcct ataatacact tgaagggaga cagaaacagt 960 ttgaagtgct tacggtacag gttgcgaaaa catagcgacc actatagaga tatatcatcc 1020 acctggcact ggaccggtgc aggcaatgaa aaaacaggaa tactgactgt aacctaccat 1080 agcgaaacac aaagaacaaa attcttaaat actgttgcaa ttccagatag tgtacaaata 1140 ttggtgggat acatgacaat gtatgtatta ctgagtgcag gggccctgac tgccttgatg 1200 ttgataattt tcctgatgac atgttgtaga agagtcaatc gatcagaacc tacgcaacac 1260 aatctcagag ggacagggag ggaggtgtca gtcactcccc aaagcgggaa gatcatatct 1320 tcatgggaat cacacaagag tgggggtgag accagactgt ga 1362 <210> 14 <211> 741 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Nucleotide sequence encoding a membrane-anchored and non-oncogenic HPV-18 E6 polypeptide degenerated to reduce homology with the native HPV-16 E6-encoding sequence <400> 14 atggtaccgc aagccctgct attcgtacct ttattggtct ttcccctctg tttcggtaag 60 tttcctatag gatctatggc gcgctttgag gatccaacac ggcgacccta caagctacct 120 gatctgtgca cggaactgaa cacttcactg caagacatag aaataacctg tgtatattgt 180 aagacagtat tggaacttac agaggtattt gaatttgcat ttaaagacct atttgtggtg 240 tatcgtgaca gtatacccca tgccgcatgc cataagtgta tagattttta ctctagaatc 300 agagaattaa ggcactattc agactctgtg tacggagaca cattggaaaa actaactaac 360 actgggttat acaatttatt aataagatgc ctgcggtgcc agaaaccgtt gcttagacac 420 cttaatgaaa aacgacgatt tcacaacata gctgggcact atagaggcca gtgccattcg 480 tgctgcaacc gagcacgaca ggaacgactc caacgacgca gggagacaca agtaagatcc 540 tacgtactgc tatcggcagg cacgttgatc gcactaatgc ttatcatctt cctaataacc 600 tgctgcaagc gggttgatag gcccgaaagt acccaaaggt ccttgagagg taccggacgc 660 aacgtatcgg taacgtcgca aagcggcaag ttcattagca gttgggagtc gcacaaatca 720 ggtggagaga cccgcctgtg a 741 <210> 15 <211> 585 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Nucleotide sequence encoding a membrane-anchored and non-oncogenic HPV-18 E7 polypeptide degenerated to reduce homology with the native HPV-16 E7-encoding sequence <400> 15 atgggtctca aggtgaacgt ctctgccata ttcatggcag tactgttaac tctccaaaca 60 cccaccggtc aaatccattg gggcagatct atgcacggac ctaaggcaac actgcaagac 120 attgtattgc atttagagcc ccaaaatgaa attccggttg cacagttaag cgactcagag 180 gaagaaaacg acgagattga cggagttaat catcaacatt taccagcccg acgagctgaa 240 ccacaacgtc acacaatgtt gtgtatgtgc tgtaaatgcg aagccagaat tgagctggta 300 gtagagagct cagcagacga ccttcgagca ttccagcagc tatttctgaa caccctgtcc 360 tttgtctgtc cgtggtgtgc atcccagcag ggatctggtt tatcgagcac tagcatagtc 420 tacatcctga ttgcagtgtg tcttggaggg ttgataggga tccccgcttt aatatgttgc 480 tgcagggggc gttgtaacaa aaagggagaa caagttggta tgtcaagacc aggcctaaag 540 cctgatctta cgggaacatc aaaatcctat gtaaggtcgc tctga 585 <210> 16 <211> 34 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> sense primer to amplify HPV-16 E2 sequence from CaSki cells <400> 16 aaacccggat ccatggagac tctttgccaa cgtt 34 <210> 17 <211> 49 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> antisense primer to isolate HPV-16 E2 sequence from caSki cells <400> 17 aaacccgaat tcaagcttag atcttcatat agacataaat ccagtagac 49 <210> 18 <211> 33 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer for reassambling HPV16 SS-E2mute-TMR sequence <400> 18 aaacccggat ccatggtacc acaagcgctg tta 33 <210> 19 <211> 53 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer for reassembilng HPV-16 SS-E2mute-TMR sequence <400> 19 tctctttatg ttttggaaaa ttcccaatag agactctttg ccaacgttta aat 53 <210> 20 <211> 53 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer for reassembling HPV-16 SS-E2mute-TMR sequence <400> 20 atttaaacgt tggcaaagag tctctattgg gaattttcca aaacataaag aga 53 <210> 21 <211> 49 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer for reassembling HPV-16 SS-E2mute-TMR sequence <400> 21 cagtgtctac tggatttatg tctatatatg ttcttctctc tgctggaac 49 <210> 22 <211> 49 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer for reassembling HPV-16 SS-E2mute-TMR sequence <400> 22 gttccagcag agagaagaac atatatagac ataaatccag tagacactg 49 <210> 23 <211> 44 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer for reassembling HPV-16 SS-E2mute-TMR sequence <400> 23 aaacccagat cttcaaagac gtgtttcgcc tccactctta tgag 44 <210> 24 <211> 34 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer for isolating HPV-16 E1 sequence from CaSki cells <400> 24 aaacccggat ccatggctga tcctgcaggt acca 34 <210> 25 <211> 34 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer for isolating HPV-16 E1 sequence from CaSki cells <400> 25 aaacccgaat tccattatcg taggcccatt gtac 34 <210> 26 <211> 32 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer for isolating HPV-16 E1 sequence from CaSki cells <400> 26 aaacccggat ccgagacacg ccagaatgga ta 32 <210> 27 <211> 50 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer for isolating HPV-16 E1 sequence from CaSki cells <400> 27 aaacccgaat tcaagcttag atcttcataa tgtgttagta ttttgtcctg 50 <210> 28 <211> 88 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer for generating E1 degenerated sequence <400> 28 aaacccagat cttcacaaag tatttgtgtt ctgaccagat acgcacttga atgtaggtaa 60 tgaatcacca tcgttttcct tgtcctcg 88 <210> 29 <211> 21 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer for generating degenerated HPV-16 E1 sequence <400> 29 gatgctacag tgccctgttg g 21 <210> 30 <211> 35 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer for reconstituting sequence encoding HPV-16 SS-E1*deg-TMR <400> 30 aaacccaagg atccatggta ccgcaagccc tgcta 35 <210> 31 <211> 52 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer for reconstituting sequence encoding HPV-16 SS-E1*deg-TMR <400> 31 ttcccctctg tttcggtaag tttcctatag ctgatcctgc aggtaccaat gg 52 <210> 32 <211> 52 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer for reconstituting sequence encoding HPV-16 SS-E1*deg-TMR <400> 32 ccattggtac ctgcaggatc agctatagga aacttaccga aacagagggg aa 52 <210> 33 <211> 50 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer oTG17563 for reconstituting sequence encoding HPV-16 SS-E1 <400> 33 tatctggtca gaacacaaat actttgtacg tactgctatc ggcaggcacg 50 <210> 34 <211> 50 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer oTG17564 for reconstituting sequence encoding HPV-16 SS-E1*deg-TMR <400> 34 cgtgcctgcc gatagcagta cgtacaaagt atttgtgttc tgaccagata 50 <210> 35 <211> 42 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer oTG17565 for reconstituting sequence encoding SS-E1*deg-TMR <400> 35 aaacccaaag atcttcacag gcgggtctct ccacctgatt tg 42 <210> 36 <211> 33 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer oTG15315 for reconstituting sequence encoding HPV-18 SS6E1*deg-TMF <400> 36 ggggagatct atgggtctca aggtgaacgt ctc 33 <210> 37 <211> 39 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer oTG17881 for reconstituting sequence encoding HPV-18 SS-E1*deg-TMF <400> 37 gtgccttctg ggtctgcgcc ccaatggatt tgaccggtg 39 <210> 38 <211> 37 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer oTG17882 for reconstituting sequence encoding HPV-18 SS-E1*deg-TMF <400> 38 ggtcaaatcc attggggcgc agacccagaa ggcacag 37 <210> 39 <211> 42 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer oTG17883 for reconstituting sequence encoding HPV-18 SS-E1*deg-TMF <400> 39 cagaatcaca ggcctcttgg tttatcgagc actagcatag tc 42 <210> 40 <211> 39 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer oTG17884 for reconstituting sequence encoding HPV-18 SS-E1*deg-TMF <400> 40 gctagtgctc gataaaccaa gaggcctgtg attctgtcc 39 <210> 41 <211> 32 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer oTG17885 for reconstituting sequence encoding HPV-18 SS-E1*deg-TMF <400> 41 gggggcggcc gctcagagcg accttacata gg 32 <210> 42 <211> 31 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> sense primer oTG17875 for reconstituting sequence encoding HPV-18 SS-E2*deg-TMR <400> 42 ggggagatct atggttcctc aggctctcct g 31 <210> 43 <211> 39 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> sense primer oTG17876 for reconstituting sequence encoding HPV-18 SS-E2*deg-TMR <400> 43 gttttgggaa attccctatt cagacaccga aggaaaccc 39 <210> 44 <211> 43 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> antisense primer oTG17877 for reconstituting sequence encoding HPV-18 SS-E2*deg-TMR <400> 44 gtttccttcg gtgtctgaat agggaatttc ccaaaacaca atg 43 <210> 45 <211> 39 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> sense primer oTG17878 for recosntituting sequence encoding HPV-18 SS-E2*deg-TMR <400> 45 gtgggataca tgacaatgta tgtattactg agtgcaggg 39 <210> 46 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> antisense primer oTG17879 for reconstituting sequence encoding HPV-18 SS-E2*deg-TMR <400> 46 ctgcactcag taatacatac attgtcatgt atcccacc 38 <210> 47 <211> 29 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> antisense primer oTG17880 for reconstituting sequence encoding HPV-18 SS-E2*deg-TMR <400> 47 gggggcggcc gctcacagtc tggtctcac 29 <210> 48 <211> 83 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> sense primer oTG15174 for reconstituting sequence encoding HPV-18 E6*deg <400> 48 ggggagatct atggcgcgct ttgaggatcc aacacggcga ccctacaagc tacctgatct 60 gtgcacggaa ctgaacactt cac 83 <210> 49 <211> 84 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> sense primer oTG15175 for reconstituting sequence encoding HPV-18 E6*deg <400> 49 gtattggaac ttacagaggt atttgaattt gcatttaaag acctatttgt ggtgtatcgt 60 gacagtatac cccatgccgc atgc 84 <210> 50 <211> 85 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> sense primer oTG15176 for reconstituting sequence encoding HPV-18 E6*deg <400> 50 aggcactatt cagactctgt gtacggagac acattggaaa aactaactaa cactgggtta 60 tacaatttat taataagatg 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<212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> antisense primer oTG15181 for reconstituting sequence encoding HPV-18 E6*deg <400> 55 caaatacctc tgtaagttcc aatactgtct tacaatatac acaggttatt tctatgtctt 60 gcagtgaagt gttcagttcc gtgcac 86 <210> 56 <211> 70 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> sense primer oTG14773 for reconstituting sequence encoding HPV-18 E7*deg <400> 56 aaacccagat ctatgcacgg acctaaggca acactgcaag acattgtatt gcatttagag 60 ccccaaaatg 70 <210> 57 <211> 76 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> antisense primer oTG14774 for reconstituting sequence encoding HPV-18 E7*deg <400> 57 aatctcgtcg ttttcttcct ctgagtcgct taactgtgca accggaattt cattttgggg 60 ctctaaatgc aataca 76 <210> 58 <211> 76 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> sense primer oTG14775 for reconstituting sequence encoding HPV-18 E7*deg <400> 58 actcagagga agaaaacgac gagattgacg gagttaatca tcaacattta ccagcccgac 60 gagctgaacc acaacg 76 <210> 59 <211> 76 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> antisense primer oTG14776 for reconstituting sequence encoding HPV-18 E7*deg <400> 59 ctagctcaat tctggcttcg catttacagc acatacacaa cattgtgtga cgttgtggtt 60 cagctcgtcg ggctgg 76 <210> 60 <211> 76 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> sense primer oTG14777 for reconstituting sequence encoding HPV-18 E7*deg <400> 60 taaatgcgaa gccagaattg agctagtagt agagagctca gcagacgacc ttcgagcatt 60 ccagcagcta tttctg 76 <210> 61 <211> 79 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> antisense primer oTG14778 for reconstituting sequence encoding HPV-18 E7*deg <400> 61 aaacccggat ccctgctggg atgcacacca cggacagaca aaggacaggg tgttcagaaa 60 tagctgctgg aatgctcga 79 <210> 62 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer sens polylinker <400> 62 cctgcagaag cttcccgggg 20 <210> 63 <211> 28 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> anstisense primer polylinker <400> 63 gatcccccgg gaagcttctg caggagct 28 <210> 64 <211> 243 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> HPV-16 membrane-presented and non-oncogenic E6 variant (SS-16E6*-TMF) <400> 64 Met Gly Leu Lys Val Asn Val Ser Ala Ile Phe Met Ala Val Leu Leu 1 5 10 15 Thr Leu Gln Thr Pro Thr Gly Gln Ile His Trp Gly Met His Gln Lys 20 25 30 Arg Thr Ala Met Phe Gln Asp Pro Gln Glu Arg Pro Arg Lys Leu Pro 35 40 45 Gln Leu Cys Thr Glu Leu Gln Thr Thr Ile His Asp Ile Ile Leu Glu 50 55 60 Cys Val Tyr Cys Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg Glu Val Tyr Asp Phe 65 70 75 80 Ala Phe Arg Asp Leu Cys Ile Val Tyr Arg Asp Gly Asn Pro Tyr Ala 85 90 95 Val Cys Asp Lys Cys Leu Lys Phe Tyr Ser Lys Ile Ser Glu Tyr Arg 100 105 110 His Tyr Cys Tyr Ser Leu Tyr Gly Thr Thr Leu Glu Gln Gln Tyr Asn 115 120 125 Lys Pro Leu Cys Asp Leu Leu Ile Arg Cys Ile Asn Cys Gln Lys Pro 130 135 140 Leu Gln Arg His Leu Asp Lys Lys Gln Arg Phe His Asn Ile Arg Gly 145 150 155 160 Arg Trp Thr Gly Arg Cys Met Ser Cys Cys Arg Ser Ser Arg Thr Arg 165 170 175 Arg Glu Thr Gln Leu Gly Leu Ser Ser Thr Ser Ile Val Tyr Ile Leu 180 185 190 Ile Ala Val Cys Leu Gly Gly Leu Ile Gly Ile Pro Ala Leu Ile Cys 195 200 205 Cys Cys Arg Gly Arg Cys Asn Lys Lys Gly Glu Gln Val Gly Met Ser 210 215 220 Arg Pro Gly Leu Lys Pro Asp Leu Thr Gly Thr Ser Lys Ser Tyr Val 225 230 235 240 Arg Ser Leu <210> 65 <211> 185 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> HPV-16 membrane-presented and non-oncogenic E7 variant (SS-16E7*-TMR) <400> 65 Met Val Pro Gln Ala Leu Leu Phe Val Pro Leu Leu Val Phe Pro Leu 1 5 10 15 Cys Phe Gly Lys Phe Pro Ile Gly Ser Met His Gly Asp Thr Pro Thr 20 25 30 Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln Pro Glu Thr Thr Gln Leu Asn 35 40 45 Asp Ser Ser Glu Glu Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala 50 55 60 Glu Pro Asp Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys 65 70 75 80 Asp Ser Thr Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val Asp Ile Arg 85 90 95 Thr Leu Glu Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro Ile 100 105 110 Cys Ser Gln Lys Pro Arg Ser Tyr Val Leu Leu Ser Ala Gly Ala Leu 115 120 125 Thr Ala Leu Met Leu Ile Ile Phe Leu Met Thr Cys Cys Arg Arg Val 130 135 140 Asn Arg Ser Glu Pro Thr Gln His Asn Leu Arg Gly Thr Gly Arg Glu 145 150 155 160 Val Ser Val Thr Pro Gln Ser Gly Lys Ile Ile Ser Ser Trp Glu Ser 165 170 175 His Lys Ser Gly Gly Glu Thr Arg Leu 180 185 <210> 66 <211> 1062 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> nucleotide sequence encoding a replication-defective HPV-33 E2 polypeptide (degenerated sequence) <400> 66 atggaggaaa tatcagcacg cttgaatgca gtccaagaga aaattctaga tctttacgaa 60 gcagataaaa ctgatttacc atctcaaatt gaacactgga aattgatacg catggcctgc 120 gctttattgt atacagccaa acagatgggc ttttcacatt tatgtcacca agtggtacct 180 tctttgttag catccaaaac caaagcgttt caagtagcgg aactacagat ggcattagag 240 acattaagta aatcacagta tagcacaagc caatggacgt tgcaacagac aagcttagag 300 gtttggcttt gtgaaccacc aaaatgtttt aaaaagcaag gagaaacagt aactgtgcaa 360 tatgacaatg acaaaaaaaa taccatggac tatactaact ggggtgaaat atacattata 420 gaggaagata catgtactat ggttacaggg aaagtagatt atataggtat gtattacata 480 cataactgtg aaaaggtata ctttaaatat tttaaggagg atgctgccaa atactctaaa 540 acacaaatgt gggaagtcca tgtaggtggc caggttattg tttgccctac gtctatatct 600 agcaatcaaa tatccactac tgagactgct gacatacaga cagacaacga taaccgacca 660 ccacaagcag cggccaaacg acgacgacct gcagacacta ctgacaccgc ccagcccctt 720 acaaagctgt tctgtgcaga ccccgccttg gataatagaa cagcacgtac agcaactaac 780 tgcacaaata agcagcggac tgtgtgtagt tctaacgttg caccaatagt gcatttgaaa 840 ggcgaatcaa atagcttaaa gtgtttgaga tacagattaa aaccttataa agagttgtac 900 agttctatgt cttcaacttg gcactggact agtgacaaca aaaatagtaa aaatggcata 960 gtaaccgtga catttgtaac tgaacagcaa caacaaatgt tcttgggtac cgtaaagata 1020 cctcctactg tgcagataag taccggattc atgaccttat aa 1062 <210> 67 <211> 1326 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> nucleotide sequence encoding a membrane-presented and replication-defective HPV-33 E2 polypeptide (SS-33E2*-TMR) (degenerated sequence) <400> 67 atggtaccgc aagccctgct attcgtacct ttattggtct ttcccctctg tttcggtaag 60 tttcctatag aggaaatatc agcacgcttg aatgcagtcc aagagaaaat tctagatctt 120 tacgaagcag ataaaactga tttaccatct caaattgaac actggaaatt gatacgcatg 180 gcctgcgctt tattgtatac agccaaacag atgggctttt cacatttatg tcaccaagtg 240 gtaccttctt tgttagcatc caaaaccaaa gcgtttcaag tagcggaact acagatggca 300 ttagagacat taagtaaatc acagtatagc acaagccaat ggacgttgca acagacaagc 360 ttagaggttt ggctttgtga accaccaaaa tgttttaaaa agcaaggaga aacagtaact 420 gtgcaatatg acaatgacaa aaaaaatacc atggactata ctaactgggg tgaaatatac 480 attatagagg aagatacatg tactatggtt acagggaaag tagattatat aggtatgtat 540 tacatacata actgtgaaaa ggtatacttt aaatatttta aggaggatgc tgccaaatac 600 tctaaaacac aaatgtggga agtccatgta ggtggccagg ttattgtttg ccctacgtct 660 atatctagca atcaaatatc cactactgag actgctgaca tacagacaga caacgataac 720 cgaccaccac aagcagcggc caaacgacga cgacctgcag acactactga caccgcccag 780 ccccttacaa agctgttctg tgcagacccc gccttggata atagaacagc acgtacagca 840 actaactgca caaataagca gcggactgtg tgtagttcta acgttgcacc aatagtgcat 900 ttgaaaggcg aatcaaatag cttaaagtgt ttgagataca gattaaaacc ttataaagag 960 ttgtacagtt ctatgtcttc aacttggcac tggactagtg acaacaaaaa tagtaaaaat 1020 ggcatagtaa ccgtgacatt tgtaactgaa cagcaacaac aaatgttctt gggtaccgta 1080 aagatacctc ctactgtgca gataagtacc ggattcatga ccttatacgt actgctatcg 1140 gcaggcacgt tgatcgcact aatgcttatc atcttcctaa taacctgctg caagcgggtt 1200 gataggcccg aaagtaccca aaggtccttg agaggtaccg gacgcaacgt atcggtaacg 1260 tcgcaaagcg gcaagttcat tagcagttgg gagtcgcaca aatcaggtgg agagacccgc 1320 ctgtga 1326 <210> 68 <211> 1107 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> nucleotide sequence encoding a replication-defective HPV-52 E2 polypeptide (52degE2*) (degenerated sequence) <400> 68 atggaatcga taccggcacg gttaaacgct gtgcaggaaa agatactcga tctatatgag 60 gctgacagca atgatctaaa cgcacaaatc gagcattgga agttgactcg aatggcttgt 120 gttttgtttt ataaagcaaa ggaactggga ataactcata taggccatca agtagtgcct 180 ccaatggcag tgtctaaggc aaaggcctgc caagccgcag agcttcaatt ggctttggag 240 gcattgaaca aaactcaata cagtacagat ggctggacct tacagcaaac aagtctagaa 300 atgtggcgtg cagagccaca aaaatacttc aagaagcacg ggtacacaat aacagtccaa 360 tacgataatg ataaaaacaa cactatggat tacacaaatt ggaaggaaat ttatttactt 420 ggtgagtgtg aatgcacaat tgtagaagga caagtggatt actatgggtt atactattgg 480 tgtgatggag aaaaaatcta tttcgtaaaa tttagtaacg acgcaaagca atattgtgta 540 acaggagtct gggaggtgca cgtgggcggt caagtaatcg tgtgtccagc atcggtatca 600 agtaacgagg tttctactac agaaacagct gtccacctat gcaccgaaac ctccaagacc 660 tccgcagtgt ccgtgggtgc caaagacaca cacctacaac caccacagaa gcgacgtcga 720 ccagatgtca cagattccag aaacaccaag taccccaaca accttttgcg gggacaacaa 780 tccgttgaca gcactacacg gggactcgta actgccactg agtgcactaa taaaggtcgg 840 gttgcacata caacttgtac tgctcctatt attcacctaa agggtgaccc caacagcttg 900 aaatgcctaa ggtatagggt aaaaacacat aaaagtttat atgttcaaat ttcatctacg 960 tggcattgga cgagtaatga atgtacaaat aataaactag gtattgtaac aataacgtac 1020 agtgatgaga cacagcgtca acagttttta aaaactgtca aaatcccaaa taccgtccaa 1080 gttatacaag gtgtcatgtc attgtaa 1107 <210> 69 <211> 1374 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> nucleotide sequence encoding a membrane-presented and replication-defective HPV-52 E2 polypeptide (SS-52E2*-TMF) (degenerated sequence) <400> 69 atgggtctca aggtgaacgt ctctgccata ttcatggcag tactgttaac tctccaaaca 60 cccaccggtc aaatccattg gggcgaatcg ataccggcac ggttaaacgc tgtgcaggaa 120 aagatactcg atctatatga ggctgacagc aatgatctaa acgcacaaat cgagcattgg 180 aagttgactc gaatggcttg tgttttgttt tataaagcaa aggaactggg aataactcat 240 ataggccatc aagtagtgcc tccaatggca gtgtctaagg caaaggcctg ccaagccgca 300 gagcttcaat tggctttgga ggcattgaac aaaactcaat acagtacaga tggctggacc 360 ttacagcaaa caagtctaga aatgtggcgt gcagagccac aaaaatactt caagaagcac 420 gggtacacaa taacagtcca atacgataat gataaaaaca acactatgga ttacacaaat 480 tggaaggaaa tttatttact tggtgagtgt gaatgcacaa ttgtagaagg acaagtggat 540 tactatgggt tatactattg gtgtgatgga gaaaaaatct atttcgtaaa atttagtaac 600 gacgcaaagc aatattgtgt aacaggagtc tgggaggtgc acgtgggcgg tcaagtaatc 660 gtgtgtccag catcggtatc aagtaacgag gtttctacta cagaaacagc tgtccaccta 720 tgcaccgaaa cctccaagac ctccgcagtg tccgtgggtg ccaaagacac acacctacaa 780 ccaccacaga agcgacgtcg accagatgtc acagattcca gaaacaccaa gtaccccaac 840 aaccttttgc ggggacaaca atccgttgac agcactacac ggggactcgt aactgccact 900 gagtgcacta ataaaggtcg ggttgcacat acaacttgta ctgctcctat tattcaccta 960 aagggtgacc ccaacagctt gaaatgccta aggtataggg taaaaacaca taaaagttta 1020 tatgttcaaa tttcatctac gtggcattgg acgagtaatg aatgtacaaa taataaacta 1080 ggtattgtaa caataacgta cagtgatgag acacagcgtc aacagttttt aaaaactgtc 1140 aaaatcccaa ataccgtcca agttatacaa ggtgtcatgt cattgggttt atcgagcact 1200 agcatagtct acatcctgat tgcagtgtgt cttggagggt tgatagggat ccccgcttta 1260 atatgttgct gcagggggcg ttgtaacaaa aagggagaac aagttggtat gtcaagacca 1320 ggcctaaagc ctgatcttac gggaacatca aaatcctatg taaggtcgct ctga 1374 <210> 70 <211> 441 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> membrane-presented and replication-defective HPV-33 E2 polypeptide (SS-33E2*-TMR) <400> 70 Met Val Pro Gln Ala Leu Leu Phe Val Pro Leu Leu Val Phe Pro Leu 1 5 10 15 Cys Phe Gly Lys Phe Pro Ile Glu Glu Ile Ser Ala Arg Leu Asn Ala 20 25 30 Val Gln Glu Lys Ile Leu Asp Leu Tyr Glu Ala Asp Lys Thr Asp Leu 35 40 45 Pro Ser Gln Ile Glu His Trp Lys Leu Ile Arg Met Ala Cys Ala Leu 50 55 60 Leu Tyr Thr Ala Lys Gln Met Gly Phe Ser His Leu Cys His Gln Val 65 70 75 80 Val Pro Ser Leu Leu Ala Ser Lys Thr Lys Ala Phe Gln Val Ala Glu 85 90 95 Leu Gln Met Ala Leu Glu Thr Leu Ser Lys Ser Gln Tyr Ser Thr Ser 100 105 110 Gln Trp Thr Leu Gln Gln Thr Ser Leu Glu Val Trp Leu Cys Glu Pro 115 120 125 Pro Lys Cys Phe Lys Lys Gln Gly Glu Thr Val Thr Val Gln Tyr Asp 130 135 140 Asn Asp Lys Lys Asn Thr Met Asp Tyr Thr Asn Trp Gly Glu Ile Tyr 145 150 155 160 Ile Ile Glu Glu Asp Thr Cys Thr Met Val Thr Gly Lys Val Asp Tyr 165 170 175 Ile Gly Met Tyr Tyr Ile His Asn Cys Glu Lys Val Tyr Phe Lys Tyr 180 185 190 Phe Lys Glu Asp Ala Ala Lys Tyr Ser Lys Thr Gln Met Trp Glu Val 195 200 205 His Val Gly Gly Gln Val Ile Val Cys Pro Thr Ser Ile Ser Ser Asn 210 215 220 Gln Ile Ser Thr Thr Glu Thr Ala Asp Ile Gln Thr Asp Asn Asp Asn 225 230 235 240 Arg Pro Pro Gln Ala Ala Ala Lys Arg Arg Arg Pro Ala Asp Thr Thr 245 250 255 Asp Thr Ala Gln Pro Leu Thr Lys Leu Phe Cys Ala Asp Pro Ala Leu 260 265 270 Asp Asn Arg Thr Ala Arg Thr Ala Thr Asn Cys Thr Asn Lys Gln Arg 275 280 285 Thr Val Cys Ser Ser Asn Val Ala Pro Ile Val His Leu Lys Gly Glu 290 295 300 Ser Asn Ser Leu Lys Cys Leu Arg Tyr Arg Leu Lys Pro Tyr Lys Glu 305 310 315 320 Leu Tyr Ser Ser Met Ser Ser Thr Trp His Trp Thr Ser Asp Asn Lys 325 330 335 Asn Ser Lys Asn Gly Ile Val Thr Val Thr Phe Val Thr Glu Gln Gln 340 345 350 Gln Gln Met Phe Leu Gly Thr Val Lys Ile Pro Pro Thr Val Gln Ile 355 360 365 Ser Thr Gly Phe Met Thr Leu Tyr Val Leu Leu Ser Ala Gly Thr Leu 370 375 380 Ile Ala Leu Met Leu Ile Ile Phe Leu Ile Thr Cys Cys Lys Arg Val 385 390 395 400 Asp Arg Pro Glu Ser Thr Gln Arg Ser Leu Arg Gly Thr Gly Arg Asn 405 410 415 Val Ser Val Thr Ser Gln Ser Gly Lys Phe Ile Ser Ser Trp Glu Ser 420 425 430 His Lys Ser Gly Gly Glu Thr Arg Leu 435 440 <210> 71 <211> 457 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> membrane-presented and replication-defective HPV-52 E2 polypeptide (SS-52E2*-TMF) <400> 71 Met Gly Leu Lys Val Asn Val Ser Ala Ile Phe Met Ala Val Leu Leu 1 5 10 15 Thr Leu Gln Thr Pro Thr Gly Gln Ile His Trp Gly Glu Ser Ile Pro 20 25 30 Ala Arg Leu Asn Ala Val Gln Glu Lys Ile Leu Asp Leu Tyr Glu Ala 35 40 45 Asp Ser Asn Asp Leu Asn Ala Gln Ile Glu His Trp Lys Leu Thr Arg 50 55 60 Met Ala Cys Val Leu Phe Tyr Lys Ala Lys Glu Leu Gly Ile Thr His 65 70 75 80 Ile Gly His Gln Val Val Pro Pro Met Ala Val Ser Lys Ala Lys Ala 85 90 95 Cys Gln Ala Ala Glu Leu Gln Leu Ala Leu Glu Ala Leu Asn Lys Thr 100 105 110 Gln Tyr Ser Thr Asp Gly Trp Thr Leu Gln Gln Thr Ser Leu Glu Met 115 120 125 Trp Arg Ala Glu Pro Gln Lys Tyr Phe Lys Lys His Gly Tyr Thr Ile 130 135 140 Thr Val Gln Tyr Asp Asn Asp Lys Asn Asn Thr Met Asp Tyr Thr Asn 145 150 155 160 Trp Lys Glu Ile Tyr Leu Leu Gly Glu Cys Glu Cys Thr Ile Val Glu 165 170 175 Gly Gln Val Asp Tyr Tyr Gly Leu Tyr Tyr Trp Cys Asp Gly Glu Lys 180 185 190 Ile Tyr Phe Val Lys Phe Ser Asn Asp Ala Lys Gln Tyr Cys Val Thr 195 200 205 Gly Val Trp Glu Val His Val Gly Gly Gln Val Ile Val Cys Pro Ala 210 215 220 Ser Val Ser Ser Asn Glu Val Ser Thr Thr Glu Thr Ala Val His Leu 225 230 235 240 Cys Thr Glu Thr Ser Lys Thr Ser Ala Val Ser Val Gly Ala Lys Asp 245 250 255 Thr His Leu Gln Pro Pro Gln Lys Arg Arg Arg Pro Asp Val Thr Asp 260 265 270 Ser Arg Asn Thr Lys Tyr Pro Asn Asn Leu Leu Arg Gly Gln Gln Ser 275 280 285 Val Asp Ser Thr Thr Arg Gly Leu Val Thr Ala Thr Glu Cys Thr Asn 290 295 300 Lys Gly Arg Val Ala His Thr Thr Cys Thr Ala Pro Ile Ile His Leu 305 310 315 320 Lys Gly Asp Pro Asn Ser Leu Lys Cys Leu Arg Tyr Arg Val Lys Thr 325 330 335 His Lys Ser Leu Tyr Val Gln Ile Ser Ser Thr Trp His Trp Thr Ser 340 345 350 Asn Glu Cys Thr Asn Asn Lys Leu Gly Ile Val Thr Ile Thr Tyr Ser 355 360 365 Asp Glu Thr Gln Arg Gln Gln Phe Leu Lys Thr Val Lys Ile Pro Asn 370 375 380 Thr Val Gln Val Ile Gln Gly Val Met Ser Leu Gly Leu Ser Ser Thr 385 390 395 400 Ser Ile Val Tyr Ile Leu Ile Ala Val Cys Leu Gly Gly Leu Ile Gly 405 410 415 Ile Pro Ala Leu Ile Cys Cys Cys Arg Gly Arg Cys Asn Lys Lys Gly 420 425 430 Glu Gln Val Gly Met Ser Arg Pro Gly Leu Lys Pro Asp Leu Thr Gly 435 440 445 Thr Ser Lys Ser Tyr Val Arg Ser Leu 450 455 <210> 72 <211> 36 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> priler oTG18962 for reconstituting sequence encoding SS-33E2*-TMR <400> 72 cccaaaggat ccaccatggt accgcaagcc ctgcta 36 <210> 73 <211> 52 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer oTG18963 for reconstituting sequence encoding SS-33E2*-TMR <400> 73 ttcccctctg tttcggtaag tttcctatag aggaaatatc agcacgcttg aa 52 <210> 74 <211> 52 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer oTG18964 for reconstituting sequence encoding SS-33E2*-TMR <400> 74 ttcaagcgtg ctgatatttc ctctatagga aacttaccga aacagagggg aa 52 <210> 75 <211> 49 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer oTG18965 for reconstituting sequence encoding SS-33E2*-TMR <400> 75 gataagtacc ggattcatga ccttatacgt actgctatcg gcaggcacg 49 <210> 76 <211> 49 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer oTG18966 for reconstituting sequence encoding SS-33-E2*-TMR <400> 76 cgtgcctgcc gatagcagta cgtataaggt catgaatccg gtacttatc 49 <210> 77 <211> 56 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer oTG18967 for reconstituting sequence encoding SS-33E2*-TMR <400> 77 aaaaccccgc atgcgcggcc gcaagctatc acaggcgggt ctctccacct gatttg 56 <210> 78 <211> 37 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer oTG18968 for reconstituting sequence encoding SS-52E2*-TMF <400> 78 aaacccgaga tctaccatgg gtctcaaggt gaacgtc 37 <210> 79 <211> 46 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer oTG18969 for reconstituting sequence encoding SS-52E2*-TMF <400> 79 cccaccggtc aaatccattg gggcgaatcg ataccggcac ggttaa 46 <210> 80 <211> 46 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer oTG18970 for reconstituting sequence encoding SS-52E2*-TMF <400> 80 ttaaccgtgc cggtatcgat tcgccccaat ggatttgacc ggtggg 46 <210> 81 <211> 43 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer oTG18971 for reconstituting sequence encoding SS-52E2*-TMF <400> 81 gttatacaag gtgtcatgtc attgggttta tcgagcacta gca 43 <210> 82 <211> 43 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer oTG18972 for reconstituting sequence encoding SS-52E2*-TMF <400> 82 tgctagtgct cgataaaccc aatgacatga caccttgtat aac 43 <210> 83 <211> 53 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer oTG18973 for reconstituting sequence encoding SS-52E2*-TMF <400> 83 aagcttgcta gccaccggtg gggccgcggc cgctcagagc gaccttacat agg 53

Claims (45)

  1. 제1의 폴리펩티드를 코딩하는 제1의 핵산 분자와 제2의 폴리펩티드를 코딩하는 제2의 핵산 분자를 포함하는 벡터로서,
    상기 제1의 핵산 분자와 제2의 핵산 분자는 40 이상의 연속된 뉴클레오티드들에서 80% 이상의 상동성을 나타내는 제1의 원 (native) 핵산 서열과 제2의 원 핵산 서열로부터 각각 얻어지고,
    상기 상동성을 75% 미만으로 감소시키기 위하여, 상기 벡터 내에 포함된 상기 제1의 핵산 분자, 상기 제2의 핵산 분자, 또는 제1의 핵산 분자 및 상기 제2의 핵산 분자 모두는 변형되며 (modified),
    상기 제1의 핵산 분자와 제2의 핵산 분자는 관련된 HPV 혈청형들로부터 얻은 동일한 폴리펩티드를 코딩하는 벡터.
  2. 제1항에 있어서, 상동성을 75% 미만으로 감소시키기 위하여, 상기 제1의 핵산 분자 또는 제2의 핵산 분자 또는 제1의 핵산 분자와 제2의 핵산 분자 모두의 코돈 이용 패턴 (pattern)은 적어도 40 이상의 연속된 뉴클레오티드의 상동성 부분(들)에서 변형되는 벡터.
  3. 제2항에 있어서, 상기 코돈 이용 패턴은 뉴클레오티드 수준에서 변형되고, 상기 변형은 아미노산 수준에서 사일런스인 (silent) 벡터.
  4. 제2항에 있어서, 상기 코돈 이용 패턴은 제1의 핵산 분자와 제2의 핵산 분자 간의 상동성 부분이 8 보존 뉴클레오티드들 미만으로 제한되는 방식으로 변형되는 벡터.
  5. 제4항에 있어서, 상기 코돈 이용 패턴은 제1의 핵산 분자와 제2의 핵산 분자 간의 상동성 부분이 5 보존 뉴클레오티드들 미만으로 제한되는 방식으로 변형되는 벡터.
  6. 제1항에 있어서, 상기 벡터는 아데노 바이러스 벡터인 벡터.
  7. 제6항에 있어서, 상기 아데노 바이러스 벡터는 복제-결손인 벡터.
  8. 제1항에 있어서, 상기 벡터는 폭스 바이러스 벡터인 벡터.
  9. 제8항에 있어서, 상기 폭스 바이러스 벡터는 코펜하겐 종, 와이어스 종, NYVAC 및 고도로 약독화된 변형 앙카라(MVA) 종으로 이루어지는 군으로부터 선택된 백시니아 바이러스로부터 얻어지는 벡터.
  10. 제1항에 있어서, 상기 제1의 핵산 분자와 제2의 핵산 분자는 HPV-16, HPV-18, HPV-30, HPV-31, HPV-33, HPV-35, HPV-39, HPV-45, HPV-51, HPV-52, HPV-56, HPV-58, HPV-59, HPV-66, HPV-68, HPV-70 및 HPV-85로 이루어지는 군으로부터 선택된 고 위험 파필로마 바이러스로부터 독립적으로 얻어지는 벡터.
  11. 제10항에 있어서, 상기 제1의 핵산 분자와 제2의 핵산 분자는 E1, E2, E6 및 E7로 이루어지는 군으로부터 선택된 초기 파필로마 바이러스 폴리펩티드를 코딩하는 벡터.
  12. 제1항에 있어서, 관련된 생물체들로부터 얻은 상기 동일한 폴리펩티드는 E2 폴리펩티드인 벡터.
  13. 제12항에 있어서, 관련된 HPV 혈청형들은 HPV-16, HPV-18, HPV-33 및 HPV-52인 벡터.
  14. 제13항에 있어서, 상기 벡터는 HPV-16 E2 폴리펩티드를 코딩하는 제1의 핵산 분자, HPV-18 E2 폴리펩티드를 코딩하는 제2의 핵산 분자, HPV-33 E2 폴리펩티드를 코딩하는 제3의 핵산 분자 및 HPV-52 E2 폴리펩티드를 코딩하는 제4의 핵산 분자를 포함하는 벡터.
  15. 제14항에 있어서, 상기 HPV-16 E2 폴리펩티드는 서열번호: 7로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 HPV-18 E2 폴리펩티드는 서열번호: 8로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 HPV-33 E2 폴리펩티드는 서열번호: 70으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 HPV-52 E2 폴리펩티드는 서열번호: 71로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 벡터.
  16. 제14항에 있어서, 상기 제1의 핵산 분자는 서열번호: 12로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 제2의 핵산 분자는 서열번호: 13으로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 제3의 핵산 분자는 서열번호: 67로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 상기 제4의 핵산 분자는 서열번호: 69로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터.
  17. 제1항에 있어서, 관련된 생물체들로부터 얻은 상기 동일한 폴리펩티드는 E6 폴리펩티드, E7 폴리펩티드 또는 E6와 E7 폴리펩티드들 모두인 벡터.
  18. 제17항에 있어서, 상기 제1의 핵산 분자는 HPV-16 E6 폴리펩티드를 코딩하고, 상기 제2의 핵산 분자는 HPV-18 E6 폴리펩티드를 코딩하며, 상기 제2의 핵산 분자는 서열번호: 14로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터.
  19. 제17항에 있어서, 상기 제1의 핵산 분자는 HPV-16 E7 폴리펩티드를 코딩하고, 상기 제2의 핵산 분자는 HPV-18 E7 폴리펩티드를 코딩하며, 상기 제2의 핵산 분자는 서열번호: 15로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터.
  20. 제18항에 있어서, 상기 벡터는 MVA 벡터이고, 상기 제1의 핵산 분자는 백시니아 7.5K 프로모터의 조절하에 놓여지고, 상기 제2의 핵산 분자는 백시니아 H5R 프로모터의 조절하에 놓여지고, 상기 제1의 핵산 분자와 제2의 핵산 분자 모두는 상기 MVA 벡터의 결실 Ⅲ으로 삽입되는 벡터.
  21. 제19항에 있어서, 상기 벡터는 MVA 벡터이고, 상기 제1의 핵산 분자는 백시니아 7.5K 프로모터의 조절하에 놓여지고, 상기 제2의 핵산 분자는 백시니아 H5R 프로모터의 조절하에 놓여지고, 상기 제1의 핵산 분자와 제2의 핵산 분자 모두는 상기 MVA 벡터의 결실 Ⅲ으로 삽입되는 벡터.
  22. 제17항에 있어서, 상기 벡터는 HPV-16 E6 폴리펩티드를 코딩하는 제1의 핵산 분자, HPV-18 E6 폴리펩티드를 코딩하는 제2의 핵산 분자, HPV-16 E7 폴리펩티드를 코딩하는 제3의 핵산 분자 및 HPV-18 E7 폴리펩티드를 코딩하는 제4의 핵산 분자를 포함하고, 상기 제1의 핵산 분자, 제2의 핵산 분자, 제3의 핵산 분자 및 제4의 핵산 분자는 75% 이상의 상동성을 나타내는 40 이상의 연속된 뉴클레오티드들의 부분을 포함하지 않는 벡터.
  23. 서열번호: 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 66, 67, 68 또는 69로 표시되는 임의의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자.
  24. 제23항에 따른 핵산 분자 또는 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 따른 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  25. 치료적으로 효과적인 양의 제23항에 따른 핵산 분자; 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 따른 벡터; 또는 제23항에 따른 핵산 분자 또는 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 따른 벡터를 포함하는 숙주세포, 및 약학적으로 허용가능한 운반체를 포함하는, 감염성 질환, 암 또는 면역 결핍 질환을 치료 또는 예방하기 위한 약학적 조성물.
  26. 제25항에 있어서, 상기 조성물은 인간에서 전신 또는 점막 투여를 위한 하나 이상의 어쥬번트(들)을 포함하는 약학적 조성물.
  27. 제26항에 있어서, 상기 어쥬번트는 이미다조퀴놀린 화합물인 약학적 조성물.
  28. 제25항에 있어서, 파필로마 바이러스에 의한 감염과 관련된 증상의 예방 또는 치료를 위한, 약학적 조성물.
  29. 제28항에 있어서, 파필로마 바이러스 지속성 감염, 또는 파필로마 바이러스 전-악성 및 악성 병변의 예방 또는 치료를 위한, 약학적 조성물.
  30. 제25항에 있어서, 상기 조성물은 프라임 부스트(prime boost) 치료 방식에 따라 투여되고, 상기 조성물은 개체에서 면역 반응을 프라임 (prime) 시키거나; 또는 부스트 (boost)시키거나; 또는 프라임시키고 부스트시키는데 이용되는, 약학적 조성물.
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