ES2370674T3 - Polipéptido e2 de papilomavirus utilizado para la vacunación. - Google Patents

Abstract

Vector que comprende moléculas de ácidos nucleicos codificantes de por lo menos dos polipéptidos E2 de papilomavirus, en el que dichas moléculas de ácidos nucleicos codificantes de E2 no comprenden una porción de 40 o más nucleótidos contiguos que muestran un porcentaje de identidad de 75% o superior a 75% entre dos cualesquiera de dichas moléculas de ácidos nucleicos codificantes de E2.

Description

Polipéptido E2 de papilomavirus utilizado para la vacunación.

La presente invención se refiere a un vector que comprende moléculas de ácidos nucleicos codificantes de por lo menos dos polipéptidos E2 de papilomavirus, en el que dichas moléculas de ácidos nucleicos codificantes de dichos E2 no comprenden una parte de 40 o más nucleótidos contiguos que muestran un porcentaje de identidad de 75% o superior a 75% entre dos cualesquiera de dichas moléculas de ácidos nucleicos codificantes de E2. La invención resulta de muy especial interés en el campo de la inmunoterapia, y más particularmente para tratar pacientes que sufren de una infección persistente por papilomavirus.

Los papilomavirus han sido aislados en varios organismos superiores, en los que infectan los tejidos epiteliales de la piel y mucosas. En la actualidad, se han identificado en el ser humano más de 100 genotipos del papilomavirus humano (HPV) (Stoler, Int. J. Gynecol. Path. 19:16-28, 2000), que pueden clasificarse en genotipos de "bajo riesgo" habitualmente asociados a tumores benignos (por ejemplo HPV-6 y HPV-11) y genotipos de "alto riesgo", que se asocian a lesiones con potencial de progresar a lesiones premalignas (por ejemplo la neoplasia intraepitelial cervical, CIN) y finalmente a tumores malignos. Por ejemplo, más de 99% de los cánceres cervicales contienen ADN del HPV y se han identificado cinco genotipos de HPV (HR-HPV) de "alto riesgo" como la causa principal, detectando HPV-16 y HPV-18 en aproximadamente 70% de los cánceres cervicales invasivos diagnosticados en todo el mundo (Clifford et al., Br. J. Cancer 88:63-73, 2003), mientras que HPV-31, HPV-33 y HPV-45 explican un 10% adicional (Cohen et al., Science 308:618-621, 2005).

Los papilomavirus son virus de ADN de un tamaño reducido circundados por una cápside de proteínas (ver, por ejemplo, Pfister, 1987, en: The papovaviridae: The Papillomaviruses, edición de Salzman y Howley, Plenum Press, New York, páginas 1 a 38). El genoma es un ADN circular de doble cadena de aproximadamente 7.900 pares de bases que consta de tres regiones funcionales, las regiones temprana (E), tardía (L) y larga de control (LCR). La LCR contiene secuencias reguladoras de la transcripción, tales como intensificadores y promotores. La región tardía codifica las proteínas estructurales L1 y L2, respectivamente las proteínas de cápside mayor y menor, mientras que la región temprana codifica proteínas reguladoras (E1-E7), presentes predominantemente en el núcleo, que controlan la replicación vírica, la transcripción y la transformación celular.

La proteína E1 es la de mayor tamaño (E1 de HPV-16 presenta una longitud de 649 aminoácidos) y la más conservada codificada por el genoma de papilomavirus. El E1 es una fosfoproteína de unión a ADN con una actividad helicasa dependiente de ATP que requiere la dimerización e interacción con E2 para estimular la replicación vírica (Desaintes y Demeret, Semin. Cancer Biol. 7:339-347, 1996; Wilson et al., Virus Gene 24:275-290, 2002). La actividad helicasa se ha localizado en el dominio C-terminal de E1 y el dominio de unión a ADN, en el dominio central. La proteína E2 (E2 de HPV-16 presenta una longitud de 365 aminoácidos) es una fosfoproteína de unión a ADN multifuncional que regula la transcripción génica vírica y controla la replicación del ADN (Bechtold et al.,

J. Virol. 77:2021-2028, 2003). La regulación de la transcripción vírica requiere la dimerización y unión de los dímeros de E2 a un sitio de unión a E2 (secuencia de consenso ACCN6GGT), cuyo contexto determina si la transcripción vírica se transactiva o se reprime (Ham et al., Trends Biochem. Sci. 16:440-444, 1991; McBride et al., J. Biol. Chem. 266:18411-18444, 1991). La E2 también proporciona la represión del promotor p97 de HPLV-16, que controla la expresión de las oncoproteínas E6 y E7. Finalmente, la E2 se encuentra implicada en la distribución del genoma vírico en las células hija. El dominio N-terminal de la E2 de HPV-16 es responsable de la transactivación, de la interacción con E1 y de la estimulación de la replicación, mientras que el dominio C-terminal se encuentra implicado en la unión y dimerización del ADN (McBride et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:510-514, 1989). La proteína codificada por E4 se une y altera la red citoplasmática de queratina y desempeña un papel en la maduración vírica. Todavía no se conoce con exactitud cuál es la función de la proteína E5. Las proteínas E6 y E7 se encuentran implicadas en la transformación oncogénicas de las células infectadas por HR-HPV (Kanda et al., J. Virol. 62:610613, 1988; Vousden et al., Oncogene Res. 3:1-9, 1988; Bedell et al., J. Virol. 61:3635-3640, 1987) a través de la unión de estas proteínas víricas a los productos génicos celulares de supresión tumoral p53 y retinoblastoma (Rb), respectivamente (revisados en Howley, Papillomaviruses and their replication, páginas 2045 a 2076, en: B.N. Fields,

D.M. Knipe y P.M. Howley (editores), Virology, 3a edición, Lippincott-Raven Press, New York, N.Y., 1996).

La infección por el HPV es una de las infecciones de transmisión sexual más frecuentes y aproximadamente 25% de los adultos sexualmente activos se encuentran infectados por HPV (Woodman et al., The Lancet 357:1831-1836, 2001). Aproximadamente el 80% de los sujetos consiguen erradicar espontáneamente el virus en 6 a 12 meses (Ho et al., N. Engl. J. Med. 338:423-428, 1998). Sin embargo, en el 20% restante, la infección por HPV progresa a lesiones premalignas CIN que, si no se diagnostican, pueden conducir a cánceres invasivos (O'Shaughnessy et al., Clinical Cancer Research 2:314-346, 2002). El mecanismo inductor de la neoplasia aparentemente implica la integración del genoma del HPV en los cromosomas celulares (Cullen et al., J. Virol. 65:606-612, 1991). En mayoría de casos, lo anterior lleva a la interrupción del ADN genómico del HPV en la región E1/E2, a la liberación del promotor E6/E7 del efecto represor de E2 y en consecuencia a la regulación positiva de la expresión de E6 y E7 y a la transformación celular.

En la actualidad, las vacunas profilácticas destinadas a prevenir la infección por HPV están próximas a comercializarse. Presentan como diana proteínas de la cápside expresadas en la superficie vírica, con el fin de bloquear al virus antes de que penetre en las células huésped principalmente mediante la inducción de anticuerpos neutralizadores. Generalmente se basan en proteínas L1 de producción recombinante que se reensamblan espontáneamente formando VLP (partículas similares a virus). Dos vacunas para HPV fabricadas por Merck y GlaxoSmithKline (GSK) han completado con éxito los ensayos clínicos de fase III mostrando una eficacia de prácticamente el 100% en la prevención de infecciones cervicales de tipo específico. La vacuna de GSK comprende una mezcla de VLP de HPV-16 y HPV-18, mientras que Merck también ha incluido VLP de HPV-6 y HPV-11, que causan verrugas genitales.

Sin embargo, los sujetos ya infectados por HPV no pueden seleccionares para la vacunación profiláctica y las vacunas terapéuticas resultarían de interés para tratar a los pacientes infectados con riesgo de desarrollar lesiones con potencial oncogénico. Debido a que la actividad oncogénica se ha atribuido a la expresión de los genes E6 y E7 del HPV en las células infectadas, se ha dedicado mucho esfuerzo a bloquear su expresión o a inducir una respuesta inmunológica celular contra dichos productos génicos transformantes. Se han descrito numerosos enfoques en la literatura, por ejemplo basados en la utilización de ARN antisentido (Steele et al., Cancer Res. 53:2330-2337, 1993; He et al., Cancer Res. 57:3993-3999, 1997; Choo et al., Gynecol. Oncol. 78:293-301, 2000), ribozimas (Chen et al., Cancer Gen. Ther. 3:18-23, 1996; Pan et al., Mol. Ther. 9:596-606, 2004), ARNip (Butz et al., Oncogene 22:5938-5945, 2003; Koivusalo et al., Mol. Pharmacol. 68:372-382, 2005), péptidos inmunogénicos (Feltkamp et al., Eur. J. Immunol. 23:2242-2249, 1993), plásmidos codificantes de E6 y/o E7 (Peng et al., J. Virol. 78:8468-8476, 2004) y vectores víricos (documentos WO 90/10459 y 99/03885; Kaufmann et al., Clinical Cancer Res. 8:3676-3685, 2002).

Debido a que se expresa en un estadio temprano de la infección por HPV, la proteína E2 representa una segunda diana potencial para la vacunación terapéutica. Los estudios preclínicos realizados en conejos infectados por papilomavirus de la cola de algodón del conejo (CRPV) han demostrado protección frente a lesiones implementadas asociadas a papilomavirus tras la expresión de E2. Por ejemplo, la administración de un vector adenovirus recombinante que expresa la proteína E2 de CRPV resultó en la eliminación del papiloma inducido por CRPV y la infección, probablemente a través de inmunidad mediada por células (Brandsma et al., J. Virol. 78:116-123, 2004). La administración de ADN codificante de las proteínas E1 y E2 del CRPV también resultó efectiva para prevenir o por lo menos para retrasar el desarrollo de carcinoma a partir de papilomas de la piel inducidos por el CRPV (Han et al., J. Virol. 74:9712-9716, 2000), aunque se demostró que la inmunidad protectora dependía de la vía de administración (Han et al., Vaccine 18:2937-2944, 2000). El potencial terapéutico de E2 para tratar las lesiones asociadas al papilomavirus también se demostró en sujetos humanos expuestos al HPV. Con frecuencia se detectaba inmunidad de células T ayudantes específicamente anti-E2 en sujetos sanos (De Jong et al., Cancer Res. 62:472-479, 2002), mientras que se observó inmunidad de las células T CD4+ alteradas contra E2 y E6 en mujeres que presentaban cánceres cervicales asociados a HPV-16 (De Jong et al., Cancer Res. 64:5449-5455, 2004).

Se están realizando en la actualidad ensayos clínicos de fase II en pacientes con CIN 2 y 3 de grado alto asociados al HPV utilizando un vector MVA (virus Ankara modificado) recombinante codificante de una proteína E2 de papilomavirus bovino (BPV). Se inyectan las partículas víricas directamente en las lesiones de CIN y se espera que la producción de E2 en las células que expresan E6 y E7 conduzca a la apoptosis de las mismas. En efecto se observó una regresión de las lesiones de CIN en la mayoría de los pacientes tratados. Sin embargo, en algunos casos, no se eliminó el ADN vírico y se detectó la recurrencia de las lesiones 1 año después (García-Hernández et al., Cancer Gene Ther. 13:592-597, 2006).

Se prevé que el HPV continúe siendo una amenaza sanitaria global grave durante muchos años debido a la naturaleza persistente de la infección, su elevada prevalencia y la morbilidad significativa de los cánceres inducidos por HPV. En efecto se ha demostrado que las mujeres con infección persistente por HR-HPV presentan un riesgo significativamente más alto, hasta 200 veces superior, de desarrollar lesiones de CIN en comparación con mujeres no infectadas o mujeres que consiguen eliminar el virus espontáneamente (Bory et al., Int. J. Cancer 102:519-525, 2002).

La infección por HPV generalmente se detecta tras un cribado anormal (por ejemplo un ensayo citológico Papanicolau). En la actualidad, la única ventaja médica del diagnóstico de la infección por HPV es la implementación de un seguimiento más frecuente con el fin de detectar las lesiones (por ejemplo CIN2/3 de grado alto) en cuanto se producen, que en este caso pueden eliminarse mediante procedimientos ablativos tales como la excisión con asa electroquirúrgica (LEEP) y la biopsia cónica (conización). Dichos procedimientos son eficientes globalmente al 90%; sin embargo, presentan un riesgo de complicaciones obstétricas (por ejemplo con incidencia en el potencial reproductivo de la mujer en edad de procrear). Además de que no resultan totalmente satisfactorios desde un punto de vista médico, también implican incomodidad para el paciente (ansiedad).

Por lo tanto, existe una necesidad de desarrollar una vacuna para tratar los pacientes con infección persistente por HPV, especialmente en vista del elevado riesgo en esta población de progresión a lesiones premalignas y finalmente a cáncer.

De esta manera, la presente invención representa un avance significativo en este contexto. La presente descripción proporciona un procedimiento no invasivo y seguro que ofrece una protección más temprana frente a infecciones causadas por genotipos de HR-HPV. Presenta la ventaja de proporcionar un tratamiento de los pacientes infectados antes de producirse las lesiones asociadas a papilomavirus y, en consecuencia, de reducir los riesgos asociados a los procedimientos ablativos convencionales (por ejemplo complicaciones obstétricas), incrementando la comodidad para el paciente (por ejemplo reduciendo la ansiedad asociada al reconocimiento de las lesiones). Resulta importante que la presente invención también podría permitir la reducción del riesgo de incidencias futuras de reinfección por HPV a través de la erradicación del papilomavirus infeccioso y aislados del mismo relacionados.

La presencia de secuencias homólogas en un vector que comprende moléculas de ácidos nucleicos codificantes de por lo menos dos polipéptidos E2 de papilomavirus se espera que influya negativamente sobre su estabilidad, especialmente durante la etapa de producción del vector. Puede producirse la recombinación entre las secuencias homólogas, posiblemente conduciendo a la pérdida de la parte comprendida entre las dos secuencias homólogas.

En el documento WO 92/16636, dicho problema se trata disponiendo una pareja de secuencias de nucleótidos homólogas en el vector vírica de manera que se encuentren invertidas una respecto a la otra.

En el vector de la invención, este problema técnico se resuelve mediante la provisión de las formas de realización definidas en las reivindicaciones.

Resultarán evidentes otros aspectos y aspectos, características y ventajas adicionales de la presente invención a partir de la descripción siguiente de las formas de realización actualmente preferidas de la invención. Estas formas de realización se proporcionan con el fin de su publicación.

De acuerdo con lo expuesto anteriormente, en un primer aspecto, la presente invención proporciona un vector que comprende moléculas de ácidos nucleicos codificantes de por lo menos dos polipéptidos E2 de papilomavirus, en los que dichas moléculas de ácidos nucleicos codificantes de E2 no comprenden una parte de 40 o más nucleótidos contiguos que muestran una identidad de 75% o superior al 75% entre dos cualesquiera de dichas moléculas de ácidos nucleicos codificantes de E2.

Tal como se utiliza en la presente memoria a lo largo de la solicitud, los términos "un" y "una" se utilizan en el sentido de "por lo menos una", "por lo menos un primer", "uno o más" o "una pluralidad" de los compuestos o etapas referenciados, a menos que el contexto indique lo contrario. Por ejemplo, la expresión "un polipéptido E2 de papilomavirus" comprende un tipo único de polipéptido E2 de papilomavirus o una pluralidad de polipéptidos E2 de papilomavirus que incluye una mezcla de los mismos.

El término "y/o" según se utiliza en la presente memoria incluye el significado de "y", "o" y "la totalidad o cualquier otra combinación de los elementos conectados por dicho término".

El término "alrededor de" o "aproximadamente" tal como se utiliza en la presente memoria significa dentro del 20%, preferentemente dentro del 10%, y más preferentemente dentro del 5% de un valor o intervalo dado.

Los términos "aminoácidos" y "residuos" son sinónimos y comprenden los aminoácidos naturales, así como los análogos de aminoácidos (por ejemplo aminoácidos no naturales, sintéticos y modificados, incluyendo los isómeros ópticos D o L).

Los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína" tal como se utilizan en la presente memoria intercambiablemente se refieren a polímeros de residuos aminoácidos que comprenden nueve o más aminoácidos unidos mediante enlaces peptídicos. El polímero puede ser lineal, ramificado o cíclico y puede comprender aminoácidos naturales y/o análogos de aminoácidos y puede encontrarse interrumpido por no aminoácidos. A título de indicación general, en el caso de que el polímero de aminoácidos sea largo (por ejemplo de más de 50 residuos aminoácidos), preferentemente se hace referencia al mismo como polipéptido o proteína, mientras que en el caso de que presente una longitud de 50 aminoácidos o superior, se denomina "péptido".

Las expresiones "ácido nucleico", "molécula de ácidos nucleicos", "polinucleótido" y "secuencia de nucleótidos" se utilizan en la presente memoria intercambiablemente y definen un polímero de cualquier longitud de polidesoxirribonucleótido (ADN) (por ejemplo ADNc, ADN genómico, plásmidos, vectores, genomas víricos, ADN aislado, sondas, cebadores y cualquier mezcla de los mismos) o moléculas de polirribonucleótido (ARN) (por ejemplo ARNm o ARN antisentido) o polirribo-polidesoxirribonucleótidos mixtos. Comprenden polinucleótidos de una cadena o de doble cadena, lineales o circulares, naturales o sintéticos. Además, un polinucleótido puede comprender nucleótidos no naturales, tales como nucleótidos metilados y análogos de nucleótido (ver las patentes US nº 5.525.711, nº 4.711.955 o EP-A-302 175 a título de ejemplos de modificaciones) y pueden encontrarse interrumpidos por componentes no nucleótidos. En caso de encontrarse presentes, las modificaciones de los nucleótidos pueden realizarse antes o después de la polimerización.

Tal como se utiliza en la presente memoria, en su utilización para definir productos, composiciones y métodos, la expresión "que comprende" pretende referirse a que los productos, composiciones y métodos incluyen los componentes o etapas referenciados, aunque sin excluir otros. La expresión "que consta esencialmente de" pretende referirse a que se excluyen otros componentes o etapas de cualquier significación esencial. De esta manera, una composición que consta esencialmente de los componentes indicados no excluiría componentes traza ni portadores farmacéuticamente aceptables. La expresión "que consta de" se refiere a que se excluyen más que elementos traza de otros componentes o etapas. Por ejemplo un polipéptido "consta de" una secuencia de aminoácidos en el caso de que el polipéptido no contenga otro aminoácido que la secuencia de aminoácidos indicada. Un polipéptido "consta esencialmente de" una secuencia de aminoácidos en el caso de que dicha secuencia de aminoácidos se encuentre presente conjuntamente con sólo unos cuantos residuos aminoácidos adicionales, típicamente entre aproximadamente 1 y aproximadamente 50 residuos adicionales. Un polipéptido "comprende" una secuencia de aminoácidos en el caso de que la secuencia de aminoácidos sea por lo menos parte de la secuencia de aminoácidos final del polipéptido. Dicho polipéptido puede presentar entre unos cuantos y varios cientos de residuos aminoácidos adicionales. Dichos residuos aminoácidos adicionales pueden desempeñar un papel en el tráfico de polipéptidos, facilitar la producción o purificación de los polipéptidos y prolongar la vida media, entre otros aspectos. Lo mismo resulta de aplicación a las secuencias de nucleótidos.

La expresión "célula huésped" debe entenderse ampliamente de manera que comprenda células aisladas, un grupo de células, así como una organización particular de células, por ejemplo en un tejido u órgano. Dichas células pueden ser células primarias, transformadas o en cultivo. Pueden ser procarióticas (por ejemplo de Escherichia coli), de levadura (por ejemplo de Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces pombe o Pichia pastoris), eucarióticas (por ejemplo células de insecto, vegetales y de mamífero, incluyendo humanas). La expresión "célula huésped" incluye células que pueden ser o han sido receptoras de la molécula de ácidos nucleicos, del vector o de la partícula vírica infecciosa utilizados en la presente invención y la progenie de dichas células.

La expresión "organismo huésped" se refiere a un vertebrado, en particular a un miembro de la especie de mamífero y especialmente animales domésticos, animales de granja, animales de competición y primates, incluyendo seres humanos. Preferentemente, el organismo huésped es un paciente que sufre una infección persistente por papilomavirus causada por como mínimo un papilomavirus.

El término "papilomavirus" se refiere a un virus que pertenece a la subfamilia papilomavirinae. La definición comprende los papilomavirus animales de origen, que comprenden de manera no limitativa vacas, caballos, conejos, ovejas, perros, primates no humanos y roedores, así como el papilomavirus humano (HPV).

El término "HPV" se refiere más concretamente al papilomavirus de origen la especie humana y/o al que puede infectar un ser humano. Se han identificado más de 100 genotipos de HPV en la actualidad y se han numerado según el orden cronológico de aislamiento. Convencionalmente la clasificación de los HPV se basa en el grado de relación de sus genomas. Se ha construido un árbol filogenético a partir de la alineación de las secuencias de nucleótidos disponibles (Van Ranst et al., J. Gen. Virol. 73:2653, 1992; De Villiers et al., Virology 324:17-27, 2004). El HPV puede clasificarse en "de alto riesgo" (HR-HPV) y "de bajo riesgo" (LR-HPV). El HR-HPV se refiere al HPV estrechamente asociado a la transformación celular que puede llevar a lesiones con el potencial de progresar a lesiones malignas. Entre los tipos de HR-HPV se incluye, aunque sin limitación, HPV-16, HPV-18, HPV-30, HPV-31, HPV-33, HPV-35, HPV-39, HPV-45, HPV-51, HPV-52, HPV-56, HPV-58, HPV-59, HPV-66, HPV-68, HPV-70 y HPV

85. El LR-HPV se refiere a HPV que presenta un potencial de transformación celular débil, que puede llevar a lesiones benignas, tales como verrugas con un potencial bajo de progreso a lesiones malignas. Entre los tipos de LR-HPV se incluyen, aunque sin limitación, HPV-6 y HPV-11.

Los papilomavirus pueden aislarse, clonarse o derivarse a partir de cualquier fuente en la naturaleza. Entre dichas fuentes se incluyen las muestras biológicas, las células cultivadas, así como los materiales recombinantes. Tal como se utiliza en la presente memoria, una "muestra biológica" comprende una diversidad de muestras recogidas de un organismo huésped que ha sido expuesto a un papilomavirus que pueden utilizarse como fuente de papilomavirus o en un ensayo diagnóstico o de seguimiento. En el contexto de la invención, una muestra biológica puede haberse manipulado de cualquier modo después de su recolección, tal como mediante tratamiento con reactivos, solubilización o enriquecimiento para determinados componentes (por ejemplo polipéptidos o moléculas de ácidos nucleicos). La definición comprende líquidos biológicos (por ejemplo sangre, plasma o sueros), muestras líquidas (por ejemplo muestras vaginales, líquidos cervicales y muestras citológicas), muestras de tejido sólido (por ejemplo secciones de tejido, especímenes de biopsia) y cultivos de tejidos. La expresión "células cultivadas" comprende las células en cultivo (por ejemplo las células CaSki disponibles de la ATCC), sobrenadantes celulares y lisados celulares. Los materiales recombinantes comprenden de manera no limitativa los papilomavirus (por ejemplo disponibles en instituciones de depósito), el genoma de papilomavirus, las bibliotecas genómicas o de ADNc, los plásmidos que contienen uno o más fragmentos de genoma de papilomavirus o cualquier vector de la técnica anterior que se conozca que incluye dichos elementos.

A título de información general, las secuencias de nucleótidos de varios genomas de papilomavirus y las secuencias de aminoácidos de los polipéptidos codificados han sido descritos en la literatura y se encuentran disponibles en bancos de datos especializados, por ejemplo los números de acceso de Genbank NC_01526 y K02718 en relación a HPV-16; NC_001375 y X05015 en relación a HPV-18; J04353 en relación a HPV-31; M12732 en relación a HPV-33; NC_001529 en relación a HPV-35; NC_001535 en relación a HPV-39; X74479 en relación a HPV-45; NC_001533 en relación a HPV-51; NC_001592 en relación a HPV-52; X74483 en relación a HPV-56; D90400 en relación a HPV-58; NC_001635 en relación a HPV-59; X67160 y M73258 en relación a HPV-68; U21941 en relación a HPV-70 y AF131950 en relación a HPV-85.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "polipéptido E2 de papilomavirus" comprende polipéptidos E2 nativos (es decir, expresados a partir de un ORF de E2 en una fuente natural de papilomavirus), polipéptidos E2 modificados y péptidos inmunogénicos de los mismos.

Un péptido E2 inmunogénico presenta por lo menos 9 aminoácidos y este término incluye los epítopos de E2 (por ejemplo motivos aminoácidos específicos que pueden inducir o activar una respuesta inmunológica a través de una ruta mediada por el MHC de clase I y/o II, tal como los indicados en el documento EP 523 395), un constructo multiepítopo (por ejemplo tal como se describe en el documento WO 2005/089164) y polipéptidos E2 truncados. El truncado puede variar entre 1 y 300 residuos aminoácidos que pueden ser contiguos o no y localizarse en el extremo N-terminal y/o C-terminal y/o internamente.

El polipéptido E2 codificado por la molécula de ácidos nucleicos comprendida en el vector de la invención puede originarse a partir de cualquier genotipo de papilomavirus, con especial preferencia para un genotipo de HR-HPV tal como uno seleccionado de entre el grupo que consta de los listados anteriormente, y más particularmente HPV-16, HPV-18, HPV-33 o HPV-52 o cualquier combinación de los mismos (por ejemplo tanto HPV-16 como HPV-18). Se ha descrito en la literatura un gran número de polipéptidos E2 nativos, por ejemplo E2 de HPV-18 en Cole et al. (J. Mol. Biol. 193:599-608, 1987), E2 de HPV-16 en Seedorf et al. (Virology 145:181-185, 1985) y Kennedy et al. (J. Virol. 65:2093-2097, 1991), E2 de HPV-31 en Goldsborough et al. (Virology 171:306-311, 1989), E2 de HPV-33 en Cole et al. (J. Virol. 58:991-995, 1986) y E2 de BPV-1 del papilomavirus bovino en Chen et al. (Nature 299:529-534, 1982) y en Danos et al. (J. Virol. 46:557-566, 1983). A título ilustrativo, la secuencia de aminoácidos del polipéptido E2 de HPV-16 se proporciona en SEC ID nº 1.

Sin embargo, la presente invención no se encuentra limitada a dichas secuencias ejemplificativas. En efecto, las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos pueden variar entre diferentes aislados de papilomavirus y esta variación genética natural se encuentra comprendida dentro del alcance de la invención, así como una o más modificaciones no naturales tales como las indicadas posteriormente. El término "modificación" incluye la deleción, sustitución o adición de uno o más residuos nucleótidos o cualquier combinación de estas posibilidades. En el caso de que estén comprendidas varias modificaciones, pueden referirse a residuos consecutivos y/o a residuos no consecutivos. Puede generarse una o más modificaciones en la molécula de ácidos nucleicos utilizada en la invención mediante varias maneras conocidas por el experto en la materia, tales como la mutagénesis sitio-dirigida (por ejemplo utilizando el sistema de mutagénesis in vitro SculptorTM de Amersham, Les Ullis, Francia), la mutagénesis por PCR, la reorganización del ADN y las técnicas sintéticas químicas (por ejemplo que resultan en una molécula sintética de ácidos nucleicos).

La modificación o modificaciones comprendidas en la presente invención comprenden modificaciones silenciosas que no modifican la secuencia de aminoácidos del E2 de papilomavirus codificado, así como las modificaciones que se traducen en el polipéptido E2 codificado, resultando en una secuencia de aminoácidos modificada respecto a la nativa correspondiente.

Las modificaciones silenciosas al nivel del polipéptido E2 codificado típicamente se llevan a cabo sustituyendo uno o más codones de la secuencia codificante de E2 por uno o más codones codificantes del mismo aminoácido. Mientras que un codón único codifica el residuo Met o Trp, es bien conocido en la técnica que pueden utilizarse 6 codones diferentes para codificar la arginina, la leucina o la serina, y cuatro diferentes para codificar la alanina, la glicina, la prolina, la treonina y la valina. De esta manera, resulta posible modificar la secuencia de nucleótidos codificante de E2 sin alterar la secuencia de aminoácidos. Preferentemente, dichas modificaciones están destinadas a mejorar la expresión del polipéptido E2 de papilomavirus en una célula u organismo huésped dado, por ejemplo en células huésped de mamífero, incluyendo las humanas. Los ejemplos representativos de dichas modificaciones comprenden de manera no limitativa la supresión de uno o más codones utilizados infrecuentemente mediante optimización de codones, la supresión de elementos de secuencia negativos que previsiblemente influyen negativamente sobre los niveles de expresión y/o la supresión de secuencias homólogas que previsiblemente influyen negativamente sobre la estabilidad de la molécula o vector de ácidos nucleicos utilizada en la presente invención.

Típicamente, la optimización de codones se lleva a cabo sustituyendo uno o más codones "nativos" (por ejemplo de HPV) correspondiente a un codón utilizado infrecuentemente en la célula huésped de interés por uno o más codones codificantes del mismo aminoácido que se utiliza más frecuentemente. No resulta necesario sustituir todos los codones nativos correspondientes a codones utilizados infrecuentemente debido a que puede conseguirse un nivel incrementado de expresión incluso con la sustitución parcial. Además, pueden realizarse algunas desviaciones respecto a la adherencia estricta a la utilización optimizada de codones para permitir la introducción de uno o más sitios de restricción en la molécula de ácidos nucleicos resultante. Dichas moléculas de ácidos nucleicos de codones optimizados se encuentran descritas en la literatura, por ejemplo en los documentos WO 01/14416, WO 02/08435 y WO 03/018055.

Los ejemplos representativos de elementos de secuencia negativos que resulta adecuado suprimir en el contexto de la invención comprenden de manera no limitativa las regiones que presentan un contenido de GC muy alto (>80%) o muy bajo (<30%); las regiones que presentan un contenido de AT muy alto; las secuencias de repetición directa o invertida inestables; las estructuras secundarias de ARN; y/o los elementos reguladores crípticos internos tales como las cajas TATA internas, los sitios chi, los sitios de entrada ribosómica y/o los sitios donadores/aceptores de procesamiento.

La presencia de secuencias homólogas en el vector según la invención previsiblemente influirá negativamente sobre su estabilidad, especialmente durante la etapa de producción del vector. La recombinación puede producirse entre las secuencias homólogas, conduciendo posiblemente a la pérdida de la parte comprendida entre las dos secuencias homólogas. Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión &quot;secuencias homólogas&quot; se refiere a secuencias de nucleótidos que conservan un elevado grado de identidad entre sí a lo largo de por lo menos 40, ventajosamente por lo menos 45, preferentemente por lo menos 50, más preferentemente por lo menos 55, o todavía más preferentemente por lo menos 59 nucleótidos consecutivos. Un grado elevado de identidad es 75% o superior a 75%, ventajosamente 80% o superior a 80%, preferentemente 85% o superior a 85%, preferentemente 90% o superior a 90%, más preferentemente 95% o superior a 95%, todavía más preferentemente 97% o superior a 97% (por ejemplo una identidad de secuencia de 100%). El porcentaje de identidad entre dos secuencias de nucleótidos es una función del número de posiciones idénticas compartido por las secuencias, considerando el número de huecos que resulta necesario introducir para la alineación óptima y la longitud de cada hueco. Se dispone en la técnica de diversos programas informáticos y algoritmos matemáticos para determinar los porcentajes de identidad entre las secuencias de nucleótidos, tales como el paquete del GCG Wisconsin.

La homología entre dos secuencias homólogas de nucleótidos se suprime mediante la degeneración del uso de los codones en por lo menos una de las secuencias homólogas, de manera que el porcentaje de identidad entre las secuencias previamente homólogas se reduce a menos de 75%. Lo anterior puede llevarse a cabo sustituyendo uno

o más codones &quot;nativos&quot; (por ejemplo de HPV) presentes en la parte homóloga por uno o más codones codificantes del mismo aminoácido. No resulta necesario degenerar todos los codones nativos debido a que la homología puede reducirse suficientemente con la sustitución parcial. Dichas modificaciones resultan particularmente útiles en el caso de que la molécula de ácidos nucleicos o vector utilizado en la invención codifique dos polipéptidos de papilomavirus, las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de los cuales se encuentren relativamente conservados (por ejemplo secuencias codificantes de 2 o más polipéptidos E2, tales como los polipéptidos E2 de HPV-16 y de HPV-18) o que contengan una parte común (por ejemplo las secuencias codificantes de E1 y E2 de HPV-16, que comparten 59 nucleótidos). Un ejemplo representativo de dicha forma de realización se proporciona en SEC ID nº 6, proporcionando un ejemplo de secuencias degeneradas correspondientes a la parte de 59 nucleótidos presente en tanto en secuencias codificantes de E1 como en secuencias codificantes de E2.

Las modificaciones que se traducen al nivel del polipéptido E2 codificado resultan en la mutación de uno o más residuos aminoácidos del polipéptido E2. Ventajosamente, el polipéptido E2 modificado conserva un grado elevado de identidad de secuencia de aminoácidos con el polipéptido nativo correspondiente a lo largo de la secuencia de aminoácidos de longitud completa o un fragmento de la misma (por ejemplo de una longitud de por lo menos 9, 20, 50, 100, 200 o 300 aminoácidos), que es de 75% o superior a 75%, ventajosamente superior a 80%, preferentemente superior a 85%, preferentemente superior a 90%, más preferentemente superior a 95%, todavía más preferentemente superior a 97% (por ejemplo una identidad de secuencia de 100%). El porcentaje de identidad entre dos polipéptidos es una función del número de posiciones idénticas compartido por las secuencias, considerando el número de huecos que resulta necesario introducir para la alineación óptima y la longitud de cada hueco. Se encuentran disponibles en la técnica diversos programas informáticos y algoritmos matemáticos para determinar los porcentajes de identidad entre las secuencias de aminoácidos, tales como, por ejemplo, el programa W2H HUSAR y el programa Blast (por ejemplo Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997; Altschul et al., FEBS J. 272:5101-5109, 2005), disponibles de NCBI.

En una forma de realización, la molécula de ácidos nucleicos comprendida en el vector de la invención se modifica de manera que codifique un polipéptido E2 defectuoso en por lo menos una de las actividades biológicas de un polipéptido E2 nativo, y más particularmente defectuoso para la activación de la replicación y/o transcripción vírica. Los aminoácidos que resultan críticos para dichas actividades biológicas pueden identificarse mediante métodos rutinarios, tales como el análisis estructural y funcional y un experto en la materia podrá determinar fácilmente el tipo de mutación o mutaciones que pueden reducir o anular una actividad biológica dada. Es bien conocido de la técnica que los residuos implicados en las actividades de activación transcripcional y replicación de E2 se encuentran situadas dentro de la parte N-terminal, mientras que la parte C-terminal es responsable del reconocimiento de sitios de unión de E2 en el ADN vírico y de la dimerización. Tal como se utiliza en la presente memoria, la parte N-terminal de E2 incluye los 220 primeros residuos aminoácidos partiendo del iniciador Met. Por ejemplo, puede realizarse la mutagénesis sitio-dirigida o técnicas de PCR para delecionar o sustituir uno o más de los residuos aminoácidos en la parte N-terminal de E2 que regulan la replicación vírica, de manera que se reduzca significativamente o se anule la función o funciones de replicación de E2 y se genere un polipéptido E2 defectuoso para la replicación del genoma de papilomavirus. Alternativamente o en combinación, puede eliminarse o sustituirse uno o más de los residuos aminoácidos dentro de la parte N-terminal de E2 responsables de la activación transcripcional de manera que se reduzca significativamente o se elimine la capacidad de E2 de activar la transcripción a partir de promotores de papilomavirus. Se describen ejemplos representativos de polipéptidos E2 defectuosos adecuados en la literatura disponible para el experto en la materia, por ejemplo en Demeret et al. (Nucleic Acids Res. 23:4777-4784, 1995), Sakai et al. (J. Virol. 70:1602-1611, 1996), Brokaw et al. (J. Virology 70:23-29, 1996) y Ferguson et al. (J. Virology 70:4193-4199, 1996). La reducción o falta de actividades de replicación de E2 y de activación transcripcional puede determinarse fácilmente en ensayos apropiados utilizando métodos estándares conocidos por el experto en la materia (Sakai et al., J. Virol. 70:1602-1611, 1996).

Un polipéptido E2 defectuoso en replicación preferido codificado por el ácido nucleico comprendido en el vector de la invención se origina a partir de HPV-16 y comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID nº 1 excepto en que por lo menos el residuo Glu en la posición 39 (E39) se ha modificado, por ejemplo se sustituido por cualquier residuo aminoácido aparte de Glu. Otro polipéptido E2 preferente defectuoso para la activación transcripcional se origina a partir de HPV-16 y comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID nº 1 excepto en que por lo menos el residuo Ile en la posición 73 (I73) se ha modificado, por ejemplo sustituido por cualquier residuo aminoácido aparte de Ile. Un polipéptido E2 todavía más preferente defectuoso tanto para la replicación como la activación transcripcional se origina a partir de HPV-16 y comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID nº 1 excepto en que por lo menos el residuo Glu (E39) en la posición 39 y el residuo Ile en la posición 73 (I73) han sido modificados, por ejemplo sustituidos por cualquier residuo aminoácido aparte de Glu e Ile en las posiciones respectivas 39 y 73. Más preferentemente, el residuo Glu en la posición 39 y/o el residuo Ile en la posición 73 se sustituyen por un residuo Ala (E39A y/o I73A). En el contexto de la invención, dicho polipéptido E2 defectuoso puede originarse a partir de cualquier papilomavirus y se encuentra comprendido dentro de las capacidades del experto en la materia adaptar las modificaciones descritas en relación a E2 de HPV-16 a un polipéptido E2 originado a partir de otro genotipo de papilomavirus (por ejemplo el residuo o residuos aminoácidos situados en una posición equivalente a la posición 39 y/o a la posición 73 de E2 de HPV-16 pueden identificarse mediante comparación entre secuencias y modificarse mediante técnicas estándares). A título ilustrativo, dichos residuos corresponden, respectivamente, a la Glu en la posición 43 y a la Ile en la posición 77 en E2 de HPV-18, a la Glu en posición 39 y a Ile en posición 73 en HPV-33 y HPV-52.

En otra forma de realización, la molécula de ácidos nucleicos comprendida en el vector de la invención se modifica de manera que codifique una fusión entre un polipéptido E2 de papilomavirus y una o más parejas de fusión, en el extremo N-terminal, en el extremo C-terminal o en ambos extremos de E2. La pareja de fusión puede originarse a partir de un papilomavirus o no. La fusión puede llevarse a cabo por medios genéticos, es decir mediante la fusión en el mismo marco de lectura de las secuencias de nucleótidos codificantes del polipéptido E2 y aquéllas codificantes de la pareja o parejas de fusión, de manera que la expresión de las secuencias codificantes fusionadas resulta en un único polipéptido. La fusión puede ser directa (es decir, sin ningún residuo aminoácido adicional entre ellas) o mediante un péptido conector para unir el polipéptido E2 con la pareja o parejas de fusión. La presencia de una molécula conectora puede facilitar la formación, plegamiento y/o funcionamiento correctos de la proteína de fusión. Las moléculas conectoras adecuadas según la invención presentan una longitud de entre 2 y 30 aminoácidos y están compuestas de residuos aminoácidos tales como glicina, serina, treonina, asparagina, alanina y/o prolina (ver, por ejemplo, Wiederrecht et al., Cell 54:841, 1988; Aumailly et al., FEBS Lett. 262:82, 1990; y Dekker et al., Nature 362:852, 1993).

Las parejas de unión no de papilomavirus comprenden de manera no limitativa la calreticulina (Cheng et al., J. Clin. Invest. 108:669-678, 2001), la proteína 70 de choque térmico de Mycobacterium tuberculosis (HSP70) (Chen et al., Cancer Res. 60:1035-1042, 2000), la ubiquitina (Rodríguez et al., J. Virol. 71:8497-8503, 1997) y la toxina bacteriana, tal como el dominio de traslocación de la exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa (ETA(dIII)) (Hung et al., Cancer Res. 61:3698-3703, 2001).

Las parejas de fusión de papilomavirus adecuadas pueden ser cualquier polipéptido de papilomavirus, tardío o temprano, o cualquier fragmento del mismo. Una pareja de fusión preferente se origina de un polipéptido HPV 5 temprano seleccionado de entre el grupo que consta de E1, E2, E4, E5, E6 y E7 o una mezcla de los mismos. El polipéptido E2 y la pareja de fusión de papilomavirus pueden originarse a partir del mismo genotipo de papilomavirus, tal como la fusión de los polipéptidos E1 y E2 de HPV-16. Alternativamente, el polipéptido E2 y la pareja de fusión de papilomavirus pueden originarse a partir de diferentes genotipos de papilomavirus, siendo un ejemplo representativo la fusión de los polipéptidos E2 de HPV-16 y E2 de HPV-18.

Independientemente o en combinación con la modificación o modificaciones anteriormente definidas, la molécula de ácidos nucleicos comprendida en el vector de la invención puede comprender además modificaciones adicionales que resultan beneficiosas para el procesamiento, estabilidad y/o solubilidad del polipéptido E2 codificado, por ejemplo la supresión de uno o más sitios potenciales de corte, la supresión de uno o más sitios potenciales de glucosilación y/o la presentación del polipéptido E2 codificado en la superficie de las células huésped de expresión. Por ejemplo, la supresión de un sitio potencial de glucosilación puede conseguirse identificando un sitio potencial de N-glucosilación (por ejemplo que comprenda un motivo Asn-Val-Ser-Val) y sustituyendo uno o más residuos aminoácidos por un residuo diferente (por ejemplo sustituyendo el residuo Ser por un residuo Gly o Ala), proporcionando un polipéptido E2 que no puede ser glucosilado al expresarse en una célula u organismo huésped eucariótico.

En una forma de realización preferida, la molécula de ácidos nucleicos comprendida en el vector de la invención se modifica de manera que codifique un polipéptido E2 presentado en la membrana, con el fin de mejorar la presentación del MCH de clase I y/o el MHC de clase II, y de esta manera su potencial inmunogenicidad en la célula u organismo huésped. Anteriormente se ha demostrado que la presentación en la membrana permite mejorar la eficacia terapéutica de los polipéptidos E6 y E7 de HPV-16 (ver, por ejemplo, el documento WO 99/03885). El polipéptido E2 de papilomavirus es una proteína nuclear, aunque no se ha identificado ninguna señal de localización nuclear típica. La presentación en la membrana puede conseguirse mediante la fusión del polipéptido E2 con una secuencia secretora (es decir, un péptido de señal) y una secuencia de anclaje a membrana. Dichas secuencias son conocidas en la técnica. Brevemente, las secuencias secretoras se encuentran presentes generalmente en el extremo N-terminal de los polipéptidos presentados en membrana o secretados e inician su paso al interior del retículo endoplasmático (ER). Comprenden 15 a 35 aminoácidos esencialmente hidrofóbicos que seguidamente son eliminados por una endopeptidasa específica localizada en el ER, proporcionando el polipéptido maduro. Las secuencias de anclaje a membrana habitualmente son de naturaleza altamente hidrofóbica y sirven para anclar los polipéptidos a la membrana celular (ver, por ejemplo, Branden y Tooze, en: Introduction to Protein Structure, páginas 202 a 215, NY Garland, 1991).

La elección de las secuencias de anclaje a membrana y/o secretoras que pueden utilizarse en el contexto de la presente invención es muy amplio. Pueden obtenerse a partir de cualquier polipéptido anclado a membrana y/o secretado (por ejemplo polipéptidos celulares o víricos), tales como la glucoproteína del virus de la rabia, la glucoproteína de cubierta del virus VIH o la proteína F del virus del sarampión, o pueden ser sintéticos. El sitio de inserción preferente de la secuencia secretora es el extremo N-terminal situado cadena abajo del codón de inicio de traducción y el de la secuencia de anclaje a membrana es el extremo C-terminal, por ejemplo inmediatamente cadena arriba del codón de parada. Además, puede utilizarse un péptido conector para unir la secuencia secretora y/o la secuencia de anclaje a membrana al polipéptido E2.

El polipéptido E2 con diana en la membrana codificado por el ácido nucleico comprendido en el vector de la presente invención preferentemente se modifica mediante fusión con las secuencias secretora y de anclaje a membrana de la glucoproteína del virus de la rabia, tal como se ilustra en la sección de ejemplos, adjunta.

Según una forma de realización particularmente preferida, la molécula de ácidos nucleicos codificante de un polipéptido E2 comprende, consiste esencialmente o consiste alternativamente de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID nº 2. A título informativo, el polipéptido de SEC ID nº 2 comprende el polipéptido E2 de HPV-16 (entre las posiciones 24 y 387) defectuoso para las actividades de replicación y transactivación (modificaciones del residuo Glu en la posición 61 y del residuo Ile en la posición 95 por residuos de Ala correspondientes a los residuos de Glu e Ile, respectivamente en las posiciones 39 y 73 del polipéptido E2 nativo) fusionado con las secuencias secretora de la glucoproteína (entre las posiciones 2 y 23) y de anclaje a membrana (entre las posiciones 388 y 453) del virus de la rabia.

La presente invención se refiere a un vector o partícula infecciosa que comprende moléculas de ácidos nucleicos codificantes de por lo menos dos polipéptidos E2 originados a partir de dos genotipos diferentes de papilomavirus, en los que dichas moléculas de ácidos nucleicos codificantes de E2 no comprenden una porción de 40 o más nucleótidos contiguos que muestran un porcentaje de identidad de 75% o superior entre dos cualesquiera de dichas moléculas de ácidos nucleicos codificantes de E2, y la utilización de dicho vector o partícula infecciosa para la preparación de un fármaco destinado al tratamiento de la infección por papilomavirus, especialmente de la infección persistente por HR-HPV. En una forma de realización ventajosa, &quot;por lo menos dos&quot; es 2, 3 o 4 y cada uno de los polipéptidos E2 codificados se origina a partir de HR-HPV de genotipos diferentes. Independientemente o en combinación, los polipéptidos E2 preferentemente se modifican tal como se ha indicado anteriormente (por ejemplo para que sean defectuosos para la replicación y/o la activación transcripcional y/o la presentación en membrana). Las moléculas de ácidos nucleicos codificantes de por lo menos dos polipéptidos E2 pueden situarse bajo secuencias reguladoras independientes o pueden fusionarse entre sí para expresarse en una única cadena polipeptídica. Tal como se indica en la presente memoria, entre los ejemplos representativos se incluye un vector que comprende moléculas de ácidos nucleicos codificante de polipéptidos E2 de HPV-16 y de HPV-18, así como un vector que comprende moléculas de ácidos nucleicos codificantes de polipéptidos E2 de HPV-16, HPV-18, HPV-33 y HPV-52, situados bajo secuencias reguladoras independientes. Las secuencias de nucleótidos codificantes de E2 se degeneran de manera que muestren un porcentaje de homología inferior a 75% entre sí, no comprendiendo dichas moléculas de ácidos nucleicos codificantes de E2 una porción de 40 o más (por ejemplo 50, 55, 59, 70 o incluso más) nucleótidos contiguos que muestren un porcentaje de identidad de 75% o superior a 75% entre dos cualesquiera de dichas moléculas de ácidos nucleicos codificantes de E2.

En una forma de realización específica de la presente invención, el vector o la partícula infecciosa indicados en la presente memoria también puede utilizarse en combinación con uno o más polipéptidos adicionales o con uno o más ácidos nucleicos, vectores o partículas infecciosas codificantes de dicho polipéptido o polipéptidos adicionales. Preferentemente, el polipéptido o polipéptidos adicionales es capaz de intensificar la actividad terapéutica proporcionada por el agente activo anteriormente indicado. El ácido nucleico codificante de dicho polipéptido o polipéptidos adicionales puede insertarse en el vector de la invención o en un vector independiente tal como uno de los indicados en la presente memoria y su expresión puede situarse bajo el control de secuencias reguladoras apropiadas, tales como las indicadas en la presente memoria. El polipéptido o polipéptidos adicionales pueden ser de origen papilomavirus o de origen no papilomavirus.

Entre los polipéptidos adicionales no de papilomavirus se incluyen citoquinas (por ejemplo IL-2, IL-7, IL-15, IL-18, IL21, IFNy) y productos génicos suicidas (por ejemplo la timidina cinasa de HSV-1 indicada en Caruso et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:7024-7028, 1993; FCU-1 indicado en el documento WO 99/54481).

Los polipéptidos adicionales de papilomavirus adicionales comprenden de manera no limitativa cualquier polipéptido temprano de HPV (o fragmento) seleccionado de entre el grupo que consta de E1, E2, E4, E5, E6 y E7 o cualquier mezcla de los mismos.

En un aspecto de la invención, el polipéptido o polipéptidos adicionales de papilomavirus pueden originarse a partir del mismo genotipo de papilomavirus que el del polipéptido E2 codificado por el vector anteriormente indicado.

Alternativamente, en otro aspecto de la invención, el polipéptido o polipéptidos adicionales de papilomavirus pueden originarse a partir de un genotipo de papilomavirus diferente que el del polipéptido E2 codificado por el vector anteriormente indicado.

El polipéptido adicional de papilomavirus puede ser nativo o modificado en comparación con la secuencia nativa correspondiente. Por ejemplo, puede modificarse el polipéptido o polipéptidos adicionales de manera que se reduzca

o anule su actividad biológica respectiva (por ejemplo una actividad enzimática) conservando simultáneamente actividad antigénica. Las modificaciones ejemplares ilustradas posteriormente se proporcionan con respecto a los polipéptidos del papilomavirus HPV-16, aunque el experto en la materia podrá trasponer estas mutaciones ejemplares a los polipéptidos correspondientes de otros genotipos de papilomavirus. Además, el polipéptido adicional de papilomavirus puede modificarse adicionalmente de manera que se presente en la membrana celular tal como se ha indicado anteriormente en relación a E2, así como en el documento WO 99/03885.

Un ejemplo adecuado de polipéptido adicional de papilomavirus es un polipéptido E1 modificado que comprenda una

o más mutaciones en comparación con el polipéptido E1 nativo correspondiente, de manera que resulte defectuoso para la estimulación de la replicación vírica. Preferentemente, el polipéptido E1 modificado comprende la mutación de cualquiera de los residuos en las posiciones 412, 439, 482 y/o 496 del polipéptido E1 nativo, tal como las variantes W439R, Y412F, G482D y G496R de E1 de HPV-16 descrito por Yasugi et al. (J. Virol. 71:5942-5951, 1997), con especial preferencia para la variante G482D que comprende la secuencia de aminoácidos del polipéptido E1 nativo de HPV-16 excepto en la sustitución del residuo Gly en la posición 482 por un residuo Asp (por ejemplo un polipéptido E1 modificado que presenta la secuencia mostrada en SEC ID nº 3). Otra polipéptido E1 modificado ejemplar comprende el polipéptido E1 de HPV-18 con una sustitución del residuo Gly en la posición 489 con un residuo Asp.

Otro ejemplo adecuado de polipéptidos adicionales de papilomavirus es un polipéptido E6 modificado que no es oncogénico y ha sido alterado para la unión al producto génico celular p53 de supresor tumoral. Todavía otro ejemplo adecuado de polipéptidos adicionales de papilomavirus es un polipéptido E7 modificado que no es oncogénico y que ha sido alterado par ala unión al producto génico celular Rb de supresor tumoral. Dichas variantes no oncogénicas se describen en, por ejemplo, Pim et al. (Oncogene 9:1869-1876, 1994), Munger et al. (EMBO J. 8:4099-4105, 1989), Crook et al. (Cell 67:547-556, 1991), Heck et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4442-4446, 1992) y Phelps et al. (J. Virol. 66:2148-2427, 1992). Un polipéptido E6 no oncogénico preferido se origina a partir de HPV-16 y presenta la deleción de los residuos 118 a 122 (CPEEK) (representando +1 el primer aminoácido del polipéptido E6 de HPV-16 nativo desde el primer residuo Met). Un polipéptido E7 no oncogénico preferido se origina a partir de HPV-16 y presenta una deleción de los residuos 21 a 26 (DLYCYE) (representado +1 el primer aminoácido del polipéptido E7 nativo de HPV-16).

Preferentemente, el polipéptido adicional de papilomavirus para la utilización en la invención, independientemente o en combinación, se selecciona de entre el grupo que consta de los polipéptidos que comprende cualquiera de las secuencias de aminoácidos proporcionada en SEC ID nº 3 a 5. Más concretamente, SEC ID nº 3 proporciona la secuencia de aminoácidos de un polipéptido E1 de HPV-16 presentado en membrana defectuoso par ala actividad de replicación (G482D). SEC ID nº 4 proporciona la secuencia de aminoácidos de un polipéptido E6 de HPV-16 no oncogénico y presentado en membrana y SEC ID nº 5, la secuencia de aminoácidos de un polipéptido E7 de HPV16 no oncogénico y presentado en membrana.

En el contexto nativo (por ejemplo el genoma de HPV-16 o de HPV-18), el extremo 3' de la molécula de ácidos nucleicos codificante de E1 se solapa en el extremo 5' de la molécula de ácidos nucleicos codificante de E2 a lo largo de 59 nucleótidos. Según una forma de realización preferida, la parte de la molécula de ácidos nucleicos codificante de E1 que se solapa con la molécula de ácidos nucleicos codificante de E2 se modifica de manera que muestre un porcentaje de identidad inferior a 75% con las secuencias de E2 solapantes. Preferentemente, las modificaciones se llevan a cabo en la molécula de ácidos nucleicos codificante de E1 a nivel de los nucleótidos mediante la degeneración del uso de los codones y son silenciosas al nivel de los aminoácidos, es decir, dichas modificaciones no se traducen en el polipéptido E1 de papilomavirus codificado. Se proporciona en SEC ID nº 6 un ejemplo representativo de las modificaciones que pueden introducirse en la porción de 59 pb presente en el extremo 3' de la molécula de ácidos nucleicos codificante de E1 de HPV-16 y solapante en el contexto nativo con la parte 5' de la molécula de ácidos nucleicos codificante de E2 de HPV-16.

Los vectores preferidos según la invención comprenden un vector seleccionado de entre el grupo que consta de:

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un vector que comprende: (i) una molécula de ácidos nucleicos codificante de un polipéptido E2 de HPV-16 y que comprende además: (ii) una molécula de ácidos nucleicos codificante de un polipéptido E2 de HPV-18,

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un vector que comprende: (i) una molécula de ácidos nucleicos codificante de un polipéptido E2 de HPV-16, (ii) una molécula de ácidos nucleicos codificante de un polipéptido E2 de HPV-33,

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un vector que comprende: (i) una molécula de ácidos nucleicos codificante de un polipéptido E2 de HPV-16, (ii) una molécula de ácidos nucleicos codificante de un polipéptido E2 de HPV-18, e (iii) una molécula de ácidos nucleicos codificante de un polipéptido E2 de HPV-52,

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un vector que comprende: (i) una molécula de ácidos nucleicos codificante de un polipéptido E2 de HPV-16, (ii) una molécula de ácidos nucleicos codificante de un polipéptido E2 de HPV-33, e (iii) una molécula de ácidos nucleicos codificante de un polipéptido E2 de HPV-52,

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un vector que comprende: (i) una molécula de ácidos nucleicos codificante de un polipéptido E2 de HPV-16, (ii) una molécula de ácidos nucleicos codificante de un polipéptido E2 de HPV-18, (iii) una molécula de ácidos nucleicos codificante de un polipéptido E2 de HPV-33, e (iv) una molécula de ácidos nucleicos codificante de un polipéptido E2 de HPV-52,

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un vector que comprende: (i) una molécula de ácidos nucleicos codificante de un polipéptido E2 de HPV-16, (ii) una molécula de ácidos nucleicos codificante de un polipéptido E1 de HPV-16, (iii) una molécula de ácidos nucleicos codificante de un polipéptido E2 de HPV-18, e (iv) una molécula de ácidos nucleicos codificante de un polipéptido E1 de HPV-18,

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un vector que comprende moléculas de ácidos nucleicos codificantes de los polipéptidos E1, E2, E6 y E7 de HPV-16 y de los polipéptidos E1, E2, E6 y E7 de HPV-18.

Preferentemente, el polipéptido o polipéptidos E2 codificados se presentan en membrana y son defectuosos para las actividades de replicación y de activación transcripcional. Preferentemente, el polipéptido E2 de HPV-16 comprende, alternativamente consiste esencialmente o consiste alternativamente de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID nº 2 y/o el polipéptido E2 de HPV-18 comprende, alternativamente consiste esencialmente o consiste alternativamente de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID nº 29 y/o el polipéptido E2 de HPV-33 comprende, alternativamente, consiste esencialmente o alternativamente consta de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID nº 30 y/o el polipéptido E2 de HPV-52 comprende, alternativamente consiste esencialmente o consiste alternativamente de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID nº 31.

Independientemente o en combinación, el polipéptido o polipéptidos E1 codificados se presentan en membrana y son defectuosos para la actividad de replicación. Preferentemente, el polipéptido E1 de HPV-16 comprende, alternativamente consiste esencialmente o alternativamente consta de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID nº 3 y/o el polipéptido E1 de HPV-18 comprende, alternativamente consiste esencialmente o alternativamente consta de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID nº 32. El polipéptido o polipéptidos E6 y/o E7 codificados se presentan en membrana y son no oncogénicos. Preferentemente, el polipéptido E6 de HPV-16 comprende, alternativamente consiste esencialmente o alternativamente consta de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID nº 4, y/o el polipéptido E7 de HPV-16 comprende, alternativamente consiste esencialmente o alternativamente consta de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID nº 5.

Más preferentemente, la molécula de ácidos nucleicos codificante del polipéptido E2 de HPV-16 comprende, consiste esencialmente o consta de la secuencia de nucleótidos mostrad en SEC ID nº 8, y/o la molécula de ácidos nucleicos codificante del polipéptido E2 de HPV-18 comprende, consiste esencialmente o consta de la secuencia de nucleótidos mostrada en SEC ID nº 33 y/o la molécula de ácidos nucleicos codificante del polipéptido E2 de HPV-33 comprende, consiste esencialmente o consta de la secuencia de nucleótidos mostrada en SEC ID nº 34 o en SEC ID nº 35, y/o la molécula de ácidos nucleicos codificante del polipéptido E2 de HPV-52 comprende, consiste esencialmente o consta de la secuencia de nucleótidos mostrada en SEC ID nº 36 o en SEC ID nº 37, y/o la molécula de ácidos nucleicos codificante del polipéptido E1 de HPV-16 comprende, consiste esencialmente o consta de la secuencia de nucleótidos mostrada en SEC ID nº 7 (secuencias degeneradas para reducir la homología con la parte solapante de E2 de HPV-16) y/o la molécula de ácidos nucleicos codificante del polipéptido E1 de HPV-18 comprende, consiste esencialmente o consta de la secuencia de nucleótidos mostrada en SEC ID nº 38 (secuencia degenerada para reducir la homología con las secuencias codificantes de E1 de HPV-16).

Tal como se ha expuesto anteriormente en la presente memoria, las secuencias de nucleótidos codificantes de E2 se encuentran degeneradas, de manera que muestran un porcentaje de homología inferior a 75% entre sí, en donde las moléculas de ácidos nucleicos codificantes de E2 no comprenden una parte de 40 o más (por ejemplo 45, 50, 55, 59, 70 o incluso más) nucleótidos contiguos que muestran un porcentaje de identidad de 75% o superior a 75% entre dos cualesquiera de dichas moléculas de ácidos nucleicos codificantes de E2. Las secuencias de nucleótidos anteriormente indicadas completan dicha forma de realización.

La molécula o moléculas de ácidos nucleicos comprendidas en el vector o partícula vírica infecciosa de la presente invención pueden generarse utilizando datos de secuencia accesibles de la técnica y la información de secuencia proporcionada en la presente memoria. Puede aislarse directamente a partir de células que contienen HPV (por ejemplo células CaSKi disponibles de ATCC bajo el número de acceso CRL-1550) o de cualquier fuente de papilomavirus tal como se ha definido anteriormente, mediante técnicas convencionales de biología molecular o PCR y, en caso necesario, puede modificarse adicionalmente tal como se ha definido en la presente memoria mediante técnicas rutinarias de mutagénesis (por ejemplo para optimizar la expresión en una célula huésped particular, para generar una variante defectuosa, etc.). Alternativamente, la molécula o moléculas de ácidos nucleicos comprendidas en el vector de la invención también pueden generarse mediante síntesis química en un procedimiento automatizado (por ejemplo pueden ensamblarse a partir de oligonucleótidos sintéticos solapantes tal como se describe en, por ejemplo, Edge, Nature 292:756, 1981; Nambair et al., Science 223:1299, 1984; Jay et al.,

J. Biol. Chem. 259:6311, 1984).

En otra forma de realización, la molécula o moléculas de ácidos nucleicos comprendidas en el vector o partícula vírica infecciosa de la presente invención se encuentran en una forma adecuada para la expresión del polipéptido o polipéptidos codificados en una célula u organismo huésped, lo que implica que la molécula o moléculas de ácidos nucleicos se sitúan bajo el control de una o más secuencias reguladoras necesarias para la expresión de las mismas.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión &quot;secuencias reguladoras&quot; se refiere a cualquier secuencia que permita, contribuya o module la expresión de la molécula de ácidos nucleicos en una célula huésped dada, incluyendo la replicación, duplicación, transcripción, corte y empalme, traducción, estabilidad y/o transporte del ácido nucleico o derivado del mismo (es decir, ARNm) en la célula huésped. Dichas secuencias reguladoras son bien conocidas en la técnica (ver, por ejemplo, Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, 1990). El experto en la materia apreciará que la elección de las secuencias reguladoras puede depender de factores tales como el tipo de vector, la célula huésped, el nivel de expresión deseado, etc. En el contexto de la presente invención, las secuencias reguladoras se encuentran ligadas funcionalmente a la molécula de ácidos nucleicos que debe expresarse. La expresión &quot;operablemente ligado&quot; pretenderse referirse a que la molécula de ácidos nucleicos se encuentra ligada a las secuencias reguladoras de una manera que permite su expresión en una célula u organismo huésped.

El promotor resulta de especial importancia y la presente invención comprende la utilización de promotores constitutivos que dirigen la expresión de la molécula de ácidos nucleicos en muchos tipos de célula huésped y aquellos que dirigen la expresión únicamente en determinadas células huésped o en respuesta a sucesos concretos

o factores exógenos (por ejemplo la temperatura, la adición de un nutriente, hormona u otro ligando). Los promotores adecuados han sido muy descritos en la literatura y pueden mencionarse concretamente promotores víricos tales como los promotores del RSV (virus del sarcoma de Rous), del SV40 (virus 40 del simio), del CMV (citomegalovirus) y MLP (promotor tardío mayor). Entre los promotores preferentes para la utilización en un vector poxvirus se incluyen, aunque sin limitación, los promotores de Vaccinia 7.5K, H5R, TK, p28, p11 y K1L, los promotores quiméricos entre promotores poxvíricos tempranos y tardíos, así como promotores sintéticos tales como los indicados en Chakrabarti et al. (Biotechniques 23:1094-1097, 1997), Hammond et al. (J. Virological Methods 66:135-138, 1997) y Kumar y Boyle (Virology 179:151-158, 1990).

El experto en la materia apreciará que las secuencias reguladoras que controlan la expresión de la molécula de ácidos nucleicos pueden comprender además elementos adicionales para el inicio, regulación y/o terminación correctos de la transcripción (por ejemplo secuencias poliA de terminación de la transcripción), transporte del ARNm (por ejemplo secuencias de señal de localización nuclear), de procesamiento (es decir, señales de corte y empalme), de estabilidad (por ejemplo intrones y secuencias 5' y 3' no codificantes) y de traducción (por ejemplo secuencias líder tripartitas, sitios de unión ribosómica, secuencias de Shine-Dalgarno, etc.) en la célula u organismo huésped.

En el contexto de la presente invención, una o más copias de la molécula de ácidos nucleicos pueden encontrarse comprendidas en dicho vector o partícula vírica infecciosa utilizada según la presente invención.

El término &quot;vector&quot; tal como se utiliza en la presente memoria define vectores víricos así como no víricos (por ejemplo ADN plasmídico), incluyendo vectores extracromosómicos (por ejemplo episomas), vectores multicopia e integrantes (es decir, que se incorporan en los cromosomas del huésped). Resultan particularmente importantes en el contexto de la invención los vectores para la utilización en terapia génica (es decir, que pueden introducir la molécula de ácidos nucleicos en un organismo huésped), así como los vectores de expresión para la utilización en diversos sistemas de expresión. En referencia a un vector vírico, el término &quot;vector&quot; tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a cualquier molécula de ácidos nucleicos que comprende por lo menos un elemento de origen vírico, incluyendo un genoma vírico completo, una parte del mismo o un genoma vírico modificado tal como se indica posteriormente, así como partículas víricas generadas del mismo (por ejemplo un vector vírico empaquetado en una cápside vírica para producir partículas víricas infecciosas).

Entre los vectores no víricos adecuados se incluyen plásmidos tales como pREP4, pCEP4 (Invitrogene), pCI (Promega), pCDM8 (Seed, Nature 329:840, 1987), pVAX y pgWiz (Gene Therapy System Inc., Himoudi et al., J. Virol. 76:12735-12746, 2002).

Los vectores víricos pueden originarse a partir de una diversidad de diferentes virus, y especialmente a partir de un virus seleccionado de entre el grupo que consta de retrovirus, adenovirus, virus asociado a adenovirus (AAV), poxvirus, herpesvirus, virus del sarampión y virus espumoso. Los vectores víricos pueden ser competentes para replicación o pueden discapacitarse genéticamente de manera que sean defectuosos en replicación o de replicación alterada. La expresión &quot;competente para replicación&quot; tal como se utiliza en la presente memoria comprende los vectores víricos selectivos para replicación y condicionalmente replicantes que se manipulan para que se repliquen mejor o selectivamente en células huésped específicas (por ejemplo en células tumorales).

En un aspecto, el vector es un vector adenovírico (para una revisión ver &quot;Adenoviral vectors for gene therapy&quot;, Editores D. Curiel y J. Douglas, Academic Press, 2002). Puede originarse a partir de una diversidad de fuentes humanas o animales y puede utilizarse cualquier serotipo de los serotipos adenovíricos 1 a 51. Resultan particularmente preferentes los adenovirus humanos 2 (Ad2), 5 (Ad5), 6 (Ad6), 11 (Ad11), 24 (Ad24) y 35 (Ad35). Dichos adenovirus se encuentran disponibles de la American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, Md.) y han sido objeto de numerosas publicaciones que describen su secuencia, organización y métodos de producción, permitiendo que el experto en la materia realice aplicaciones de los mismos (ver, por ejemplo, las patentes US nº 6.133.028, nº 6.110.735, el documento WO 02/40665, el documento WO 00/50573, el documento EP 1016711; Vogels et al., J. Virol. 77:8263-8271, 2003).

El vector adenovírico puede ser competente para la replicación. Se encuentran fácilmente disponibles para el experto en la materia numerosos ejemplos de vectores adenovíricos competentes para la replicación (Hernández-Alcoceba et al., Human Gene Ther. 11:2009-2024, 2000; Nemunaitis et al., Gene Ther. 8:746-759, 2001; Alemany et al., Nature Biotechnology 18:723-727, 2000). Por ejemplo, pueden construirse a partir de un genoma adenovírico de tipo salvaje mediante deleción del dominio CR2 de E1A (por ejemplo, patente WO 00/24408) y/o mediante sustitución de los promotores de E1 y/o E4 nativos por promotores específicos de tejido, tumor o estado celular (ver, por ejemplo, la patente US nº 5.998.205, el documento WO 99/25860, la patente US nº 5.698.443, el documento WO 00/46355, el documento WO 00/15820 y el documento WO 01/36650).

Alternativamente, el vector adenovírico es defectuoso para la replicación (ver, por ejemplo, el documento WO 94/28152; Lusky et al., J. Virol. 72:2022-2032, 1998). Los vectores adenovíricos defectuosos para replicación preferentes son defectuosos para E1 (ver, por ejemplo, las patentes US nº 6.136.594 y nº 6.013.638), con una deleción de E1 que se extiende aproximadamente entre las posiciones 459 y 3.328 o entre aproximadamente las posiciones 459 y 3.510 (haciendo referencia a la secuencia del adenovirus humano de tipo 5 dado a conocer en GeneBank bajo el número de acceso M 73260 y en Chroboczek et al., Virol. 186:280-285, 1992). La capacidad de clonación puede mejorarse adicionalmente mediante deleción de la parte o partes adicionales del genoma adenovírico (por ejemplo en la región no esencial de E3 o en otras regiones no esenciales de E2 o E4). La inserción de la molécula de ácidos nucleicos utilizada en la invención puede llevarse a cabo mediante recombinación homóloga en cualquier localización del genoma adenovírico tal como se describe en Chartier et al. (J. Virol. 70:48054810, 1996). Preferentemente, se inserta en sustitución de la región de E1. Puede situarse en orientación de sentido

o antisentido respecto a la dirección natural de transcripción de la región en cuestión.

En otro aspecto preferido, el vector de la invención es un vector poxvirus (ver, por ejemplo, Cox et al., en: &quot;Viruses in Human Gene Therapy&quot;, editor J.M. Hos, Carolina Academic Press). Puede obtenerse a partir de cualquier miembro de Poxviridae, en particular del poxvirus del canario (por ejemplo ALVAC, tal como se describe en el documento WO 95/27780), del poxvirus aviar (por ejemplo TROVAC tal como se describe en Paoletti et al., Dev. Biol. Stand. 84:159163, 1995) o del virus Vaccinia, siendo preferente éste último. Entre los virus Vaccinia adecuados se incluyen, aunque sin limitación, la cepa Copenhagen (Goebel et al., Virol. 179:247-266 y 517-563, 1990; Johnson et al., Virol. 196:381-401, 1993), la cepa Wyeth, NYVAC (ver el documento WO 92/15672 y Tartaglia et al., Virology 188:217232, 1992) y la cepa Ankara (MVA) modificada altamente atenuada (Mayr et al., Infection 3:6-16, 1975).

La técnica básica para insertar la molécula de ácidos nucleicos y elementos reguladores asociados necesarios para la expresión en un genoma de poxvirus se describe en numerosos documentos accesibles al experto en la materia (Paul et al., Cancer Gene Ther. 9:470-477, 2002; Piccini et al., Methods of Enzymology 153:545-563, 1987; patentes US nº 4.769.330, nº 4.772.848, nº 4.603.112, nº 5.100.587 y nº 5.179.993). Habitualmente, se realiza una recombinación homóloga entre secuencias solapantes (es decir, flanqueantes del sitio de inserción deseado) presentes tanto en el genoma vírico como en un plásmido que porta el ácido nucleico que debe insertarse. La molécula de ácidos nucleicos comprendida en el vector de la invención preferentemente se inserta en un locus no esencial del genoma poxvírico, con el fin de que el poxvirus recombinante siga siendo viable e infeccioso. Las regiones no esenciales son regiones intergénicas no codificantes o cualquier gen para el que la inactivación o deleción no altere significativamente el crecimiento, replicación o infección víricos. También puede contemplarse la inserción en un locus vírico esencial, con la condición de que la función defectuosa se proporcione en trans durante la producción de las partículas víricas, por ejemplo mediante la utilización de una línea celular ayudante que porte las secuencias complementarias correspondientes a las delecionadas en el genoma poxvírico.

Al utilizar el virus Vaccinia Copenhagen, la molécula de ácidos nucleicos preferentemente se inserta en el gen timidina cinasa (tk) (Hruby et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:3411-3415, 1983; Weir et al., J. Virol. 46:530-537, 1983). Sin embargo, también resultan apropiados otros sitios de inserción, por ejemplo en el gen hemaglutinina (Guo et al., J. Virol. 63:4189-4198, 1989), en el locus K1L, en el gen u (Zhou et al., J. Gen. Virol. 71:2185-2190, 1990) o en el extremo izquierdo del genoma del virus Vaccinia, en donde una diversidad de deleciones espontáneas o artificiales han sido publicadas en la literatura (Altenburger et al., Archives Virol. 105:15-27, 1989; Moss et al., J. Virol. 40:387-395, 1981; Panicali et al., J. Virol. 37:1000-1010, 1981; Perkus et al., J. Virol. 63:3829-3836, 1989; Perkus et al., Virol. 179:276-286, 1990; Perkus et al., Virol. 180:406-410, 1991).

Al utilizar el MVA, la molécula de ácidos nucleicos puede insertarse en cualquiera de las deleciones I a VII identificadas presentes en el genoma del MVA (Antoine et al., Virology 244:365-396, 1998), así como en el locus D4R, aunque resulta preferida la inserción en la deleción II o III (Meyer et al., J. Gen. Virol. 72:1031-1038, 1991; Sutter et al., Vaccine 12:1032-1040, 1994).

Al utilizar el poxvirus aviar, aunque puede considerarse la inserción dentro del gen timidina cinasa, la molécula de ácidos nucleicos preferentemente se introduce en la región intergénica situada entre las ORF 7 y 9 (ver, por ejemplo, el documento EP 314 569 y la patente US nº 5.180.675).

Preferentemente, el vector de la invención es un vector virus Vaccinia, con especial preferencia por un vector MVA. Más preferentemente, la molécula o moléculas de ácidos nucleicos se insertan en la deleción III y, finalmente, en dirección opuesta, especialmente en el caso de que dichas moléculas de ácidos nucleicos se sitúen bajo el control del mismo promotor. Resulta preferente que la molécula o moléculas de ácidos nucleicos codificantes de E2 y/o E7 se sitúen bajo el promotor H5R de Vaccinia y la molécula o moléculas de ácidos nucleicos codificantes de E1 y/o E6 bajo el control del promotor de p7.5K.

La presente descripción también da a conocer la utilización de un vector acomplejado con lípidos o polímeros formando estructuras particuladas, tales como liposomas, lipoplejos o nanopartículas. Dichas tecnologías se encuentran disponibles de la técnica (ver, por ejemplo, Arangoa et al., Gene Ther. 10:5-14, 2003; Eliaz et al., Gene Ther. 9:1230-1237, 2002, y Betageri et al., &quot;Liposome drug delivery systems&quot;, Technomic Publishing Company, Inc., 1993).

La presente invención también se refiere a partículas víricas infecciosas que comprenden los vectores anteriormente indicados y su utilización tal como se define en la presente memoria.

Típicamente, dichas partículas víricas se producen en una línea celular apropiada cultivada bajo condiciones adecuadas y utilizando procedimientos bien conocidos de la técnica. En la presente memoria no se realiza ningún intento para describir en detalle los diversos métodos conocidos para la producción de partículas víricas infecciosas.

En el caso de que el vector vírico sea defectuoso, las partículas infecciosas habitualmente se producen en una línea celular de complementación o mediante la utilización de un virus ayudante, que proporciona en trans los genes víricos no funcionales. Por ejemplo, entre las líneas celulares adecuadas para la complementación de los vectores adenovíricos con deleción de E1 se incluyen las células 293 (Graham et al., J. Gen. Virol. 36:59-72, 1997), así como las células PER-C6 (Fallaux et al., Human Gene Ther. 9:1909-1917, 1998) y los derivados de PER-C6. Las células apropiadas para propagar los vectores poxvirus son células aviares, y más preferentemente fibroblastos primarios de embrión de pollo (CEF) preparados a partir de embriones de pollo obtenidos de huevos fertilizados. Las células productoras pueden cultivarse en biorreactores de fermentación, matraces y placas Petri convencionales, bajo condiciones apropiadas de temperatura, pH y contenido de oxígeno.

Las partículas víricas infecciosas pueden recuperarse a partir del sobrenadante de cultivo o de las células tras la lisis. Pueden purificarse adicionalmente según técnicas estándares (cromatografía, ultracentrifugación tal como se describe, por ejemplo, en los documentos WO 96/27677, 98/00524, 98/22588, 98/26048, 00/40702, EP 1016700 y WO 00/50573).

La presente descripción también da a conocer la utilización de vectores o partículas víricas que han sido modificadas para permitir el direccionamiento preferente a una célula diana particular (ver, por ejemplo, Wickam et al., J. Virol. 71:8221-8229, 1997; Arnberg et al., Virol. 227:239-244, 1997; Michael et al., Gene Therapy 2:660-668, 1995; patentes WO 94/10323, WO 02/96939 y patente EP 1 146 125). Una particularidad característica de los vectores y partículas víricas direccionados es la presencia en su superficie de un ligando capaz de reconocer y unirse a un componente celular y expuesto en la superficie, tal como un marcador específico de un tipo de célula (por ejemplo una célula infectada por HPV), un marcador específico de tejido (por ejemplo un marcador específico de células epiteliales), así como un antígeno vírico (por ejemplo HPV). Entre los ejemplos de ligandos adecuados se incluyen anticuerpos o fragmentos de los mismos dirigidos a un dominio antigénico de HPV. El direccionamiento celular puede llevarse a cabo insertando genéticamente el ligando en un polipéptido presente sobre la superficie del virus (por ejemplo fibra adenovírica, pentona, pIX o producto del gen p14 de Vaccinia).

También se describen células huésped que comprenden los vectores o partículas víricas infecciosas anteriormente indicados para la utilización según se define en la presente memoria.

Los vectores y partículas víricas infecciosas de la invención pueden introducirse en la célula huésped mediante cualquier método conocido de la técnica. Entre dichos métodos se incluyen, aunque sin limitación, la microinyección (Capechi et al., Cell 22:479-488, 1980), la transfección mediada por CaPO4 (Chen y Okayama, Mol. Cell Biol. 7:2745-2752, 1987), la transfección mediada por DEAE-dextrano, la electroporación (Chu et al., Nucleic Acid Res. 15:1311-1326, 1987), la lipofección/fusión de liposomas (Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413-7417, 1987), el bombardeo con partículas (Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:9568-9572, 1990), las pistolas génicas, la transducción, la infección vírica, así como la administración directa en un organismo huésped por diversos medios. Además, tal como se comenta anteriormente, pueden utilizarse asociados a reactivos de transfección con el fin de facilitar su introducción en la célula u organismo huésped, tal como polímeros policatiónicos (por ejemplo quitosano, polimetacrilato, PEI, etc.) y lípidos catiónicos (por ejemplo DC-ChoI/DOPE, lipofectina y transfectam, ahora disponible de Promega).

En otro aspecto de la presente invención, el vector o partícula vírica infecciosa anteriormente indicado (también denominado en la presente memoria &quot;agente activo&quot;) o cualquier combinación de los mismos se encuentra comprendido en una composición.

Ventajosamente, la composición es una composición farmacéutica que comprende, además de una cantidad terapéuticamente efectiva del agente o agentes activos, un vehículo farmacéuticamente aceptable. Tal como se utiliza en la presente memoria, una &quot;cantidad terapéuticamente efectiva&quot; es una dosis suficiente para el alivio de uno

o más síntomas normalmente asociados a la enfermedad o condición que se desea tratar. Por ejemplo, una cantidad terapéuticamente efectiva podría ser aquella cantidad necesaria para inducir una respuesta inmunológica o para activar el sistema inmunológico, resultando en el desarrollo de una respuesta anti-HPV. Tal como se utiliza en la presente memoria, un &quot;vehículo farmacéuticamente aceptable&quot; pretende incluir alguno o todos los portadores, solventes, diluyentes, excipientes, adyuvantes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, y agentes retardantes de la absorción, y similares, compatibles con la administración farmacéutica.

Preferentemente, la composición de la invención se formula para la utilización humana o animal. Preferentemente se incluye en un diluyente isotónico, hipotónico o débilmente hipertónico y presenta una fuerza iónica relativamente baja. Entre los ejemplos representativos de diluyentes adecuados se incluyen agua estéril, solución salina fisiológica (por ejemplo cloruro sódico), solución de Ringer, soluciones de glucosa, trehalosa o sacarosa, solución de Hank y otras soluciones acuosas salinas fisiológicamente equilibradas (ver, por ejemplo, la edición más actual de Remington: The Science and Practice of Pharmacy, A. Gennaro, Lippincott, Williams&amp;Wilkins). Además, la composición puede tamponarse a un pH fisiológico o ligeramente básico (por ejemplo entre aproximadamente pH 7 y aproximadamente pH 9). Entre los tampones adecuados, aunque sin limitación, se incluyen el tampón fosfato (por ejemplo PBS), el tampón bicarbonato y el tampón Tris-HCl. A título ilustrativo, entre las formulaciones particularmente adaptadas a la invención se incluyen:

o sacarosa 1 M, NaCl 150 mM, MgCl2 1 mM, Tween-80 54 mg/l, Tris-HCl 10 mM, pH 8,5 (especialmente en el caso de que el agente activo sea un vector adenovírico),

o manitol 10 mg/ml, HSA 1 mg/ml, Trips 20 mM, pH 7,2 y NaCl 150 mM, y

o solución salina fisiológica.

Dichas formulaciones resultan particularmente adecuadas para conservar la estabilidad de la composición a la temperatura de congelación (por ejemplo -70ºC o -20ºC), de refrigeración (por ejemplo 4ºC) o a temperatura ambiente. La composición de la invención también puede formularse en forma sólida. Pueden obtenerse composiciones sólidas (por ejemplo en forma de polvos secos o liofilizadas) mediante un procedimiento que implica el secado al vacío y la liofilización. Habitualmente se reconstituyen en un vehículo adecuado antes de utilizarlas.

La composición también puede contener uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables para proporcionar propiedades farmacéuticas o farmacodinámicas deseables, incluyendo, por ejemplo, la modificación o mantenimiento de pH, osmolaridad, viscosidad, transparencia, color, esterilidad, estabilidad, velocidad de disolución de la formulación, la modificación o mantenimiento de la liberación o absorción en un organismo animal o humano, la inducción del transporte a través de una barrera mucosal o la penetración en un órgano particular. Por ejemplo, una composición adecuada para la administración vaginal puede incluir finalmente uno o más potenciadores de la absorción que resulten útiles para incrementar el tamaño de poro de las membranas mucosales.

Además, la composición de la invención puede comprender uno o más adyuvantes adecuados para la aplicación sistémica o mucosal en el ser humano. Preferentemente, el adyuvante puede estimular la inmunidad frente al agente activo, especialmente inmunidad mediada por células T, por ejemplo a través de receptores de tipo Toll (TLR), tales como TLR-7, TLR-8 y TLR-9. Entre los ejemplos representativos de adyuvantes útiles se incluyen, aunque sin limitación, alumbre, emulsión de aciete mineral tal como las soluciones completa e incompleta de Freund (IFA), lipopolisacáridos o un derivado de los mismos (Ribi et al., Immunology and Immunopharmacology of Bacterial Endotoxins, Plenum Publ. Corp., NY, páginas 407 a 419, 1986), saponinas tales como QS21 (Sumino et al., J. Virol. 72:4931-4939, 1998; patente WO 98/56415), compuestos de imidazoquinolina tales como imiquimod (Suader, J. Am. Acad. Dermatol. 43:S6-S11, 2000), derivado 1H-imidazo(4,5-c)quinolón-4-amina (AldaraTM) y el compuesto relacionado S-27609 (Smorlesi, Gene Ther. 12:1324-1332, 2005), oligodesoxinucleótidos citosina fosfato guanosina, tales como CpG (Chu et al., J. Exp. Med. 186:1623, 1997; Tritel et al., J. Immunol. 171:2358-2547, 2003) y péptidos catiónicos tales como IC-31 (Kritsch et al., J. Chromatogr. Anal. Technol. Biomed. Life Sci. 822:263-270, 2005).

La composición de la invención puede administrarse mediante una diversidad de modos de administración, entre ellos la administración sistémica, tópica y mucosal. La administración sistémica puede llevarse a cabo por cualquier medio, por ejemplo mediante inyección subcutánea, intradérmica, intramuscular, intravenosa, intraperitoneal, intravascular o intraarterial. Las inyecciones pueden llevarse a cabo con jeringas y agujas convencionales, o mediante cualquier dispositivo apropiado disponible de la técnica. La administración mucosal puede llevarse a cabo por vía oral, nasal, intratraqueal, intrapulmonar, intravaginal o intrarrectal. La administración tópica puede llevarse a cabo utilizando medios transdérmicos (por ejemplo parches y similares). La composición de la invención preferentemente se formula en una forma adecuada para la inyección, resultando preferente la administración intramuscular o subcutánea.

La dosis apropiada puede adaptarse como función de diversos parámetros, en particular el modo de administración, el agente activo utilizado, la edad, salud y peso del organismo huésped, el tipo de tratamiento concurrente y/o la frecuencia del tratamiento. El experto en la materia podrá realizar rutinariamente afinar adicionalmente los cálculos necesarios para determinar la dosis apropiada para el tratamiento a la luz de las circunstancias relevantes. Para una guía general, la dosis adecuada para las partículas adenovíricas varía entre aproximadamente 105 y aproximadamente 1013 iu (unidades infecciosas), preferentemente entre aproximadamente 107 y aproximadamente 1012 iu, y preferentemente entre aproximadamente 108 y aproximadamente 1011 iu. La dosis adecuada para las partículas de MVA varía entre aproximadamente 104 y aproximadamente 1010 pfu (partícula formadora de placa), preferentemente entre aproximadamente 105 y aproximadamente 109 pfu, y preferentemente entre aproximadamente 106 y aproximadamente 108 pfu. Los vectores plásmidos pueden administrarse en dosis de entre 10 μg y 20 mg, y preferentemente de entre 100 μg y 2 mg.

Además, la administración puede tener lugar en una única dosis o, alternativamente, en dosis múltiples según los protocolos estándares, dosis y regímenes durante varias horas, días y/o semanas. Además, la administración puede realizarse mediante inyección de bolo o la infusión continua. Por ejemplo, el organismo huésped puede tratarse con por lo menos dos (por ejemplo entre 2 y 10) administraciones de la molécula de ácidos nucleicos, vector, partícula infecciosa o composición anteriormente indicado. Preferentemente, se lleva a cabo una primera serie de administraciones secuencialmente dentro de un periodo de tiempo de entre unos cuantos días y 4 semanas, seguido de una segunda serie de administraciones (por ejemplo una o dos administraciones) llevada a cabo uno a 6 meses después de la última administración de la primera serie. El periodo de tiempo entre cada administración de la segunda serie puede ser de entre unos cuantos días y 4 semanas. En una forma de realización preferida, la primera serie de administraciones comprende tres administraciones secuenciales a intervalos de una semana y la segunda serie comprende una administración 4 a 6 meses después de la primera serie. A modo de guía general, en el caso de que se utilicen partículas infecciosas de MVA según la presente invención, la administración preferentemente se lleva a cabo por vía subcutánea con una dosis de partículas de MVA comprendida entre 106 y 5x108 pfu.

Tal como se ha indicado anteriormente, el vector, partícula vírica infecciosa o composición indicado en la presente memoria, o combinación de los mismos, preferentemente se administra tras la exposición del organismo huésped (el paciente) a por lo menos un papilomavirus y antes de la detección/aparición de una lesión asociada a un papilomavirus. En otros términos, los organismos huésped con infección por HPV pero que todavía no han progresado a neoplasia son candidatos adecuados para la utilización según la presente invención para prevenir o reducir la probabilidad de progresión a neoplasia y en última instancia a cáncer.

El término &quot;exposición&quot; se refiere al contacto de un organismo huésped con por lo menos un papilomavirus que permite que se produzca la infección. Ahora se encuentran disponibles en la técnica varios métodos diagnósticos, permitiendo diagnosticar la infección por papilomavirus. Por ejemplo, puede recogerse una muestra biológica de un organismo huésped bajo riesgo de infección por papilomavirus y analizarse para la presencia de papilomavirus, ácidos nucleicos víricos (por ejemplo ADN o ARNm) y/o antígenos víricos. Entre dichos métodos se incluyen, aunque sin limitación, PCR, hibridación in situ, inmunofluorescencia, ELISA y varios ensayos diagnósticos ahora disponibles. Entre los ejemplos representativos de ensayo adecuados se incluyen el sistema LiPA (patente WO 99/14377; productos de Labo Biomedical, Países Bajos), el ensayo Hybrid Capture II® (HCII, Digene Corp., USA, que permite la detección de ADN de 13 HR-HPV), el ensayo Linear Array® (Roche, que permite el genotipado del ADN de 37 genotipos de HPV), el sistema Thin Prep (Cytyc Corporate, Marlborough, MA), PreTect-HPV Proofer® (NorChip AS, Noruega, que permite la detección de ARNm de E6/E7 para HPV-16, HPV-18, HPV-31, HPV-33 y HPV-45), los sistemas de PCR/RT-PCR y la PCR en tiempo real descrita en Pretet et al. (J. Clin. Virol. 31:140-147, 2004) o en Monnier-Benoit et al. (J. Clin. Virol. 31:140-147, 2006). Los cebadores adecuados son conocidos por el experto en la materia o pueden sintetizarse fácilmente basándose en la secuencia de nucleótidos del papilomavirus detectado.

Tal como se utiliza en la presente memoria, una &quot;lesión asociada a papilomavirus&quot; se refiere a cualquier enfermedad

o condición causada por la infección por un papilomavirus. Esta expresión comprende lesiones premalignas, así como malignas. Entre los ejemplos representativos de lesiones premalignas se incluyen, aunque sin limitación, la neoplasia intraepitelial de grado bajo, moderado o alto que puede detectarse en diversos tejidos, tales como la CIN, la neoplasia intraepitelial vulvar (VIN) y la neoplasia intraepitelial (AIN), la neoplasia intraepitelial peneana (PIN) y la neoplasia intraepitelial vaginal (VaIN). Entre los ejemplos representativos de lesiones malignas se incluyen, aunque sin limitación, el carcinoma cervical, el carcinoma anal, el cáncer vaginal, el cáncer peneano y el cáncer oral. Las lesiones premalignas y malignas asociadas a papilomavirus pueden visualizarse mediante examen directo (por ejemplo mediante colposcopia, finalmente tras la aplicación de ácido acético) o diagnosticarse con métodos utilizados comúnmente por el médico clínico (por ejemplo el cribado por análisis citológico Papanicolau o la detección de células anormales de muestras citológicas). Por ejemplo, puede realizarse una biopsia local de regiones o lesiones acidófilas que se visualicen mediante colposcopia y examinarse para anormalidades morfológicas (por ejemplo hiperplasia epitelial, anormalidades nucleares marcadas, etc.). En el contexto de la invención, las lesiones asociadas papilomavirus no comprenden anormalidades leves tales como ASCUS (células escamosas atípicas de significado indeterminado).

Según una forma de realización preferida, el vector o partícula vírica infecciosa descrito en la presente memoria, o composición o combinación de los mismos se utiliza para tratar una infección persistente causada por como mínimo un papiloma, especialmente un HR-HPV, con especial preferencia por HPV-16, HPV-18, HPV-33 o HPV-52 o cualquier combinación de los mismos (por ejemplo tanto HPV-16 como HPV-18). En el contexto de la invención, los polipéptidos E2 codificados en el vector según la invención pueden originarse a partir del papilomavirus infeccioso o de un papilomavirus que reaccione cruzadamente con el papilomavirus infeccioso.

Debido a la conservación de las secuencias de aminoácidos en los polipéptidos E2 de diversos HR-HPV, podría esperarse reactividad cruzada entre HPV16 y HPV31, HPV33, HPV35, HPV52 y HPV58. En un aspecto, la presente invención utiliza un vector, partícula vírica infecciosa o composición según la invención tal como se describe en la presente memoria codificante de un polipéptido E2 originado a partir de HPV-16, para el tratamiento de pacientes que sufren una infección causada por como mínimo uno de entre HPV16, HPV31, HPV33, HPV35, HPV52 y HPV58.

De manera similar, puede esperarse una reactividad cruzada entre HPV-18 y HPV-39, HPV-45, HPV-51, HPV-56, HPV-59, HPV-68, HPV-70 y HPV-85. En otro aspecto, la presente invención utilzia una molécula de ácidos nucleicos, vector, partícula vírica infecciosa o composición codificante de un polipéptido E2 que se origina a partir de HPV-18, para el tratamiento de pacientes que sufren una infección causada por como mínimo uno de entre HPV-18, HPV-39, HPV-45, HPV-51, HPV-56, HPV-59, HPV-68, HPV-70 y HPV-85.

Tal como se utiliza en la presente memoria, una &quot;infección persistente por papilomavirus&quot; corresponde a la etapa asintomática de la infección por papilomavirus en un organismo huésped que no ha conseguido una erradicación vírica espontánea tras la exposición al papilomavirus. Se ha establecido una infección persistente por papilomavirus en el caso de que s detecte papilomavirus, o por lo menos uno de sus elementos (por ejemplo ácidos nucleicos, antígenos y similares) en el organismo huésped en 2 ensayos sucesivos separados por varios meses, por ejemplo por lo menos 6 meses, ventajosamente por lo menos 8 meses, preferentemente por lo menos 10 meses, y más preferentemente por lo menos 12 meses, mientras que no se observan indicios clínicos (por ejemplo lesiones premalignas y/o malignas asociadas a papilomavirus). La etapa asintomática se caracteriza por una citología normal (aunque se toleran anormalidades leves tales como ASCUS). Por ejemplo, se ha establecido una infección persistente por papilomavirus en pacientes que muestran un ensayo positivo de HCII a intervalos de aproximadamente 6 meses aunque presentan una citología Papanicolau normal.

En una forma de realización, el vector, partícula vírica infecciosa o composición anteriormente indicado se utiliza según las modalidades indicadas en la presente memoria para inducir o activar una respuesta inmunológica en el organismo huésped tratado en comparación con la no utilización de dichos agentes activos.

La respuesta inmunológica inducida o actividad puede ser específica y/o no específica, y puede ser humoral y/o mediada por células. Entre las respuestas humorales se incluyen la producción de anticuerpos contra por lo menos un polipéptido de papilomavirus, mientras que la respuesta celular incluye una respuesta de células T ayudantes y/o de CTL y/o la estimulación de la producción de citoquinas. Preferentemente, la respuesta inmunológica inducida o actividad resulta efectiva para proporcionar una respuesta antivírica contra por lo menos uno de los papilomavirus infecciosos.

La capacidad del vector, partícula vírica infecciosa o composición anteriormente indicado para inducir o activar una respuesta inmunológica en un organismo huésped tratado puede evaluarse in vitro o in vivo mediante una diversidad de ensayos que son estándares de la técnica (para una descripción general de las técnicas disponibles para evaluar la inducción y activación de una respuesta inmunológica, ver, por ejemplo, Coligan et al., 1992 y 1994, Current Protocols in Immunology, editado por J. Wiley &amp; Sons Inc., National Institute of Health). La medición de la inmunidad celular puede llevarse a cabo mediante la medición de perfiles de citoquinas secretadas por células efectoras activadas, incluyendo aquéllas derivadas de célula T CD4+ y CD8+ (por ejemplo la cuantificación de células productoras de IL-10 o de IFNy mediante ELIspot), mediante la determinación del estado de activación de las células efectoras inmunológicas (por ejemplo ensayos de proliferación de las células T mediante una incorporación clásica de [3H]timidina), mediante el ensayo para linfocitos T específicos de antígeno en un sujeto sensibilizado (por ejemplo la lisis específica de péptidos en un ensayo de citotoxocidad). La capacidad de estimular una respuesta celular también podría evaluarse, por ejemplo, en ratones singénicos (por ejemplo H2Db) o en ratones transgénicos (por ejemplo HLA A2 y HLA B7) mediante ELISPOT, técnicas analíticas basadas en tetrámeros u otras técnicas estándares para el análisis de la inmunidad mediada por células T. La respuesta humoral puede determinarse mediante ensayos de unión de anticuerpos y/o de competición (ver, por ejemplo, Harlow, Antibodies, Cold Spring Harbor Press, 1989). Por ejemplo, pueden desarrollarse herramientas inmunológicas, por ejemplo ELISA, para detectar anticuerpos anti-E2 en el organismo huésped tratado.

En otra forma de realización, el vector, partícula vírica infecciosa o composición anteriormente indicado se utiliza según las modalidades indicadas en la presente memoria, para proporcionar una respuesta antivírica contra por lo menos uno de los papilomavirus infecciosos en comparación con la no utilización de dichos agentes activos.

Tal como se utiliza en la presente memoria, una &quot;respuesta antivírica&quot; se refiere a una reducción o eliminación de síntomas habitualmente asociada a una infección por papilomavirus en el organismo tratado. Por ejemplo, puede determinarse una respuesta antivírica a partir de la capacidad del agente o agentes activos anteriormente indicados para controlar la infección vírica, reducir o eliminar por lo menos el papilomavirus infeccioso y/o de reducir o eliminar las células infectadas o aquéllas que expresan secuencias génicas de papilomavirus (especialmente los genes E6 y E7 potencialmente oncogénicos). Lo anterior puede evaluarse como una reducción significativa o la falta de un nivel detectable de marcadores indicados de infección por papilomavirus, por ejemplo papilomavirus, ácidos nucleicos víricos y/o antígenos víricos, en una muestra biológica recogida del organismo huésped bajo tratamiento, en comparación con la situación anterior a la utilización. La reducción o eliminación se indica comparando el nivel de dicho marcador o marcadores medidos en el punto temporal posterior al cese de la utilización según la invención, con el nivel del mismo marcador o marcadores medido antes de dicha utilización, que representa la infección no tratada. En una forma de realización preferida, la respuesta antivírica permite que no haya papilomavirus, ácidos nucleicos víricos y/o antígenos detectables medidos en una muestra biológica recogida del organismo huésped bajo tratamiento durante varios meses después de cesar la utilización según la invención.

También puede determinarse una respuesta antivírica a partir de la capacidad del agente o agentes activos anteriormente indicados de reducir significativamente la incidencia, el tamaño y/o la severidad de las lesiones que típicamente se desarrollan en los organismos infectados por papilomavirus. Tal como se utiliza en la presente memoria, &quot;reducir&quot; se refiere a prevenir, retrasar, alterar, lentificar, retardar y/o posponer el desarrollo de la incidencia, el tamaño y/o la severidad de las lesiones asociadas a papilomavirus tal como se define en la presente memoria. La capacidad del agente activo anteriormente activo de reducir la incidencia, el tamaño y/o la severidad de las lesiones asociadas a papilomavirus puede evaluarse mediante un seguimiento periódico del organismo huésped tratado. Preferentemente, la reducción es suficiente para que el organismo huésped tratado no desarrolle ninguna lesión asociada a papilomavirus (por ejemplo lesiones CIN confirmadas histológicamente) durante por lo menos un año, ventajosamente durante por lo menos 2 años, preferentemente durante por lo menos 3 años, y más preferentemente durante por lo menos 5 años, tras completar la utilización según la invención. Más preferentemente, la utilización según la invención permite retrasar o eliminar la necesidad de un procedimiento ablativo (por ejemplo la conización) en el organismo huésped tratado.

A modo de indicación general, el periodo de tiempo que separa la última administración del agente activo en el organismo huésped y la detección de la respuesta antivírica puede variar dependiendo de la historia de la infección por papilomavirus, las modalidades de utilización y/o el organismo huésped bajo tratamiento. Preferentemente, es una cuestión de tres meses a varios años, con especial preferentemente durante por lo menos 3 meses, ventajosamente por lo menos 4 meses, preferentemente por lo menos 5 meses, preferentemente por lo menos 6 meses, y más preferentemente por lo menos un año. Por ejemplo, se determina una respuesta antivírica en el caso de que se detecte que el organismo huésped que era positivo antes del tratamiento para ADN del HPV detectado en una muestra cervical, por ejemplo, mediante Digen HC-II, es negativo para el mismo papilomavirus por lo menos 6 meses después de la última administración del agente activo anteriormente indicado.

En una forma de realización, la utilización según la presente invención puede llevarse a cabo conjuntamente con una

o más modalidades terapéuticas convencionales. Una multiplicidad de enfoques terapéuticos proporcionan al organismo huésped una intervención de base más amplia. La administración de los mismos puede ser anterior, concomitante o posterior a la administración del vector, partícula vírica infecciosa o composición utilizado en la invención.

En otra forma de realización, la utilización según la invención puede llevarse a cabo según una modalidad terapéutica de primera dosis-refuerzo que comprende la administración secuencial de uno o más dosis iniciales y uno o más refuerzos. Típicamente, la primera dosis y la dosis de refuerzo utilizando vehículos diferentes que comprenden o codifican por lo menos un dominio inmunogénico común. La dosis inicial se administra inicialmente en el organismo huésped y la dosis de refuerzo se administra posteriormente el en mismo organismo huésped tras un periodo variable de entre un día y doce meses. La utilización según la invención puede comprender una a diez administraciones secuenciales de la dosis inicial seguido de una a diez administraciones secuenciales de la dosis de refuerzo. Además, la dosis inicial y la dosis de refuerzo pueden administrarse en el mismo sitio o en sitios alternativos por la misma vía o por vías de administración diferentes, por ejemplo la inyección subcutánea de un vector de MVA, la inyección intramuscular para un plásmido de ADN y para un vector adenovírico.

En el contexto de la invención, el vector, partícula vírica infecciosa o composición anteriormente indicados pueden utilizarse para iniciar o reforzar o tanto iniciar como reforzar una repuesta inmunológica anti-papilomavirus. Por ejemplo, el vector o partículas de adenovirus tal como se ha definido anteriormente pueden utilizarse como dosis inicial y vector o partículas de MVA tal como se ha definido anteriormente como refuerzo, o viceversa. También resulta posible utilizar el vector, partícula vírica infecciosa o composición anteriormente indicado en combinación con cualquier material de la técnica anterior codificante o que comprende un dominio antigénico en común con la composición de la invención. La fuente de dicho material es amplia e incluye, aunque sin limitación, péptidos, proteínas (por ejemplo un polipéptido E2 producido recombinantemente), vectores víricos, ADN plasmídico, partículas proteicas tales como partículas de tipo vírico, materiales celulares tales como células irradiadas, etc.

La invención se ha descrito a título ilustrativo, y debe interpretarse que la terminología que se ha utilizado pretende utilizarse a título descriptivo y no limitativo. Evidentemente podrán introducirse muchas modificaciones y variaciones en la presente invención a partir de las enseñanzas proporcionadas anteriormente. Por lo tanto, debe interpretarse que, dentro del alcance según las reivindicaciones adjuntas, la invención puede ponerse en práctica de un modo diferente del descrito concretamente en la presente memoria.

Leyendas de las figuras

La figura 1 ilustra una representación esquemática del plásmido pTG17408 codificante de u polipéptido E2 de HPV16 defectuoso y presentado sobre membrana.

La figura 2 ilustra una representación esquemática del plásmido pTG17409 codificante de un polipéptido E1 de HPV16 defectuoso para replicación y presentando en membrana, la secuencia de nucleótidos del cual se ha degenerado en la parte de 59 nucleótidos común a la secuencia codificante de E2 de HPV-16.

La figura 3 ilustra la respuesta de Th1 de IFNy específica de E2 detectada mediante ELISPOT en ratones que han recibido una inyección de MVATG17408 (MVA-E2) o de MVA-N33 de control negativo.

Los ejemplos siguientes se proporcionan a título ilustrativo de la presente invención.

Ejemplos

Los constructos indicados a continuación se prepararon según las técnicas generales de ingeniería genética y de clonación molecular detalladas en Maniatis et al. (Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY, 1989) o según las recomendaciones del fabricante al utilizar un kit comercial. Las técnicas de amplificación por PCR son conocidas por el experto en la materia (ver, por ejemplo, PCR protocols - A guide to methods and applications, publicado por Innis, Gelfand, Sninsky y White, Academic Press, 1990). Los plásmidos recombinantes que portaban el gen de resistencia a la ampicilina se replicaron en E. coli C600 (Stratagene), BJ5183 (Hanahan, J. Mol. Biol. 166:557-580, 1983) y NM522 en agar o medio líquido suplementado con 100 μg/ml de antibiótico. La cepa BJ5183 preferentemente se utiliza en el caso de que la clonación se lleve a cabo mediante recombinación homóloga (Bubek et al., Nucleic Acids Res. 21:3601-3602, 1993).

Los constructos de los virus Vaccinia recombinantes se preparan según tecnología convencional en el campo, descrita en los documentos indicados anteriormente y en Mackett et al. (Proc. Natl. ACad. Sci. USA 79:7415-7419, 1982) y en Mackett et al. (J. Virol. 49:857-864, 1984). El gen de selección gpt (xantina guanina fosforribosiltransferasa) de E. coli (Falkner y Moss, J. Virol. 62:1849-1854, 1988) se utiliza para facilitar la selección de los virus Vaccinia recombinantes.

Ejemplo 1: Construcción de un vector MVA recombinante que expresa el gen E2 de HPV-16

Clonación del gen E2 de HPV16

Las secuencias de nucleótidos codificantes de E2 de HPV16 se clonaron a partir del ADN genómico aislado de células CaSki (ATCC nº CRL-1550). El gen E2 se amplificó utilizando los cebadores OTG16809 (SEC ID nº 9) y OTG16810 (SEC ID nº 10). El fragmento resultante se digirió con BamHI y EcoRI y se insertó en pGEX2T (Amersham Biosciences) cortado con los mismos enzimas, dando lugar a pTG172329. La secuenciación del gen E2 clonado mostró cinco mutaciones en comparación con la secuencia del prototipo E2 de HPV16 (descrito en GenBank nº NC-01526). Dos mutaciones eran silenciosas y las tres mutaciones no silenciosas (T210I, S219P y K310T) se corrigieron utilizando el kit de mutagénesis sitio-dirigida QuikChange (Stratagene), dando lugar a pTG17268.

Modificación del polipéptido E2 de HPV-16

Las secuencias de nucleótidos de E2 incorporadas en pTG17268 se modificaron mediante mutagénesis sitio-dirigida con el fin de generar una variante de E2 de HPV-16 (E39A y 173A) denominada E2*. Más concretamente, se anuló la función de replicación de E2 mediante la sustitución del residuo Glu en posición 39 con una Ala y la función de transactivación mediante la sustitución del residuo Ile en posición 73 por una Ala. El plásmido resultante pTG17318 comprende las secuencias modificadas codificantes de E2* de HPV-16.

Se modificó adicionalmente E2* de HPV-16 mediante fusión en su extremo N-terminal con un péptido de señal y en su extremo C-terminal con secuencias de anclaje a membrana derivadas de la glucoproteína del aislado de virus de la rabia (GenBank nº ay009097), de manera que se dirigiese la presentación de E2* de HPV-16 en las células huésped expresantes a la superficie de la membrana plasmática. Las secuencias de nucleótidos (SEC ID nº 8) codificantes de la variante defectuosa de E2 presentada en membrana denominada SS-E2*-TMR se reensamblaron mediante triple PCR utilizando los cebadores siguientes: OTG17500 (SEC ID nº 11), OTG17501 (SEC ID nº 12), OTG17502 (SEC ID nº 13), OTG17503 (SEC ID nº 14), OTG17504 (SEC ID nº 15) y OTG17505 (SEC ID nº 16). La secuencia reensamblada se insertó en un vector derivado de pBS (Stratagene), proporcionando pTG17360, y después se clonó en un plásmido de transferencia Vaccinia cadena abajo del promotor de pH5R (Rosel et al., J. Virol. 60:436-449, 1986), resultando en pTG17408 (figura 1).

El plásmido de transferencia se diseñó para permitir la inserción de la secuencia de nucleótidos que debía transferirse mediante recombinación homóloga en la deleción III del genoma de MVA. Se origina a partir del plásmido pTG1E (descrito en Braun et al., Gene Ther. 7:1447-1467, 2000), en el que se clonaron las secuencias flanqueantes (BRG3 y BRD3) circundantes a la deleción III del MVA, las secuencias del cual se obtuvieron mediante PCR a partir del ADN de MVATGN33.1 (Sutter y Moss, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10847-10851, 1992). El plásmido de transferencia también contenía una fusión entre la proteína fluorescente verde incrementada de Aequorea victoria (gen eGFP, aislado a partir de pEGP-C1, Clontech) y el gen xantina-guanina fosforibosiltransferasa de Escherichia coli (gen gpt) bajo el control del promotor sintético temprano-tardío del virus Vaccinia p11K7.5 (cortesía de R. Wittek, Universidad de Lausanne). La síntesis de xantina-guanina fosforibosiltransferasa permite que el MVA recombinante GPT+ forme placas en un medio selectivo que contiene ácido micofenólico, xantina e hipoxantina (Falkner et al., J. Virol. 62:1849-1854, 1988) y eGFP permite la visualización de las placas de MVA recombinantes. El marcador de selección eGPP-GPT se sitúa entre dos secuencias homólogas en la misma orientación. Tras conseguir la selección clonal, el marcador de selección se elimina fácilmente mediante varios pases sin selección, permitiendo el crecimiento de MVA recombinante eGPP-GPT.

Construcción de un MVA recombinante que expresa el gen SS-E2*-TMR de HPV-16

La generación del virus MVATG17408 se llevó a cabo mediante recombinación homóloga en fibroblastos embrionarios de pollo primarios (CEF) infectados con MVATGN33.1 (a una MOI de 0,1 pfu/célula) y se transfectó con pTG17408 (según la precipitación estándar del ADN con fosfato cálcico). Se llevó a cabo la selección vírica mediante purificación de placas en tres rondas en presencia de un medio selectivo que contenía ácido micofenólico, xantina e hipoxantina. Tal como se ha indicado anteriormente, seguidamente se eliminó el marcador de selección mediante pase en un medio no selectivo. La ausencia de contaminación por MVA parental se verificó mediante PCR.

El análisis de la expresión de E2 se llevó a cabo mediante transferencia western. Los CEF se infectaron a una MOI de 0,2 con MVATG17408 y tras 24 horas, se recolectaron las células. El análisis de transferencia western se llevó a cabo utilizando anticuerpo monoclonal anti-E2 comercial TVG271 (Abcam). Se detectó la expresión de una proteína con un peso molecular aparente de 55 kDa, mientras que el peso molecular teórico de E2*-TMR era de 48,9 kDa. Tras el tratamiento de los extractos celulares con endoglucosidasa F, se observó una reducción del tamaño de la proteína recombinante, sugiriendo que E2*-TMR se encontraba modificado mediante N-glucosilación.

Ejemplo 2: Construcción de un MVA recombinante que expresa el gen E1 de HPV-16

Las secuencias de nucleótidos codificantes del polipéptido E1 de HPV16 se clonó a partir de ADN de células CaSki (ATCC nº CRL-1550). Más concretamente, el gen E1 se amplificó en dos partes Ela (nt1 a 1.102) y EIb (nt 1.001 a 1.950). Se utilizaron los cebadores OTG16811 (SEC ID nº 17) y OTG16814 (SEC ID nº 18) para amplificar el fragmento E1a, que se digirió con BamHI y EcoRI y se insertó en pGEX2T cortado con los mismos enzimas, dando lugar a pTG17240. Se generó el fragmento EIb utilizando OTG16813 (SEC ID nº 19) y OTG16812 (SEC ID nº 20) y se digirió con BamHI y EcoRI antes de insertarlo en pGEX2T, resultando en pTG17241. La secuenciación mostró 4 mutaciones en comparación con la secuencia del prototipo E1 de HPV-16 (descrito en GenBank nº NC-01526). Una mutación era silenciosa y las tres mutaciones no silenciosas presentes en Ela (K130Q, N185T y T220S) se corrigieron mediante mutagénesis sitio-dirigida. A continuación, el gen E1 completo se reensambló mediante clonación del fragmento EIa corregido en pTG17241, digerido con BsrGI y EcoRI. El plásmido resultante se denominó pTG17289.

En el genoma de HPV-16, los 59 últimos nucleótidos del gen E1 son idénticos a los 59 primeros nucleótidos del gen E2. La presencia de estas secuencias homólogas pueden generar sucesos de recombinación homóloga y de esta manera, inestabilidad durante las etapas de producción de un vector MVA codificante de E1 y E2. Por lo tanto, dicha parte de las secuencias codificantes de E1 se modificó mediante degeneración del uso de codones de manera que se reduzca la homología de secuencias con la secuencia codificante de E2. La secuencia degenerada se obtuvo mediante amplificación del extremo 3' del gen E1 utilizando los cebadores degenerados OTG17408 (SEC ID nº 21) y OTG17409 (SEC ID nº 22). El fragmento amplificado se digirió con NsiI y BglII y se insertó en pTG17289 cortado con los mismos enzimas, dando lugar a pTG17340.

Las secuencias de E1 degeneradas de HPV-16 también se mutaron mediante mutagénesis sitio-dirigida con el fin de anular la función de replicación del polipéptido E1 codificado, mediante la sustitución del residuo Gly en posición 482 del E1 de HPV-16 con un residuo Asp (G482D, también denominado en la presente memoria E1*), resultando en pTG17373.

Las secuencias Eldeg* de HPV-16 también se modificaron de manera que dirigiese la expresión del polipéptido codificado a la superficie de la célula plasmática mediante fusión con el péptido de señal y las secuencias de anclaje a membrana derivadas de la glucoproteína del aislado del virus de la rabia (descrito en GenBank nº M38452). Se reconstituyó la secuencia de SS-EIdeg*-TMR mediante triple PCR utilizando los cebadores siguientes: OTG17560 (SEC ID nº 23), OTG17561 (SEC ID nº 24), OTG17562 (SEC ID nº 25), OTG17563 (SEC ID nº 26), OTG17564 (SEC ID nº 27) y OTG17565 (SEC ID nº 28). La secuencia resultante (SEC ID nº 7) se insertó en un vector derivado de pBS (Stratagene), proporcionando pTG17404. A continuación, se clonó la secuencia de SS-EIdeg*-TMR en el plásmido de transferencia tal como se describe en el Ejemplo 1, cadena abajo del promotor p7.5K (Cochran et al., J. Virol. 54:30-37, 1985), dando lugar a pTG17409 (figura 2).

La generación de los virus MVATG17409 se llevó a cabo en CEF mediante recombinación homóloga tal como se describe en el Ejemplo 1.

Ejemplo 3: Construcción de un MVA recombinante que expresa los genes E1 y E2 de HPV-16

El SS-EIdeg*-TMR secuenciado controlado por el promotor p7.5K se aisló a partir de pTG17409 y se insertó en pTG17408, dando lugar a pTG17410.

La generación de los virus MVATG17410 se llevó a cabo en CEF mediante recombinación homóloga tal como se describe en el ejemplo 1.

Ejemplo 4: Construcción de un MVA recombinante que expresa los genes E1, E2, E6 y E7 de HPV-16

Se aisló el gen E7 de HPV-16 y se modificó tal como se describe en el documento WO 99/03885 para codificar un polipéptido E7 no oncogénico y dirigido a membrana, que se ilustra en SEC ID nº 5. La mutación no oncogénica se llevó a cabo mediante deleción de los residuos aminoácidos 21 a 26 (DLYCYE) y direccionamiento a membrana mediante la fusión al péptido de señal y secuencias de anclaje a membrana de la glucoproteína del virus de la rabia. La secuencia resultante se clonó bajo el control del promotor temprano-tardío pH5R. A continuación, se introdujo el casete de expresión en pTG17410, generando pTG17482.

Se aisló el gen E6 de HPV-16 y se modificó tal como se describe en el documento WO 99/03885 para codificar un polipéptido E6 no oncogénico y direccionado a membrana, que se ilustra en SEC ID nº 4. Se llevó a cabo una mutación no oncogénica mediante deleción de los residuos aminoácidos 118 a 122 (CPEEK) y direccionamiento a membrana mediante fusión al péptido de señal y secuencias de anclaje a membrana de la proteína F del virus del sarampión. La secuencia resultante se clonó bajo el control del promotor p7.5K. A continuación, se introdujo el casete de expresión en pTG17482, generando pTG17483.

La generación de NWATG174783 se llevó a cabo tal como se describe en el Ejemplo 1.

Ejemplo 5: Evaluación de la respuesta de Th1 específica de E2 de HPV-16 en ratones

Se evaluó la respuesta de Th1 específica de E2 de HPV-16 mediante ELISPOT en ratones inyectados con MVATG17408 (MVA-E2). Se seleccionaron péptidos del MHC de clase I restringidos a HLA-A0201 humanos y restringidos a H2b, específicos de genotipo, predichos por SYFPEITHI y BIMAS, para analizar las células productoras de IFNy en respuesta a E2. Se muestran estos péptidos en la tabla I a continuación.

posición

secuencia nombre Puntuación SYFPEITHI Puntuación BIMAS

E2-HPV16/ H2-Db

129 MHYTNWTHI M9I 24 67

280

NCNSNTTPI N9I 23 117

51

FKHINHQVV F9V 19 <10

71

QAIELQLTL Q9L 19 30

348

SQVKIPKTI S9I 19 39

E2-HPV16/ HLA-A0201

138 YICEEASVTV Y9V 26 <10

69

ALQAIELQL A9L 20 21

7

RLNVCQDKIL R10L 20 <10

93

TLQDVSLEV T9V 19 285

E2-HPV18/ H2-Db

166 KEGYNTFYI K9I 24 < 10

40

IRWENAIFF I9F 22 <10

281

LCSGNTTPI L9I 22 84

344

TKFLNTVAI T9I 22 58

196

NVIDCNDSM N9M 15 61

Se inmunizaron los ratones C57B1/6 hembra por vía subcutánea 3 veces (los días 0, 7 y 14) con 5x107 pfu de MVATGN33 (control negativo) o MVATG17408 (MVA-E2). Se extirparon los bazos el día 21 tras la primera inmunización y se realizó una ELISPOT de IFNy utilizando los péptidos anteriormente indicados a una concentración

5 de 5 μg/ml. Se llevó a cabo ELISPOT utilizando el kit ELISPO PLUS IFNy Mabtech AB de ratón (Mabtech, Francia) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se realizó un recuento de las manchas utilizando el lector Elispot Bioreader 4000 Pro-X (BIOSYS-GmbH; Serlabo, Francia). Se obtuvieron resultados tras la substracción del fondo irrelevante de péptidos.

10 Tal como se ilustra en la figura 3, los cuatro péptidos presentaban un número significativo de esplenocitos productores de IFNy, en comparación con la respuesta de fondo medida en animales vacunados con MVA-N33. Todos dichos péptidos eran específicos de HPV16. Se definieron F9V y N9I en el contexto de H2-Db de ratón, y se definió A9L y T9V en el contexto de HLA-A201 humano. Debe indicarse que se ha descrito que el péptido A9L induce una respuesta específica de CTL (Konya et al., J. Gen. Virol. 78:2615-20, 1997).

15 En conclusión, tal como se demuestra mediante ELISPOT, la inyección subcutánea de MVATG17408 induce una respuesta de células T contra HPV16 en los ratones vacunados.

Ejemplo 6: Construcción de un vector MVA recombinante que expresa genes E1 y E2 de HPV-18 20 (MVATG17582)

Se reconstituyeron los genes E1 y E2 de HPV-18 como genes sintéticos y se diseñaron los oligonucleótidos para reducir la homología a un nivel inferior a 75% entre la porción de 59 nucleótidos presentes tanto en el extremo 3' de la secuencia de E1 de HPV-18 nativa y en el extremo 5' de la secuencia de E2 de HPV-18 y para introducir las

25 mutaciones que anulan las funciones enzimáticas del producto génico E1 y E2 de HPV-18 (EI: G489D; E2: E43A y 177A). También se diseñó la secuencia de E1 de HPV-18 sintético para reducir el porcentaje de homología entre las partes homólogas compartidas por las secuencias nativas de HPV-16 y HPV-18 hasta un nivel inferior a 75%. Con este fin, las secuencias de nucleótidos de los genes E1 y E2 de HPV-16 y HPV-18 se alinearon y se diseñaron los oligonucleótidos para reducir la homología a menos de 6 nucleótidos consecutivos.

30 Se reconstituyó la secuencia de degE1* de HPV-18 mediante ensamblaje de 50 oligonucleótidos y se clonó en un vector pBS, dando lugar a pTG17473. A continuación, se fusionó la secuencia de E1 a la secuencia de nucleótidos codificante de los péptidos de señalización procedentes de la proteína F del virus del sarampión (SS-18E1deg*-TMF) mediante una triple PCR utilizando los cebadores OTG15315 (SEC ID nº 39), OTG17881 (SEC ID nº 40),

35 OTG17882 (SEC ID nº 41), OTG17883 (SEC ID nº 42), OTG17884 (SEC ID nº 43) y OTG17885 (SEC ID nº 44). El fragmento resultante (SEC ID nº 38) codificante del polipéptido SS18degE1*-TMF se clonó en un vector de transferencia MVA bajo el control del promotor p7.5K, generando pTG17521.

La secuencia de degE2* de HPV-18 se reconstituyó mediante el ensamblaje de 26 oligonucleótidos y se clonó en un

40 vector pBS, dando lugar a pTG17498. La fusión con los péptidos de señal y de anclaje a membrana de la glucoproteína del virus de la rabia (cepa ERA, GenBank nº M38452) se llevó a cabo mediante PCR triple utilizando los cebadores OTG17875 (SEC ID nº 45), OTG17876 (SEC ID nº 46), OTG17877 (SEC ID nº 47), OTG17878 (SEC ID nº 48), OTG17879 (SEC ID nº 49) y OTG17880 (SEC ID nº 50). El fragmento resultante (SEC ID nº 33) codificante de los polipéptidos SS-18E2*-TMR se insertó en el plásmido de transferencia MVA cadena abajo del

45 promotor pH5R, dando lugar a pTG17552. Finalmente, se aisló el casete p7.5K-SS-EIdeg*-TMF a partir de pTG17521 y se insertó en pTG17552, dando lugar a pTG17582.

Se llevó a cabo la generación de MVATG17521, MVATG17552 y MVATG17582 recombinantes tal como se ha descrito anteriormente. Tras la infección de las células cultivadas, se confirmó la expresión del polipéptido E1 de 50 HPV-18 de los constructos de MVA mediante transferencia western utilizando sueros obtenidos de conejos

inmunizados.

Ejemplo 7: Construcción de un vector MVA recombinante multivalente que expresaba genes E1 y E2 de HPV16 y HPV-18 (MVATG17583)

El casete p7.5K-SS-18EIdeg*-TMF y el casete pH5R-SS-18E2*-TMR se introdujeron en pTG17410 (que contenía el casete p7.5K-SS-16EIdeg*-TMR y pH5R-SS-16E2*-TMR) y el plásmido de transferencia resultante se denominó pTG17583. La generación de MVATG17583 se llevó a cabo tal como se ha descrito anteriormente. Tras la infección con MVA TG17583 de las células cultivadas, la expresión de los polipéptidos E1 de HPV-16, E2 de HPV-16 y E1 de HPV-18 se confirmó mediante transferencia western utilizando sueros obtenidos a partir de conejos inmunizados.

Ejemplo 8: Construcción de un vector MVA recombinante que expresa el gen E2 de HPV-33

Un gen sintético codificante del polipéptido E2 de HPV-33 fue sintetizado por Geneart (Regensburg, Alemania). Se diseñó la secuencia sintética con el fin de: (i) reducir el porcentaje de homología a un nivel inferior a 75% respecto a los genes E2 de HPV-16, HPV-18 y HPV-52 (si resulta posible, se reducen las porciones homólogas a menos de 6 nucleótidos consecutivos), e (ii) introducir las mutaciones que anulan las funciones enzimáticas del producto génico de HPV-33 (E39A e I73A).

A continuación, se fusionó la secuencia de degE2* de HPV-33 con la secuencia de nucleótidos codificante de los péptidos de señal y de anclaje a membrana de la glucoproteína del virus de la rabia (cepa ERA, GenBank nº M38452). Lo anterior se llevó a cabo mediante triple PCR utilizando los cebadores OTG18962 (SEC ID nº 51), OTG18963 (SEC ID nº 52), OTG18964 (SEC ID nº 53), OTG18965 (SEC ID nº 54), OTG18966 (SEC ID nº 55) y OTG18967 (SEC ID nº 56). El fragmento resultante (SEC ID nº 35) codificante del polipéptido SS-33degE2*-TMR se clonó en un vector de transferencia MVA bajo el control del promotor p7.5K, y se generaron partículas víricas tal como se ha descrito anteriormente.

Ejemplo 9: Construcción de un vector MVA recombinante que expresa el gen E2 de HPV-52

Un gen sintético codificante del polipéptido E2 de HPV-52 fue sintetizado por Geneart (Regensburg, Alemania). Se diseñó la secuencia sintética con el fin de: (i) reducir el porcentaje de homología hasta un nivel inferior a 75% con genes E2 de HPV-16, HPV-18 y HPV-33 (las porciones homólogas se redujeron preferentemente a menos de 6 nucleótidos consecutivos), e (ii) introducir las mutaciones que anulan las funciones enzimáticas del producto génico de HPV-52 (E39A e I73A).

A continuación, se fusionó la secuencia sintética de E2*deg de HPV-52 con las secuencias de nucleótidos codificantes de los péptidos de señal y de anclaje de membrana de la proteína F del virus del sarampión (proporcionando SS-52E2*deg-TMF) mediante una triple PCR utilizando los cebadores OTG18968 (SEC ID nº 57), OTG18969 (SEC ID nº 58), OTG18970 (SEC ID nº 59), OTG18971 (SEC ID nº 60), OTG18972 (SEC ID nº 61) y OTG18973 (SEC ID nº 62).

El fragmento resultante (SEC ID nº 37) codificante del polipéptido SS-52E2*deg-TMF se insertó en un plásmido de transferencia MVA cadena abajo del promotor p7.5K y se generaron partículas víricas tal como se ha indicado anteriormente.

Ejemplo 10: Construcción de un vector MVA recombinante multivalente que expresaba el gen E2 de HPV-16, HPV-18, HPV-33 y HPV-52

El casete pH5R-SS-18E2*-TMR codificante del polipéptido E2 de HPV-18 presentado en membrana y enzimáticamente defectuoso (aislado a partir de pTG17552), el casete p7.5K-SS-33degE2*-TMR codificante del polipéptido E2 de HPV-33 presentado en membrana y enzimáticamente defectuoso y el casete p7.5K-SS-52degE2*-TMF codificante del polipéptido E2 de HPV presentado en membrana y enzimáticamente defectuoso se introdujeron en pTG17408 (que contenía el casete pH5R-SS-16E2*-TMR) y se generaron partículas víricas tal como se ha descrito anteriormente.

Ejemplo 11: Modelo animal para la evaluación de la eficacia terapéutica de los constructos recombinantes de MVA

El modelo de CRPV es el único modelo de laboratorio en el que los papilomas inducidos víricamente persisten a pesar de la inmunocompetencia y evolucionan bajo presión selectiva del huésped en carcinomas de células escamosas invasivos y metastásicos (Brandsma, Intervirology 37:189-190, 1994, y Brandsma, Animal models for human papillomavirus vaccine development, páginas 69 a 78, 1996, en: C. Lacey (editor), Papillomavirus reviews: current research on papillomaviruses, Leeds University Press, Leeds, Reino Unido). El MVA que expresa E2 pudo someterse a ensayo en este modelo con el fin de evaluar su eficacia terapéutica con respecto al papilomavirus persistente. Sin embargo, debido a la falta de protección cruzada entre los antígenos de HPV y de CRPV, se generaron constructos de MVA recombinantes específicos de CRPV con los antígenos de CRPV (dados a conocer

en GenBank bajo el número de acceso NC_001541) sustituyendo sus contrapartidas de HPV-16. Más concretamente, se construyeron los MVA recombinantes siguientes: MVATG17535 que comprende insertado en la deleción III el casete de expresión que comprende la secuencia de nucleótidos codificante del polipéptido E2 de CRPV (secuencia de referencia) fusionado con los péptidos de señal y de anclaje de membrana de la glucoproteína 5 F del virus del sarampión (SR-CRPVE2-TMF) situado bajo el control del promotor pH5R; MVATG17534 que comprende insertado en la deleción III el casete de expresión que comprende la secuencia de nucleótidos codificante del polipéptido E1 de CRPV (secuencia de referencia) fusionado con los péptidos de señal y de anclaje a membrana de la glucoproteína del virus de la rabia (SR-CRPVE1-TMR) situado bajo el control del promotor p7.5K, y MVATG17562 que comprende insertado en la deleción III los casetes de expresión E2 de CRPV (pH5R-SR

10 CRPVE2-TMF) y E1 de CRPV (p7.5K-SR-CRPVE1-TMR).

Se inocularon conejos hembra blancos New Zealand con ADN de CRPV el día 1 utilizando la transferencia de ADN mediada por partículas con el sistema de pistola génica Helios (Biorad). Se recubrieron partículas de oro de 1,6 μm con ADN vírico tal como indica el fabricante y se administraron a razón de 0,1 μg por sitio en tres sitios y de 0,5 μg

15 por sitio en tres otros sitios en el lomo del conejo. Los días 2, 9 y 16, se inyectó MVA recombinante de CRPV por vía intradérmica en el lomo del conejo. Se realizó un seguimiento del desarrollo de verrugas semanalmente durante 8 a 12 semanas.

Al final del experimento, se sacrificaron los conejos y los sitios epidérmicos en los que se había inyectado ADN de

20 CRPV y que no presentaban papilomas se extirparon y se congelaron. Se extrajeron los ADN y se sometió a ensayo la presencia de ADN de CRPV mediante análisis de PCR para determinar si la vacunación con MVA había inducido la eliminación vírica.

Listado de secuencias

<110> TRANSGENE S.A. BAUDIN Martine

5 BALLOUL Jean-Marc SILVESTRE Nathalie

<120> Vacuna de papilomavirus 10 <130> TG182 EXT

<150> EP07360004.1

<151> 2007-01-30 15 <150> EP07360018.1

<151> 2007-05-15

<160> 62 20 <170> PatentIn versión 3.3

<210> 1

<211> 365

<212> PRT 25 <213> Papilomavirus humano de tipo 16

<400> 1 <210> 2

<211> 453 5 <212> PRT

<213> secuencia artificial

<220>

<223> variante de E2 de HPV-16 defectuosa y presentada en membrana 10

<400> 2

<210> 3

<211> 737

<212> PRT 5 <213> secuencia artificial

<220>

<223> variante de E1 de HPV-16 defectuosa en la replicación y presentada en la membrana

10 <400> 3

<210> 4 5 <211> 243

<212> PRT

<213> secuencia artificial

<220> 10 <223> variante de E6 de HPV-16 no oncogénica y presentada en la membrana

<400> 4

<210> 5

<211> 185

<212> PRT

<213> secuencia artificial

<220>

<223> variante de E7 de HPV-16 no oncogénica y presentada en la membrana

<400> 5

<210> 6

<211> 59

<212> ADN

<213> secuencia artificial 15

<220>

<223> Porción de 59 nucleótidos de la secuencia codificante de E1 de HPV-16 degenerada para disminuir la homología con la secuencia codificante de E2 de HPV-16 de solapamiento

20 <400> 6

atggtgattc attacctaca ttcaagtgcg tatctggtca gaacacaaat actttgtga 59

<210> 7 25 <211> 2214

<212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

30 <223> secuencia que codifica un polipéptido E1 de HPV-16 defectuoso y dirigido a la membrana que comprende la secuencia degenerada de 59 nucleótidos

<400> 7 <210> 8

<211> 1362 5 <212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<223> secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido E2 de HPV-16 defectuoso y dirigido a la membrana 10

<400> 8

15

<210> 9 <211> 34 <212> ADN <213> secuencia artificial

20

<220> <223> cebador sentido

<400> 9

25

aaacccggat ccatggagac tctttgccaa cgtt 34

30

<210> 10 <211> 49 <212> ADN <213> secuencia artificial

<220> <223> cebador antisentido

<400> 10

aaacccgaat tcaagcttag atcttcatat agacataaat ccagtagac

49

<210> 11 <211> 33 <212> ADN <213> secuencia artificial

<220> <223> cebador sentido

<400> 11

aaacccggat ccatggtacc acaagcgctg tta

33

<210> 12 <211> 53 <212> ADN <213> secuencia artificial

<220> <223> cebador sentido

<400> 12

tctctttatg ttttggaaaa ttcccaatag agactctttg ccaacgttta aat

53

<210> 13 <211> 53 <212> ADN <213> secuencia artificial

<220> <223> cebador antisentido

<400> 13

atttaaacgt tggcaaagag tctctattgg gaattttcca aaacataaag aga

53

<210> 14 <211> 49 <212> ADN <213> secuencia artificial

<220> <223> cebador sentido

<400> 14

cagtgtctac tggatttatg tctatatatg ttcttctctc tgctggaac

49

<210> 15 <211> 49 <212> ADN <213> secuencia artificial

<220> <223> cebador antisentido

<400> 15

gttccagcag agagaagaac atatatagac ataaatccag tagacactg

49

<210> 16 <211> 44 <212> ADN <213> secuencia artificial

<220> <223> cebador sentido

<400> 16

aaacccagat cttcaaagac gtgtttcgcc tccactctta tgag

44

<210> 17 <211> 34 <212> ADN <213> secuencia artificial

<220> <223> cebador sentido

<400> 17

aaacccggat ccatggctga tcctgcaggt acca

34

<210> 18 <211> 34 <212> ADN <213> secuencia artificial

<220> <223> cebador antisentido

<400> 18

aaacccgaat tccattatcg taggcccatt gtac

34

<210> 19 <211> 32 <212> ADN <213> secuencia artificial

<220> <223> cebador sentido

<400> 19

aaacccggat ccgagacacg ccagaatgga ta

32

<210> 20 <211> 50 <212> ADN <213> secuencia artificial

<220> <223> cebador antisentido

<400> 20

aaacccgaat tcaagcttag atcttcataa tgtgttagta ttttgtcctg

50

<210> 21 <211> 88 <212> ADN <213> secuencia artificial

<220>

<223> cebador antisentido

<400> 21

<210> 22 <211> 21 <212> ADN <213> secuencia artificial

<220> <223> cebador sentido

<400> 22

gatgctacag tgccctgttg g

21

<210> 23 <211> 35 <212> ADN <213> secuencia artificial

<220> <223> cebador sentido

<400> 23

aaacccaagg atccatggta ccgcaagccc tgcta

35

<210> 24 <211> 52 <212> ADN <213> secuencia artificial

<220> <223> cebador sentido

<400> 24

ttcccctctg tttcggtaag tttcctatag ctgatcctgc aggtaccaat gg

52

<210> 25 <211> 52 <212> ADN <213> secuencia artificial

<220> <223> anticebador sentido

<400> 25

ccattggtac ctgcaggatc agctatagga aacttaccga aacagagggg aa

52

<210> 26 <211> 50 <212> ADN <213> secuencia artificial

<220> <223> cebador sentido

<400> 26

tatctggtca gaacacaaat actttgtacg tactgctatc ggcaggcacg

50

<210> 27 <211> 50 <212> ADN <213> secuencia artificial

<220> <223> cebador antisentido

<400> 27

cgtgcctgcc gatagcagta cgtacaaagt atttgtgttc tgaccagata

50

<210> 28 <211> 42 <212> ADN <213> secuencia artificial

<220> <223> anticebador sentido

<400> 28

aaacccaaag atcttcacag gcgggtctct ccacctgatt tg

42

<210> 29 <211> 453 <212> PRT <213> secuencia artificial

<220> <223> polipéptido E2 defectuoso en la replicación y presentado en la membrana de HPV-18 (SS-18 E2*-TMR)

<400> 29

<212> PRT

<213> secuencia artificial

<220> 10 <223> polipéptido E2 defectuoso en la replicación y presentado en la membrana de HPV-33 (SS-33 E2*-TMR)

<400> 30 5 <210> 31

<211> 457

<212> PRT

<213> secuencia artificial

10 <220>

<223> polipéptido E2 defectuoso en la replicación y presentado en la membrana de HPV-52

<400> 31 15

<210> 32

<211> 746 5 <212> PRT

<213> secuencia artificial

<220>

<223> polipéptido E1 defectuoso en la replicación y presentado en la membrana de HPV-18 10

<400> 32 5 <210> 33

<211> 1362

<212> ADN

<213> secuencia artificial

10 <220>

<223> secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido E2 de HPV-18 defectuoso en la replicación y presentado en la membrana (degenerada para reducir la homología con la secuencia que codifica E2 de HPV-16)

<400> 33 15

<212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

10 <223> secuencia de nucleótidos codificante de un polipéptido E2 de HPV-33 defectuoso en la replicación (secuencia degenerada)

<400> 34

<210> 35

<211> 1326 20 <212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<223> secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido E2 de HPV-33 defectuoso en la replicación y presentado 25 en la membrana (SS-33E2*-TMR) (secuencia degenerada)

<400> 35 5 <210> 36

<211> 1107

<212> ADN

<213> secuencia artificial

10 <220>

<223> Secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido E2 defectuoso en la replicación de HPV-53 ((52degE2*) (secuencia degenerada)

<400> 36 15

<210> 37 20 <211> 1374

<212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

25 <223> Secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido E2 de HPV-52 defectuoso en la replicación y presentado en la membrana SS-52degE2*(secuencia degenerada)

<400> 37 <210> 38

<211> 2241 5 <212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia de nucleótidos que codifica un E1 de HPV-18 defectuoso en la replicación y presentado en la

10 membrana (SS-18E1*-TMF) (degenerada para reducir la homología con la secuencia de nucleótidos de HPV16 que codifica el E1)

<400> 38

<210> 39

<211> 33 <212> ADN <213> secuencia artificial

<220> <223> cebador oTG15315 para reconstituir la secuencia que codifica HPV-18 SS-6E1*deg-TMF

<400> 39

ggggagatct atgggtctca aggtgaacgt ctc

33

<210> 40 <211> 39 <212> ADN <213> secuencia artificial

<220> <223> primer cebador oTG17881 para reconstituir la secuencia que codifica HPV-18 SS-E1*deg-TMF

<400> 40

gtgccttctg ggtctgcgcc ccaatggatt tgaccggtg

39

<210> 41 <211> 37 <212> ADN <213> secuencia artificial

<220> <223> primer cebador oTG17882 para reconstituir la secuencia que codifica HPV-18 SS-E1*deg-TMF

<400> 41

ggtcaaatcc attggggcgc agacccagaa ggcacag

37

<210> 42 <211> 42 <212> ADN <213> secuencia artificial

<220> <223> primer cebador oTG17883 para reconstituir la secuencia que codifica HPV-18 SS-E1*deg-TMF

<400> 42

cagaatcaca ggcctcttgg tttatcgagc actagcatag tc

42

<210> 43 <211> 39 <212> ADN <213> secuencia artificial

<220> <223> primer cebador oTG17884 para reconstituir la secuencia que codifica HPV-18 SS-E1*deg-TMF

<400> 43

gctagtgctc gataaaccaa gaggcctgtg attctgtcc

39

<210> 44 <211> 32 <212> ADN

<213> secuencia artificial

<220> <223> cebador sentido oTG17885 para reconstituir la secuencia que codifica HPV-18 SS-E2*deg-TMF

<400> 44

gggggcggcc gctcagagcg accttacata gg

32

<210> 45 <211> 31 <212> ADN <213> secuencia artificial

<220> <223> cebador sentido oTG17875 para reconstituir la secuencia que codifica HPV-18 SS-E2*deg-TMF

<400> 45

ggggagatct atggttcctc aggctctcct g

31

<210> 46 <211> 39 <212> ADN <213> secuencia artificial

<220> <223> cebador sentido oTG17876 para reconstituir la secuencia que codifica HPV-18 SS-E2*deg-TMF

<400> 46

gttttgggaa attccctatt cagacaccga aggaaaccc

39

<210> 47 <211> 43 <212> ADN <213> secuencia artificial

<220> <223> cebador sentido oTG17877 para reconstituir la secuencia que codifica HPV-18 SS-E2*deg-TMF

<400> 47

gtttccttcg gtgtctgaat agggaatttc ccaaaacaca atg

43

<210> 48 <211> 39 <212> ADN <213> secuencia artificial

<220> <223> sense cebador sentido oTG17878 para reconstituir la secuencia que codifica HPV-18 SS-E2*deg-TMF

<400> 48

gtgggataca tgacaatgta tgtattactg agtgcaggg

39

<210> 49 <211> 38 <212> ADN <213> secuencia artificial

<220>

<223> cebador sentido oTG17879 para reconstituir la secuencia que codifica HPV-18 SS-E2*deg-TMF

<400> 49

ctgcactcag taatacatac attgtcatgt atcccacc

38

<210> 50 <211> 29 <212> ADN <213> secuencia artificial

<220> <223> cebador sentido oTG17880 para reconstituir la secuencia que codifica HPV-18 SS-E2*deg-TMF <400> 50

gggggcggcc gctcacagtc tggtctcac

29

<210> 51 <211> 36 <212> ADN <213> secuencia artificial

<220> <223> cebador oTG18962 para reconstituir la secuencia que codifica SS-33E2*-TMR

<400> 51

cccaaaggat ccaccatggt accgcaagcc ctgcta

36

<210> 52 <211> 52 <212> ADN <213> secuencia artificial

<220> <223> cebador oTG18963 para reconstituir la secuencia que codifica SS-33E2*-TMR

<400> 52

ttcccctctg tttcggtaag tttcctatag aggaaatatc agcacgcttg aa

52

<210> 53 <211> 52 <212> ADN <213> secuencia artificial

<220> <223> cebador oTG18964 para reconstituir la secuencia que codifica SS-33E2*-TMR

<400> 53

ttcaagcgtg ctgatatttc ctctatagga aacttaccga aacagagggg aa

52

<210> 54 <211> 49 <212> ADN <213> secuencia artificial

<220> <223> cebador oTG18965 para reconstituir la secuencia que codifica SS-33E2*-TMR

<400> 54

gataagtacc ggattcatga ccttatacgt actgctatcg gcaggcacg

49

<210> 55 <211> 49 <212> ADN <213> secuencia artificial

<220> <223> cebador oTG18966 para reconstituir la secuencia que codifica SS-33E2*-TMR

<400> 55

cgtgcctgcc gatagcagta cgtataaggt catgaatccg gtacttatc

49

<210> 56 <211> 56 <212> ADN <213> secuencia artificial

<220> <223> cebador oTG18967 para reconstituir la secuencia que codifica SS-33E2*-TMR

<400> 56

aaaaccccgc atgcgcggcc gcaagctatc acaggcgggt ctctccacct gatttg

56

<210> 57 <211> 37 <212> ADN <213> secuencia artificial

<220> <223> cebador oTG18968 para reconstituir la secuencia que codifica SS-33E2*-TMR

<400> 57

aaacccgaga tctaccatgg gtctcaaggt gaacgtc

37

<210> 58 <211> 46 <212> ADN <213> secuencia artificial

<220> <223> cebador oTG18969 para reconstituir la secuencia que codifica SS-33E2*-TMR

<400> 58

cccaccggtc aaatccattg gggcgaatcg ataccggcac ggttaa

46

<210> 59 <211> 46 <212> ADN <213> secuencia artificial

<220> <223> cebador oTG18970 para reconstituir la secuencia que codifica SS-33E2*-TMR

<400> 59

ttaaccgtgc cggtatcgat tcgccccaat ggatttgacc ggtggg

46

<210> 60 <211> 43 <212> ADN <213> secuencia artificial

<220> <223> cebador oTG18971 para reconstituir la secuencia que codifica SS-33E2*-TMR

<400> 60

gttatacaag gtgtcatgtc attgggttta tcgagcacta gca

43

<210> 61 <211> 43 <212> ADN <213> secuencia artificial

<220>

<223> cebador oTG18972 para reconstituir la secuencia que codifica SS-33E2*-TMR

<400> 61

tgctagtgct cgataaaccc aatgacatga caccttgtat aac

43

<210> 62 <211> 53 <212> ADN <213> secuencia artificial

<220> <223> cebador oTG18973 para reconstituir la secuencia que codifica SS-33E2*-TMR

<400> 62

aagcttgcta gccaccggtg gggccgcggc cgctcagagc gaccttacat agg

53

Claims (23)

1. REIVINDICACIONES

   1. Vector que comprende moléculas de ácidos nucleicos codificantes de por lo menos dos polipéptidos E2 de papilomavirus, en el que dichas moléculas de ácidos nucleicos codificantes de E2 no comprenden una porción de 40

   o más nucleótidos contiguos que muestran un porcentaje de identidad de 75% o superior a 75% entre dos cualesquiera de dichas moléculas de ácidos nucleicos codificantes de E2.

2. 2.

   Vector según la reivindicación 1, en el que dicha(s) molécula(s) de ácidos nucleicos codificante(s) de E2 codifica(n) un polipéptido E2 originado a partir de un HR-HPV seleccionado de entre el grupo constituido por HPV16, HPV-18, HPV-30, HPV-31, HPV-33, HPV-35, HPV-39, HPV-45, HPV-51, HPV-52, HPV-56, HPV-58, HPV-59, HPV-66, HPV-68, HPV-70 y HPV-85, originado preferentemente a partir de HPV-16, HPV-18, HPV-33 o HPV-52 o cualquier combinación de los mismos.

3. 3.

   Vector según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en el que dichas moléculas de ácidos nucleicos se modifican de manera que codifiquen un polipéptido E2 defectuoso para por lo menos una actividad de activación de la replicación y/o de la transcripción.

4. 4.

   Vector según la reivindicación 3, en el que dicho polipéptido E2 se origina a partir de HPV-16 y comprende la secuencia de aminoácidos representada en SEC ID nº 1, excepto en que por lo menos el residuo Glu en la posición 39 (E39) y/o el residuo Ile en la posición 73 (I73) se sustituye(n) por cualquier residuo aminoácido aparte de Glu e Ile en las posiciones respetivas 39 y 73, preferentemente con un residuo de Ala.

5. 5.

   Vector según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dichas moléculas de ácidos nucleicos se modifican de manera que codifiquen un polipéptido E2 presentado en la membrana.

6. 6.

   Vector según la reivindicación 5, en el que dicho polipéptido E2 presentado en la membrana se modificó mediante fusión de dicho polipéptido E2 de papilomavirus con una secuencia secretora y de anclaje a la membrana, en el que dichas secuencias secretoras y/o de anclaje a la membrana se originan preferentemente a partir de la glucoproteína de virus de la rabia, la glucoproteína de cubierta del virus VIH o la proteína F del virus del sarampión o son sintéticas.

7. 7.

   Vector según la reivindicación 6, en el que dicha molécula de ácidos nucleicos codifica un polipéptido E2 que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID nº 2.

8. 8.

   Vector según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicho vector comprende moléculas de ácidos nucleicos codificantes de por lo menos dos polipéptidos E2 originados a partir de diferentes genotipos de papilomavirus.

9. 9.

   Vector según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que dicho vector se selecciona de entre el grupo constituido por:

   -

   un vector que comprende (i) una molécula de ácidos nucleicos codificante de un polipéptido E2 de HPV-16 y que comprende además (ii) una molécula de ácidos nucleicos codificante de un polipéptido E2 de HPV-18;

   -

   un vector que comprende (i) una molécula de ácidos nucleicos codificante de un polipéptido E2 de HPV-16, (ii) una molécula de ácidos nucleicos codificante de un polipéptido E2 de HPV-18, e (iii) una molécula de ácidos nucleicos codificante de un polipéptido E2 de HPV-33;

   -

   un vector que comprende (i) una molécula de ácidos nucleicos codificante de un polipéptido E2 de HPV-16, (ii) una molécula de ácidos nucleicos codificante de un polipéptido E2 de HPV-18, e (iii) una molécula de ácidos nucleicos codificante de un polipéptido E2 de HPV-52;

   -

   un vector que comprende: (i) una molécula de ácidos nucleicos codificante de un polipéptido E2 de HPV-16, (ii) una molécula de ácidos nucleicos codificante de un polipéptido E2 de HPV-33, e (iii) una molécula de ácidos nucleicos codificante de un polipéptido E2 de HPV-52;

   -

   un vector que comprende: (i) una molécula de ácidos nucleicos codificante de un polipéptido E2 de HPV-16, (ii) una molécula de ácidos nucleicos codificante de un polipéptido E2 de HPV-18, (iii) una molécula de ácidos nucleicos codificante de un polipéptido E2 de HPV-33, e (iv) una molécula de ácidos nucleicos codificante de un polipéptido E2 de HPV-52;

   -

   un vector que comprende: (i) una molécula de ácidos nucleicos codificante de un polipéptido E2 de HPV-16, (ii) una molécula de ácidos nucleicos codificante de un polipéptido E1 de HPV-16, (iii) una molécula de ácidos nucleicos codificante de un polipéptido E2 de HPV-18, e (iv) una molécula de ácidos nucleicos codificante de un polipéptido E1 de HPV-18;

   -

   un vector que comprende moléculas de ácidos nucleicos codificantes de los polipéptidos E1, E2, E6 y E7 de HPV-16, y los polipéptidos E1, E2, E6 y E7 de HPV-18.

10. 10.

    Vector según la reivindicación 9, en el que dicho polipéptido E2 de HPV-16 comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID nº 2; y/o dicho polipéptido E2 de HPV-18 comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID nº 29; y/o dicho polipéptido E2 de HPV-33 comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID nº 30, y/o dicho polipéptido E2 de HPV-52 comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID nº 31.

11. 11.

    Vector según la reivindicación 9 ó 10, en el que dicho polipéptido E1 de HPV-16 comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID nº 3, y/o dicho polipéptido E1 de HPV-18 comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID nº 32; y/o dicho polipéptido E6 de HPV-16 comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID nº 4; y/o dicho polipéptido E7 de HPV-16 comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID nº 5.

12. 12.

    Vector según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, en el que dicha molécula de ácidos nucleicos codificante del polipéptido E2 de HPV-16 comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en SEC ID nº 8 y/o dicha molécula de ácidos nucleicos codificante del polipéptido E2 de HPV-18 comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en SEC ID nº 33; y/o dicha molécula de ácidos nucleicos codificante del polipéptido E2 de HPV-33 comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en SEC ID nº 34 o SEC ID nº 35; y/o dicha molécula de ácidos nucleicos codificante del polipéptido E2 de HPV-52 comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en SEC ID nº 36 o SEC ID nº 37; y/o dicha molécula de ácidos nucleicos codificante del polipéptido E1 de HPV-16 comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en SEC ID nº 7 y/o dicha molécula de ácidos nucleicos codificante del polipéptido E1 de HPV-18 comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en SEC ID nº 38.

13. 13.

    Vector según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que dicho vector es un vector poxvírico generado a partir de un poxvirus del canario, un poxvirus aviar o un virus Vaccinia, preferentemente un virus Vaccinia seleccionado de entre la cepa Copenhagen, la cepa Wyeth, NYVAC o la cepa Ankara modificada (MVA).

14. 14.

    Vector según la reivindicación 13, en el que dicho vector vírico es a) derivado de un virus Vaccinia Copenhagen y en el que dicha molécula de ácidos nucleicos se inserta en el gen timidina cinasa, o b) derivado de un virus Vaccinia MVA y en el que dicha molécula de ácidos nucleicos se inserta en la deleción III.

15. 15.

    Vector según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 14, en el que dicha(s) molécula(s) de ácidos nucleicos codificante(s) de E2 y/o de E7 se sitúa(n) bajo el promotor H5R de Vaccinia y molécula(s) de ácidos nucleicos codificante(s) de E1 y/o de E6 bajo el control del promotor p7.5K.

16. 16.

    Partícula vírica infecciosa que comprende el vector según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15.

17. 17.

    Composición que comprende un vector según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 o partícula vírica infecciosa según la reivindicación 16 o cualquier combinación de las mismas, preferentemente formulada en una forma adecuada para la inyección, en particular mediante la administración intramuscular o subcutánea.

18. 18.

    Utilización de un vector según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, una partícula vírica infecciosa según la reivindicación 16, o una composición según la reivindicación 17, en la preparación de un fármaco para el tratamiento de un organismo huésped que sufre una infección persistente por papilomavirus causada por por lo menos un papilomavirus, preferentemente por por lo menos un HR-HPV.

19. 19.

    Utilización según la reivindicación 18, para el tratamiento de un organismo huésped que sufre una infección causada por por lo menos uno de entre HPV16, HPV31, HPV33, HPV35, HPV52 y HPV58, en la que dicho vector comprende una molécula de ácidos nucleicos codificante de un polipéptido E2 originado a partir de HPV-16.

20. 20.

    Utilización según la reivindicación 18, para el tratamiento de un organismo huésped que sufre una infección causada por por lo menos uno de entre HPV-18, HPV-39, HPV-45, HPV-51, HPV-56, HPV-59, HPV-68, HPV-70 y HPV-85, en la que dicho vector comprende una molécula de ácidos nucleicos codificante de un polipéptido E2 originado a partir de HPV-18.

21. 21.

    Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 20, en la que el fármaco debe administrarse en una primera serie de administraciones realizada secuencialmente dentro de un periodo de tiempo comprendido entre unos pocos días y 4 semanas, seguido de una segunda serie de administraciones realizada en uno a 6 meses siguientes a la última administración de la primera serie, comprendiendo la primera serie de administraciones preferentemente tres administraciones secuenciales a intervalos semanales y comprendiendo la segunda serie una administración en 5 ó 6 meses siguientes a la primera serie.

22. 22.

    Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 21, en la que dicho fármaco está destinado a la utilización a) para proporcionar una respuesta antivírica contra por lo menos uno de los papilomavirus infecciosos, o

    b) para inducir o activar una respuesta inmunológica en un organismo animal o humano.

23. 23.

    Vector según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, una partícula vírica infecciosa según la reivindicación 16

    o una composición según la reivindicación 17, para la utilización en a) el tratamiento de una infección persistente por papilomavirus en un organismo animal o humano, b) la inducción o activación de una respuesta inmunológica en un organismo animal o humano, o c) la provisión de una respuesta antivírica en un organismo animal o humano.