ES2277605T3

ES2277605T3 - Secuencias de papilomavirus de codones optimizados.

Info

Publication number: ES2277605T3
Application number: ES01953199T
Authority: ES
Inventors: Peter F. Ertl; Gerald W. Gough; Christopher J. Ring; Sarah Marina GlaxoSmithKline WALCOTT
Original assignee: Glaxo Group Ltd
Current assignee: Glaxo Group Ltd
Priority date: 2000-07-21
Filing date: 2001-07-20
Publication date: 2007-07-16
Anticipated expiration: 2021-07-20
Also published as: ATE346947T1; HUP0300745A3; PL365385A1; WO2002008435A8; WO2002008435A1; NZ523683A; CY1106334T1; HK1056195B; EP1301614A1; NO20030219L; CN1462309A; PT1301614E; EP1301614B1; AU2001275695B9; NO20030219D0; DK1301614T3; IL154009A0; KR100874552B1; CA2416488A1; BR0112637A

Abstract

Una secuencia polinucleotídica que codifica una secuencia de aminoácidos de papilomavirus humano de un antígeno temprano de HPV o fragmento del mismo siendo capaz dicho polinucleótido de provocar una respuesta inmune cuando se administra in vivo caracterizada porque dicho polinucleótido tiene un coeficiente de uso de codones mayor de 0, 5 pero menor de 1, 0 para un gen humano altamente expresado.

Description

Secuencias de papilomavirus de codones optimizados.

La presente invención se refiere a procedimientos y composiciones útiles en el tratamiento y prevención de infecciones por papilomavirus humanos y los síntomas y enfermedades asociados con los mismos.

Las infecciones por papilomavirus se han observado en una diversidad de especies, incluyendo ovejas, perros, conejos, monos, ganado y seres humanos. Los papilomavirus humanos (HPV) se han clasificado en más de 80 tipos (Epidemiology and Biology of Cervical Cancer. Seminars in Surgical Oncology 1999 16:203-211). Los nuevos tipos se definen como aquellos en los que el gen L1 presenta menos de un 90% de identidad de secuencia con secuencias L1 de tipos identificados previamente, mientras que un subtipo presenta entre el 90% y el 98% de identidad de secuencia de L1, y una variante más del 98% de identidad de secuencia (al tipo prototípico (parental)). Los papilomavirus generalmente infectan epitelios, pero los diferentes tipos de HPV causan distintas enfermedades. Por ejemplo, los tipos 1-4, 7, 10 y 26-29 causan verrugas cutáneas benignas, los tipos 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, y 68 están asociados con cánceres cervicales y los tipos 6 y 11 están implicados en verrugas genitales (condilomata no maligno del tracto genital).

La mayoría de las verrugas genitales (>90%) contienen los genotipos 6 y 11 de HPV. Aunque HPV-6 es el genotipo más dominante identificado en infecciones sencillas, tanto HPV-6 como HPV-11 pueden existir ocasionalmente en la misma lesión. Las verrugas generalmente existen en varios sitios en individuos infectados y más del 60% de los pacientes con compañeros que tienen condiloma (verrugas genitales) desarrollan lesiones, con un tiempo de incubación promedio de 3 meses. Actualmente está disponible un intervalo de opciones de tratamiento. Sin embargo, dependen de la escisión y ablación y/o el uso de geles tópicos y cremas. No están libres de dolor, pueden requerir frecuentes visitas clínicas, y la eficacia es elevadamente variable. La recurrencia de la enfermedad sigue siendo un problema significativo para el tratamiento eficaz de esta enfermedad.

Las verrugas genitales pueden retroceder espontáneamente y la inmunidad mediada por células parece ser un acontecimiento principal responsable de la regresión de las verrugas. Los elevados índices de regresión espontánea indican que la inmunidad celular del huésped puede resolver la enfermedad clínica y hace de la intervención de terapia inmune una opción para el tratamiento o prevención de las verrugas genitales. Los objetivos para el tratamiento de la enfermedad son para una terapia específica de virus que está libre de dolor, requiere un mínimo de visitas clínicas, tiene elevados índices de resolución de la enfermedad y que reduce/minimiza la recurrencia de la enfermedad.

HPV ha demostrado ser difícil de cultivar en cultivo tisular, de modo que no existe una vacuna viral viva tradicional o atenuada. El desarrollo de una vacuna contra HPV también se ha ralentizado por la ausencia de un modelo animal adecuado en el que el virus humano pueda estudiarse. Esto es porque los virus son altamente específicos de especie, de modo que no es posible infectar un animal inmunocompetente con un papilomavirus humano, como sería necesario para un ensayo seguro antes de que se pruebe por primera vez la vacuna en seres humanos.

Los papilomavirus tienen un genoma de ADN que codifica genes "tempranos" y "tardíos" denominados E1 a E7, L1 y L2. Las secuencias génicas tempranas han demostrado tener funciones relacionadas con la replicación y trascripción del ADN viral, la evasión de la inmunidad del huésped, y la alteración del ciclo celular normal del huésped y otros procesos. Por ejemplo, la proteína E1 es una ADN helicasa dependiente de ATP y está implicada en el inicio del proceso de replicación del ADN viral mientras que E2 es una proteína reguladora que controla tanto la expresión del gen viral como la replicación del ADN. A través de su capacidad de unirse tanto a E1 como al origen de replicación viral, E2 provoca una concentración local de E1 en el origen, estimulando de este modo el inicio de la replicación del ADN viral. La proteína E4 parece tener varias funciones mal definidas pero entre éstas pueden estar la unión al cito esqueleto de la célula huésped, mientras que E5 parece retardar la acidificación de los endosomas produciendo una expresión aumentada del receptor de EGF en la superficie celular y tanto E6 como E7 son conocidas por unirse a las proteínas celulares p53 y pRB respectivamente. Las proteínas E6 y E7 de tipos de HPV asociados con cáncer cervical son oncogenes conocidos. L1 y L2 codifican las dos proteínas estructurales virales (cápsida).

Históricamente, las vacunas se han visto como un modo de prevenir la infección por un patógeno, estimulando el sistema inmune a reconocer el patógeno y neutralizarlo si existe una infección. La vacuna incluye uno o más antígenos del patógeno, habitualmente el organismo completo, muerto o en una forma debilitada (atenuada), o péptidos antigénicos seleccionados del organismo. Cuando el sistema inmune se expone al antígeno o antígenos, se generan células que retienen una "memoria" inmunológica de los mismos durante la vida del individuo. La exposición posterior al mismo antígeno (por ejemplo, después de infección por el patógeno) estimula una respuesta inmune específica que produce la eliminación o inactivación del agente infeccioso.

Hay dos armas para la respuesta inmune: una respuesta humoral (anticuerpo) y una respuesta mediada por células. Los antígenos proteicos obtenidos de patógenos que se replican de forma intracelular (virus y algunas bacterias) se procesan en la célula huésped infectada que libera péptidos cortos que se presentan posteriormente en la superficie de la célula infectada en asociación con moléculas de histocompatibilidad principal de clase I (MHC I). Cuando este complejo asociado de MHC I y péptido contactan por células T CD8+ específicas de antígeno se activa la célula T, adquiriendo actividad citotóxica. Estas células T citotóxicas (CTL) pueden lisar células huésped infectadas, limitando de este modo la replicación y propagación del patógeno infeccioso. Otro brazo importante de la respuesta inmune está controlado por las células T CD4+. Cuando el antígeno obtenido de patógenos se libera en el medio extracelular pueden captarse por células presentadoras de antígenos especializadas (APC) y presentarse en la superficie de estas células asociadas con moléculas MHC II. El reconocimiento de antígeno en este complejo estimula las células T CD4+ a secretar factores solubles (citoquinas) que regulan los mecanismos efectores de otras células T. El anticuerpo se produce por células B. La unión del antígeno a un anticuerpo secretado puede neutralizar la infectividad de un patógeno y la unión de un antígeno a un anticuerpo unido a membrana en la superficie de células B estimula la división de las células B amplificando de este modo la respuesta de células B. En general, tanto las respuestas inmunes de anticuerpos como las mediadas por células (CD8+ y CD4+) son necesarias para controlar las infecciones por patógenos.

Se cree que puede ser posible utilizar el sistema inmune, incluso después de la infección por un patógeno, para controlar o resolver la infección por inactivación o eliminación del patógeno. Dichas terapias inmunes (también conocidas como vacunas "terapéuticas" o agentes inmunoterapéuticos) necesitarían de forma ideal que fuera eficaz una respuesta mediada por células, aunque pueden provocarse tanto respuestas inmunes humorales como mediadas por células.

Se ha demostrado (Benvenisty, N y Reshaf, L. PNAS 83 9551-9555) que la inoculación de ratones con ADN precipitado con fosfato cálcico produce la expresión de los péptidos codificados por el ADN. Posteriormente, la inyección intramuscular a los ratones de ADN plasmídico que no había precipitado demostró producir la captación del ADN en las células musculares y la expresión de la proteína codificada. Como la expresión del ADN provoca la producción de las proteínas del patógeno codificadas en las células del huésped, como en una infección natural, este mecanismo puede estimular la respuesta inmune mediada por células necesaria para las terapias inmunes o vacunación terapéutica, de modo que un fármaco basado en ADN podría aplicarse como una vacuna profiláctica o como una terapia inmune. Las vacunas de ADN se describen en el documento WO 90/11092 (Vical, Inc.).

La vacunación con ADN puede suministrarse por mecanismos diferentes a inyección intramuscular. Por ejemplo, el suministro a la piel tiene la ventaja del hecho de que los mecanismos inmunes son altamente activos en tejidos que son barreras a infecciones tales como la piel y membranas mucosas. El suministro a la piel podría ser por inyección, por un inyector a chorro (que fuerza entrar un líquido en la piel, o los tejidos subyacentes incluyendo los músculos, a presión) o por bombardeo de partículas, en el que el ADN puede revestirse sobre partículas de suficiente densidad para penetrar el epitelio (patente de Estados Unidos Nº 5371015). Por ejemplo, las secuencias nucleotídicas pueden incorporarse en un plásmido que está revestido sobre perlas de oro que después se administran a elevada presión en la epidermis, tal como, por ejemplo, como se describe en Haynes y col J. Biotechnology 44: 37-42 (1996). La proyección de estas partículas en la piel produce una transfección directa de células tanto epidérmicas como células epidérmicas de Langerhan. Las células de Langerhan son células presentadoras de antígeno (APC) que captan el ADN, expresan los péptidos codificados, y los procesan para presentarlos en proteínas MHC de superficie celular. Las células de Langerhan transfectadas migran a los ganglios linfáticos donde presentan los fragmentos antigénicos presentados a los linfocitos, provocando una respuesta inmune. Son necesarias cantidades muy pequeñas de ADN (menos de 1 \mug, a menudo menos de 0,5 \mug) para inducir una respuesta inmune por suministro mediado por partículas a la piel y esto contrasta con las cantidades de miligramos de ADN que se sabe que son necesarias para generar respuestas inmunes después de una inyección intramuscular directa.

La expresión y detección de proteínas de HPV en células de mamífero transfectada tales como HeLa, 293, o CHO a menudo han demostrado ser difíciles y para estudios bioquímicos e inmunológicos que requieren expresión detectable de proteínas, o cantidades de proteínas puras a menudo se usan los sistemas de expresión de proteínas de E. coli, Baculovirus o levaduras. En estos sistemas los rendimientos de proteína son adecuados haciendo que el análisis funcional y la purificación y los estudios bioquímicos e inmunológicos posteriores sean practicables. Sin embargo, los procedimientos de detección de proteínas directa (por ejemplo, transferencia de Western) típicamente no logran detectar la expresión de la proteína E1 en células de mamífero transfectadas incluso cuando se usan vectores con promotores potentes tales como CMV o SV40. Los procedimientos diseñados para aumentar la expresión de proteína E1 en células de mamífero incluye la clonación de las secuencias flanqueantes 5' a los lados del gen E1 (Remm y col. J. Virol 1999 73, 3062-3070) y la amplificación del vector plasmídico de E1 transfectado después de la transfección (Zou y col. J. Virol 1998 72, 3436-3441). La amplificación del plásmido del vector de entrada por replicación después de la transfección tiene el efecto neto de aumentar el número de copias del gen E1 en la célula, reforzando de este modo los niveles de proteínas y facilitando de este modo la detección de proteínas (por transferencia de Western). Como la expresión y detección de la proteína E1 es problemática en células de mamífero, varios autores han recurrido a detectar la expresión de la proteína por trascripción-traducción in vitro con metionina marcada con ^{35}S usando el sistema de reticulocito de conejo (Promega), (Gopalakrishnan y col. Virology 1999 256, 330-339., Safari y col. Virology 1995 211, 385-396). Sin embargo, este es un sistema libre de células y requiere el uso de un promotor modificado que contenga la secuencia de unión para la ARN polimerasa del fago T7.

La expresión de la proteína E1 además se ha detectado indirectamente, por detección de la replicación del ADN in vitro de un plásmido que contiene un origen de replicación de ADN de HPV. La detección de este plásmido que contiene el origen replicado actúa como sustituto para la expresión de la proteína E1 (y E2) (Gopalakrishnan y col, Virology 1999 256, 330-339., Lu y col J. Virol 1993 67, 7131-7139 y Del Vecchio y col J. Virol 1992 66, 5949-5958). Tanto E1 como E2 son necesarias para la replicación del origen de HPV, de modo que la transfección de células de mamífero con plásmidos que codifican los genes E1 y E2, más un tercer plásmido que lleva un origen de replicación de ADN de HPV, sólo provocaría la replicación del plásmido que lleva el origen si la expresión de la proteína E1 (y la proteína E2) ha sido exitosa, aunque indetectable por el procedimiento de detección de proteínas convencional (transferencia de Western).

El código de ADN tiene 4 letras (A, T, C y G) y usa éstas para deletrear "codones" de tres letras que representan los aminoácidos de las proteínas codificadas en los genes de un organismo. La secuencia lineal de los codones a lo largo de la molécula de ADN se traduce en la secuencia lineal de aminoácidos en la proteína o proteínas codificadas por estos genes. El código está altamente degenerado, codificando 61 codones los 20 aminoácidos naturales y representando 3 codones las señales de "parada". Por tanto, la mayoría de los aminoácidos están codificados por más de un codón - de hecho varios están codificados por cuatro o más codones diferentes.

Cuando está disponible más de un codón para codificar un aminoácido dado, se ha observado que los patrones de uso de codones de los organismos son altamente no aleatorios. Diferentes especies muestran una desviación diferente en su selección de codones y, además, la utilización de codones puede ser marcadamente diferente en una única especie entre genes que se expresan a elevados y bajos niveles. Esta desviación es diferente en virus, plantas, bacterias y células de mamífero, y algunas especies muestran una desviación mayor de una selección de codones aleatoria que otras. Por ejemplo, en los seres humanos y otros mamíferos están menos fuertemente desviados que ciertas bacterias o virus. Por estas razones, existe una probabilidad significativa de que un gen de mamífero expresado en E. coli o un gen viral expresado en células de mamífero tenga una distribución inapropiada de codones para la expresión eficaz. Sin embargo, un gen con un patrón de uso de codones adecuado para la expresión en E. coli puede también expresarse de forma eficaz en seres humanos. Se cree que la presencia en una secuencia de ADN heteróloga de grupos de codones que se observan raramente en el huésped en el que sucede la expresión, es predictiva de bajos niveles de expresión heteróloga en el huésped.

Hay varios ejemplos en los que cambiando codones de los que son raros en el huésped a los que son preferidos por el huésped ("optimización de codones") ha potenciado los niveles de expresión heteróloga, por ejemplo se han optimizado los codones de los genes tardíos L1 y L2 de BPV (papilomavirus bovino) para los patrones de uso de codones en mamífero y esto ha demostrado dar niveles de expresión aumentados sobre las secuencias de HPV de tipo silvestre en un cultivo celular de mamífero (Cos-1) (Zhou y col. J. virol 1999 73, 4972-4982). En este trabajo cada codón de BPV que existía más de dos veces más frecuentemente en BPV que en mamíferos (proporción de uso >2), y la mayoría de los codones con una proporción de uso de >1,5 se reemplazaban conservativamente por el codón de mamífero usado de forma preferente. En los documentos WO97/31115, WO97/48370 y WO98/34640 (Merck & Co., Inc.) la optimización de codones de genes de VIH o segmentos de los mismos han demostrado producir una expresión aumentada de proteínas y una inmunogenicidad mejorada cuando las secuencias con codones optimizados se usan como vacunas de ADN en el mamífero huésped para el que se ha adaptado la optimización. En este trabajo, las secuencias constan completamente de codones optimizados (excepto donde esto introduciría un sitio de restricción, sitio de corte y empalme de intrones, etc. no deseado) porque cada codón viral está reemplazado conservativamente con el codón óptimo para el huésped pretendido.

En el documento WO 011446 (Merck y Co., Inc.) se aplicó el mismo procedimiento a genes de HPV.

De acuerdo con un primer aspecto, la presente invención proporciona una secuencia polinucleotídica que codifica una secuencia de aminoácidos de HPV de un antígeno temprano de HPV o fragmento del mismo, siendo capaz dicho polinucleótido de provocar una respuesta inmune cuando se administra in vivo donde dicho polinucleótido tiene un coeficiente de uso de codones (como se define a continuación) de más de 0,5 pero de menos de 1,0 para un gen humano altamente expresado. Preferiblemente, la secuencia polinucleotídica es una secuencia de ADN. Idealmente, el patrón de uso de codones de la secuencia polinucleotídica también se parece al de genes de E. coli altamente expresados. La secuencia polinucleotídica puede ser una secuencia de ADN, por ejemplo una secuencia de ADN bicatenaria. Preferiblemente, la secuencia polinucleotídica codifica un polipéptido de HPV de un tipo o subtipo de HPV asociado con cáncer cervical, verrugas cutáneas benignas o verrugas genitales, por ejemplo los tipos 1-4. 6, 7,10, 11, 16, 18, 26-29, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 y 68, preferiblemente los tipos 6, 11, 16, 18, 33 ó 45, que están asociados particularmente con cáncer cervical y verrugas genitales, mucho más preferiblemente HPV-11, 6a o 6b.

Por consiguiente, se proporciona un gen sintético que comprende una pluralidad de codones juntos que codifican una secuencia de aminoácidos de HPV, donde la selección de los posibles codones usados para codificar la secuencia de aminoácidos se ha cambiado para que se parezca al uso de codones humanos óptimos de modo de que frecuencia de uso de codones en el gen sintético se parezca de forma estrecha a los genes humanos expresados de forma elevada en lugar de a los genes de papilomavirus. Preferiblemente, el patrón de uso de codones es sustancialmente igual al de los genes humanos altamente expresados.

En ciertas realizaciones, la secuencia de aminoácidos codificada es una secuencia de aminoácidos de HPV de tipo silvestre. En realizaciones alternativas, la secuencia de aminoácidos codificada es una secuencia de aminoácidos de HPV mutada que comprende la secuencia de tipo silvestre con cambios de aminoácidos, por ejemplo mutaciones puntuales de aminoácidos, suficientes para reducir o inactivar una o más de las funciones biológicas del polipéptido. La secuencia de aminoácidos mutada retendrá de forma deseable la inmunogenicidad del polipéptido de tipo silvestre.

El polipéptido de HPV codificado puede comprender un producto génico temprano tal como E1, E2 o E7 o un fragmento, análogo o fusión del mismo. Un polinucleótido de la invención puede, por ejemplo, codificar una fusión entre dos o más productos génicos tempranos de HPV, un producto génico temprano de HPV y un producto génico tardío de HPV por ejemplo L1 o L2, o un fragmento, análogo o fusión del mismo, o entre dos o más productos génicos tardíos de HPV, entre uno o más fragmentos de productos génicos de HPV, o entre un producto génico de HPV (o un fragmento del mismo) y un polipéptido derivado de una fuente diferente a HPV, por ejemplo un adyuvante o péptido dirigido, o polipéptido, tal como un péptido núcleo de HPV. Las fusiones pueden ser entre productos génicos de HPV obtenidos del mismo o diferentes tipos o subtipos virales. Dichas fusiones retendrán de forma deseable la inmunogenicidad de los componentes polipeptídicos fusionados. Preferiblemente, el polipéptido de HPV codificado comprende todo o parte de un producto génico temprano, más preferiblemente E1 o E2. En una realización particular, la secuencia polinucleotídica codifica el polipéptido E1 de tipo silvestre de HPV 6b como se expone en la Figura 1, o un fragmento análogo del mismo. En realizaciones alternativas, la secuencia polinucleotídica puede codificar uno o más de: la secuencia de aminoácidos de E1 de HPV 6b mutada expuesta en la Figura 2; la secuencia de aminoácidos de E2 de tipo silvestre (Figura 3) de HPV 11 o de 6a o 6b; la secuencia de aminoácidos de E2 de HPV 6b mutada de la Figura 4b; y la secuencia de E2 de HPV 11 mutada de la Figura 4a, o fragmentos, análogos o fusiones de las mismas en las que los polipéptidos codificados retienen la inmunogenicidad.

De acuerdo con la presente invención, el patrón de uso de codones del polinucleótido excluirá preferiblemente codones con un valor RSCU de menos de 0,2 en genes altamente expresados del organismo diana. Un valor de uso de codones sinónimos relativo (RSCU) es el número observado de codones dividido por el número esperado si todos los codones para ese aminoácido se usarán de forma igualmente frecuente. Un polinucleótido de la presente invención generalmente tendrá un coeficiente de uso de codones (como se define a continuación) para genes humanos altamente expresados de más de 0,5 pero menos de 1. Deseablemente, el polinucleótido también tendrá un coeficiente de uso de codones para genes de E. coli altamente expresados de más de 0,5, preferiblemente más de 0,6, mucho más preferiblemente más de 0,7.

En una realización la presente invención proporciona una secuencia polinucleotídica que se expone en la Figura 5 o Figura 6, o un fragmento análogo de la misma que mantiene el patrón de uso de codones de la misma. En una realización adicional, la presente invención proporciona una secuencia polinucleotídica complementaria a la secuencia expuesta en la Figura 5 o Figura 6.

De acuerdo con un segundo aspecto de la invención, se proporciona un vector de expresión que comprende y es capaz de dirigir la expresión de una secuencia polinucleotídica de acuerdo con el primer aspecto de la invención, que codifica una secuencia de aminoácidos de HPV donde el patrón de uso de codones de la secuencia polinucleotídica se parece al de los genes humanos altamente expresados. El vector puede ser adecuado para dirigir la expresión de ADN heterólogo en células bacterianas, de insecto o de mamífero, particularmente células humanas. En una realización, el vector de expresión es p7313PLc (Figura 7).

De acuerdo con un tercer aspecto de la invención, se proporciona una célula huésped que comprende una secuencia polinucleotídica de acuerdo con el primer aspecto de la invención, o un vector de expresión de acuerdo con el segundo aspecto. La célula huésped puede ser bacteriana, por ejemplo, E. coli, de mamífero, por ejemplo, humana, o puede ser una célula de insecto. Las células de mamífero que comprenden un vector de acuerdo con la presente invención pueden ser células cultivadas transfectadas in vitro o pueden transfectarse in vivo por administración del vector al mamífero.

En un cuarto aspecto, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende una secuencia polinucleotídica de acuerdo con el primer aspecto de la invención. Preferiblemente, la composición comprende un vector de ADN de acuerdo con el segundo aspecto de la presente invención. En realizaciones preferidas, la composición comprende una pluralidad de partículas, preferiblemente partículas de oro, revestidas con ADN que comprende un vector que codifica una secuencia polinucleotídica que codifica una secuencia de aminoácidos de HPV, donde el patrón de uso de codones de la secuencia polinucleotídica se parece al de genes de mamífero altamente expresados, particularmente genes humanos. En realizaciones alternativas, la composición comprende un excipiente farmacéuticamente aceptable y un vector de ADN de acuerdo con el segundo aspecto de la presente invención. La composición también puede incluir un adyuvante.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un procedimiento para preparar una composición farmacéutica que incluye la etapa de alterar el patrón de uso de codones de una secuencia nucleotídica de HPV de tipo silvestre, o crear una secuencia polinucleotídica de forma sintética, para producir una secuencia que tiene un patrón de uso de codones que se parece al de genes de mamífero altamente expresados y que codifica una secuencia de aminoácidos de HPV de tipo silvestre o una secuencia de aminoácidos de HPV mutada que comprende la secuencia de tipo silvestre con cambios de aminoácidos suficientes para inactivar una o más de las funciones naturales del polipéptido.

También se proporciona el uso de un polinucleótido de acuerdo con el primer aspecto, o de un vector de acuerdo con un segundo aspecto de la invención, en el tratamiento o profilaxis de una infección por HPV, preferiblemente una infección por un tipo o subtipo de HPV asociado con cáncer cervical, verrugas cutáneas benignas o verrugas genitales, por ejemplo, los tipos 1-4, 6, 7, 10, 11, 16, 18, 26-29, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 y 68. En ciertas realizaciones, la invención proporciona el uso de un polinucleótido de acuerdo con el primer aspecto, o de un vector de acuerdo con un segundo aspecto de la invención, en el tratamiento o profilaxis de una infección por HPV de tipo 6, 11, 16, 18, 33 ó 45, que están asociados particularmente con cáncer cervical y verrugas genitales, más preferiblemente HPV 11, 6a o 6b. La invención también proporciona el uso de un polinucleótido de acuerdo con el primer aspecto, un vector de acuerdo con el segundo aspecto de la invención o una composición farmacéutica de acuerdo con el cuarto aspecto de la invención, en el tratamiento o profilaxis de verrugas cutáneas (de la piel), verrugas genitales, células escamosas atípicas de significado indeterminado (ASCUS), displasia cervical, neoplasia intraepitelial cervical (CIN) o cáncer cervical. Por consiguiente, la presente invención también proporciona el uso de un polinucleótido de acuerdo con el primer aspecto, o de un vector de acuerdo con el segundo aspecto de la invención para preparar un medicamento para el tratamiento o profilaxis de una infección por HPV de uno cualquiera o más de los tipos 1-4, 6, 7, 10, 11, 16, 18, 26-29, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 y 68, o cualquier síntoma o enfermedad asociado con los mismos.

La presente invención también proporciona procedimientos para tratar o prevenir infecciones por HPV, particularmente infecciones por uno cualquiera o más de los tipos de HPV 1-4, 6, 7, 10, 11, 16, 18, 26-29, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 y 68, o cualquier síntoma o enfermedad asociado con los mismos, que comprende administra una cantidad de eficaz de un polinucleótido de acuerdo con el primer aspecto, un vector de acuerdo con el segundo aspecto o una composición farmacéutica de acuerdo con el cuarto aspecto de la invención. La administración de una composición farmacéutica puede tener forma de una o más dosis individuales, por ejemplo en un régimen de vacunación terapéutico de "estimulación-refuerzo". En ciertos casos la vacunación de "estimulación" puede ser por suministro de ADN mediado por partículas de un polinucleótido de acuerdo con la presente invención, preferiblemente incorporado en un vector derivado de plásmidos y el "refuerzo" por administración de un vector viral recombinante que comprende la misma secuencia polinucleotídica.

Durante toda la presente memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas las palabras "comprenden" e " incluyen" y variaciones tales como "comprende", "que comprende", "incluye", "que incluye" deben interpretarse de forma global. Es decir, estas palabras pretenden cubrir la posible inclusión de otros elementos o números enteros no específicamente indicados donde lo permita el contexto.

El término "análogo" se refiere a un polinucleótido que codifica la misma secuencia de aminoácidos que otro polinucleótido de la presente invención pero que, a través de la redundancia del código genético, tiene una secuencia nucleotídica diferente manteniendo el mismo patrón de uso de codones, por ejemplo que tiene el mismo coeficiente de uso de codones o un coeficiente de uso de codones en 0,1, preferiblemente en 0,05 del de el otro polinucleótido.

La expresión "patrón de uso de codones" se refiere a las frecuencias promedio para todos los codones en la secuencia nucleotídica, gen o clase de genes en análisis (por ejemplo, genes de mamífero altamente expresados). Los patrones de uso de codones para mamíferos, incluyendo seres humanos, pueden encontrarse en la bibliografía (véase, por ejemplo, Nakamura y col. Nucleic Acids Research 1996, 24: 214-215).

En los polinucleótidos de la presente invención, el patrón de uso de codones está alterado a partir del típico de papilomavirus humanos para representar más cercanamente la desviación de codones del organismo diana, por ejemplo, E. coli o un mamífero, especialmente un ser humano. El "coeficiente de uso de codones" es una medida de cómo de estrechamente se parece un patrón de uso de codones de una secuencia polinucleotídica dada al de una especie diana. Las frecuencias de codones pueden obtenerse de las fuentes de bibliografía para genes altamente expresados de muchas especies (véase, por ejemplo, Nakamura y col. Nucleic Acids Research 1996, 24: 214-215). Las frecuencias de codones para cada uno de los 61 codones (expresado como el número de apariciones por 1000 codones de la clase de genes seleccionada) se normaliza para cada uno de los veinte aminoácidos naturales, de modo que el valor para el codón usado más frecuentemente para cada aminoácido se ajusta a 1 y las frecuencias para los codones menos comunes se ponen a escala para que coincidan entre cero y 1. Por tanto, cada uno de los 61 codones se asigna a un valor de 1 o inferior para los genes altamente expresados de las especies diana. Para calcular un coeficiente de uso de codones para un polinucleótido específico, con relación a los genes altamente expresados de esa especie, el valor a escala para cada codón del polinucleótido especificado se indica y se extrae la media geométrica de todos estos valores (dividiendo la suma de los logaritmos naturales de estos valores por la cantidad total de codones y extrayendo el anti-log). El coeficiente tendrá un valor entre cero y 1 y cuanto mayor sea el coeficiente más codones en el polinucleótido serán codones frecuentemente usados. Si una secuencia polinucleotídica tiene un coeficiente de uso de codones de 1, todos los codones son codones "muy frecuentes" para genes altamente expresados de la especie diana.

Pertenecen al alcance de la invención secuencias polinucleotídicas más cortas. Por ejemplo, un polinucleótido de la invención puede codificar un fragmento de una proteína HPV. Un polinucleótido que codifica un fragmento de al menos 8, por ejemplo 8-10 aminoácidos o hasta 20, 50, 60, 70, 80, 100, 150 ó 200 aminoácidos de longitud se considera que está dentro del alcance de la invención siempre que el polinucleótido tenga un patrón de uso de codones que se parezca al de un gen de mamífero altamente expresado y el oligo o polipéptido codificado demuestre antigenicidad de HPV. En particular, pero no exclusivamente, este aspecto de la invención abarca la situación en la que el polinucleótido codifica un fragmento de una secuencia proteica de HPV completa y puede representar uno o más epítopes concretos de esa proteína.

Los polinucleótidos de la presente invención muestran mayor expresión en E. coli y células de mamífero que las correspondientes secuencias de tipo silvestre que codifican las mismas secuencias aminoacídicas. Aunque no se desea limitarse por ninguna teoría, se cree que es al menos por dos razones. En primer lugar, teniendo un patrón de uso de codones más cercano al de la célula huésped, las secuencias se procesan más fácilmente por la maquinaria de traducción celular. En segundo lugar, como hasta el 30% de la secuencia nucleotídica (o más) es diferente de la secuencia de tipo silvestre, los sitios que impiden la transcripción o traducción (tales como sitios de unión a proteínas) se retirarán o alterarán.

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En algunas realizaciones, los polinucleótidos de acuerdo con la presente invención muestran patrones de uso de codones que se parecen a los de los genes de E. coli y de mamífero (por ejemplo, humanos). Esto es particularmente ventajoso cuando debe usarse una secuencia en la vacunación de un mamífero y en la generación de cantidades significativas de la proteína antigénica in vitro usando células de E. coli (por ejemplo, para el uso en ensayos, tales como inmunoensayos para juzgar los niveles de expresión en tejidos de mamífero o humanos).

Como se ha analizado anteriormente, la presente invención incluye vectores de expresión que comprenden las secuencias nucleotídicas de la invención. Dichos vectores de expresión se construyen de forma rutinaria en la técnica de biología molecular y pueden, por ejemplo, implicar el uso de un ADN plasmídico e iniciadores, promotores, potenciadores y otros elementos apropiados, tales como por ejemplo señales de poliadenilación que pueden ser necesarias, y que se colocan en la orientación correcta, para permitir la expresión proteica. Otros vectores adecuados serían evidentes para los especialistas en la técnica. A modo de ejemplo adicional en este aspecto se hace referencia a Sambrook y col. Molecular Cloning: a Laboratory Manual. 2ª Edición. CSH Laboratory Press. (1989).

Preferiblemente, un polinucleótido de la invención, o para el uso en la invención en un vector, está unido de forma operativa a una secuencia de control que es capaz de proporcionar la expresión de la secuencia codificante por la célula huésped, es decir, el vector es un vector de expresión. La expresión "unido de forma operativa" se refiere a una yuxtaposición donde los componentes descritos están en una relación que les permite funcionar en su modo pretendido. Una secuencia reguladora, tal como un promotor, "unido de forma operativa" a una secuencia codificante se coloca de un modo tal que se consigue la expresión de la secuencia codificante en condiciones compatibles con la secuencia reguladora.

Los vectores pueden ser, por ejemplo, plásmidos, cromosomas artificiales (por ejemplo, BAC, PAC, YAC), virus o vectores fágicos provistos de un origen de replicación, opcionalmente un promotor para la expresión del polinucleótido y opcionalmente un regulador del promotor. Los vectores pueden contener uno o más genes marcadores de selección, por ejemplo un gen de resistencia a ampicilina o kanamicina en el caso de un plásmido bacteriano o un gen de resistencia para un vector fúngico. Los vectores pueden usarse in vitro, por ejemplo para la producción de ADN o ARN o usarse para transfectar o transformar una célula huésped, por ejemplo, una célula huésped de mamífero por ejemplo para la producción de una proteína codificada por el vector. Los vectores también pueden adaptarse para usarse in vivo, por ejemplo en un procedimiento de vacunación de ADN o de terapia génica.

Pueden seleccionarse promotores y otras señales de regulación de la expresión que son compatibles con la célula huésped para la que está diseña la expresión. Por ejemplo, los promotores de mamífero incluyen el promotor de la metalotioneína, que puede inducirse en respuesta a metales pesados tales como cadmio, y el promotor de la beta actina. También pueden usarse promotores virales tales como el promotor del antígeno T de SV40, el promotor temprano inmediato (IE) de citomegalovirus humano (CMV), el promotor de LTR del virus del sarcoma de Rous, el promotor de adenovirus, o un promotor de HPV, particularmente la región reguladora cadena arriba (URR) de HPV. Todos estos promotores están también descritos y fácilmente disponibles en la técnica.

Los ejemplos de vectores virales adecuados incluyen vectores del virus del herpes simple, vectores de vaccinia y virus alfa y retrovirus, incluyendo lentivirus, adenovirus y virus adeno-asociados. Las técnicas de transferencia de genes que usan estos virus son conocidas por los especialistas en la técnica. Los vectores de retrovirus por ejemplo pueden usarse para integrar de forma estable el polinucleótido de la invención en el genoma del huésped, aunque dicha recombinación no se prefiere. Los vectores de adenovirus deficientes en la replicación, por el contrario, permanecen siendo episómicos y por lo tanto permiten la expresión transitoria. Pueden emplearse vectores capaces de dirigir la expresión en células de insecto (por ejemplo vectores de baculovirus), en células humanas o en bacterias para producir cantidades de la proteína de HPV codificada por los polinucleótidos de la presente invención, por ejemplo para su uso como vacunas de subunidad o en inmunoensayos.

Los polinucleótidos de acuerdo con la invención tienen utilidad en la producción por expresión de las proteínas codificadas, cuya expresión puede tener lugar in vitro, in vivo o ex vivo. Los nucleótidos por lo tanto pueden implicarse en síntesis de proteínas recombinantes, por ejemplo para aumentar los rendimientos, o de hecho pueden encontrar uso como agentes terapéuticos en sí mismos, utilizarse en técnicas de vacunación de ADN. Cuando se usan los polinucleótidos de la presente invención en la producción de las proteínas codificadas in vitro o ex vivo, las células, por ejemplo en cultivo celular, se modificarán para incluir el polinucleótido a expresar. Dichas células incluyen líneas celulares de mamífero transitorias o preferiblemente estables. Los ejemplos particulares de células que pueden modificarse por inserción de vectores que codifican un polipéptido de acuerdo con la invención incluyen las células de mamífero HEK293T, CHO, HeLa, 293 y COS. Preferiblemente, la línea celular seleccionada será una que no solamente sea estable, sino que también permita la glicosilación madura y la expresión en la superficie celular de un polipéptido. La expresión puede conseguirse en ovocitos transformados. Un polipéptido puede expresarse a partir de un polinucleótido de la presente invención, en células de un animal no humano transgénico, preferiblemente un ratón. Un animal no humano transgénico que expresa un polipéptido a partir de un polinucleótido de la invención se incluye en el alcance de la invención.

Cuando los polinucleótidos de la presente invención encuentran uso como agentes terapéuticos, por ejemplo, en vacunación de ADN, el ácido nucleico se administrará al mamífero, por ejemplo, un ser humano a vacunar. El ácido nucleico, tal como ARN o ADN, preferiblemente ADN, se proporciona en forma de un vector, tal como los descritos anteriormente, que pueden expresarse en las células del mamífero. Los polinucleótidos pueden administrarse por cualquier técnica disponible. Por ejemplo, el ácido nucleico puede introducirse por inyección con aguja, preferiblemente por vía intradérmica, subcutánea o intramuscular. Como alternativa, el ácido nucleico puede suministrarse directamente a la piel usando un dispositivo de suministro de ácidos nucleicos tal como suministro de ADN mediado por partículas (PMDD). En este procedimiento, las partículas inertes (tales como perlas de oro) se revisten con un ácido nucleico, y se aceleran a velocidades suficientes para posibilitar que penetren una superficie de un destinatario (por ejemplo, la piel), por ejemplo mediante una descarga a presión elevada desde un dispositivo de proyección. (Las partículas revestidas con una molécula de ácido nucleico de la presente invención están dentro del alcance de la presente invención, que son un dispositivo de suministro cargado con dichas partículas). La composición comprende de forma deseable partículas de oro que tienen un diámetro promedio de 0,5-5 \mum, preferiblemente aproximadamente 2 \mum. En realizaciones preferidas, las perlas de oro revestidas se cargan en tubos para servir como cartuchos de modo que cada cartucho contenga 0,1-1 mg, preferiblemente 0,5 mg de oro revestido con 0,1-5 \mug, preferiblemente aproximadamente 0,5 \mug de ADN por cartucho.

Las técnicas adecuadas para introducir el polinucleótido o vector desnudo en un paciente incluyen aplicación tópica con un vehículo apropiado. El ácido nucleico puede administrarse por vía tópica a la piel, o a la superficie mucosa por ejemplo por administración intranasal, oral, intravaginal o intrarrectal. El polinucleótido o vector desnudo puede estar presente junto con un excipiente farmacéuticamente aceptable, tal como solución salina taponada con fosfato (PBS). La captación del ADN puede facilitarse adicionalmente por el uso de agentes facilitadores tales como bupivacaína por separado o incluidos en la formulación de ADN. Otros procedimientos para administrar el ácido nucleico directamente a un destinatario incluyen ultrasonidos, estimulación eléctrica, electroporación y microsiembra que se describen en el documento US-5.697.901.

La captación de las construcciones de ácido nucleico puede potenciarse por varias técnicas de transfección conocidas, por ejemplo las que incluyen el uso de agentes de transfección. Los ejemplos de estos agentes incluyen agentes catiónicos, por ejemplo, fosfato cálcico y DEAE-dextrano y lipofectantes, por ejemplo, lipofectam y transfectam. La dosificación del ácido nucleico administra puede alterarse. Típicamente el ácido nucleico se administra en una cantidad en el intervalo de 1 pg a 1 mg, preferiblemente 1 pg a 10 \mug de ácido nucleico para el suministro de genes mediado por partículas y 10 \mug a 1 mg para otras vías.

También puede administrarse una secuencia de ácido nucleico de la presente invención mediante vectores de suministro especializados útiles en terapia génica. Los enfoques de terapia génica se analizan por ejemplo por Verme y col, Nature 1997, 389:239-242. Pueden usarse sistemas de vector tanto virales como no virales. Los sistemas basados en virus incluyen sistemas basados en retrovirus, lentivirus, adenovirus, virus adeno-asociados, herpesvirus, virus de la viruela del canario y virus vaccinia. Los sistemas no basados en virus incluyen la administración directa de ácidos nucleicos, tecnología de encapsulación en microesferas (poli(lactida-co-glicolida) y, sistemas basados en liposomas. Los sistemas de suministro virales y no virales pueden combinarse cuando sea deseable proporcionar inyecciones de refuerzo después de una vacunación inicial, por ejemplo una vacunación de ADN de "estimulación" inicial usando un vector no viral tal como un plásmido seguido de una o más vacunaciones de entre "refuerzo" usando un vector viral o sistema no basado en virus.

También puede administrarse una secuencia de ácido nucleico de la presente invención mediante células transformadas. Dichas células incluyen células recogidas de un sujeto. El polinucleótido o vector desnudo de la presente invención puede introducirse en dichas células in vitro y las células transformadas después pueden devolverse al sujeto. El polinucleótido de la invención puede integrarse en un ácido nucleico ya presente en una célula por acontecimientos de recombinación homóloga. Una célula transformada puede, si se desea, cultivarse in vitro y puede usarse una o más de las células resultantes en la presente invención. Las células pueden proporcionarse en un sitio apropiado en un paciente por técnicas quirúrgicas o microquirúrgicas conocidas (por ejemplo, injerto, microinyección, etc.).

Las células adecuadas incluyen células presentadoras de antígeno (APC), tales como células dendríticas, macrófagos, células B, monocitos y otras células que pueden modificarse genéticamente para que sean APC eficaces. Dichas células pueden, pero no necesariamente, modificarse genéticamente para aumentar la capacidad de presentar el anfígeno, para mejorar la activación y/o mantenimiento de la respuesta de células T, para que tengan efectos anti-tumorales, por ejemplo anti-carcinoma cervical per se y/o para que sean inmunológicamente compatibles con el receptor (es decir, haplotipo HLA coincidente). Las APC generalmente pueden aislarse de cualquiera de una diversidad de fluidos biológicos y órganos incluyendo tejidos tumorales y peri-tumorales, y pueden ser células autólogas, alogénicas, singénicas o xenogénicas.

Ciertas realizaciones preferidas de la presente invención usan células dendríticas o progenitores de las mismas como células presentadoras de antígeno, para la transformación in vitro y devolverlas al paciente o como la diana in vivo de nucleótidos suministrados en la vacuna, por ejemplo por suministro de ADN mediado por partículas. Las células dendríticas son APC altamente potentes (Banchereau y Steinman, Nature 392:245-251, 1998) y han demostrado ser eficaces como adyuvante fisiológico para provocar inmunidad anti-tumoral profiláctica o terapéutica (véase Timmerman y Levy, Ann. Rev. Med. 50:507-529,1999). En general, las células dendríticas pueden identificarse en base a su forma típica (estrellada in situ, con procesos citoplásmicos marcados (dendritas) visibles in vitro), su capacidad de captar, procesar, y presentar antígenos con alta eficacia y su capacidad de activar respuestas de células T vírgenes. Las células dendríticas pueden, por supuesto, modificarse genéticamente para expresar receptores de superficie celular específicos o ligandos que no se encuentran comúnmente en células dendríticas in vivo o ex vivo, por ejemplo el antígeno o antígenos codificados en las construcciones de la invención y dichas células dendríticas modificadas se contemplan por la presente invención. Como alternativa a las células dendríticas, pueden usarse células dendríticas cargadas de antígeno en vesículas secretadas (llamadas exosomas) en una vacuna (véase, Zitvogel y col., Nature Med. 4:594-600,1998).

Las células dendríticas y los progenitores pueden obtenerse de sangre periférica, medula ósea, células de infiltración de tumor, células de infiltración de tejidos peritumorales, ganglios linfáticos, bazo, piel, sangre del cordón umbilical y cualquier otro tejido o fluido adecuado. Por ejemplo, las células dendríticas pueden diferenciarse ex vivo añadiendo una combinación de citoquina tales como GM-CSF, IL-4, IL-13 y/o TNF a cultivos de monocitos recogidos de sangre periférica. Como alternativa, las células CD34 positivas recogidas de sangre periférica, sangre de cordón umbilical o medula ósea pueden diferenciarse en células dendríticas añadiendo al medio de cultivo combinaciones de GM-CSF, IL-3, TNF, ligando de CD40, lipopolisacárido LPS, ligando flt3 (una citoquina importante en la generación de células presentadoras de antígeno profesionales, particularmente células dendríticas) y/u otro compuesto o compuestos que inducen la diferenciación, maduración y proliferación de células dendríticas.

Las APC generalmente pueden transfectarse con un polinucleótido que codifica una secuencia de aminoácidos de HPV antigénica, tal como un polinucleótido con codones optimizados que se prevé en la presente invención. Dicha transfección puede tener lugar ex vivo, y después puede usarse una composición o vacuna que comprende dichas células transfectadas para propósitos terapéuticos, como se describe en este documento. Como alternativa, puede administrarse a un paciente un vehículo de suministro de genes que dirige una célula dendrítica u otra célula presentadora de antígeno, provocando que suceda la transfección in vivo. La transfección in vivo y ex vivo de células dendríticas, por ejemplo, generalmente puede realizarse usando cualquier procedimiento conocido en la técnica, tal como los descritos en el documento WO97/24447, o el enfoque mediado por partículas descrito por Mahvi y col., Immunology and cell Biology 75:456-460,1997.

Las vacunas y composiciones farmacéuticas pueden presentarse en recipientes de dosis unitaria o múltiples dosis tales como ampollas o viales precintados. Dichos recipientes están preferiblemente precintados herméticamente para conservar la esterilidad de la formulación hasta su uso. En general, las formulaciones pueden almacenarse como suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos oleosos o acuosos. Como alternativa, puede almacenarse una vacuna o composición farmacéutica en un estado secado por congelación que solamente requiere la adicción de un vehículo líquido estéril inmediatamente antes de su uso. Las vacunas que comprenden secuencias nucleotídicas pretendidas para la administración por suministro mediado por partículas pueden presentarse como cartuchos adecuados para su uso con un instrumento de suministro de gas comprimido, en cuyo caso los cartuchos pueden constar de tubos huecos cuya superficie interna está revestida con partículas que llevan la secuencia nucleotídica de la vacuna, opcionalmente en presencia de otros ingredientes farmacéuticamente aceptables.

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden incluir compuestos adyuvantes, u otras sustancias que pueden servir para modular o aumentar una respuesta inmune inducida por la proteína que está codificada por el ADN. Éstas pueden estar codificadas con el ADN, por separado o como una fusión con el antígeno, o pueden incluirse como elementos no de ADN de la formulación. Los ejemplos de sustancias de tipo adyuvante que pueden incluirse en las formulaciones de la presente invención incluyen ubiquitina, proteína de membrana asociada a lisosomas (LAMP), antígeno núcleo del virus de la hepatitis B, ligando flt3 y otras citoquinas tales como IFN-\gamma y GMCSF.

Otros adyuvantes adecuados están disponibles en el mercado tales como, por ejemplo, adyuvante incompleto y adyuvante completo de Freund (Difco Laboratories, Detroit, MI); Imiquimod (3M, St. Paul, MN); Resimiquimod (3M, St. Paul, MN); Adyuvante 65 de Merck (Merck and Company, Inc., Rahway, NJ); AS-2 (SmithKline Beecham, Philadelphia, PA); sales de aluminio tales como gel de hidróxido de aluminio (alumbre) o fosfato de aluminio; sales de calcio, hierro o zinc; una suspensión insoluble de tirosina acilada; azúcares acilados; polisacáridos derivatizados catiónica o aniónicamente; polifosfacenos; microesferas biodegradables; monofosforil lípido A y quil A. También pueden usarse como adyuvantes citoquinas, tales como GM-CSF o interleuquina-2, 7, o 12.

En las formulaciones de la invención, se prefiere que la composición adyuvante induzca una respuesta inmune predominantemente del tipo Th1. Por tanto, el adyuvante puede servir para modular las respuesta inmune generada en respuesta a antígenos codificados por ADN de una respuesta predominantemente de tipo Th2 o predominante de tipo Th1. Los elevados niveles de citoquinas de tipo Th1 (por ejemplo, IFN, TNF, IL-2 e IL-12) tienden a favorecer la inducción de respuestas inmunes mediadas por células contra un antígeno administrado. En una realización preferida, en la que una respuesta es predominantemente de tipo Th1, el nivel de citoquinas de tipo Th1 aumentará a un grado mayor que el nivel de citoquinas de tipo Th2. Los niveles de estas citoquinas pueden evaluarse fácilmente usando ensayos convencionales. Para una revisión de las familias de citoquinas, véase Mosmann y Coffman, Ann. Rev. Immunol. 7:145-173,1989.

Por consiguiente, los adyuvantes adecuados para su uso en la provocación de una respuesta predominantemente de tipo Th1 incluyen, por ejemplo, una combinación de monofosforil lípido A, preferiblemente monofosforil lípido A 3-des-O-acilado (3D-MPL) junto con una sal de aluminio. Otros adyuvantes conocidos que inducen preferentemente una respuesta inmune de tipo Th1 incluyen oligonucleótidos que contienen CpG. Los oligonucleótidos están caracterizados porque el dinucleótido CpG no está metilado. Dichos oligonucleótidos son bien conocidos y se describen en, por ejemplo, el documento WO96/02555. Las secuencias de ADN inmunoestimuladoras también se describen, por ejemplo, por Sato y col., Science 273:352, 1996. Los oligonucleótidos que contienen CpG pueden codificarse por separado del antígeno o antígenos de papiloma en la misma o en una construcción de polinucleótido diferente, o pueden estar inmediatamente adyacentes a los mismos, por ejemplo como una fusión con los mismos. Como alternativa, los oligonucleótidos que contienen CpG pueden administrarse por separado, es decir, no como parte de la composición que incluye el antígeno codificado. Los oligonucleótidos CpG pueden usarse solos o en combinación con otros adyuvantes. Por ejemplo, un sistema potenciado implica la combinación de un oligonucleótido que contiene CpG y un derivado de saponina particularmente la combinación de CpG y QS21 como se describe en el documento WO 00/09159 y WO 00/62800. Preferiblemente, la formulación comprende adicionalmente una emulsión de aceite en agua y/o tocoferol.

Otro adyuvante preferido es una saponina, preferiblemente QS21 (Aquila Biopharmaceuticals Inc., Framingham, MA), que puede usarse sola o en combinación con otros adyuvantes. Por ejemplo, un sistema potenciado implica la combinación de un monofosforil lípido A y derivado de saponina, tal como la combinación de QS21 y 3D-MPL como se describe en el documento WO 94/00153, o una composición menos reactogénica en la que QS21 está inactivada con colesterol, como se describe en el documento WO 96/33739. Otras formulaciones preferidas comprenden una emulsión de aceite en agua y tocoferol. Una formulación adyuvante particularmente potente que implica QS21, 3D-MPL y tocoferol en una emulsión de aceite en agua se describe en el documento WO 95/17210.

Otros adyuvantes preferidos incluyen Montanide ISA 720 (Seppic, Francia), SAF (Chiron, California, Estados Unidos), ISCOMS (CSL), MF-59 (Chiron), Detox (Ribi, Hamilton, MT), RC-529 (Corixa, Hamilton, MT) y otros aminoalquil glucosaminida 4-fosfatos (AGP).

Otros adyuvantes preferidos incluyen moléculas adyuvantes de fórmula general (I)

Formula (I) HO(CH2CH2O)n-A-R

en la que n es 1-50, A es un enlace o -C(O)-, R es alquilo C1-50 o fenil-alquilo C1-50.

Una realización de la presente invención consta de una formulación que comprende un éter de polioxietileno de formula general (I), en la que n es entre 1 y 50, preferiblemente 4-24, más preferiblemente 9; el componente R es alquilo C1-50, preferiblemente alquilo C4-C20 y más preferiblemente alquilo C12, y A es un enlace. La concentración de los éteres de polioxietileno debe estar en el intervalo de 0,1-20%, preferiblemente de 0,1-10%, y más preferiblemente en el intervalo del 0,1-1%. Los éteres de polioxietileno preferidos se seleccionan entre el siguiente grupo: polioxietileno-9-lauril éter, polioxietileno-9-esteroil éter, polioxietileno-8-esteroil éter, polioxietileno-4-lauril éter, polioxietileno-35-lauril éter, y polioxietileno-23-lauril éter. Los éteres de polioxietileno tales como polioxietileno lauril éter se describen en el Merck index (12a edición; entrada 7717). Estas moléculas adyuvantes se describen en el documento WO 99/52549. El éter de polioxietileno de acuerdo con la formula general (I) anterior puede, si se desea, combinarse con otro adyuvante. Por ejemplo, una combinación adyuvante preferida es preferiblemente con CpG como se describe en la solicitud de patente de Reino Unido en trámite GB 9820956.2.

Cuando una vacuna incluye un adyuvante, la formulación de vacuna puede administrarse en dos partes. Por ejemplo, la parte de la formulación que contiene la construcción nucleotídica que codifica el antígeno puede administrarse primero, por ejemplo, por inyección subcutánea o intramuscular, o por suministro mediado por partículas intradérmico, después la parte de la formulación que contiene el adyuvante puede administrarse posteriormente, inmediatamente o después de un periodo de tiempo adecuado que será evidente para el médico especialista en técnicas de vacuna. En estas circunstancias el adyuvante puede administrarse por la misma vía que la formulación antigénica o por una vía alternativa. En otras realizaciones, la parte de adyuvante de la formulación se administrará antes de la parte antigénica. En una realización, el adyuvante se administra como una formulación tópica, aplicada a la piel en el sitio de suministro mediado por partículas de las secuencias nucleotídicas que codifican el antígeno o antígenos, antes o después del suministro mediado por partículas de los mismos.

Los siguientes Ejemplos sirven para ilustrar adicionalmente la invención, con referencia a los dibujos adjuntos, en los que:

la Figura 1 muestra la secuencias de aminoácidos de tipo silvestre prototipo de E1 de HPV de los tipos 11, 6a y 6b, obtenidas de Genbank;

la Figura 2 muestra la secuencia de aminoácidos de tipo silvestre prototipo de E1 de HPV6b de la Figura 1 (6b-e1) alineada con la frecuencia de aminoácidos de E1 de HPV6b que incluye mutaciones puntuales para retirar la actividad biológica (6b-e1 mut);

la Figura 3 muestra las secuencias de aminoácidos de tipo silvestre prototipo de E2 de HPV de los tipos 11, 6a y 6b, obtenidas de Genbank;

la Figura 4a muestra la secuencia de aminoácidos de tipo silvestre prototipo de E2 de HPV11 de la Figura 3 (Hpv-11e2-wt) alineada con la secuencia de aminoácidos de E2 de HPV11 que incluye una mutación puntual para retirar la actividad biológica (Hpv-11e2-mut) y con la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia nucleotídica de la Figura 6 (Hpv-11e2-comut);

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la Figura 4b muestra la secuencia de aminoácidos de tipo silvestre prototipo de E2 de HPV6b de la Figura 3 (Hpv-6be2-wt) alineada con la secuencia de aminoácidos de E2 de Hpv6b que incluye una mutación puntual para retirar la actividad biológica (Hpv-6be2-mut);

la Figura 5 muestra una secuencia de nucleótidos que tiene un patrón de uso de codones que se parece al del gen humano altamente expresado, que codifica la secuencia de aminoácidos mutada de E1 de HPV6b de la Figura 2;

la Figura 6 muestra una secuencia de nucleótidos que tiene un patrón de uso de codones que se parece al del gen humano altamente expresado, que codifica la secuencia de aminoácidos mutada de E2 de HPV11 de la Figura 4;

la Figura 7 muestra el vector de ADN p7313-PLc;

la Figura 8 muestra muestras de lisado celular del Ejemplo 4 procesadas en gel de acrilamida y teñidas para mostrar la unión de anticuerpos a la proteína E1 expresada;

la Figura 9 muestra las respuestas celulares a una estimulación con antígeno después de inmunización de los ratones con polinucleótido de acuerdo con la invención (Ejemplo 6); y

la Figura 10 muestra muestras de lisados celulares del Ejemplo 7 procesadas en gel de acrilamida y teñidas para mostrar la unión de anticuerpos a la proteína E2 expresada.

Ejemplo 1 Optimización de Codones de E1 de HPV6b

La secuencia de aminoácidos prototipo de tipo silvestre de E1 de HPV6b, obtenida de Genbank, se expone en la Figura 1 (secuencia inferior). Esta figura muestra el elevado nivel de homología para esta proteína entre las secuencias prototipo del virus HPV de los tipos 11, 6a y 6b. De forma similar, la Figura 3 expone las secuencias de aminoácidos prototipo de tipo silvestre para la proteína E2 de HPV11, 6a y 6b. Se espera que una terapia inmune (vacuna terapéutica) usando secuencias de HPV6b reaccione de forma cruzada para proporcionar una respuesta inmune profiláctica o terapéutica contra todos los tipos virales.

El uso de codones de la secuencia de E1 de HPV6b se comparó al de los genes humanos y de E. coli altamente expresados y se descubrió que tenían un bajo coeficiente de uso de codones para ambas especies. Simplemente usando el codón más abundante para cada resto aminoacídico también produciría un patrón de uso de codones sesgado, ya que ningún organismo usa exclusivamente su codón más preferido para un aminoácido dado. Por consiguiente, se asignaron los codones usando un procedimiento estadístico para dar un gen sintético que tenga una frecuencia de codones más cercana a la encontrada de forma natural en genes de E. coli y humanos altamente
expresados.

Los codones en el gen sintético se asignaron usando un programa de Visual Basic llamado Calcgene, escrito por R. S. Hale y G Thompson (Protein Expression and Purification Col. 12 pág. 185-188 (1998)). Para cada resto aminoacídico en la secuencia original, se asignó un codón en base a la probabilidad de su aparición en genes de E. coli altamente expresados. Los detalles del programa, que funciona con Microsoft Windows 3.1, puede obtenerse de los autores. Como el programa aplica un procedimiento estadístico para asignar codones al gen sintético, no todos los codones resultantes son los más frecuentemente usados en el organismo diana. En su lugar, la proporción de codones usados frecuente e infrecuentemente del organismo diana se refleja en la secuencia sintética asignando codones en las proporciones correctas. Sin embargo, como no hay una normal fuerte y rápida que asigne un codón particular a una posición particular en la secuencia, cada vez que se procesa el programa producirá un gen sintético diferente - aunque cada uno tendrá el mismo patrón de uso de codones y cada uno codificará la misma secuencia de aminoácidos. Si el programa se procesa varias veces para una secuencia de aminoácidos dada y un organismo diana dado, se producirán varias secuencias nucleotídicas diferentes que pueden diferir en la cantidad, tipo y posición de sitios de restricción, señales de corte y empalme de intrones, etc., algunos de los cuales puede ser indeseable. El especialista en la técnica será capaz de seleccionar una secuencia apropiada para su uso en la expresión del polipéptido en base a estas características.

Además, como los codones se asignan aleatoriamente en una base estadística, es posible (aunque quizá poco probable) que dos o más codones que se usan de forma relativamente rara en el organismo diana puedan agruparse en cercana proximidad. Se cree que dichos grupos pueden afectar a la maquinaria de traducción y provoquen índices de expresión relativamente bajos, de modo que el algoritmo para elegir los codones en el gen optimizado excluya cualquier codón con un valor RSCU de menos de 0,2 para genes altamente expresados para evitar que se seleccione fortuitamente cualquier agrupación de codones raros. La distribución de los codones restantes después se asignaron de acuerdo con las frecuencias de genes de E. coli altamente expresados para dar una distribución global en el gen sintético que se parezca a la de los genes de E. coli (coeficiente = 0,85) y también a la de genes humanos altamente expresados (coeficiente = 0,50). Se usó un procedimiento similar para obtener una secuencia nucleotídica de codones optimizados para E2 de HPV11, excepto que Syngene (Peter Ertl, no publicado), una versión actualizada del programa Calcgene, que permite sea opcional la exclusión de codones ratos, se usó para asignar codones de acuerdo con el patrón de frecuencia de codones de genes humanos altamente expresados. A diferencia de la asignación de codones para E1, no se excluyeron los codones raros. Al mismo tiempo, se hizo una alteración a uno de los oligonucleótidos para que codificara un cambio de aminoácido K111A, como se describe a continuación.

Se introdujeron mutaciones en los genes E1 y E2 de codones optimizados para dar lugar a mutaciones puntuales en las secuencias de aminoácidos de E1 (K83G, R84G y G483D) y E2 (K111A). Las secuencias de aminoácidos de los genes mutados se muestran (alineadas con la secuencia prototipo de tipo silvestre) en las Figuras 2 (E1 de HPV6b) y 4 (E2 de HPV6b y E2 de HPV11). La secuencia nucleotídica de codones optimizados y mutada para E1 de HPV6b se muestra en la Figura 5. La secuencia nucleotídica de codones optimizados y mutada de E2 de HPV11 se muestra en la Figura 6. En la Figura 4, la secuencia de aminoácidos del polipéptido obtenido por expresión del gen de E2 de HPV11 de codones optimizados y mutado, en alineación con las secuencias de tipo silvestre prototipo y de tipo silvestre mutada, para mostrar que la optimización de codones de la secuencia nucleotídica no altera la secuencia de aminoácidos codificada (que es idéntica a la secuencia de tipo silvestre mutada).

Ejemplo 2 Construcción de la Secuencia Polinucleotídica de E1 de HPV6b de Codones Optimizados Diseño del Gen

Usando el software de optimización analizado anteriormente, solapando oligonucleótidos de 40 unidades se calcularon de la secuencia optimizada. Los oligonucleótidos terminales que contienen los sitios de restricción son de 60 unidades. Los oligonucleótidos se solicitaron a Life Technologies Ltd a una concentración de 50 nmoles, desprotegidos y no fosforilados.

Ensamblaje de oligonucleótidos

Cada oligonucleótido se disolvió en agua doblemente destilada a una concentración final de 100 micromolar (\muM) y se preparó una mezcla igual de los 96 oligonucleótidos a 100 \muM. La síntesis se ajustó del siguiente modo usando la polimerasa Pwo de Roche Boehringer (Nº Cat. 1 644 955).

	Agua doblemente destilada	86 \mul
	Tampón Pwo 10X	10 \mul
	Mezcla dNTP	1 \mul (mezcla igual de dNTP 100 mM)
	Mezcla de oligos	1 \mul (mezcla igual de oligos 100 \muM)
	Polimerasa Pwo	2 \mul

Se realizó una Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) en la anterior mezcla de reacción en un Trio Thermoblock (Biometra) usando las siguientes condiciones:

: 1. 40ºC 2 minutos

: 2. 72ºC 10 segundos

: 3. 94ºC 15 segundos

: 4. 40ºC 30 segundos

: 5. 72ºC 20 segundos + 2 segundos por ciclo

: 6. 4ºC \infty

El ciclo se repitió 25 veces entre las etapas 3 y 5.

Después de completarse los 25 ciclos, se retiró una alícuota de cada tubo y se procesó en un gel de agarosa con Tris Acetato (TAE) al 0,8% y se observó bajo luz de longitud de onda UV. El tamaño esperado del ADN de E1 sintetizado debe ser aproximadamente 2 kb.

Recuperación del Gen

El gen sintético se recuperó por PCR usando la polimerasa usando los dos oligos terminales que contenían un sitio de restricción Not 1 en el extremo N terminal del oligo sintético y un sitio Bam H1 en el extremo C terminal del oligo sintético.

\newpage

	Agua doblemente destilada	65 \mul
	Tampón Pwo 10X	10 \mul
	Mezcla dNTP	1 \mul (mezcla igual de dNTP 100 mM)
	Mezcla de ensamblaje	20 \mul (de la PCR previa)
	Oligo N terminal	1 \mul (100 \muM)
	Oligo C terminal	1 \mul (100 \muM)
	Polimerasa Pwo	2 \mul

\vskip1.000000\baselineskip

: 1. 94ºC 45 segundos

: 2. 72ºC 2 minutos + 1minuto por 500 pb

: 3. 72ºC 10 minutos

: 4. 4ºC \infty

El ciclo se repitió 25 veces entre las etapas 2 y 1.

El producto de PCR se purificó después usando un kit de purificación QIAquick PCR (Nº Cat. Qiagen 28104) antes de que se resuspendiera el ADN en un total de 50 \mul de tampón de elución del kit. Se digirió una alícuota de 10 \mul con las enzimas de restricción Not 1 y BamH1 (de Life Technologies Ltd, 3 Fountain Drive, Inchinnan Park, Paisley, Escocia) durante 2 horas a 37ºC. Esta digestión se purificó en gel en un gel de agarosa con TAE al 0,8% y el producto de ADN de 2 kb escindido y se extrajo usando un kit de extracción QIAquick Gel (Nº Cat. Qiagen 28704). El fragmento de ADN puro y diferido final se eluyó en un total de 50 \mul del tampón de elución del kit.

Este fragmento de PCR se clonó en el vector p7313PLc (Figura 7), (Powderject Vaccines Inc., véanse los detalles adicionales a continuación) y se transformó en células JM109 competentes (Nº Cat. Promega P9751). El ADN plasmídico de los clones seleccionados se comprobó con enzimas de restricción por digestión con Nco1-BamH1 y Nco1-EcoR1. Se seleccionaron cinco clones correctos con insertos del fragmento de 2 kb y se secuenció el ADN del inserto. Se seleccionó un clon con un inserto que contenía justamente tres mutaciones puntuales para su uso adicional. Las tres mutaciones puntuales se corrigieron por intercambio de ligamiento con pequeños fragmentos homólogos de otros clones.

El clon corregido se volvió a comprobar por digestión con enzimas de restricción y se secuenció completamente el ADN del inserto. Este clon se denominó p6bE1c/o. Al mismo tiempo y para los estudios de expresión comparativa e inmunización se amplificaron por PCR el gen de E1 de HPV-6b de tipo silvestre y el gen E1 de HPV-11 de tipo silvestre de los clones genómicos de HPV-6b (EMBO J. 2 (12) 2314-2318 1983) y HPV-11 (Virology 151, 124-130 1986) y los fragmentos respectivos se clonaron en el vector p7313PLc digerido con Not 1 - BamH1. Estos clones se denominaron p6bE1w/t y p11E1w/t respectivamente.

Se mutaron adicionalmente los genes E1 de los clones p6bE1c/o y p6bE1w/t para introducir los cambios de aminoácidos K83G, R84G y G438D. Se usaron los cebadores oligonucleotídicos 3' y 5' de secuencia coincidente con sustituciones de nucleótidos diseñadas para introducir las mutaciones deseadas en reacciones de PCR con otros reactivos del kit por procedimientos descritos en el kit Quick-Change Site-Directed Mutagenesis (Nº Cat. Stratagene 200518). Los clones p6bE1c/o y p6bE1w/t mutados se denominaron p6bE1c/o mut y p6bE1w/t mut respectivamente.

Ejemplo 3 Construcción de la Secuencia Polinucleotídica de E2 de HPV11 de Codones Optimizados

El diseño, ensamblaje y recuperación del gen E2 de codones optimizados fue como se ha descrito anteriormente para E1, pero los oligonucleótidos solapantes fueron de 60 nucleótidos de longitud en lugar de 40, con un solapamiento de 18 nt. A diferencia del procedimiento de E1 se generó un clon que contenía la mutación aminoacídica K111A en el mismo momento que el clon del gen E2 de codones optimizados sustituyendo los dos oligonucleótidos de secuencia de tipo silvestre adecuados con dos oligonucleótidos de 60 unidades que junto comprenden la sustitución de nucleótido necesaria para generar el cambio K111A.

Composición del plásmido p7313-PLc

El plásmido se construyó reemplazando el gen de la beta-lactamasa que contenía el fragmento Eam11051 - Pst1 de pUC19 (disponible en Amersham Pharmacia Biotech UK Ltd., Amersham Place, Little Chalfont, Bucks, HP7 9NA) con un fragmento EcoR1 de pUC4K (Amersham-Pharmacia) que contiene el gen de resistencia a kanamicina, después de formación de extremos romos de los dos fragmentos usando la ADN polimerasa T4. Se obtuvo el promotor/potenciador IE1 de Citomegalovirus humano, Intrón A, del plásmido JW4303 obtenido de la Dra. Harriet Robinson, University of Massachusetts, y se insertó en el sitio Sal1 de pUC19 como un fragmento Xho1-Sal1, que incorpora la señal de poliadenilación de la hormona del crecimiento bovina. La deleción del fragmento SalI-BanI 5' del promotor generó el promotor mínimo usado en el vector (documento WO 00/23592 - Powderject Vaccines Inc.). La 3'UTR del antígeno de superficie de HBV se obtuvo del virus de la Hepatitis B, serotipo adw, en el vector pAM6 (Moriarty y col., Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 78, 2606-2610). Se obtuvo pAM6 (vector basado en pBR322) de la American Type Culture Collection, número de catálogo ATCC 45020. La 3' UTR se insertó 5' a la señal de poliadenilación como un fragmento BamHI de 1,4 kb, con extremos romos para su inserción para retirar los sitios BamHI. En una serie de etapas (incluyendo digestión con Bgl II, tratamiento con la polimerasa Klenow, digestión con BstX I, digestión con Nco I, tratamiento con nucleasa de fríjol chino para retirar el saliente y digestión adicional con BstX I) se hicieron modificaciones a la región entre la región potenciadora no traducida 3' del gen S de HBV y la señal bGHpA para retirar todas las fases de lectura abierta de más de 5 codones entre el promotor del gen X y la señal bGHpA. Esto produjo la deleción de la secuencia que codifica la parte traducible de la proteína X (9 aminoácidos) y el codón de inicio del gen X. Sin embargo, la región potenciadora/promotora débil del gen X se retuvo porque se descubrió que esta región potenciaba la expresión de HBsAg desde el promotor CMV. La señal de poliadenilación de la hormona del crecimiento bovina se sustituyó por la señal de poliadenilación de la beta globina de conejo. Se escindieron las secuencias codificantes y no codificantes 5' del antígeno S y se reemplazaron por un engarce oligonucleotídico para proporcionar sitios de clonación múltiple como se muestra para producir el plásmido p7313-PL.

100

La secuencia ColE1 cer se obtuvo de un subclón del plásmido pDAH212 de David Hodgeson (Warwick University) y se amplificó por PCR usando cebadores para situar sitios de restricción EcoRI en los extremos de la secuencia. La secuencia cer se insertó después en el sitio EcoRI de p7313-PL para producir el plásmido p7313-PLc (Figura 7). La secuencia de cer amplificado se verificó frente a la entrada M11411 de Genbank.

Ejemplo 4 Expresión de E1 en células 293T de mamífero

Se cultivaron células 293T de mamífero en fase logarítmica a una concentración final de 2 x 10^{5} de células por placa de cultivo tisular Corning Costar^{TM} de 6 pocillos (Corning Science Products, 10 The ValleyCentre, Gordon Road, High Wycombe, Bucks, UK) durante una noche a 37ºC en CO_{2} al 5%. Se preparó la siguiente mezcla de transfección y se complejó durante 25 minutos:

2 \mug de ADN plasmídico (vector, p6bE1c/o, p6bE1w/t) en 16 \mul de agua estéril doblemente destilada

OPTI-mem^{TM} (Gibco BRL, Paisley, Escocia)	8 \mul
Lipofectamina^{TM} (GibcoBRL)	6 \mul

Se lavó cuidadosamente cada monocapa celular dos veces con OPTI-mem^{TM}. Se añadieron 800 \mul de OPTI-mem^{TM} a cada pocillo. Se añadieron 200 \mul de OPTI-mem^{TM} a cada mezcla de transfección, se mezclaron y se añadieron suavemente a una monocapa celular. La placa se incubó durante 5 horas a 37ºC en CO_{2} al 5% después de lo cual se desechó la mezcla de transfección. Las monocapas celulares se lavaron suavemente con medio de crecimiento celular dos veces y las células finalmente transfectadas se incubaron durante 24 horas en Medio de Eagle Modificado por Dulbecco que contenía suero de ternera fetal al 10% y 29,2 mg/ml de L-glutamina a 37ºC en CO_{2} al 5%. Las células se rasparon en microtubos, se lavaron dos veces con PBS, se centrifugaron y se resuspendió el sedimento celular en colorante Laemmli de SDS Page. Los sedimentos celulares se hirvieron y se cargaron en un gel SDS Page al 10% y se sometieron a electroforesis en tampón Tris Glicina SDS 1X. Después de la electroforesis, se transfirió el gel a una membrana de nitrocelulosa (Amersham) y se hizo transferencia de Western. La membrana de nitrocelulosa se bloqueó con Marvel^{TM} al 5% (Premier Beverages, Knighton, Adbaston, Stafford, UK) en PBS durante 30 minutos a temperatura ambiente y se lavó dos veces con PBS y Tween 20 al 0,1%. Se diluyó un anticuerpo policlonal producido contra la secuencia proteica C terminal de E1 de HPV6b (secuencia proteica: CSSSLDIQDSEDEEDGSNSQAFR) en conejos, en Marvel^{TM} al 5% en PBS y se añadió a la membrana de nitrocelulosa. Esto se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora con agitación suave. El anticuerpo diluido se retiró y se lavó la membrana tres veces con PBS y Tween 20 al 0,1%. Se diluyó 1:20000 un conjugado secundario, anticuerpo de cerdo anti-conejo con peroxidasa de rábano rusticano (HRP) (DAKO), en PBS y Tween 20 al 0,1%. Esto se añadió a la membrana lavada y se incubó con agitación suave a temperatura ambiente durante 1 hora. La membrana después se lavó minuciosamente con PBS y Tween 20 al 0,1%. Se usó un kit HRP quimioluminiscente (Amersham) para detectar las proteínas transferidas a la membrana.

Resultados

El tamaño predicho de la proteína traducida para E1 es 68 kDa - 72 kDa. Los resultados (Figura 8) muestran un tamaño de proteína correcto expresado por p7313-PLc que contiene E1 de HPV6b de codones optimizados (carril 4). El vector que contiene E1 de tipo silvestre está en el carril 3, que muestra que no hubo expresión detectable de E1 en células humanas de la secuencia nucleotídica de tipo silvestre. De forma similar, no se detectó E1 en el carril 2 (vector vacío) y el carril 1 (células no transfectadas). La banda de aproximadamente 60 kDa en los carriles 1-4 es una proteína celular no identificada que reacciona de forma cruzada con el anticuerpo anti-E1. La banda es de intensidad más o menos constante en todos los carriles, lo que demuestra que la carga de las muestras fue uniforme.

Ejemplo 5 Construcción de Virus Vaccinia Recombinante que Expresa las proteínas E1 y E2 de HPV

Se generó virus Vaccinia que expresa la proteína E1 de HPV-6b en Glaxo Wellcome, Stevenage, UK. Los virus Vaccinia que expresan E1 de HPV-11 y E2 de HPV-11 eran una aportación generosa de Jeff Engler, University of Alabama en Birmingham, US.

En resumen, se clonó el gen E1 de p6bE1w/t en el vector del virus vaccinia pTM3 y después se usó el vector recombinante comprobado con enzimas de restricción y de ADN secuenciado para transfectar células HTk^{-}. Se aisló el virus Vaccinia recombinante y se purificó en placa. La expresión de la proteína E1 se comprobó por transferencia de Western usando antisueros para péptidos después de la infección de células permisivas con el virus recombinante que expresa E1 de HPV-6b y, un segundo virus Vaccinia (vTF7-3) que expresa la ARN polimerasa del bacteriófago T7. También es necesaria la co-infección de células con el virus Vaccinia vTF7-3 para dirigir la expresión de la proteína E1 y E2 de los virus Vaccinia recombinantes con E1 y E2 de HPV-11. Se usó la cepa WR del virus Vaccinia en experimentos de control negativo. El vector pTM3 y el virus vTF7-3 eran del National Institute of Health, Maryland, US.

Ejemplo 6 Inmunología - detección de respuestas celulares contra antígenos de HPV

Todos los reactivos se obtuvieron de Gibco BRL, Paisley, Escocia o Sigma, Poole, Dorset salvo que se indique de otro modo.

A. Protocolo de inmunización

Se inmunizaron ratas C57BU6 hembra con 1,0-2,0 \mug de ADN (p6bE1c/o, p6bE1w/t, p6bE1w/t, p6bE1c/o mut, p6bE1w/t mut o plásmido vacío p7313PLc) por PMDD y se reforzaron con una dosis idéntica 14 días después. Se sacrificaron los animales por dislocación cervical y se retiraron los bazos para la investigación de las respuestas celulares contra antígenos de HPV.

B. Preparación de suspensión celular sencilla de esplenocitos

Se "machacaron" los bazos entre resbaladeras rectificadas de vidrio (BDH), se lisaron los glóbulos rojos (NH_{4}Cl 155 mM, KHCO_{3} 10 mM, EDTA 0,1 mM) y las células se resuspendieron en RPMI complejo. (Medio RPMI-1640 suplementado con suero de ternera fetal (FCS) al 10%, glutamina 2 mM, 100 unidades/ml de penicilina, 100 \mug/ml de estreptomicina y 2-mercaptoetanol 5 x 10^{-5} M).

C. Infección de células diana MC57

Los epítopes inmunodominantes derivados de antígenos de HPV permanecen indefinidos, por lo tanto la detección de respuestas específicas de antígeno in vitro dependen del procesamiento natural del antígeno completo generado en células diana que se han transfectado con ADNc que codifica la proteína o proteínas completas. Se infectaron células MC57 (K^{b} positivas) con virus vaccinia recombinantes que expresa E1 de HPV-6b, E2 de HPV-11 o E1 de HPV-11 usando una multiplicidad de infección de 5 durante 1 hora a 37ºC. Se retiró por lavado el exceso de virus y las células se resuspendieron en RPMI completo que contenía 50 ng/ml de IL-2 humana recombinante (Glaxo Wellcome, Geneva).

D. ELISPOT

Se revistieron placas ELISPOT (96 pocillos, Millipore MAIP S 45 1 0) con anticuerpo de rata anti-IFN gamma de ratón (Pharmingen 18181D) a 15 \mug/ml en PBS durante una noche (4ºC) antes de la adición de 4 x 10^{5} esplenocitos de grupos experimentales. El antígeno se presentó por la adición de 1 x 10^{4} células MC57 infectadas con vaccinia recombinante. Se usó la cepa WR de vaccinia de tipo silvestre como control negativo. El ensayo se incubó durante una noche a 37ºC (CO_{2} al 5%).

\newpage

En el día 2 del ensayo, se detectaron las células que formaban manchas usando anticuerpo biotinilado de rata anti-IFN gamma de ratón (Pharmingen 18112D) a 1 \mug/ml seguido de conjugado de estreptavidina y fosfatasa alcalina (TCS biologicals SA 1008) a dilución 1/1000 en PBS. Esto se visualizó usando un kit de sustrato de fosfatasa alcalina (Biorad 170-6432) y se cuantificó por análisis de imágenes. Los resultados se muestran en la Figura 9.

Como puede observarse en la Figura 9, se observó una fuerte respuesta celular de los tres ratones vacunados con plásmido que codifica la secuencia de E1 de codones optimizados de HPV-6b, cuando se estimularon con E1 en el vector vaccinia (vacc.E1(11) o vacc.E1(6b)). No se observó respuesta cuando estos ratones se estimularon con vaccinia de tipo silvestre (vacc.WT), o con vaccinia que expresa E2 de HPV-11 (vacc.E2(11)). Por el contrario, la vacunación de ratones con plásmido que codifica la secuencia de E1 de tipo silvestre no produce una respuesta de células T. Los esplenocitos de estos ratones no reaccionan a una estimulación con vaccinia que lleva el gen E1, no a ninguna estimulación (datos no mostrados). La mutación del gen E1 no altera la respuesta celular en ratones. Además, como los ratones inmunizados con p6bE1c/o y p6bE1c/o mut provocaron fuertes respuestas inmunes celulares contra células diana infectadas con un virus vaccinia que expresa la proteína E1 de HPV-11, se supones que hay un elevado nivel de reactividad cruzada inmune entre E1 de HPV-6b y E1 de HPV-11. Los ratones vacunados con vector p7316-PLc vacío no mostraron respuesta a ninguna estimulación.

Ejemplo 7 Expresión de E2 de HPV 6b en células 293T de mamífero

Se transfectaron monocapas de células 293T (80% confluentes) en placas de 24 pocillos con 1 \mug de cada plásmido (p6bw/t, p6bc/o, p6bw/t mut, p6bc/o mut usando 2,5 \mul de Lipofectamina 2000 (Life Technologies) por transfección siguiendo el protocolo convencional (véase el Ejemplo 4 anterior). Las células se recogieron 24 horas después de la transfección, se aclararon en solución salina tamponada con fosfato y se examinaron por SDS-PAGE y transferencia de Western usando un antisuero anti-péptido E2 (Nº 1100) producido contra la secuencia de aminoácidos N-terminal de HPV-6b MEAIAKRLDACQEQLLELYEEC (Figura 10).

Resultados

Los resultados muestran una banda de proteínas principal del tamaño esperado (40 kD - 45 kD) en el carril 3 (E2 de codones optimizados) y carril 5 (E2 de codones optimizados y mutada). También aparece una banda minoritaria del mismo tamaño en el carril 4 que indica algún nivel de expresión muy bajo del plásmido de E2 de tipo silvestre mutado, pero no en el carril 1 (control negativo), o en el carril 2 (proteína E2 de tipo silvestre). Aparece una banda de proteína de reacción cruzada de \sim25 kD en todos los carriles que indica una carga igual de lisados proteicos. La mutación de E2 no parece comprometer la expresión de la proteína E2 que se mejora significativamente por optimización de codones.

Claims

1. Una secuencia polinucleotídica que codifica una secuencia de aminoácidos de papilomavirus humano de un antígeno temprano de HPV o fragmento del mismo siendo capaz dicho polinucleótido de provocar una respuesta inmune cuando se administra in vivo caracterizada porque dicho polinucleótido tiene un coeficiente de uso de codones mayor de 0,5 pero menor de 1,0 para un gen humano altamente expresado.

2. Una secuencia polinucleotídica de acuerdo con la reivindicación 1 que es una secuencia de ADN.

3. Una secuencia polinucleotídica de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2 que codifica un polipéptido de HPV de un tipo o subtipo de HPV asociado con cáncer cervical, verrugas cutáneas benignas o verrugas genitales.

4. Una secuencia polinucleotídica de acuerdo con la reivindicación 3 que codifica un polipéptido de HPV de uno de los tipos 1-4, 6, 7, 10, 11, 16, 18, 26-29, 31, 33, 35, 39, 49, 51, 52, 56, 58, 59 y 68.

5. Una secuencia polinucleotídica de acuerdo con la reivindicación 4 que codifica un polipéptido de HPV de un tipo o subtipo de HPV que está asociado con cáncer cervical o verrugas genitales.

6. Una secuencia polinucleotídica de acuerdo con la reivindicación 5 que codifica un polipéptido de HPV de uno de los tipo 6, 11, 16, 18, 33 ó 45, o una fusión de dos o más polipéptidos de uno o más de los tipos de virus HPV 6, 11, 16, 18, 33 ó 45.

7. Una secuencia polinucleotídica de acuerdo con la reivindicación 5 que codifica un polipéptido de HPV de un tipo o subtipo de HPV seleccionado entre HPV11, 6a o 6b.

8. Una secuencia polinucleotídica de acuerdo con cualquier reivindicación precedente que codifica un polipéptido E1 de HPV mutado que tiene las siguientes mutaciones K38G, R84G y G483D.

9. Una secuencia polinucleotídica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 que codifica un polipéptido E2 de HPV mutado que comprende una mutación K111A.

10. Una secuencia polinucleotídica de acuerdo con cualquier reivindicación precedente en la que el polipéptido codificado comprende la totalidad o parte de un producto génico temprano de HPV.

11. Una secuencia polinucleotídica de acuerdo con la reivindicación 9 en la que el polipéptido de HPV codificado comprende la totalidad o una parte de E1 o E2, o una fusión de la totalidad o una parte de E1 o E2 con otro polipéptido de HPV.

12. Una secuencia polinucleotídica de acuerdo con cualquier reivindicación precedente que tiene un coeficiente de uso de codones para genes de E. coli de más de 0,6.

13. Una secuencia polinucleotídica como se ha expuesto de (SEC ID Nº 10, Figura 5), o un fragmento o análogo de la misma que retiene el uso de codones de la misma.

14. Una secuencia polinucleotídica como se expone en (SEC ID Nº 11, Figura 6), o un fragmento o análogo de la misma que retiene el uso de codones de la misma.

15. Un vector de expresión que comprende una secuencia polinucleotídica de acuerdo con cualquier reivindicación precedente unidad de forma operativa a una secuencia de control que es capaz de proporcionar la expresión de la secuencia polinucleotídica por una célula huésped.

16. Un vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 15 que es capaz de dirigir la expresión de la secuencia polinucleotídica en células bacterianas, de insecto o de mamífero.

17. Un vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 15 o reivindicación 16 en el que la estructura del vector es p7313PLc como se muestra en la Figura 7.

18. Una célula huésped que comprende una secuencia polinucleotídica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-14.

19. Una célula huésped que comprende un vector de expresión de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 15-17.

20. Una célula huésped de acuerdo con la reivindicación 18 o reivindicación 19 que es una célula bacteriana, de mamífero, o de insecto.

\newpage

21. Una composición farmacéutica que comprende una secuencia polinucleotídica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-14.

22. Una composición farmacéutica que comprende un vector de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 15-17.

23. Una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 21 o reivindicación 22 que comprende una pluralidad de partículas, preferiblemente partículas de oro, revestidas con ADN.

24. Una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 22 que comprende un excipiente farmacéuticamente aceptable y el vector de ADN.

25. Una composición farmacéutica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicación 21-24 que comprende adicionalmente un adyuvante.

26. Una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 25, en la que el adyuvante está codificado como una fusión con el polipéptido de HPV codificado por el polinucleótido.

27. Uso de un polinucleótido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-14 en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o profilaxis de una infección por HPV.

28. Uso de un vector de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 15-17 en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o profilaxis de una infección por HPV.

29. Uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 27 y 28 en el que la infección por HPV es una infección de uno más de los tipos de HPV 6, 11, 16 ó 18.

30. El uso de un polinucleótido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-14, un vector de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 15-17 en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o profilaxis de verrugas cutáneas (de la piel), verrugas genitales, células escamosas atípicas de significado indeterminado (ASCUS), displasia cervical, neoplasia intraepitelial cervical (CIN) o cáncer cervical.