CN114181961A - 用于人***状瘤病毒的改进疫苗及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了用于人***状瘤病毒的改进疫苗及其使用方法。本发明具体公开了改进的抗‑HPV免疫原和编码它们的核酸分子。所公开的免疫原包括具有共有HPV6 E6E7、HPV11 E6E7、HPV16 E6E7、HPV18 E6E7、HPV31 E6E7、HPV33 E6E7、HPV39 E6E7、HPV45 E6E7、HPV52 E6E7和HPV58 E6E7的那些免疫原。本发明公开了药物组合物、包含DNA质粒的重组疫苗和活减毒疫苗，还公开了在个体中诱导针对HPV的免疫应答的方法。

Description

用于人***状瘤病毒的改进疫苗及其使用方法
本申请是申请日为2014年03月12日的题为“用于人***状瘤病毒的改进疫苗及其使用方法”的中国专利申请号201480013180.5的分案申请。
发明领域
本发明涉及改进的人***状瘤病毒(HPV)疫苗、用于诱导免疫应答的改进的方法、以及用于针对HPV来预防性和/或治疗性免疫个体的改进的方法。
发明背景
***状瘤病毒是小DNA病毒，其包含至多7个早期基因和2个晚期基因。通常，***状瘤病毒早期基因表示为E1-E7，并且***状瘤病毒晚期基因表示为L1和L2。若干个物种的动物可被***状瘤病毒家族的成员感染。
人***状瘤病毒(HPV)感染是常见的，并且可发生性传播。基于DNA序列的同源性，HPV已经分成56种或更多种类型。16和18型HPV(其引起上皮异常增生和其它病变)通常和下列情况有关：癌症风险增加，特别是子宫颈、***、阴门以及肛管的原位和侵入性癌瘤。在全世界将近88％的子***是HPV亚型16、18、45、31、33、52以及58所造成的结果。此外，各种研究已揭示HPV6和HPV11存在于大多数发生的复发性呼吸道***状瘤病中。尽管已知了HPV6和HPV11与生殖器疣的相关性并且在小百分比的子***病例中发现了它们，但已经在2.6％至5.2％的所有情况的低级子宫颈病变中发现了HPV6和HPV11。此外，HPV6和HPV11现已发现与大约20％的现被视为子***先兆的低级鳞状上皮内病变，包括2级和3级子宫颈上皮内瘤形成和轻度子宫颈发育不良有关。更多的研究已揭示了两种血清型与各种形式的耳鼻喉科疾病，包括生殖器疣、复发性呼吸道***状瘤病、肺癌、扁桃体癌、喉癌、以及头颈部本来良性肿瘤的其它恶性转化和发育不良的相关性。此研究的发现结果揭示了使用共有序列DNA疫苗来对抗HPV6和HPV11的光明前景。
DNA疫苗相对于更加传统的疫苗接种法具有许多概念上的优点，如活减毒病毒和重组蛋白基疫苗。DNA疫苗安全、稳定、易于生产，并且在人中耐受良好，其中临床前实验指示几乎没有质粒整合迹象[Martin,T.等,Plasmid DNA malaria vaccine:the potentialfor genomic integration after intramuscular injection.Hum Gene Ther,1999.10(5):第759-68页；Nichols,W.W.等,Potential DNA vaccine integration into hostcell genome.Ann N Y Acad Sci,1995.772:第30-9页]。另外，DNA疫苗非常适于反复施用，因为疫苗的效果实际上不受到对于载体预先存在的抗体滴度的影响[Chattergoon,M.、J.Boyer以及D.B.Weiner,Genetic immunization:a new era in vaccines and immunetherapeutics.FASEB J,1997.11(10):第753-63页]。然而，在移至较大动物时，临床采用DNA疫苗的一个主要障碍是平台免疫原性的降低[Liu,M.A.和J.B.Ulmer,Human clinicaltrials of plasmid DNA vaccines.Adv Genet,2005.55:第25-40页]。DNA疫苗免疫原工程化中的近期技术进展如密码子优化、RNA优化和添加免疫球蛋白前导序列已经提高了DNA疫苗的表达和免疫原性[Andre,S.等,Increased immune response elicited by DNAvaccination with a synthetic gp120 sequence with optimized codon usage.JVirol,1998.72(2):第1497-503页；Deml,L.等,Multiple effects of codon usageoptimization on expression and immunogenicity of DNA candidate vaccinesencoding the human immunodeficiency virus type 1Gag protein.J Virol,2001.75(22):第10991-1001页；Laddy,D.J.等,Immunogenicity of novel consensus-based DNAvaccines against avian influenza.Vaccine,2007.25(16):第2984-9页；Frelin,L.等,Codon optimization and mRNA amplification effectively enhances theimmunogenicity of the hepatitis C virus nonstructural 3/4A gene.Gene Ther,2004.11(6):第522-33页]，以及质粒递送***方面的近期开发的技术如电穿孔[Hirao,L.A.等,Intradermal/subcutaneous immunization by electroporation improvesplasmid vaccine delivery and potency in pigs and rhesus macaques.Vaccine,2008.26(3):第440-8页；Luckay,A.等,Effect of plasmid DNA vaccine design and invivo electroporation on the resulting vaccine-specific immune responses inrhesus macaques.J Virol,2007.81(10):第5257-69页；Ahlen,G.等,In vivoelectroporation enhances the immunogenicity of hepatitis C virusnonstructural 3/4A DNA by increased local DNA uptake,protein expression,inflammation,and infiltration of CD3+T cells.J Immunol,2007.179(7):第4741-53页]。另外，研究表明相比于单独的天然抗原，共有免疫原的使用能够增加细胞免疫应答的宽度[Yan.,J.等,Enhanced cellular immune responses elicited by an engineeredHIV-1 subtype B consensus-based envelope DNA vaccine.Mol Ther,2007.15(2):第411-21页；Rolland,M.等,Reconstruction and function of ancestral center-of-treehuman immunodeficiency virus type 1proteins.J Virol,2007.81(16):第8507-14]。
仍存在对于改进的疫苗和预防与治疗HPV感染、尤其是引起子***和/或肺癌、扁桃体癌以及喉癌的感染的方法的需要。
发明概述
本发明的方面提供包含至少一种核苷酸序列的组合物，所述核苷酸序列包含选自由以下组成的组的HPV E6-E7融合抗原：HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV39、HPV45、HPV52和HPV58。
另一方面提供包含一种或多种核苷酸序列的组合物，所述核苷酸序列编码选自由以下组成的组的HPV E6-E7融合抗原：编码SEQ ID NO:2的核苷酸序列；编码SEQ ID NO:4的核苷酸序列；编码SEQ ID NO:6的核苷酸序列；编码SEQ ID NO:8的核苷酸序列；编码SEQ IDNO:18的核苷酸序列；编码SEQ ID NO:20的核苷酸序列；编码SEQ ID NO:22的核苷酸序列；编码SEQ ID NO:24的核苷酸序列；编码SEQ ID NO:25的核苷酸序列；编码SEQ ID NO:26的核苷酸序列；与编码SEQ ID NO:2的核苷酸序列具有至少95％同源性的核酸序列；与编码SEQ ID NO:4的核苷酸序列具有至少95％同源性的核酸序列；与编码SEQ ID NO:6的核苷酸序列具有至少95％同源性的核酸序列；与编码SEQ ID NO:8的核苷酸序列具有至少95％同源性的核酸序列；与编码SEQ ID NO:18的核苷酸序列具有至少95％同源性的核酸序列；与编码SEQ ID NO:20的核苷酸序列具有至少95％同源性的核酸序列；与编码SEQ ID NO:22的核苷酸序列具有至少95％同源性的核酸序列；与编码SEQ ID NO:24的核苷酸序列具有至少95％同源性的核酸序列；与编码SEQ ID NO:25的核苷酸序列具有至少95％同源性的核酸序列；与编码SEQ ID NO:26的核苷酸序列具有至少95％同源性的核酸序列；编码SEQ ID NO:2的核苷酸序列的片段；编码SEQ ID NO:4的核苷酸序列的片段；编码SEQ ID NO:6的核苷酸序列的片段；编码SEQ ID NO:8的核苷酸序列的片段；编码SEQ ID NO:18的核苷酸序列的片段；编码SEQ ID NO:20的核苷酸序列的片段；编码SEQ ID NO:22的核苷酸序列的片段；编码SEQ ID NO:24的核苷酸序列的片段；编码SEQ ID NO:25的核苷酸序列的片段；编码SEQ IDNO:26的核苷酸序列的片段；与编码SEQ ID NO:2的核苷酸序列的片段具有至少95％同源性的核酸序列；与编码SEQ ID NO:4的核苷酸序列的片段具有至少95％同源性的核酸序列；与编码SEQ ID NO:6的核苷酸序列的片段具有至少95％同源性的核酸序列；与编码SEQ IDNO:8的核苷酸序列的片段具有至少95％同源性的核酸序列；与编码SEQ ID NO:18的核苷酸序列的片段具有至少95％同源性的核酸序列；与编码SEQ ID NO:20的核苷酸序列的片段具有至少95％同源性的核酸序列；与编码SEQ ID NO:22的核苷酸序列的片段具有至少95％同源性的核酸序列；与编码SEQ ID NO:24的核苷酸序列的片段具有至少95％同源性的核酸序列；与编码SEQ ID NO:25的核苷酸序列的片段具有至少95％同源性的核酸序列；以及与编码SEQ ID NO:26的核苷酸序列的片段具有至少95％同源性的核酸序列。在一些实施方案中，编码HPV E6-E7融合抗原的核苷酸序列在5’末端不具有为编码SEQ ID NO:10的核苷酸序列的前导序列。
在本发明的另一方面，提供包含一种或多种核苷酸序列的组合物，所述核苷酸序列编码选自由以下组成的组的HPV E6-E7融合抗原：SEQ ID NO:1；SEQ ID NO:3；SEQ IDNO:5；SEQ ID NO:7；SEQ ID NO:17；SEQ ID NO:19；SEQ ID NO:21；SEQ ID NO:23；与SEQ IDNO:1具有至少95％同源性的核酸序列；与SEQ ID NO:3具有至少95％同源性的核酸序列；与SEQ ID NO:5具有至少95％同源性的核酸序列；与SEQ ID NO:7具有至少95％同源性的核酸序列；与SEQ ID NO:17具有至少95％同源性的核酸序列；与SEQ ID NO:19具有至少95％同源性的核酸序列；与SEQ ID NO:21具有至少95％同源性的核酸序列；与SEQ ID NO:23具有至少95％同源性的核酸序列；SEQ ID NO:1的片段；SEQ ID NO:3的片段；SEQ ID NO:5的片段；SEQ ID NO:7的片段；SEQ ID NO:17的片段；SEQ ID NO:19的片段；SEQ ID NO:21的片段；SEQ ID NO:23的片段；与SEQ ID NO:1的片段具有至少95％同源性的核酸序列；与SEQID NO:3的片段具有至少95％同源性的核酸序列；与SEQ ID NO:5的片段具有至少95％同源性的核酸序列；与SEQ ID NO:7的片段具有至少95％同源性的核酸序列；与SEQ ID NO:17的片段具有至少95％同源性的核酸序列；与SEQ ID NO:19的片段具有至少95％同源性的核酸序列；与SEQ ID NO:21的片段具有至少95％同源性的核酸序列；以及与SEQ ID NO:23的片段具有至少95％同源性的核酸序列。在一些实施方案中，编码HPV E6-E7融合抗原的核苷酸序列在5’末端不具有具有核苷酸序列SEQ ID NO:9的前导序列。
所提供的核苷酸序列可为质粒。
在另外的方面，提供了包含所公开的核苷酸序列的药物组合物；优选地具有多个抗原。
在一些方面，存在在个体中诱导针对多于一种亚型的HPV的有效免疫应答的方法，其包括向所述个体施用包含一种或多种所提供的核苷酸序列的组合物；优选地，组合物具有多于一种抗原。所述方法优选地包括通过电穿孔将所提供的核苷酸序列引入到个体中的步骤。
附图简述
图1A-图1B.分别基于E6和E7比对的相邻接合评估的***发生树。星号指示每个树上的共有序列的位置。图1C.示出在产生共有E6/E7融合序列之后进行若干修饰。
图2A-图2B.p6E6E7和p11E6E7的体内表达。从裂解的转染293-T细胞分离基因产物，穿过SDS-PAGE凝胶，并使用放射自显影术进行检测。HPV 6和HPV 11E6/E7蛋白皆各自为大约32kDa(图2A)。人横纹肌肉瘤(RD)细胞也用p6E6E7和p11E6E7转染并且随后在免疫荧光染色之后固定。FITC荧光确定了p6E6E7和p11E6E7的表达(图2B)。DAPI荧光确定了Hoescht染色之后的核定位。
图3A-图3B.IFN-γELISpot测定示出p6E6E7(图3A)和p11E6E7(图3B)在C57BL/6小鼠中诱导稳固的细胞介导的应答。使用在三次两周一次的免疫之后从各对应的组(每组5只小鼠)的小鼠中分离的脾细胞进行测定。每次免疫包括每种构建体20μg。组合组中的小鼠以每种构建体20μg接受p6E6E7和p11E6E7两者，每次免疫共计40μgDNA。经由IM注射，随后进行电穿孔来施用DNA(*指示p<0.0001；
Figure BDA0003440678440000061
指示p＝0.0001)。
图4A-图4B.使用个别肽进行另外的IFN-γELISpot测定以表征优势肽。从疫苗接种的小鼠和阴性对照中分离的脾细胞用涵盖整个HPV 6E6/E7融合蛋白(图4A)或HPV 11E6/E7融合蛋白(图4B)的重叠肽刺激。
图5A-图5B.由细胞内细胞因子染色表征的抗原特异性T细胞的细胞因子产生。将从接种了p6E6E7(图5A)和p11E6E7(图5B)的小鼠中分离的脾细胞用R10生长培养基、PMA或共有基因肽刺激4小时，随后进行表面标记和细胞内染色。以上点图示出产生IFN-γ、IL-2和TNF-α的总CD4+或CD8+细胞的减去了背景的百分比的差异。因为阴性对照组的平均值是零，所以带有星号的点的P值不能被确定。
图6.示出了注释以示出IgE前导序列(IgEL)、内切蛋白酶切割位点以及其中E6和E7结构域突变以增强表达和免疫原性的位点的HPV31 E6/E7(SEQ ID NO:18)的氨基酸序列。在图中，IgE前导序列加下划线。内切蛋白水解裂解位点用框表示。▲表示p53结合/降解所需的结构域的缺失进行的位点。E6蛋白与p53以及E7蛋白与细胞成视网膜细胞瘤(Rb)蛋白的结合位点突变并且用*表示。
图7.示出了注释以示出IgE前导序列(IgEL)、内切蛋白酶切割位点以及其中E6和E7结构域突变以增强表达和免疫原性的位点的HPV52 E6/E7(SEQ ID NO:20)的氨基酸序列。在图中，IgE前导序列加下划线。内切蛋白水解裂解位点用框表示。▲表示p53结合/降解所需的结构域的缺失进行的位点。E6蛋白与p53以及E7蛋白与细胞成视网膜细胞瘤(Rb)蛋白的结合位点突变并且用*表示。
优选实施方案的详细描述
定义.
本文所用的术语仅是出于描述特定实施方案的目的而并不旨在限制。除非上下文另外明确规定，否则如本说明书和所附权利要求书中使用的单数形式“一个”、“一种”和“所述(the)”包括复数指示物。
针对本文中数值范围的叙述，明确涵盖具有相同精确度的介于其间的每个居间数字。例如，针对6至9的范围，除了6和9之外还涵盖数字7和8，并且针对6.0至7.0的范围，明确涵盖数字6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9和7.0。
a.佐剂
如本文所用的“佐剂”可意指被添加到本文所述的DNA质粒疫苗中来增强由下文所述的DNA质粒和编码核酸序列所编码的一种或多种抗原的免疫原性的任何分子。
b.抗体
“抗体”可意指类别IgG、IgM、IgA、IgD或IgE的抗体，或片段、其片段或衍生物，包括Fab、F(ab')2、Fd以及单链抗体、双抗、双特异性抗体、双功能抗体及其衍生物。所述抗体可以是从哺乳动物的血清样品中分离出的抗体、多克隆抗体、亲和纯化抗体或其混合物，其对所需的表位或从其衍生的序列表现出足够的结合特异性。
c.抗原
“抗原”是指：具有HPV E6或HPV E7结构域并且优选地E6和E7与其间的内切蛋白酶切割位点融合的蛋白质。抗原包括SEQ ID NO:2(亚型6)、4(亚型11)、6(亚型33)、8(亚型58)、18(亚型31)、20(亚型52)、22(亚型16)和24(亚型18)；具有本文所述长度的其片段、变体，即具有与如本文所述的SEQ ID NO:2、4、6、8、18、20、22和24具有同源性的序列的蛋白质、具有本文所述长度的变体的片段及其组合。抗原可具有SEQ ID NO:10的IgE前导序列或可替代地将所述序列从N末端去除。抗原可任选地包括信号肽，如来自其它蛋白质的那些。
d.编码序列
如本文所用的“编码序列”或“编码核酸”可意指包含编码如以上节段c中所述的抗原的核苷酸序列的核酸(RNA或DNA分子)。编码序列可进一步包括可操作地连接至调控元件的起始信号和终止信号，所述调控元件包括能够在向其施用核酸的个体或哺乳动物的细胞中指导表达的启动子和多腺苷酸化信号。编码序列还可包括编码信号肽例如IgE前导序列如SEQ ID NO:9的序列。
e.互补序列
如本文所用的“互补序列”或“互补”可意指核酸，可以意味着核酸分子的核苷酸或核苷酸类似物之间的沃森-克里克(Watson-Crick)(例如，A-T/U和C-G)或Hoogsteen碱基配对。
f.片段
“片段”可意指能够在哺乳动物中引发针对抗原的免疫应答的抗原的多肽片段。抗原的片段可与全长100％相同，除了N和/或C端缺失至少一个氨基酸，在每种情况中，在第1位具有或不具有信号肽和/或甲硫氨酸。片段可包括不包括所添加的任何异源信号肽的特定全长抗原的长度的60％或更高、65％或更高、70％或更高、75％或更高、80％或更高、85％或更高、90％或更高、91％或更高、92％或更高、93％或更高、94％或更高、95％或更高、96％或更高、97％或更高、98％或更高、99％或更高百分比。片段可优选地包括与抗原具有95％或更高、96％或更高、97％或更高、98％或更高、或99％或更高同源性的多肽的片段，并且另外包含当计算同源性百分比时未被包括的N端甲硫氨酸或异源信号肽。片段还可包括N端甲硫氨酸和/或信号肽如免疫球蛋白信号肽，例如IgE或IgG信号肽。N端甲硫氨酸和/或信号肽可连接至抗原的片段。
编码抗原的核酸序列的片段可与全长100％相同，除了5’和/或3’末端缺失至少一个核苷酸，在每种情况中，在第1位具有或不具有编码信号肽和/或甲硫氨酸的序列。片段可包括不包括所添加的任何异源信号肽的特定全长编码序列的长度的60％或更高、65％或更高、70％或更高、75％或更高、80％或更高、85％或更高、90％或更高、91％或更高、92％或更高、93％或更高、94％或更高、95％或更高、96％或更高、97％或更高、98％或更高、99％或更高百分比。片段可优选地包括编码与抗原具有95％或更高、96％或更高、97％或更高、98％或更高、或99％或更高同源性的多肽的片段，并且另外任选地包含编码当计算同源性百分比时未被包括的N端甲硫氨酸或异源信号肽的序列。片段还可包括N端甲硫氨酸和/或信号肽如免疫球蛋白信号肽例如IgE或IgG信号肽的编码序列。编码N端甲硫氨酸和/或信号肽的编码序列可连接至编码序列的片段。
g.相同的
如本文在两种或更多种核酸或多肽序列的背景下所使用的术语“相同的”或“同一性”可意指序列具有指定百分比的在指定区域上相同的残基。可以通过以下方式来计算百分比：最优比对两个序列，在指定区域上比较两个序列，确定相同残基出现在两个序列中的位置的数目以得到匹配位置的数目，用匹配位置的数目除以指定区域中的位置的总数目，并且将结果乘以100来得到序列同一性的百分比。在两个序列具有不同长度或比对产生一个或多个交错末端并且比较的指定区域仅包括单个序列的情况下，单个序列的残基包括于计算的分母而不是分子中。在比较DNA和RNA时，可以认为胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)是等同的。可以手动地或通过使用计算机序列算法(如BLAST或BLAST 2.0)来执行同一性。
h.免疫应答
如本文所用的“免疫应答”可意指宿主免疫***例如哺乳动物的免疫***响应于通过提供的DNA质粒疫苗进行的一种或多种抗原的引入的激活。免疫应答可以呈细胞应答或体液应答或两者兼有的形式。
i.核酸
如本文所用的“核酸”或“寡核苷酸”或“多核苷酸”可意指共价连接在一起的至少两个核苷酸。单链的描绘也定义互补链的序列。因此，核酸还涵盖所描绘的单链的互补链。核酸的许多变体可以用于与给定核酸相同的目的。因此，核酸还涵盖大致上相同的核酸及其互补序列。单链提供可以在严格杂交条件下与靶序列杂交的探针。因此，核酸还涵盖在严格杂交条件下杂交的探针。
核酸可以是单链或双链的，或可含有双链序列和单链序列的部分。核酸可以是DNA、基因组和cDNA、RNA或杂交体，其中核酸可含有脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的组合以及碱基的组合，所述碱基包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、异胞嘧啶和异鸟嘌呤。可以通过化学合成方法或通过重组方法获得核酸。
j.可操作地连接
如本文所用的“可操作地连接”可意指基因的表达受与其在空间上连接的启动子的控制。启动子可定位在受其控制的基因的5'(上游)或3'(下游)。启动子与基因之间的距离可以与启动子所源自的基因中所述启动子与其控制的基因之间的距离大致相同。如本领域中已知的，可容许该距离的变化而不丧失启动子功能。
k.启动子
如本文所用的“启动子”可意指能够在细胞中赋予、激活或增强核酸的表达的合成或天然来源的分子。启动子可包括一个或多个特异性转录调控序列，以进一步增强所述基因的表达和/或改变其空间表达和/或时间表达。启动子还可包括远端增强子或阻遏物元件，所述元件可位于距离转录起始位点多达数千个碱基对处。启动子可来源于包括病毒、细菌、真菌、植物、昆虫和动物的来源。启动子可相对于其中表达发生的细胞、组织或器官，相对于表达发生所处的发育阶段或响应于外部刺激如生理应激、病原体、金属离子或诱导剂而组成型地或差异地调控基因组分的表达。启动子的代表性实例包括噬菌体T7启动子、噬菌体T3启动子、SP6启动子、lac操纵子-启动子、tac启动子、SV40晚期启动子、SV40早期启动子、RSV-LTR启动子、CMV IE启动子、SV40早期启动子或SV40晚期启动子以及CMV IE启动子。
l.严格杂交条件
如本文所用的“严格杂交条件”可意指在其下第一核酸序列(例如，探针)将与第二核酸序列(例如，靶标)如在核酸的复杂混合物中杂交的条件。严格条件为序列依赖性的并且在不同情况下将有所不同。严格条件可经选择比限定离子强度pH下特定序列的热熔点(Tm)低约5 10℃。Tm可以是在所述温度下处于平衡时50％互补于靶标的探针杂交于靶标序列(因为靶标序列过量存在，所以在Tm下，在平衡时50％的探针被占据)的温度(在限定的离子强度、pH以及核酸浓度下)。严格条件可以是这样的条件，其中在pH 7.0至8.3下盐浓度低于约1.0M钠离子，如约0.01-1.0M钠离子浓度(或其它盐)并且温度为至少约30℃(对于短探针，例如约10-50个核苷酸)和至少约60℃(对于长探针，例如大于约50个核苷酸)。还可以通过加入去稳定剂如甲酰胺来实现严格条件。对于选择性或特异性杂交，阳性信号可为背景杂交的至少2至10倍。示例性的严格杂交条件包括以下：50％甲酰胺、5×SSC以及1％SDS、在42℃下孵育；或5×SSC、1％SDS、在65℃下孵育，其中在65℃下用0.2×SSC和0.1％SDS洗涤。
m.大致上互补
如本文所用的“大致上互补”可意指第一序列与第二序列的互补序列在8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100或更多个核苷酸或氨基酸的区域上具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％的同一性，或两个序列在严格杂交条件下杂交。
n.大致上相同
如本文所用的“基本上相同”可意指第一序列和第二序列在8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100或更多个核苷酸或氨基酸的区域上具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％的同一性，或就核酸而言，如果第一序列与第二序列的互补序列基本上互补，则第一序列和第二序列基本上相同。
o.变体
本文关于核酸所用的“变体”可意指(i)参照核苷酸序列的部分或片段；(ii)参照核苷酸序列或其部分的互补序列；(iii)与参照核酸或其互补序列基本上相同的核酸；或(iv)在严格条件下与参照核酸、其互补序列或与其基本上相同的序列杂交的核酸。
就肽或多肽而言的“变体”通过氨基酸的***、缺失或保守性取代而在氨基酸序列上有所不同，但是保留至少一种生物活性。变体也可指氨基酸序列大致上与具有某一氨基酸序列的参照蛋白相同的保留至少一种生物活性的蛋白质。氨基酸的保守性取代，即，用具有类似性质(例如，亲水性、带电区域的程度和分布)的不同氨基酸代替某一氨基酸，在本领域中被认为通常涉及微小变化。这些微小变化可部分地通过考虑氨基酸的亲水指数来鉴定，如本领域中所理解的。Kyte等，J.Mol.Biol.157:105-132(1982)。氨基酸的亲水性指数是基于对它的疏水性和电荷的考虑。本领域已知的是具有类似亲水性指数的氨基酸可被取代且仍然保留蛋白质功能。在一个方面，亲水性指数为±2的氨基酸被取代。氨基酸的亲水性也可用于揭示将产生保留生物功能的蛋白质的取代。在肽的上下文中氨基酸的亲水性的考虑允许计算所述肽的最大局部平均亲水性，已报道与抗原性和免疫原性良好相关的有用的测量。美国专利号4,554,101，通过引用全部并入本文。具有相似亲水性值的氨基酸的取代可产生保留生物活性例如免疫原性的肽，如本领域中所理解的。可利用具有在±2内的亲水性值的氨基酸彼此进行取代。氨基酸的疏水性指数和亲水性值两者均受所述氨基酸的特定侧链影响。与那个观察一致的是，可与生物功能相容的氨基酸取代被理解为取决于所述氨基酸的相对类似性，并且特别是那些氨基酸的侧链的相对类似性，如通过疏水性、亲水性、电荷、大小及其它性质所揭示。
p.载体
本文所用的"载体"可意指含有复制起点的核酸序列。载体可为质粒、噬菌体、细菌人工染色体或酵母人工染色体。载体可为DNA载体或RNA载体。载体可以是自主复制的染色体外载体，或整合到宿主基因组中的载体。
公开了改进的疫苗，所述疫苗源自用以增强由免疫原诱导的细胞免疫应答的多阶段战略。产生了修饰的共有序列。还公开了基因修饰，包括密码子优化、RNA优化以及高效免疫球蛋白前导序列的添加。新型构建体已经被设计来引发比对应的密码子优化的免疫原更强和更宽的细胞免疫应答。
改进的HPV疫苗是基于蛋白质和编码具有使它们作为可用以诱导出抗-HPV的免疫原特别有效的表位的蛋白质的基因构建体。因此，疫苗可诱导治疗或预防性免疫应答。在一些实施方案中，递送免疫原的方式是DNA疫苗、重组疫苗、蛋白质亚单位疫苗、包含免疫原的组合物、减毒疫苗或灭活疫苗。在一些实施方案中，疫苗包含选自由以下组成的组的组合：一种或多种DNA疫苗、一种或多种重组疫苗、一种或多种蛋白质亚单位疫苗、一种或多种包含免疫原的组合物、一种或多种减毒疫苗以及一种或多种灭活疫苗。
根据一些实施方案，疫苗被递送至个体以调节个体的免疫***的活性并且由此增强针对HPV的免疫应答。当编码蛋白质的核酸分子被个体的细胞摄取时，核苷酸序列在细胞中表达并且蛋白质由此被递送至个体。提供了在核酸分子如质粒(作为重组疫苗的一部分和作为减毒疫苗的一部分，作为分离的蛋白质或载体的蛋白质部分)上递送蛋白质的编码序列的方法。
提供针对HPV预防性和/或治疗性免疫个体的组合物和方法。
用于递送包含编码免疫原的核苷酸序列的核酸分子的组合物可操作地连接至调控元件。组合物可包含：编码免疫原的质粒、包含编码免疫原的核苷酸序列的重组疫苗、编码本发明的蛋白质和/或包含本发明的蛋白质的活减毒病原体、包含本发明的蛋白质的灭活病原体、或包含本发明的蛋白质的组合物如脂质体或亚单位疫苗。本发明还涉及包含组合物的可注射的药物组合物。
本发明的方面提供包含至少一种核苷酸序列的组合物，所述核苷酸序列包含选自由以下组成的组的HPV E6-E7融合抗原：HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV39、HPV45、HPV52和HPV58。在一些实施方案中，组合物可包含HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV52和HPV58。在一些实施方案中，组合物可包含HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV52和HPV58。在一些实施方案中，组合物可包含HPV6、HPV11、HPV16和HPV18。在一些实施方案中，组合物可包含HPV16、HPV31和HPV52。
另一方面提供包含一种或多种核苷酸序列的组合物，所述核苷酸序列编码选自由以下组成的组的HPV E6-E7融合抗原：编码SEQ ID NO:2的核苷酸序列；编码SEQ ID NO:4的核苷酸序列；编码SEQ ID NO:6的核苷酸序列；编码SEQ ID NO:8的核苷酸序列；编码SEQ IDNO:18的核苷酸序列；编码SEQ ID NO:20的核苷酸序列；编码SEQ ID NO:22的核苷酸序列；编码SEQ ID NO:24的核苷酸序列；编码SEQ ID NO:25的核苷酸序列；编码SEQ ID NO:26的核苷酸序列；与编码SEQ ID NO:2的核苷酸序列具有至少95％同源性的核酸序列；与编码SEQ ID NO:4的核苷酸序列具有至少95％同源性的核酸序列；与编码SEQ ID NO:6的核苷酸序列具有至少95％同源性的核酸序列；与编码SEQ ID NO:8的核苷酸序列具有至少95％同源性的核酸序列；与编码SEQ ID NO:18的核苷酸序列具有至少95％同源性的核酸序列；与编码SEQ ID NO:20的核苷酸序列具有至少95％同源性的核酸序列；与编码SEQ ID NO:22的核苷酸序列具有至少95％同源性的核酸序列；与编码SEQ ID NO:24的核苷酸序列具有至少95％同源性的核酸序列；与编码SEQ ID NO:25的核苷酸序列具有至少95％同源性的核酸序列；与编码SEQ ID NO:26的核苷酸序列具有至少95％同源性的核酸序列；编码SEQ ID NO:2的核苷酸序列的片段；编码SEQ ID NO:4的核苷酸序列的片段；编码SEQ ID NO:6的核苷酸序列的片段；编码SEQ ID NO:8的核苷酸序列的片段；编码SEQ ID NO:18的核苷酸序列的片段；编码SEQ ID NO:20的核苷酸序列的片段；编码SEQ ID NO:22的核苷酸序列的片段；编码SEQ ID NO:24的核苷酸序列的片段；编码SEQ ID NO:25的核苷酸序列的片段；编码SEQ IDNO:26的核苷酸序列的片段；与编码SEQ ID NO:2的核苷酸序列的片段具有至少95％同源性的核酸序列；与编码SEQ ID NO:4的核苷酸序列的片段具有至少95％同源性的核酸序列；与编码SEQ ID NO:6的核苷酸序列的片段具有至少95％同源性的核酸序列；与编码SEQ IDNO:8的核苷酸序列的片段具有至少95％同源性的核酸序列；与编码SEQ ID NO:18的核苷酸序列的片段具有至少95％同源性的核酸序列；与编码SEQ ID NO:20的核苷酸序列的片段具有至少95％同源性的核酸序列；与编码SEQ ID NO:22的核苷酸序列的片段具有至少95％同源性的核酸序列；与编码SEQ ID NO:24的核苷酸序列的片段具有至少95％同源性的核酸序列；与编码SEQ ID NO:25的核苷酸序列的片段具有至少95％同源性的核酸序列；以及与编码SEQ ID NO:26的核苷酸序列的片段具有至少95％同源性的核酸序列。
在一些实施方案中，组合物包括选自由以下组成的组的HPV E6-E7融合抗原：编码SEQ ID NO:2的核苷酸序列；编码SEQ ID NO:4的核苷酸序列；编码SEQ ID NO:6的核苷酸序列；编码SEQ ID NO:8的核苷酸序列；编码SEQ ID NO:18的核苷酸序列；编码SEQ ID NO:20的核苷酸序列；编码SEQ ID NO:22的核苷酸序列；编码SEQ ID NO:24的核苷酸序列；与编码SEQ ID NO:2的核苷酸序列具有至少95％同源性的核酸序列；与编码SEQ ID NO:4的核苷酸序列具有至少95％同源性的核酸序列；与编码SEQ ID NO:6的核苷酸序列具有至少95％同源性的核酸序列；与编码SEQ ID NO:8的核苷酸序列具有至少95％同源性的核酸序列；与编码SEQ ID NO:18的核苷酸序列具有至少95％同源性的核酸序列；与编码SEQ ID NO:20的核苷酸序列具有至少95％同源性的核酸序列；与编码SEQ ID NO:22的核苷酸序列具有至少95％同源性的核酸序列；与编码SEQ ID NO:24的核苷酸序列具有至少95％同源性的核酸序列；编码SEQ ID NO:2的核苷酸序列的片段；编码SEQ ID NO:4的核苷酸序列的片段；编码SEQ ID NO:6的核苷酸序列的片段；编码SEQ ID NO:8的核苷酸序列的片段；编码SEQ IDNO:18的核苷酸序列的片段；编码SEQ ID NO:20的核苷酸序列的片段；编码SEQ ID NO:22的核苷酸序列的片段；编码SEQ ID NO:24的核苷酸序列的片段；与编码SEQ ID NO:2的核苷酸序列的片段具有至少95％同源性的核酸序列；与编码SEQ ID NO:4的核苷酸序列的片段具有至少95％同源性的核酸序列；与编码SEQ ID NO:6的核苷酸序列的片段具有至少95％同源性的核酸序列；与编码SEQ ID NO:8的核苷酸序列的片段具有至少95％同源性的核酸序列；与编码SEQ ID NO:18的核苷酸序列的片段具有至少95％同源性的核酸序列；与编码SEQID NO:20的核苷酸序列的片段具有至少95％同源性的核酸序列；与编码SEQ ID NO:22的核苷酸序列的片段具有至少95％同源性的核酸序列；以及与编码SEQ ID NO:24的核苷酸序列的片段具有至少95％同源性的核酸序列。
在一些实施方案中，组合物包括选自由以下组成的组的HPV E6-E7融合抗原：编码SEQ ID NO:6的核苷酸序列；编码SEQ ID NO:8的核苷酸序列；编码SEQ ID NO:18的核苷酸序列；编码SEQ ID NO:20的核苷酸序列；编码SEQ ID NO:22的核苷酸序列；编码SEQ ID NO:24的核苷酸序列；与编码SEQ ID NO:6的核苷酸序列具有至少95％同源性的核酸序列；与编码SEQ ID NO:8的核苷酸序列具有至少95％同源性的核酸序列；与编码SEQ ID NO:18的核苷酸序列具有至少95％同源性的核酸序列；与编码SEQ ID NO:20的核苷酸序列具有至少95％同源性的核酸序列；与编码SEQ ID NO:22的核苷酸序列具有至少95％同源性的核酸序列；与编码SEQ ID NO:24的核苷酸序列具有至少95％同源性的核酸序列；编码SEQ ID NO:6的核苷酸序列的片段；编码SEQ ID NO:8的核苷酸序列的片段；编码SEQ ID NO:18的核苷酸序列的片段；编码SEQ ID NO:20的核苷酸序列的片段；编码SEQ ID NO:22的核苷酸序列的片段；编码SEQ ID NO:24的核苷酸序列的片段；与编码SEQ ID NO:6的核苷酸序列的片段具有至少95％同源性的核酸序列；与编码SEQ ID NO:8的核苷酸序列的片段具有至少95％同源性的核酸序列；与编码SEQ ID NO:18的核苷酸序列的片段具有至少95％同源性的核酸序列；与编码SEQ ID NO:20的核苷酸序列的片段具有至少95％同源性的核酸序列；与编码SEQID NO:22的核苷酸序列的片段具有至少95％同源性的核酸序列；以及与编码SEQ ID NO:24的核苷酸序列的片段具有至少95％同源性的核酸序列。
在一些实施方案中，组合物包括选自由以下组成的组的HPV E6-E7融合抗原：编码SEQ ID NO:2的核苷酸序列；编码SEQ ID NO:4的核苷酸序列；编码SEQ ID NO:22的核苷酸序列；编码SEQ ID NO:24的核苷酸序列；与编码SEQ ID NO:2的核苷酸序列具有至少95％同源性的核酸序列；与编码SEQ ID NO:4的核苷酸序列具有至少95％同源性的核酸序列；与编码SEQ ID NO:22的核苷酸序列具有至少95％同源性的核酸序列；与编码SEQ ID NO:24的核苷酸序列具有至少95％同源性的核酸序列；编码SEQ ID NO:2的核苷酸序列的片段；编码SEQ ID NO:4的核苷酸序列的片段；编码SEQ ID NO:22的核苷酸序列的片段；编码SEQ IDNO:24的核苷酸序列的片段；与编码SEQ ID NO:2的核苷酸序列的片段具有至少95％同源性的核酸序列；与编码SEQ ID NO:4的核苷酸序列的片段具有至少95％同源性的核酸序列；与编码SEQ ID NO:22的核苷酸序列的片段具有至少95％同源性的核酸序列；以及与编码SEQID NO:24的核苷酸序列的片段具有至少95％同源性的核酸序列。
在一些实施方案中，组合物包括选自由以下组成的组的HPV E6-E7融合抗原：编码SEQ ID NO:18的核苷酸序列；编码SEQ ID NO:20的核苷酸序列；编码SEQ ID NO:22的核苷酸序列；与编码SEQ ID NO:18的核苷酸序列具有至少95％同源性的核酸序列；与编码SEQID NO:20的核苷酸序列具有至少95％同源性的核酸序列；与编码SEQ ID NO:22的核苷酸序列具有至少95％同源性的核酸序列；编码SEQ ID NO:18的核苷酸序列的片段；编码SEQ IDNO:20的核苷酸序列的片段；编码SEQ ID NO:22的核苷酸序列的片段；与编码SEQ ID NO:18的核苷酸序列的片段具有至少95％同源性的核酸序列；与编码SEQ ID NO:20的核苷酸序列的片段具有至少95％同源性的核酸序列；以及与编码SEQ ID NO:22的核苷酸序列的片段具有至少95％同源性的核酸序列。
在本发明的另一方面，提供包含一种或多种核苷酸序列的组合物，所述核苷酸序列编码选自由以下组成的组的HPV E6-E7融合抗原：SEQ ID NO:1；SEQ ID NO:3；SEQ IDNO:5；SEQ ID NO:7；SEQ ID NO:17；SEQ ID NO:19；SEQ ID NO:21；SEQ ID NO:23；与SEQ IDNO:1具有至少95％同源性的核酸序列；与SEQ ID NO:3具有至少95％同源性的核酸序列；与SEQ ID NO:5具有至少95％同源性的核酸序列；与SEQ ID NO:7具有至少95％同源性的核酸序列；与SEQ ID NO:17具有至少95％同源性的核酸序列；与SEQ ID NO:19具有至少95％同源性的核酸序列；与SEQ ID NO:21具有至少95％同源性的核酸序列；与SEQ ID NO:23具有至少95％同源性的核酸序列；SEQ ID NO:1的片段；SEQ ID NO:3的片段；SEQ ID NO:5的片段；SEQ ID NO:7的片段；SEQ ID NO:17的片段；SEQ ID NO:19的片段；SEQ ID NO:21的片段；SEQ ID NO:23的片段；与SEQ ID NO:1的片段具有至少95％同源性的核酸序列；与SEQID NO:3的片段具有至少95％同源性的核酸序列；与SEQ ID NO:5的片段具有至少95％同源性的核酸序列；与SEQ ID NO:7的片段具有至少95％同源性的核酸序列；与SEQ ID NO:17的片段具有至少95％同源性的核酸序列；与SEQ ID NO:19的片段具有至少95％同源性的核酸序列；与SEQ ID NO:21的片段具有至少95％同源性的核酸序列；以及与SEQ ID NO:23的片段具有至少95％同源性的核酸序列。
在一些实施方案中，组合物包括选自由以下组成的组的HPV E6-E7融合抗原：SEQID NO:5；SEQ ID NO:7；SEQ ID NO:17；SEQ ID NO:19；SEQ ID NO:21；SEQ ID NO:23；与SEQID NO:5具有至少95％同源性的核酸序列；与SEQ ID NO:7具有至少95％同源性的核酸序列；与SEQ ID NO:17具有至少95％同源性的核酸序列；与SEQ ID NO:19具有至少95％同源性的核酸序列；与SEQ ID NO:21具有至少95％同源性的核酸序列；与SEQ ID NO:23具有至少95％同源性的核酸序列；SEQ ID NO:5的片段；SEQ ID NO:7的片段；SEQ ID NO:17的片段；SEQ ID NO:19的片段；SEQ ID NO:21的片段；SEQ ID NO:23的片段；与SEQ ID NO:5的片段具有至少95％同源性的核酸序列；与SEQ ID NO:7的片段具有至少95％同源性的核酸序列；与SEQ ID NO:17的片段具有至少95％同源性的核酸序列；与SEQ ID NO:19的片段具有至少95％同源性的核酸序列；与SEQ ID NO:21的片段具有至少95％同源性的核酸序列；以及与SEQ ID NO:23的片段具有至少95％同源性的核酸序列。
在一些实施方案中，组合物包括选自由以下组成的组的HPV E6-E7融合抗原：SEQID NO:1；SEQ ID NO:3；SEQ ID NO:21；SEQ ID NO:23；与SEQ ID NO:1具有至少95％同源性的核酸序列；与SEQ ID NO:3具有至少95％同源性的核酸序列；与SEQ ID NO:21具有至少95％同源性的核酸序列；与SEQ ID NO:23具有至少95％同源性的核酸序列；SEQ ID NO:1的片段；SEQ ID NO:3的片段；SEQ ID NO:21的片段；SEQ ID NO:23的片段；与SEQ ID NO:1的片段具有至少95％同源性的核酸序列；与SEQ ID NO:3的片段具有至少95％同源性的核酸序列；与SEQ ID NO:21的片段具有至少95％同源性的核酸序列；以及与SEQ ID NO:23的片段具有至少95％同源性的核酸序列。
在一些实施方案中，组合物包括选自由以下组成的组的HPV E6-E7融合抗原：SEQID NO:17；SEQ ID NO:19；SEQ ID NO:21；与SEQ ID NO:17具有至少95％同源性的核酸序列；与SEQ ID NO:19具有至少95％同源性的核酸序列；与SEQ ID NO:21具有至少95％同源性的核酸序列；SEQ ID NO:17的片段；SEQ ID NO:19的片段；SEQ ID NO:21的片段；与SEQID NO:17的片段具有至少95％同源性的核酸序列；与SEQ ID NO:19的片段具有至少95％同源性的核酸序列；以及与SEQ ID NO:21的片段具有至少95％同源性的核酸序列。
在一些实施方案中，本文所述的核苷酸序列中不存在前导序列。包含HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV39、HPV45、HPV52和HPV58的核苷酸序列中不存在前导序列。具体地讲，包括编码SEQ ID NO:2的核苷酸序列；编码SEQ ID NO:4的核苷酸序列；编码SEQID NO:6的核苷酸序列；编码SEQ ID NO:8的核苷酸序列；编码SEQ ID NO:18的核苷酸序列；编码SEQ ID NO:20的核苷酸序列；编码SEQ ID NO:22的核苷酸序列；编码SEQ ID NO:24的核苷酸序列；以及编码SEQ ID NO:25的核苷酸序列的HPV E6-E7融合抗原在5’末端不存在前导序列，例如编码SEQ ID NO.10的核苷酸序列。具体地讲，包括核苷酸序列SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23的HPV E6-E7融合抗原在5’末端不存在前导序列，例如核苷酸序列SEQ IDNO.9。
在一些实施方案中，本发明的核苷酸序列可与所提供的核苷酸序列具有80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同源性；优选地95％、96％、97％、98％、或99％；或98％或99％。
所提供的核苷酸序列可被包括在多种已知载体或递送***中的一种中，所述载体或递送***包括质粒、病毒载体、脂质载体、纳米颗粒；优选地质粒。
在另外的方面，提供了包含所公开的核苷酸序列的药物组合物；优选地具有多个抗原。
在一些方面，存在在个体中诱导针对多于一种亚型的HPV的有效免疫应答的方法，其包括向所述个体施用包含一种或多种所提供的核苷酸序列的组合物；优选地，组合物具有多于一种抗原。所述方法优选地包括通过电穿孔将所提供的核苷酸序列引入个体的步骤。
SEQ ID NO:1包含编码HPV 6E6和E7蛋白的共有免疫原的核苷酸序列。SEQ ID NO:1包括连接至SEQ ID NO:1的5’末端处的核苷酸序列的IgE前导序列SEQ ID NO:9。SEQ IDNO:2包含HPV 6E6和E7蛋白的共有免疫原的氨基酸序列。SEQ ID NO:2包括位于共有免疫原序列的N-末端的IgE前导序列SEQ ID NO:10。IgE前导序列是SEQ ID NO:10，并且可由SEQID NO:9编码。
在一些实施方案中，疫苗包括SEQ ID NO:2或编码SEQ ID NO:2的核酸分子。
SEQ ID NO:2的片段可与全长100％相同，除了N和/或C端缺失至少一个氨基酸，在每种情况中，在第1位具有或不具有信号肽和/或甲硫氨酸。SEQ ID NO:2的片段可包括不包括所添加的任何异源信号肽的全长SEQ ID NO:2的长度的60％或更高、65％或更高、70％或更高、75％或更高、80％或更高、85％或更高、90％或更高、91％或更高、92％或更高、93％或更高、94％或更高、95％或更高、96％或更高、97％或更高、98％或更高、99％或更高百分比。片段可优选地包括与SEQ ID NO:2具有95％或更高、96％或更高、97％或更高、98％或更高、或99％或更高同源性的SEQ ID NO:2的片段，并且另外包含当计算同源性百分比时未被包括的N端甲硫氨酸或异源信号肽。片段还可包括N端甲硫氨酸和/或信号肽如免疫球蛋白信号肽，例如IgE或IgG信号肽。N端甲硫氨酸和/或信号肽可连接至所述片段。
核酸序列SEQ ID NO:1的片段可与全长100％相同，除了5’和/或3’末端缺失至少一个核苷酸，在每种情况中，在第1位具有或不具有编码信号肽和/或甲硫氨酸的序列。片段可包括不包括所添加的任何异源信号肽的全长编码序列SEQ ID NO:1的长度的60％或更高、65％或更高、70％或更高、75％或更高、80％或更高、85％或更高、90％或更高、91％或更高、92％或更高、93％或更高、94％或更高、95％或更高、96％或更高、97％或更高、98％或更高、99％或更高百分比。片段可优选地包括编码与抗原SEQ ID NO:2具有95％或更高、96％或更高、97％或更高、98％或更高、或99％或更高同源性的多肽的片段，并且另外任选地包含编码当计算同源性百分比时未被包括的N端甲硫氨酸或异源信号肽的序列。片段还可包含N端甲硫氨酸和/或信号肽如免疫球蛋白信号肽例如IgE或IgG信号肽的编码序列。编码N端甲硫氨酸和/或信号肽的编码序列可连接至所述片段。
在一些实施方案中，SEQ ID NO:1的片段可包含786或更多个核苷酸；在一些实施方案中，可包含830或更多个核苷酸；在一些实施方案中，可包含856或更多个核苷酸；并且在一些实施方案中，可包含865或更多个核苷酸。在一些实施方案中，SEQ ID NO:1的片段如本文所列出的那些片段还可包含IgE前导序列的编码序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:1的片段不包含IgE前导序列的编码序列。
在一些实施方案中，SEQ ID NO:2的片段可包含252或更多个氨基酸；在一些实施方案中，可包含266或更多个氨基酸；在一些实施方案中，可包含275或更多个氨基酸；并且在一些实施方案中，可包含278或更多个氨基酸。
SEQ ID NO:3包含编码HPV 11E6和E7蛋白的共有免疫原的核苷酸序列。SEQ IDNO:3包括连接至SEQ ID NO:3的5’末端处的核苷酸序列的IgE前导序列SEQ ID NO:9。SEQID NO:4包含HPV 11E6和E7蛋白的共有免疫原的氨基酸序列。SEQ ID NO:4包括位于共有免疫原序列的N-末端的IgE前导序列SEQ ID NO:10。IgE前导序列是SEQ ID NO:10，并且可由SEQ ID NO:9编码。
在一些实施方案中，疫苗包括SEQ ID NO:4或编码SEQ ID NO:4的核酸分子。
SEQ ID NO:4的片段可与全长100％相同，除了N和/或C端缺失至少一个氨基酸，在每种情况中，在第1位具有或不具有信号肽和/或甲硫氨酸。SEQ ID NO:4的片段可包括不包括所添加的任何异源信号肽的全长SEQ ID NO:4的长度的60％或更高、65％或更高、70％或更高、75％或更高、80％或更高、85％或更高、90％或更高、91％或更高、92％或更高、93％或更高、94％或更高、95％或更高、96％或更高、97％或更高、98％或更高、99％或更高百分比。片段可优选地包括与SEQ ID NO:4具有95％或更高、96％或更高、97％或更高、98％或更高、或99％或更高同源性的SEQ ID NO:4的片段，并且另外包含当计算同源性百分比时未被包括的N端甲硫氨酸或异源信号肽。片段还可包括N端甲硫氨酸和/或信号肽如免疫球蛋白信号肽，例如IgE或IgG信号肽。N端甲硫氨酸和/或信号肽可连接至所述片段。
核酸序列SEQ ID NO:3的片段可与全长100％相同，除了5’和/或3’末端缺失至少一个核苷酸，在每种情况中，在第1位具有或不具有编码信号肽和/或甲硫氨酸的序列。片段可包括不包括所添加的任何异源信号肽的全长编码序列SEQ ID NO:3的长度的60％或更高、65％或更高、70％或更高、75％或更高、80％或更高、85％或更高、90％或更高、91％或更高、92％或更高、93％或更高、94％或更高、95％或更高、96％或更高、97％或更高、98％或更高、99％或更高百分比。片段可优选地包括编码与抗原SEQ ID NO:4具有95％或更高、96％或更高、97％或更高、98％或更高、或99％或更高同源性的多肽的片段，并且另外任选地包含编码当计算同源性百分比时未被包括的N端甲硫氨酸或异源信号肽的序列。片段还可包含N端甲硫氨酸和/或信号肽如免疫球蛋白信号肽例如IgE或IgG信号肽的编码序列。编码N端甲硫氨酸和/或信号肽的编码序列可连接至所述片段。
在一些实施方案中，SEQ ID NO:3的片段可包含786或更多个核苷酸；在一些实施方案中，可包含830或更多个核苷酸；在一些实施方案中，可包含856或更多个核苷酸；并且在一些实施方案中，可包含865或更多个核苷酸。在一些实施方案中，SEQ ID NO:3的片段如本文所列出的那些片段还可包含IgE前导序列的编码序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:3的片段不包含IgE前导序列的编码序列。
在一些实施方案中，SEQ ID NO:4的片段可包含252或更多个氨基酸；在一些实施方案中，可包含266或更多个氨基酸；在一些实施方案中，可包含275或更多个氨基酸；并且在一些实施方案中，可包含278或更多个氨基酸。
SEQ ID NO:5包含编码HPV 33E6和E7蛋白的共有免疫原的核苷酸序列。SEQ IDNO:5包含连接至SEQ ID NO:5的5’末端处的核苷酸序列的IgE前导序列SEQ ID NO:9。SEQID NO:6包含HPV 33E6和E7蛋白的共有免疫原的氨基酸序列。SEQ ID NO:6包括位于共有免疫原序列的N-末端的IgE前导序列SEQ ID NO:10。IgE前导序列是SEQ ID NO:10，并且可由SEQ ID NO:9编码。
在一些实施方案中，疫苗包括SEQ ID NO:6或编码SEQ ID NO:6的核酸分子。
SEQ ID NO:6的片段可与全长100％相同，除了N和/或C端缺失至少一个氨基酸，在每种情况中，在第1位具有或不具有信号肽和/或甲硫氨酸。SEQ ID NO:6的片段可包括不包括所添加的任何异源信号肽的全长SEQ ID NO:6的长度的60％或更高、65％或更高、70％或更高、75％或更高、80％或更高、85％或更高、90％或更高、91％或更高、92％或更高、93％或更高、94％或更高、95％或更高、96％或更高、97％或更高、98％或更高、99％或更高百分比。片段可优选地包括与SEQ ID NO:6具有95％或更高、96％或更高、97％或更高、98％或更高、或99％或更高同源性的SEQ ID NO:6的片段，并且另外包含当计算同源性百分比时未被包括的N端甲硫氨酸或异源信号肽。片段还可包括N端甲硫氨酸和/或信号肽如免疫球蛋白信号肽，例如IgE或IgG信号肽。N端甲硫氨酸和/或信号肽可连接至所述片段。
核酸序列SEQ ID NO:5的片段可与全长100％相同，除了5’和/或3’末端缺失至少一个核苷酸，在每种情况中，在第1位具有或不具有编码信号肽和/或甲硫氨酸的序列。片段可包括不包括所添加的任何异源信号肽的全长编码序列SEQ ID NO:5的长度的60％或更高、65％或更高、70％或更高、75％或更高、80％或更高、85％或更高、90％或更高、91％或更高、92％或更高、93％或更高、94％或更高、95％或更高、96％或更高、97％或更高、98％或更高、99％或更高百分比。片段可优选地包括编码与抗原SEQ ID NO:6具有95％或更高、96％或更高、97％或更高、98％或更高、或99％或更高同源性的多肽的片段，并且另外任选地包含编码当计算同源性百分比时未被包括的N端甲硫氨酸或异源信号肽的序列。片段还可包含N端甲硫氨酸和/或信号肽如免疫球蛋白信号肽例如IgE或IgG信号肽的编码序列。编码N端甲硫氨酸和/或信号肽的编码序列可连接至所述片段。
在一些实施方案中，SEQ ID NO:5的片段可包含746或更多个核苷酸；在一些实施方案中，可包含787或更多个核苷酸；在一些实施方案中，可包含812或更多个核苷酸；并且在一些实施方案中，可包含820或更多个核苷酸。在一些实施方案中，SEQ ID NO:5的片段如本文所列出的那些片段还可包含IgE前导序列的编码序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:5的片段不包含IgE前导序列的编码序列。
在一些实施方案中，SEQ ID NO:6的片段可包含235或更多个氨基酸；在一些实施方案中，可包含248或更多个氨基酸；在一些实施方案中，可包含256或更多个氨基酸；并且在一些实施方案中，可包含259或更多个氨基酸。
SEQ ID NO:7包含编码HPV 58E6和E7蛋白的共有免疫原的核苷酸序列。SEQ IDNO:7包括连接至SEQ ID NO:7的5’末端处的核苷酸序列的IgE前导序列SEQ ID NO:9。SEQID NO:8包含HPV 58E6和E7蛋白的共有免疫原的氨基酸序列。SEQ ID NO:8包括位于共有免疫原序列的N-末端的IgE前导序列SEQ ID NO:10。IgE前导序列是SEQ ID NO:10，并且可由SEQ ID NO:9编码。
在一些实施方案中，疫苗包括SEQ ID NO:8或编码SEQ ID NO:8的核酸分子。
SEQ ID NO:8的片段可与全长100％相同，除了N和/或C端缺失至少一个氨基酸，在每种情况中，在第1位具有或不具有信号肽和/或甲硫氨酸。SEQ ID NO:8的片段可包括不包括所添加的任何异源信号肽的全长SEQ ID NO:8的长度的60％或更高、65％或更高、70％或更高、75％或更高、80％或更高、85％或更高、90％或更高、91％或更高、92％或更高、93％或更高、94％或更高、95％或更高、96％或更高、97％或更高、98％或更高、99％或更高百分比。片段可优选地包括与SEQ ID NO:8具有95％或更高、96％或更高、97％或更高、98％或更高、或99％或更高同源性的SEQ ID NO:8的片段，并且另外包含当计算同源性百分比时未被包括的N端甲硫氨酸或异源信号肽。片段还可包括N端甲硫氨酸和/或信号肽如免疫球蛋白信号肽，例如IgE或IgG信号肽。N端甲硫氨酸和/或信号肽可连接至所述片段。
核酸序列SEQ ID NO:7的片段可与全长100％相同，除了5’和/或3’末端缺失至少一个核苷酸，在每种情况中，在第1位具有或不具有编码信号肽和/或甲硫氨酸的序列。片段可包括不包括所添加的任何异源信号肽的全长编码序列SEQ ID NO:7的长度的60％或更高、65％或更高、70％或更高、75％或更高、80％或更高、85％或更高、90％或更高、91％或更高、92％或更高、93％或更高、94％或更高、95％或更高、96％或更高、97％或更高、98％或更高、99％或更高百分比。片段可优选地包括编码与抗原SEQ ID NO:8具有95％或更高、96％或更高、97％或更高、98％或更高、或99％或更高同源性的多肽的片段，并且另外任选地包含编码当计算同源性百分比时未被包括的N端甲硫氨酸或异源信号肽的序列。片段还可包含N端甲硫氨酸和/或信号肽如免疫球蛋白信号肽例如IgE或IgG信号肽的编码序列。编码N端甲硫氨酸和/或信号肽的编码序列可连接至所述片段。
在一些实施方案中，SEQ ID NO:7的片段可包含752或更多个核苷酸；在一些实施方案中，可包含794或更多个核苷酸；在一些实施方案中，可包含819或更多个核苷酸；并且在一些实施方案中，可包含827或更多个核苷酸。在一些实施方案中，SEQ ID NO:7的片段如本文所列出的那些片段还可包含IgE前导序列的编码序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:7的片段不包含IgE前导序列的编码序列。
在一些实施方案中，SEQ ID NO:8的片段可包含235或更多个氨基酸；在一些实施方案中，可包含249或更多个氨基酸；在一些实施方案中，可包含257或更多个氨基酸；并且在一些实施方案中，可包含260或更多个氨基酸。
SEQ ID NO:17包含编码HPV 31E6和E7蛋白的共有免疫原的核苷酸序列。SEQ IDNO:17包括连接至SEQ ID NO:17的5’末端处的核苷酸序列的IgE前导序列SEQ ID NO:9。SEQID NO:18包含HPV 31E6和E7蛋白的共有免疫原的氨基酸序列。SEQ ID NO:18包括位于共有免疫原序列的N-末端的IgE前导序列SEQ ID NO:10。IgE前导序列是SEQ ID NO:10，并且可由SEQ ID NO:9编码。
在一些实施方案中，疫苗包括SEQ ID NO:18或编码SEQ ID NO:18的核酸分子。
SEQ ID NO:18的片段可与全长100％相同，除了N和/或C端缺失至少一个氨基酸，在每种情况中，在第1位具有或不具有信号肽和/或甲硫氨酸。SEQ ID NO:18的片段可包括不包括所添加的任何异源信号肽的全长SEQ ID NO:18的长度的60％或更高、65％或更高、70％或更高、75％或更高、80％或更高、85％或更高、90％或更高、91％或更高、92％或更高、93％或更高、94％或更高、95％或更高、96％或更高、97％或更高、98％或更高、99％或更高百分比。片段可优选地包括与SEQ ID NO:18具有95％或更高、96％或更高、97％或更高、98％或更高、或99％或更高同源性的SEQ ID NO:18的片段，并且另外包含当计算同源性百分比时未被包括的N端甲硫氨酸或异源信号肽。片段还可包括N端甲硫氨酸和/或信号肽如免疫球蛋白信号肽，例如IgE或IgG信号肽。N端甲硫氨酸和/或信号肽可连接至所述片段。
核酸序列SEQ ID NO:17的片段可与全长100％相同，除了5’和/或3’末端缺失至少一个核苷酸，在每种情况中，在第1位具有或不具有编码信号肽和/或甲硫氨酸的序列。片段可包括不包括所添加的任何异源信号肽的全长编码序列SEQ ID NO:17的长度的60％或更高、65％或更高、70％或更高、75％或更高、80％或更高、85％或更高、90％或更高、91％或更高、92％或更高、93％或更高、94％或更高、95％或更高、96％或更高、97％或更高、98％或更高、99％或更高百分比。片段可优选地包括编码与抗原SEQ ID NO:18具有95％或更高、96％或更高、97％或更高、98％或更高、或99％或更高同源性的多肽的片段，并且另外任选地包含编码当计算同源性百分比时未被包括的N端甲硫氨酸或异源信号肽的序列。片段还可包含N端甲硫氨酸和/或信号肽如免疫球蛋白信号肽例如IgE或IgG信号肽的编码序列。编码N端甲硫氨酸和/或信号肽的编码序列可连接至所述片段。
在一些实施方案中，SEQ ID NO:17的片段可包含713或更多个核苷酸；在一些实施方案中，可包含752或更多个核苷酸；在一些实施方案中，可包含776或更多个核苷酸；并且在一些实施方案中，可包含784或更多个核苷酸。在一些实施方案中，SEQ ID NO:17的片段如本文所列出的那些片段还可包含IgE前导序列的编码序列。在一些实施方案中，SEQ IDNO:17的片段不包含IgE前导序列的编码序列。
在一些实施方案中，SEQ ID NO:18的片段可包含236或更多个氨基酸；在一些实施方案中，可包含249或更多个氨基酸；在一些实施方案中，可包含257或更多个氨基酸；并且在一些实施方案中，可包含259或更多个氨基酸。
SEQ ID NO:19包含编码HPV 52E6和E7蛋白的共有免疫原的核苷酸序列。SEQ IDNO:19包括连接至SEQ ID NO:19的5’末端处的核苷酸序列的IgE前导序列SEQ ID NO:9。SEQID NO:20包含HPV 52E6和E7蛋白的共有免疫原的氨基酸序列。SEQ ID NO:20包括位于共有免疫原序列的N-末端的IgE前导序列SEQ ID NO:10。IgE前导序列是SEQ ID NO:10，并且可由SEQ ID NO:9编码。
在一些实施方案中，疫苗包括SEQ ID NO:20或编码SEQ ID NO:20的核酸分子。
SEQ ID NO:20的片段可与全长100％相同，除了N和/或C端缺失至少一个氨基酸，在每种情况中，在第1位具有或不具有信号肽和/或甲硫氨酸。SEQ ID NO:20的片段可包括不包括所添加的任何异源信号肽的全长SEQ ID NO:20的长度的60％或更高、65％或更高、70％或更高、75％或更高、80％或更高、85％或更高、90％或更高、91％或更高、92％或更高、93％或更高、94％或更高、95％或更高、96％或更高、97％或更高、98％或更高、99％或更高百分比。片段可优选地包括与SEQ ID NO:20具有95％或更高、96％或更高、97％或更高、98％或更高、或99％或更高同源性的SEQ ID NO:20的片段，并且另外包含当计算同源性百分比时未被包括的N端甲硫氨酸或异源信号肽。片段还可包括N端甲硫氨酸和/或信号肽如免疫球蛋白信号肽，例如IgE或IgG信号肽。N端甲硫氨酸和/或信号肽可连接至所述片段。
核酸序列SEQ ID NO:19的片段可与全长100％相同，除了5’和/或3’末端缺失至少一个核苷酸，在每种情况中，在第1位具有或不具有编码信号肽和/或甲硫氨酸的序列。片段可包括不包括所添加的任何异源信号肽的全长编码序列SEQ ID NO:19的长度的60％或更高、65％或更高、70％或更高、75％或更高、80％或更高、85％或更高、90％或更高、91％或更高、92％或更高、93％或更高、94％或更高、95％或更高、96％或更高、97％或更高、98％或更高、99％或更高百分比。片段可优选地包括编码与抗原SEQ ID NO:20具有95％或更高、96％或更高、97％或更高、98％或更高、或99％或更高同源性的多肽的片段，并且另外任选地包含编码当计算同源性百分比时未被包括的N端甲硫氨酸或异源信号肽的序列。片段还可包含N端甲硫氨酸和/或信号肽如免疫球蛋白信号肽例如IgE或IgG信号肽的编码序列。编码N端甲硫氨酸和/或信号肽的编码序列可连接至所述片段。
在一些实施方案中，SEQ ID NO:19的片段可包含713或更多个核苷酸；在一些实施方案中，可包含752或更多个核苷酸；在一些实施方案中，可包含776或更多个核苷酸；并且在一些实施方案中，可包含784或更多个核苷酸。在一些实施方案中，SEQ ID NO:19的片段如本文所列出的那些片段还可包含IgE前导序列的编码序列。在一些实施方案中，SEQ IDNO:19的片段不包含IgE前导序列的编码序列。
在一些实施方案中，SEQ ID NO:20的片段可包含236或更多个氨基酸；在一些实施方案中，可包含249或更多个氨基酸；在一些实施方案中，可包含257或更多个氨基酸；并且在一些实施方案中，可包含259或更多个氨基酸。
SEQ ID NO:21包含编码HPV16 E6和E7蛋白的共有免疫原的核苷酸序列。SEQ IDNO:21包括连接至SEQ ID NO:21的5’末端处的核苷酸序列的IgE前导序列SEQ ID NO:9。SEQID NO:22包含HPV16E6和E7蛋白的共有免疫原的氨基酸序列。SEQ ID NO:22包括位于共有免疫原序列的N-末端的IgE前导序列SEQ ID NO:10。IgE前导序列是SEQ ID NO:10，并且可由SEQ ID NO:9编码。
在一些实施方案中，疫苗包括SEQ ID NO:22或编码SEQ ID NO:22的核酸分子。
SEQ ID NO:22的片段可与全长100％相同，除了N和/或C端缺失至少一个氨基酸，在每种情况中，在第1位具有或不具有信号肽和/或甲硫氨酸。SEQ ID NO:22的片段可包括不包括所添加的任何异源信号肽的全长SEQ ID NO:22的长度的60％或更高、65％或更高、70％或更高、75％或更高、80％或更高、85％或更高、90％或更高、91％或更高、92％或更高、93％或更高、94％或更高、95％或更高、96％或更高、97％或更高、98％或更高、99％或更高百分比。片段可优选地包括与SEQ ID NO:22具有95％或更高、96％或更高、97％或更高、98％或更高、或99％或更高同源性的SEQ ID NO:22的片段，并且另外包含当计算同源性百分比时未被包括的N端甲硫氨酸或异源信号肽。片段还可包括N端甲硫氨酸和/或信号肽如免疫球蛋白信号肽，例如IgE或IgG信号肽。N端甲硫氨酸和/或信号肽可连接至所述片段。
核酸序列SEQ ID NO:21的片段可与全长100％相同，除了5’和/或3’末端缺失至少一个核苷酸，在每种情况中，在第1位具有或不具有编码信号肽和/或甲硫氨酸的序列。片段可包括不包括所添加的任何异源信号肽的全长编码序列SEQ ID NO:21的长度的60％或更高、65％或更高、70％或更高、75％或更高、80％或更高、85％或更高、90％或更高、91％或更高、92％或更高、93％或更高、94％或更高、95％或更高、96％或更高、97％或更高、98％或更高、99％或更高百分比。片段可优选地包括编码与抗原SEQ ID NO:22具有95％或更高、96％或更高、97％或更高、98％或更高、或99％或更高同源性的多肽的片段，并且另外任选地包含编码当计算同源性百分比时未被包括的N端甲硫氨酸或异源信号肽的序列。片段还可包含N端甲硫氨酸和/或信号肽如免疫球蛋白信号肽例如IgE或IgG信号肽的编码序列。编码N端甲硫氨酸和/或信号肽的编码序列可连接至所述片段。
在一些实施方案中，SEQ ID NO:21的片段可包含736或更多个核苷酸；在一些实施方案中，可包含777或更多个核苷酸；在一些实施方案中，可包含802或更多个核苷酸；并且在一些实施方案中，可包含810或更多个核苷酸。在一些实施方案中，SEQ ID NO:21的片段如本文所列出的那些片段还可包含IgE前导序列的编码序列。在一些实施方案中，SEQ IDNO:21的片段不包含IgE前导序列的编码序列。
在一些实施方案中，SEQ ID NO:22的片段可包含238或更多个氨基酸；在一些实施方案中，可包含251或更多个氨基酸；在一些实施方案中，可包含259或更多个氨基酸；并且在一些实施方案中，可包含261或更多个氨基酸。
SEQ ID NO:23包含编码HPV18 E6和E7蛋白的共有免疫原的核苷酸序列。SEQ IDNO:23包括连接至SEQ ID NO:23的5’末端处的核苷酸序列的IgE前导序列SEQ ID NO:9。SEQID NO:24包含HPV18E6和E7蛋白的共有免疫原的氨基酸序列。SEQ ID NO:24包括位于共有免疫原序列的N-末端的IgE前导序列SEQ ID NO:10。IgE前导序列是SEQ ID NO:10，并且可由SEQ ID NO:9编码。
在一些实施方案中，疫苗包括SEQ ID NO:24或编码SEQ ID NO:24的核酸分子。
SEQ ID NO:24的片段可与全长100％相同，除了N和/或C端缺失至少一个氨基酸，在每种情况中，在第1位具有或不具有信号肽和/或甲硫氨酸。SEQ ID NO:24的片段可包括不包括所添加的任何异源信号肽的全长SEQ ID NO:24的长度的60％或更高、65％或更高、70％或更高、75％或更高、80％或更高、85％或更高、90％或更高、91％或更高、92％或更高、93％或更高、94％或更高、95％或更高、96％或更高、97％或更高、98％或更高、99％或更高百分比。片段可优选地包括与SEQ ID NO:24具有95％或更高、96％或更高、97％或更高、98％或更高、或99％或更高同源性的SEQ ID NO:24的片段，并且另外包含当计算同源性百分比时未被包括的N端甲硫氨酸或异源信号肽。片段还可包括N端甲硫氨酸和/或信号肽如免疫球蛋白信号肽，例如IgE或IgG信号肽。N端甲硫氨酸和/或信号肽可连接至所述片段。
核酸序列SEQ ID NO:23的片段可与全长100％相同，除了5’和/或3’末端缺失至少一个核苷酸，在每种情况中，在第1位具有或不具有编码信号肽和/或甲硫氨酸的序列。片段可包括不包括所添加的任何异源信号肽的全长编码序列SEQ ID NO:23的长度的60％或更高、65％或更高、70％或更高、75％或更高、80％或更高、85％或更高、90％或更高、91％或更高、92％或更高、93％或更高、94％或更高、95％或更高、96％或更高、97％或更高、98％或更高、99％或更高百分比。片段可优选地包括编码与抗原SEQ ID NO:24具有95％或更高、96％或更高、97％或更高、98％或更高、或99％或更高同源性的多肽的片段，并且另外任选地包含编码当计算同源性百分比时未被包括的N端甲硫氨酸或异源信号肽的序列。片段还可包含N端甲硫氨酸和/或信号肽如免疫球蛋白信号肽例如IgE或IgG信号肽的编码序列。编码N端甲硫氨酸和/或信号肽的编码序列可连接至所述片段。
在一些实施方案中，SEQ ID NO:23的片段可包含705或更多个核苷酸；在一些实施方案中，可包含744或更多个核苷酸；在一些实施方案中，可包含767或更多个核苷酸；并且在一些实施方案中，可包含775或更多个核苷酸。在一些实施方案中，SEQ ID NO:23的片段如本文所列出的那些片段还可包含IgE前导序列的编码序列。在一些实施方案中，SEQ IDNO:23的片段不包含IgE前导序列的编码序列。
在一些实施方案中，SEQ ID NO:24的片段可包含234或更多个氨基酸；在一些实施方案中，可包含247或更多个氨基酸；在一些实施方案中，可包含255或更多个氨基酸；并且在一些实施方案中，可包含257或更多个氨基酸。
SEQ ID NO:25包含HPV45 E6和E7蛋白的共有免疫原的氨基酸序列。SEQ ID NO:25包括位于共有免疫原序列的N-末端的IgE前导序列SEQ ID NO:10。IgE前导序列是SEQ IDNO:10，并且可由SEQ ID NO:9编码。
SEQ ID NO:26包含HPV39 E6和E7蛋白的共有免疫原的氨基酸序列。SEQ ID NO:26包括位于共有免疫原序列的N-末端的IgE前导序列SEQ ID NO:10。IgE前导序列是SEQ IDNO:10，并且可由SEQ ID NO:9编码。
存在包含氨基酸序列的组合物，所述序列选自SEQ ID NO:2；SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:6、SEQ ID NO:8；SEQ ID NO:18；SEQ ID NO:20；SEQ ID NO:22；SEQ ID NO:24；SEQ IDNO:25；或SEQ ID NO:26；或具有至少95％同源性的其片段；或其组合。在一些实施方案中，组合物包含SEQ ID NO:2；SEQ ID NO:4；SEQ ID NO:6；SEQ ID NO:8；SEQ ID NO:18；SEQ IDNO:20；SEQ ID NO:22；以及SEQ ID NO:24。在一些实施方案中，组合物包含SEQ ID NO:6；SEQ ID NO:8；SEQ ID NO:18；SEQ ID NO:20；SEQ ID NO:22；以及SEQ ID NO:24。在一些实施方案中，组合物包含SEQ ID NO:2；SEQ ID NO:4；SEQ ID NO:22；以及SEQ ID NO:24。在一些实施方案中，组合物包含SEQ ID NO:18；SEQ ID NO:20；以及SEQ ID NO:22。
氨基酸序列可为与氨基酸序列中的任一个具有至少95％同源性的片段。在一些实施方案中，氨基酸序列可为与氨基酸序列中的任一个具有至少98％同源性的片段。在一些实施方案中，氨基酸序列可为与氨基酸序列中的任一个具有至少99％同源性的片段。
根据一些实施方案，在个体中诱导针对免疫原的免疫应答的方法包括向个体施用共有免疫原的氨基酸序列，所述共有免疫原选自由以下组成的组：HPV 6E6和E7、HPV 11E6和E7、HPV 16E6和E7、HPV 18E6和E7、HPV 31E6和E7、HPV 33E6和E7、HPV 52E6和E7、HPV58E6和E7、HPV 45E6和E7，以及HPV 39E6和E7、其功能片段以及其可表达的编码序列。优选地，免疫原为共有HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV52和HPV58。优选地，免疫原为共有HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV52和HPV58。优选地，免疫原为共有HPV6、HPV11、HPV16和HPV18。优选地，免疫原为共有HPV16、HPV31和HPV52。
一些实施方案包括编码共有免疫原的氨基酸序列的分离的核酸分子，所述共有免疫原选自由以下组成的组：HPV 6E6和E7、HPV11E6和E7、HPV 16E6和E7、HPV 18E6和E7、HPV31E6和E7、HPV 33E6和E7、HPV 52E6和E7、HPV 58E6和E7、HPV 45E6和E7以及HPV 39E6和E7，以及其片段。一些实施方案包括编码共有免疫原的氨基酸序列的重组疫苗，所述共有免疫原选自由以下组成的组：HPV 6E6和E7、HPV 11E6和E7、HPV 16E6和E7、HPV 18E6和E7、HPV31E6和E7、HPV 33E6和E7、HPV 52E6和E7、HPV 58E6和E7、HPV 45E6和E7以及HPV 39E6和E7，以及其片段。一些实施方案包括包含共有免疫原的氨基酸序列的亚单位疫苗，所述共有免疫原选自由以下组成的组：HPV 6E6和E7、HPV 11E6和E7、HPV 16E6和E7、HPV 18E6和E7、HPV31E6和E7、HPV33E6和E7、HPV 52E6和E7、HPV 58E6和E7、HPV 45E6和E7以及HPV 39E6和E7，以及其片段。一些实施方案包括包含共有免疫原的氨基酸序列的减毒活疫苗和/或灭活疫苗，所述共有免疫原选自由以下组成的组：HPV 6E6和E7、HPV 11E6和E7、HPV 16E6和E7、HPV18E6和E7、HPV 31E6和E7、HPV 33E6和E7、HPV52E6和E7、HPV 58E6和E7、HPV 45E6和E7，以及HPV 39E6和E7。
存在在个体中诱导针对HPV的免疫应答的方法，所述方法包括向所述个体施用包含本文所提供的核酸序列的组合物。在一些实施方案中，所述方法还包括通过电穿孔将核酸序列引入到个体中。
在一些方面，存在在个体中诱导针对HPV的免疫应答的方法，所述方法包括向所述个体施用包含本文所提供的氨基酸序列的组合物。在一些实施方案中，所述方法还包括通过电穿孔将氨基酸序列引入到个体中。
一方面，本文的疫苗是引发针对主要发现与多种形式的头颈癌和其它形式的耳鼻喉科疾病有关的HPV亚型的免疫应答的那些疫苗，尤其所述疫苗包含HPV 6E6和E7以及HPV11E6和E7，并且优选包含两者。
另一方面，本文的疫苗是引发针对主要发现与美国之外的患者并且更具体来说亚洲的患者的多种形式的子***有关的HPV亚型的免疫应答的那些疫苗，尤其所述疫苗包含HPV 33E6和E7以及HPV58E6和E7，并且优选包含两者。
存在用于引发针对发现与子***，包括癌前期病变有关的HPV亚型的免疫应答的优选组合，其包括：HPV亚型16、18、31、33、52、58、6、11、39和45或HPV亚型16、18、31、33、52、58、6和11。这种子***的其它子组合包括：
16和18；16、18和6；16、18和11；16、18和31；16、18和33；16、18和52；16、18和58；16、18、6和11；16、18、6和31；16、18、6和33；16、18、6和52、16、18、6和58；16、18、11和31；16、18、11和33、16、18、11和52；16、18、11和58；16、18、31和33；16、18、31和52；16、18、31和58；16、18、33和52；16、18、33和58；16、18、52和58；
6、11和16；6、11和18；6、11和31；6、11和33；6、11和52；6、11和58；6、11、16和31；6、11、16和33；6、11、16和52；6、11、16和58；6、11、18和31；6、11、18和33；6、11、18和52；6、11、18和58；6、11、31和33；6、11、31和52；6、11、31和58；6、11、33和52；6、11、33和58；6、11、52和58；
6、16和31；6、16和33；6、16和52；6、16和58；6、16、31和33；6、16、31和52；6、16、31和58；6、16、33和52；6、16、33和58；6、16、52和58；
6、18和31；6、18和33；6、18和52；6、18和58；6、18、31和33；6、18、31和52；6、18、31和58；6、18、33和52；6、18、33和58；
6、31和33；6、31和52；6、31和58；6、31、33和52；6、31、33和58；
6、33和52；6、33和58；6、33、52和58；
6、52和58；
11、31和33；11、31和52；11、31和58；11、31、33和52；11、31、33和58；11、31、52和58；
11、31和52；11、31和58；11、31、52和58；
11、52和58；
16、31和33；16、31和52；16、31和58；16、31、33和52；16、31、52和58；
16、33和52；16、33和58；16、33、52和58；
18、31和33；18、31和52；18、31和58；18、31、33和52；18、31、33和58；
31、33和52；31、33和58；31、33、52和58；以及
31、52和58。
改进的疫苗包含蛋白质和编码具有使它们作为可用于诱导抗-HPV免疫应答的免疫原特别有效的表位的蛋白质的基因构建体。因此，可提供疫苗以诱导治疗或预防性免疫应答。在一些实施方案中，递送免疫原的方式是DNA疫苗、重组疫苗、蛋白质亚单位疫苗、包含免疫原的组合物、减毒疫苗或灭活疫苗。在一些实施方案中，疫苗包含选自由以下组成的组的组合：一种或多种DNA疫苗、一种或多种重组疫苗、一种或多种蛋白质亚单位疫苗、一种或多种包含免疫原的组合物、一种或多种减毒疫苗以及一种或多种灭活疫苗。
本发明的方面提供在核酸分子如质粒(作为重组疫苗的一部分和作为减毒疫苗的一部分，作为分离的蛋白质或载体的蛋白质部分)上递送蛋白质的编码序列的方法。
根据本发明的一些方面，提供预防性和/或治疗性免疫个体的组合物和方法。
DNA疫苗在美国专利号5,593,972、5,739,118、5,817,637、5,830,876、5,962,428、5,981,505、5,580,859、5,703,055、5,676,594中有所描述，并且在其中引用了优先权申请，所述专利通过引用并入本文。除了描述于那些申请中的递送方案，递送DNA的替代方法在美国专利号4,945,050和5,036,006中有所描述，所述专利均通过引用并入本文。
本发明涉及改进的减毒活疫苗、改进的灭活疫苗、和改进的使用重组载体来递送编码抗原的外源基因的疫苗、以及亚单位疫苗和糖蛋白疫苗。减毒活疫苗、使用重组载体来递送外源抗原的那些疫苗、亚单位疫苗以及糖蛋白疫苗的实例描述于美国专利号：4,510,245；4,797,368；4,722,848；4,790,987；4,920,209；5,017,487；5,077,044；5,110,587；5,112,749；5,174,993；5,223,424；5,225,336；5,240,703；5,242,829；5,294,441；5,294,548；5,310,668；5,387,744；5,389,368；5,424,065；5,451,499；5,453,364；5,462,734；5,470,734；5,474,935；5,482,713；5,591,439；5,643,579；5,650,309；5,698,202；5,955,088；6,034,298；6,042,836；6,156,319以及6,589,529中，其均以引用的方式并入本文。
当被细胞摄取时，基因构建体可保持存在于细胞中作为功能性染色体外分子和/或整合到细胞的染色体DNA中。DNA可引入细胞中，在细胞中其保持为呈一个或多个质粒形式的单独的遗传材料。或者，可整合到染色体中的线性DNA可引入到细胞中。当将DNA引入细胞中时，可以添加促进DNA整合到染色体中的试剂。适用于促进整合的DNA序列还可包括在DNA分子中。或者，可对细胞施用RNA。还涵盖提供呈线性微型染色体形式的基因构建体，包括着丝粒、端粒以及复制起点。基因构建体可在减毒活微生物或在细胞中存活的重组微生物载体中保持为遗传材料的一部分。基因构建体可以是重组病毒疫苗的基因组的一部分，其中遗传材料整合到细胞的染色体中或保持在染色体外。基因构建体包括核酸分子的基因表达所必需的调控元件。元件包括：启动子、起始密码子、终止密码子以及聚腺苷酸化信号。另外，通常需要增强子用于编码靶蛋白或免疫调节蛋白的序列的基因表达。这些元件需要可操作地连接至编码所需蛋白质的序列，并且调控元件需要在其所施用的个体中是可操作的。
起始密码子和终止密码子通常被认为是编码所需蛋白质的核苷酸序列的一部分。然而，这些元件需要在基因构建体所施用的个体中有功能。起始密码子和终止密码子必须与编码序列同框。
所使用的启动子和聚腺苷酸化信号必须在个体的细胞内有功能。
适用于实践本发明，尤其在制造人用基因疫苗中实践本发明的启动子的实例包括但不限于：来自猿猴病毒40(SV40)的启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子、人类免疫缺陷病毒(MV)如BIV长末端重复序列(LTR)启动子、莫洛尼氏病毒、ALV、巨细胞病毒(CMV)如CMV立即早期启动子、EB病毒(EBV)、劳氏肉瘤病毒(RSV)以及来自人基因如人肌动蛋白、人肌球蛋白、人血红蛋白、人肌肉肌酸和人金属硫蛋白的启动子。
适用于实践本发明，尤其在制造人用基因疫苗中实践本发明的聚腺苷酸化信号的实例包括但不限于：SV40聚腺苷酸化信号和LTR聚腺苷酸化信号。具体地说，使用在pCEP4质粒(Invitrogen,San Diego CA)中的SV40聚腺苷酸化信号，其称为SV40聚腺苷酸化信号。
除了DNA表达所需要的调控元件之外，其它元件也可包含在DNA分子中。这类另外的元件包括增强子。增强子可选自下组，所述组包括但不限于：人肌动蛋白、人肌球蛋白、人血红蛋白、人肌肉肌酸和病毒增强子，如来自CMV、RSV和EBV的那些增强子。
可提供具有哺乳动物复制起点的基因构建体以便将构建体维持在染色体外并且在细胞中产生构建体的多个拷贝。来自Invitrogen(San Diego,CA)的质粒pVAX1、pCEP4和pREP4含有EB病毒复制起点和核抗原EBNA-1编码区，该编码区产生高拷贝的附加型复制而没有整合。
在涉及免疫应用的一些优选实施方案中，递送核酸分子，所述核酸分子包含编码本发明的蛋白质的核苷酸序列，并且另外包含进一步增强针对这类靶蛋白的免疫应答的蛋白质的基因。这类基因的实例是：编码其它细胞因子和淋巴因子的那些基因，如α-干扰素、γ-干扰素、血小板源生长因子(PDGF)、TNFα、TNFβ、GM-CSF、上皮生长因子(EGF)、IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12、IL-18、MHC、CD80、CD86和IL-15(包括信号序列缺失并且任选地包含来自IgE的信号肽的IL-15)。可能有用的其它基因包括编码下列的那些基因：MCP-1、MIP-1α、MIP-1p、IL-8、RANTES、L-选择蛋白、P-选择蛋白、E-选择蛋白、CD34、GlyCAM-1、MadCAM-1、LFA-1、VLA-1、Mac-1、p150.95、PECAM、ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3、CD2、LFA-3、M-CSF、G-CSF、IL-4、IL-18的突变形式、CD40、CD40L、血管生长因子、IL-7、神经生长因子、血管内皮生长因子、Fas、TNF受体、Flt、Apo-1、p55、WSL-1、DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2、DR6、半胱天冬酶ICE、Fos、c-jun、Sp-1、Ap-1、Ap-2、p38、p65Rel、MyD88、IRAK、TRAF6、IkB、无活性NIK、SAP K、SAP-1、JNK、干扰素应答基因、NFkB、Bax、TRAIL、TRAILrec、TRAILrecDRC5、TRAIL-R3、TRAIL-R4、RANK、RANK LIGAND、Ox40、Ox40LIGAND、NKG2D、MICA、MICB、NKG2A、NKG2B、NKG2C、NKG2E、NKG2F、TAP1、TAP2及其功能片段
可添加另外的元件，如果出于任何原因希望消除接受基因构建体的细胞，则所述元件充当用于细胞破坏的靶标。可表达形式的疱疹病毒胸苷激酶(tk)基因可包含在基因构建体中。药物更昔洛韦可施用至个体并且所述药物将引起任何产生tk的细胞的选择性杀死，由此提供选择性破坏具有基因构建体的细胞的方式。
为了最大化蛋白质制备，可选择调控序列，所述调控序列非常适用于构建体所施用的细胞中的基因表达。此外，可选择在细胞中最高效地转录的密码子。本领域技术人员可制备在细胞中具有功能的DNA构建体。
在一些实施方案中，可提供基因构建体，其中本文所述的蛋白质的编码序列连接至IgE信号肽。在一些实施方案中，本文所述的蛋白质连接至IgE信号肽。
在使用蛋白质的一些实施方案中，例如使用熟知的技术，本领域技术人员可使用熟知的技术来制备和分离本发明的蛋白质。在使用蛋白质的一些实施方案中，例如，本领域技术人员可使用熟知的技术来将编码本发明的蛋白质的DNA分子***在熟知表达***中使用的市售表达载体中。例如，市售质粒pSE420(Invitrogen,San Diego,Calif.)可用于大肠埃希氏菌(E.coli)中蛋白质的制备。市售质粒pYES2(Invitrogen,San Diego,Calif.)可例如用于酵母的酿酒酵母(S.cerevisiae)菌株中的制备。市售MAXBACTM完整杆状病毒表达***(Invitrogen,San Diego,Calif.)可例如用于在昆虫细胞中的制备。市售质粒pcDNA I或pcDNA3(Invitrogen,San Diego,Calif.)可例如用于在哺乳动物细胞如中国仓鼠卵巢细胞中的制备。本领域技术人员可使用这些商业表达载体和***或其它载体和***来通过常规技术和可容易获得的起始材料制备蛋白质。(例如参见Sambrook等,Molecular Cloning aLaboratory Manual,第二版Cold Spring Harbor Press(1989)，其以引用的方式并入本文)。因此，所需蛋白质可在原核和真核***两者中制备，从而产生一系列加工形式的蛋白质。
本领域技术人员可使用其它市售表达载体和***或使用熟知方法和可容易获得的起始材料来制备载体。含有需要的控制序列(如启动子和聚腺苷酸化信号、并且优选增强子)的表达***对于多种宿主来说是容易获得的和本领域已知的。例如参见Sambrook等,Molecular Cloning a Laboratory Manual,第二版Cold Spring Harbor Press(1989)。基因构建体包括可操作地连接至启动子的蛋白质编码序列，所述启动子在构建体所转染的细胞系中具有功能。组成型启动子的实例包括来自巨细胞病毒或SV40的启动子。可诱导启动子的实例包括小鼠乳腺白血病病毒或金属硫蛋白启动子。本领域技术人员可由可容易获得的起始材料容易地制备适用于使用编码本发明的蛋白质的DNA转染细胞的基因构建体。使用包含编码蛋白质的DNA的表达载体来转化相容性宿主，然后培养所述宿主并保持在其中发生外源DNA表达的条件下。
制备的蛋白质通过使细胞裂解来从培养物中回收或者从对于本领域技术人员来说适当和已知的培养基中回收。本领域技术人员可使用熟知技术分离使用这类表达***制备的蛋白质。使用如上所述特异性结合特定的蛋白质的抗体从天然来源纯化蛋白质的方法可同样应用于通过重组DNA方法制备的蛋白质的纯化。
除了通过重组技术来制备蛋白质，还可以使用自动肽合成器来制备分离的基本上纯的蛋白质。这类技术是本领域技术人员熟知的，并且适用于具有DNA-编码的蛋白质制备中未提供的取代的衍生物。
核酸分子可使用若干种熟知的技术中的任一种来递送，所述技术包括DNA注射(也称为DNA疫苗接种)、重组载体，如重组腺病毒、重组腺病毒相关病毒和重组牛痘。
施用途径包括但不限于肌内、鼻内、腹膜内、皮内、皮下、静脉内、动脉内、眼内和口服以及局部、透皮、通过吸入或栓剂施用、或对粘膜组织施用，如通过灌洗***、直肠、尿道、口腔和舌下组织施用。优选的施用途径包括肌内、腹膜内、皮内和皮下注射。基因构建体可通过这样的方式来施用，所述方式包括但不限于电穿孔方法和装置、传统注射器、无针注射装置或"微弹轰击基因枪法"。
优选用于促进DNA疫苗的递送的电穿孔装置和电穿孔方法的实例包括由Draghia-Akli等在美国专利号7,245,963、由Smith等提交的美国专利公布2005/0052630中描述的那些，所述专利的内容在此通过引用整体并入。还优选的是，于共同待决和共同拥有的美国专利申请序列号11/874072中提供的用于促进DNA疫苗的递送的电穿孔装置和电穿孔方法，所述美国专利申请提交于2007年10月17日，并且在35USC 119(e)下要求下列申请的优先权：2006年10月17日提交的美国临时申请序列号60/852,149和2007年10月10日提交的美国临时申请序列号60/978,982，其均以引用的方式整体并入本文。
以下是使用电穿孔技术的实施方案的实例，并且在上述专利参考文献中更详细地讨论：电穿孔装置可被配置为递送产生类似于用户输入的预设电流的恒定电流的能量脉冲至哺乳动物的期望组织。电穿孔装置包括电穿孔部件和电极组件或手柄组件。电穿孔部件可包括且并有电穿孔装置的多种元件中的一种或多种，包括：控制器、电流波形产生器、阻抗试验器、波形记录仪、输入元件、状态报告元件、通信端口、记忆部件、电源和电源开关。电穿孔部件可充当电穿孔装置的一个元件，并且其它元件是与所述电穿孔部件通信的单独元件(或部件)。在一些实施方案中，电穿孔部件可充当电穿孔装置的多于一个元件，其可与电穿孔装置的独立于所述电穿孔部件的其它元件通信。使用电穿孔技术递送改进的HPV疫苗不受到现存作为一个机电或机械装置的部分的电穿孔装置的元件的限制，因为所述元件可充当与彼此通信的一个装置或单独元件。电穿孔部件能够递送在期望组织中产生恒定电流的能量脉冲，并且包括反馈机制。电极组件包括在空间布置中具有多个电极的电极阵列，其中电极组件从电穿孔部件接收能量脉冲，并且通过电极将所述能量脉冲递送至期望组织。多个电极中的至少一个在能量脉冲的过程中是中性的，并且测量期望组织中的电阻和将电阻通知电穿孔部件。反馈机制可接收所测量到的电阻，并且可调整由电穿孔部件递送的能量脉冲以保持恒定电流。
在一些实施方案中，多个电极可以分散型式来递送能量脉冲。在一些实施方案中，多个电极可以分散型式通过控制电极在编程序列下递送能量脉冲，并且编程序列由用户输入至电穿孔部件。在一些实施方案中，编程序列包含依序递送的多个脉冲，其中多个脉冲中的各脉冲通过至少两个有效电极(其中有一个中性电极测量电阻)来递送，并且其中多个脉冲的后续脉冲通过至少两个有效电极(其中有一个中性电极测量电阻)中的不同的那个来递送。
在一些实施方案中，反馈机制通过硬件或软件来执行。优选地，反馈机制通过模拟闭环电路来执行。优选地，该反馈每隔50μs、20μs、10μs或1μs发生，但优选是实时反馈或瞬时的(即，如通过用于测定应答时间的可用技术所测定，其基本上是瞬时的)。在一些实施方案中，中性电极测量期望组织中的电阻并将电阻通知反馈机制，并且反馈机制回应于电阻并调整能量脉冲以使恒定电流维持在类似于预设电流的数值下。在一些实施方案中，反馈机制在能量脉冲递送的过程中连续和瞬时地维持恒定电流。
在一些实施方案中，核酸分子是结合多核苷酸功能增强子或基因疫苗促进剂的施用而递送至细胞。多核苷酸功能增强子描述于美国序列号5,593,972、5,962,428和1994年1月26日提交的国际申请序列号PCT/US94/00899，其均以引用的方式并入本文。基因疫苗促进剂在1994年4月1日提交的美国序列号021,579中有所描述，其通过引用并入本文。结合核酸分子施用的辅剂可作为与核酸分子的混合物来施用，或者在核酸分子施用的同时、之前或之后单独施用。另外，可用作转染剂和/或复制剂和/或炎症剂并且可与GVF共同施用的其它药剂包括：生长因子、细胞因子和淋巴因子，如a-干扰素、γ-干扰素、GM-CSF、血小板源生长因子(PDGF)、TNF、表皮生长因子(EGF)、IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-12和IL-15以及成纤维细胞生长因子、表面活性剂如免疫刺激性复合物(ISCOMS)、弗氏不完全佐剂、LPS类似物(包括单磷酰基脂质A(WL))、胞壁肽、醌类似物和囊泡如三十碳六烯和角鲨烯，并且透明质酸也可与基因构建体结合而使用施用。在一些实施方案中，免疫调节蛋白也可用作GVF。在一些实施方案中，联合提供核酸分子与PLG以增强递送/摄取。
根据本发明的药物组合物包含约1纳克至约2000微克DNA。在一些优选实施方案中，根据本发明的药物组合物包含约5纳克至约1000微克DNA。在一些优选实施方案中，药物组合物含有约10纳克至约800微克DNA。在一些优选实施方案中，药物组合物含有约0.1至约500微克DNA。在一些优选实施方案中，药物组合物含有约1至约350微克DNA。在一些优选实施方案中，药物组合物含有约25至约250微克DNA。在一些优选实施方案中，药物组合物含有约100至约200微克DNA。
根据本发明的药物组合物根据所使用的施用方式来进行配制。在药物组合物是可注射的药物组合物的情况下，它们是无菌、无热原质和无颗粒的。优选使用等渗制剂。通常，用于等渗性的添加剂可包括氯化钠、右旋糖、甘露糖醇、山梨糖醇和乳糖。在一些情况下，等渗溶液如磷酸盐缓冲盐水是优选的。稳定剂包括明胶和白蛋白。在一些实施方案中，将血管收缩剂添加至制剂中。
根据本发明的一些实施方案，提供诱导免疫应答的方法。疫苗可以是基于蛋白质的、活减毒疫苗、细胞疫苗、重组疫苗或核酸或DNA疫苗。在一些实施方案中，在个体中诱导针对免疫原的免疫应答的方法(包括诱导粘膜免疫应答的方法)包括向个体施用下列中的一种或多种：CTACK蛋白、TECK蛋白、MEC蛋白及其功能片段、或其可表达的编码序列，与编码本发明的蛋白质的分离的核酸分子、和/或编码本发明的蛋白质的重组疫苗、和/或包含本发明的蛋白质的亚单位疫苗、和/或活减毒疫苗和/或灭活疫苗的组合。CTACK蛋白、TECK蛋白、MEC蛋白及其功能片段中的一种或多种可在下列物质施用之前、同时或之后施用：编码免疫原的分离的核酸分子、和/或编码免疫原的重组疫苗、和/或包含免疫原的亚单位疫苗、和/或活减毒疫苗和/或灭活疫苗。在一些实施方案中，向个体施用编码选自由以下各项组成的组的一种或多种蛋白质的分离的核酸分子：CTACK、TECK、MEC及其功能片段。
在下列实施例中进一步说明了本发明。应理解，此实施例尽管指出了本发明的实施方案，但是其仅以说明的方式给出。根据上述讨论和此实施例，本领域技术人员可确定本发明的实质性特性，并且在不偏离本发明的精神和范围的情况下，可对本发明进行各种改变和修改以使其适应各种用途和条件。因此，除了本文中示出和描述的修改之外，根据先前的描述，本发明的各种修改对于本领域技术人员来说将是显而易见的。这类修改也意在属于所附权利要求书的范围内。
本公开通篇中引用的美国专利、美国申请和引用文献各自均以引用的方式整体并入本文。
实施例
本发明在下列实施例中进行进一步限定。应理解，这些实施例尽管指出本发明的优选实施方案，但是其仅以说明的方式给出。根据上述讨论和这些实施例，本领域技术人员可确定本发明的实质性特性，并且在不偏离本发明的精神和范围的情况下，可对本发明进行各种改变和修改，以使其适应各种用途和条件。因此，除了本文中示出和描述的那些修改之外，根据先前的描述，本发明的各种修改对于本领域技术人员来说将是显而易见的。这类修改也意在属于所附权利要求书的范围内。
实施例1
编码E6/E7融合蛋白的新型工程化HPV-16DNA疫苗
免疫原已设计成表达为多聚蛋白，由此E6和E7序列由蛋白水解切割位点间隔。多聚蛋白还可被表达具有IgE前导序列。多聚蛋白设计包括E6序列中的缺失或突变，这对于E7蛋白上核糖体结合位点中的p53结合和降解以及突变是重要的。
将编码多聚蛋白(SEQ ID NO:22)的HPV16 E6/E7(SEQ ID NO:21)的编码序列***载体pVAX中以产生表达质粒。优化的人***状瘤病毒16-6&7抗原(HPV16 E6&7)，使用包括卡那霉素抗性基因(Kan)和质粒复制起点(pUC ori)的pVAX主链，由CMV启动子(PCMV)驱动，具有牛生长激素3'末端聚腺苷酸化信号(bGHpA)。
HPV18 E6/E7疫苗设计和表达
制备人***状瘤病毒(HPV)病毒蛋白18E6&7的优化的共有序列。序列被设计用于高水平的表达。该序列在我们的基因免疫技术中是有用的。来自使用共有序列进行的实验的结果是阳性的。质粒构建体包括共有HPV 18-6&7(SEQ ID NO:23)的核酸序列。掺入质粒中的共有HPV 18-6&7的核酸序列包括连接至共有HPV 18-6&7的编码序列的IgE前导肽的编码序列。
产生表达优化的人***状瘤病毒18-6&7抗原(HPVI8 E6&7)(SEQ ID NO:24)的表达质粒pGX3002，其使用包括卡那霉素抗性基因(Kan)和质粒复制起点(pUC ori)的pVAX主链，由CMV启动子(PCMV)驱动，具有牛生长激素3'末端和聚腺苷酸化信号(bGHpA)。
HPV6和HPV11 E6/E7疫苗设计和表达
HPV6和11E6/E7共有序列基融合免疫原的构建
从基因库收集6或11型HPV E6和E7基因序列，并且在进行多重比对之后获得共有E6和E7核苷酸序列。HPV 6E6或E7蛋白质的共有序列分别从98或20个序列产生，而HPV 11E6或E7蛋白质的共有序列分别从76或13个序列产生。在***发生研究中应用的多重比对程序包括Clustal X(版本2.0)的应用。如图1A和图1B所示，在其E6和E7蛋白质属于相同类型的HPV病毒株中存在约0-2％的序列分歧。然而，在HPV 6和11之间，E6蛋白质中的基因距离高达19.3％，而E7蛋白质中的基因距离高达16.3％。基于这些来自***发生分析的结果，我们开发出两种类型特异性的E6/E7共有DNA疫苗。
在产生共有E6/E7融合序列之后进行若干修饰(图1C)。将高效的前导序列同框融合在起始密码子上游以促进表达。还如先前所述进行密码子和RNA优化(J.Yan等,Cellularimmunity induced by a novel HPV18 DNA vaccine encoding an E6/E7 fusionconsensus protein in mice and rhesus macaques,Vaccine.26(2008)5210-5215；和J.Yan等,Induction of antitumor immunity in vivo following delivery of a novelHPV-16DNA vaccine encoding an E6/E7 fusion antigen,Vaccine.27(2009)431-440)。内切蛋白水解裂解位点引入在E6和E7蛋白质之间以用于恰当蛋白折叠和更好的CTL加工。合成的工程化6E6E7基因和11E6E7基因的长度均为840bp。将序列验证的合成基因分别亚克隆至pVAX表达载体的BamHI和XhoI位点用于进一步研究。通过翻译共有核苷酸序列获得共有氨基酸序列。
在获得HPV 6和11共有E6和E7序列之后，如先前所述进行密码子优化和RNA优化(J.Yan等,Vaccine.26(2008)5210-5215；和J.Yan等,Induction,Vaccine.27(2009)431-440)。合成编码6或11型HPV共有E6/E7融合蛋白(6E6E7或11E6E7)的融合基因并进行序列验证。合成的6E6E7或11E6E7用BamHI和XhoI消化，克隆至表达载体pVAX(Invitrogen)中受巨细胞病毒即刻早期启动子控制，并且将这些构建体称为p6E6E7或p11E6E7。
293-T细胞在6孔板中培养，并且使用FuGENE6转染试剂(Roche Applied Science,Indianapolis,IN)用pVAX、p6E6E7或p11E6E7转染。转染之后两天，使用改良的RIPA细胞裂解缓冲液使细胞裂解并且收集细胞裂解物。使用抗-HA单克隆抗体进行蛋白质印迹分析(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)并且使用ECLTM蛋白质印迹分析***(Amersham,Piscataway,NJ)使用辣根过氧化物酶偶联的山羊抗-小鼠IgG(Sigma-Aldrich,St Louis,MO)进行观测。
使用人横纹肌肉瘤细胞(RD细胞)进行间接免疫荧光测定以验证p6E6E7和p11E6E7的表达。在室玻片中培养的RD细胞使用Turbofectin 8.0(Origene,Rockville,MD)用pVAX、p6E6E7或p11E6E7转染。然后，细胞用PFA固定并用0.1％Triton-X的PBS溶液进行渗透。用一级抗体和二级抗体对细胞进行1-2小时的孵育，另外在孵育之间用补充有甘氨酸和BSA的PBS洗涤。所使用的一级抗体和二级抗体分别是单克隆小鼠抗-HA(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)和FITC-偶联的抗小鼠IgG(Abcam,Cambridge,MA)。还进行Hoechst染色以鉴定细胞核并定位RD细胞。在完成全部孵育之后，将细胞置于装有Fluoromount-G(SouthernBiotech,Birmingham,AL)的载玻片上。样品用共聚焦显微镜(CDB Microscopy Core,University of Pennsylvania Cell and Developmental Biology,Philadelphia,PA)观察并成像。
HPV 31、33、39、45、52和58E6E7抗原
从基因库单独地收集31、33、39、45、52和58型HPV E6和E7基因序列，并且在进行多重比对(31型-SEQ ID NO:18；33型-SEQ ID NO:6；52型-SEQ ID NO:20；以及58型-SEQ IDNO:8)之后获得共有E6和E7核苷酸序列。在***发生研究中应用的多重比对程序包括Clustal X(版本2.0)的应用。基于来自***发生分析的结果，我们开发出类型特异性的E6/E7共有DNA疫苗。
在产生共有E6/E7融合序列之后进行若干修饰。将高效的前导序列同框融合在起始密码子上游以促进表达。还如先前所述进行密码子和RNA优化(J.Yan等,Cellularimmunity induced by a novel HPV18 DNA vaccine encoding an E6/E7 fusionconsensus protein in mice and rhesus macaques,Vaccine.26(2008)5210-5215；和J.Yan等,Induction of antitumor immunity in vivo following delivery of a novelHPV-16 DNA vaccine encoding an E6/E7 fusion antigen,Vaccine.27(2009)431-440)。内切蛋白水解裂解位点引入在E6和E7蛋白质之间以用于恰当蛋白折叠和更好的CTL加工。将序列验证的合成基因分别亚克隆至pVAX表达载体的BamHI和XhoI位点用于进一步研究。通过翻译共有核苷酸序列获得共有氨基酸序列。
产生表达优化的人***状瘤病毒31、33、52和58-E6&7抗原(HPV31 E6&7-SEQ IDNO:17、HPV33 E6&7-SEQ ID NO:5、HPV52E6&7-SEQ ID NO:19和HPV58 E6&7-SEQ ID NO:7)的表达质粒，其使用包括卡那霉素抗性基因(Kan)和质粒复制起点(pUC ori)的pVAX主链，由CMV启动子(PCMV)驱动，具有牛生长激素3'末端聚腺苷酸化信号(bGHpA)。同样，产生包括为优化的人***状瘤病毒39和45E6&E7抗原(编码SEQ ID NO:26的HPV39 E6&E7序列；和编码SEQ ID NO:25的HPV45 E6&E7序列)的***物的表达质粒。
实施例2
小鼠和处理组疫苗接种
在此实验中使用6至8周龄之间的C57BL/6雌性小鼠。小鼠是从杰克逊实验室(BarHarbor,ME)获得。小鼠由宾夕法尼亚大学(Philadelphia,PA)的University LaboratoryAnimal Resources在遵守国立卫生研究院和宾夕法尼亚大学实验动物管理和使用委员会(IACUC)的政策下圈养和维持。将用于这些实验的小鼠分成四组用于免疫。小鼠用p6E6E7、p11E6E7或这两种构建体进行免疫并且pVAX组用作阴性对照。
DNA疫苗接种和电穿孔
每个小鼠以14天的间隔接受三个剂量的20μg各DNA质粒。接受p6E6E7和p11E6E7两者的组中的小鼠接受20μg的两种质粒，每次疫苗接种共计40μg DNA。DNA构建体经由肌内注射右四头肌来施用，随后通过CELLECTRATM电穿孔仪(Inovio Pharmaceuticals,Blue Bell,PA)产生方波脉冲。电穿孔仪被配置用来在0.2Amps下以52ms/脉冲、间隔1秒延迟递送两个电脉冲。如先前所述进行电穿孔程序[12、13]。
IFN-γELISpot测定
处理组和对照组的小鼠都在第三次免疫1周后处死。从每个小鼠收集脾脏并将其转移至具有10％FBS和抗生素的RPMI-1640培养基(R10)中。使用均质袋(stomacher)(Seward Laboratory Systems,Bohemia,NY)将脾脏粉碎并随后转移通过细胞滤网并悬浮在ACK裂解缓冲液中。在去除红细胞之后，分离脾细胞并悬浮于R10培养基中。高蛋白IP 96孔MultiscreenTM板(Millipore,Bedford,MA)用单克隆小鼠IFN-γ捕捉抗体(R&D Systems,Minneapolis,MN)预涂覆并在4℃下孵育过夜。在用1X PBS洗涤三次之后，在环境温度下将板用1％BSA和5％蔗糖的1×PBS溶液封闭2小时。对R10培养基中的分离的脾细胞进行计数并且以每孔2×105个细胞一式三份地添加至孔中。涵盖HPV6和HPV11的共有E6/E7序列的两组肽在DMSO(GenScript USA,Piscataway,NJ)中复原。所述肽含有15个氨基酸序列，其中8个残基与每个连续肽重叠。将HPV6和HPV11肽以在DMSO中2μg/mL的浓度各自分成两个池—一个池是E6且另一个池是E7。保留用于阳性对照和阴性对照的孔分别接收刀豆素A(Concavalin A)(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)和R10培养基代替肽。随后将板放置在5％CO2气氛孵育器中。在37℃下孵育24小时之后，用1×PBS洗涤孔。将生物素化的抗小鼠IFN-γ检测抗体(R&D Systems,Minneapolis,MN)添加至每个孔中并且接着在4℃下孵育过夜。随后洗涤板并按照R&D Systems提供的显色方案使用抗生蛋白链菌素-AP和BCIP/NBT Plus(R&D Systems,Minneapolis,MN)进行处理。将孔风干过夜，并且通过装有
Figure BDA0003440678440000531
和
Figure BDA0003440678440000532
软件的ELISpot板读取***(Cellular Technology Ltd.,ShakerHeights,OH)对孔内的斑点进行扫描并计数。使用算法转换所报告的斑点形成细胞计数以表示每1×106个脾细胞的斑点形成单位。
考虑到IFN-γELISpot测定的灵敏度和说明T细胞活性的能力，使用它们来测定响应于HPV 6或11E6和E7肽刺激的抗原特异性IFN-γ分泌细胞的数目。
如图3A和图3B所示，接种p6E6E7的小鼠的SFU/106脾细胞的平均数是1442.8，而接种p11E6E7的小鼠的SFU/106的平均数是2845，这都显著大于阴性对照组。因此，p6E6E7和p11E6E7都对在小鼠中引发稳固的类型特异性E6和E7特异性免疫应答有效。
有趣的是，接种p6E6E7或p11E6E7也诱导交叉反应性细胞免疫应答。在p11E6E7免疫的小鼠中针对HPV 6E6/E7肽的SFU/106个脾细胞的加和频率是552.8SFU/106个脾细胞，而p6E6E7免疫的小鼠中的HPV 11E6/E7特异性免疫应答是888.3SFU/106个脾细胞。HPV 6或11的E6蛋白共享约80％的同一性，而HPV 6或11的E7蛋白共享约84％的同一性。在HPV 6或11E6和E7抗原之间可能存在一些共享的免疫表位。从IFN-γELISpot测定中观察到的交叉反应性表明在HPV 6和11E6和E7抗原之间存在共享的免疫表位。
也使来自接受p6E6E7和p11E6E7两者的小鼠(组合组)的脾细胞经受以上ELISpot测定，以便检验当一起接种这两种构建体时是否存在任何免疫干扰(图3A和图3B)。组合组针对HPV6 E6和E7肽展现出平均1670SFU/106个脾细胞(σ＝55.7，p<0.001)。同一组的脾细胞针对HPV11 E6和E7肽产生2010SFU/106个脾细胞(σ＝247.8，p＝0.002)。数据表明并行接种所述两种构建体可针对HPV6和HPV11引发统计上显著的E6和E7特异性细胞应答，并且这些应答互不干扰。
表位作图
进行表位作图研究以确定肽池内的优势表位，以便确定E6/E7共有抗原内的免疫优势肽(图4A和图4B)。所述研究与先前提及的IFN-γELISpot测定类似进行。使用个别的肽而非池来刺激脾细胞。
用于此单肽分析中的每个肽代表HPV6或HPV11的E6和E7抗原的部分重叠的片段。作图数据表明肽7(TAEIYSYAYKQLKVL)SEQ ID NO:11是HPV6 E6和E7免疫原的优势表位(图4A)。TAEIYSYAYKQLKVL SEQ ID NO:11包含8、9、10-mer氨基酸表位，所述表位经NIH BIMAS提供的HLA-结合预测软件验证是H2-Kb限制型表位。为了进一步描述HPV11 E6和E7特异性T细胞免疫应答(图4B)。还用HPV11 E6和E7的重叠片段进行了肽分析。肽作图显示HPV 11E6和E7抗原的优势表位是肽7(TAEIYAYAYKNLKVV)SEQ ID NO:12和27(HCYEQLEDSSEDEVD)SEQID NO:13。与HPV6表位作图测定中的肽7一样，BIMAS HLA-结合预测软件确定TAEIYAYAYKNLKVV SEQ ID NO:12是H2-Kb限制型表位。另一个HLA-结合肽数据库，由NIHNIAID提供的免疫表位数据库和分析资源(Immune Epitope Database and AnalysisResource)确定HCYEQLEDSSEDEVD SEQ ID NO:13是H2-Kb限制型表位。通过此表位作图研究鉴定了三种免疫亚优势肽：第6号(FCKNALTTAEIYSYA)SEQ ID NO:14、第9号(LFRGGYPYAACACCL)SEQ ID NO:15以及第13号(YAGYATTVEEETKQD)SEQ ID NO:16。
细胞内细胞因子染色
根据IFN-γELISpot测定所描绘的高免疫应答，进行细胞内细胞因子染色测定以提供对p6E6E7和p11E6E7所诱导的细胞应答的更全面的概观。自疫苗接种小鼠组和未处理小鼠组分离脾细胞并在37℃下5％CO2环境中用涵盖HPV6和HPV11的E6和E7区域的肽刺激4小时。通过将细胞分别放置在佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(PMA)和R10细胞培养基中在测定中使用阳性和阴性对照。在孵育之后，细胞首先用ViViD染料(Invitrogen,Carlsbad,CA)染色以区分活细胞和死细胞，接着所有的细胞用下列表面标记抗体染色：APC-Cy7仓鼠抗小鼠CD3e、PerCP-Cy5.5大鼠抗小鼠CD4和APC大鼠抗小鼠CD8a(BD Biosciences,SanDiego,CA)。细胞随后使用Cytofix/Cytoperm试剂盒(BD Biosciences,San Diego,CA)固定。在按照制造商方案固定之后，细胞用下列细胞内标记抗体染色：Alexa Fluor 700大鼠抗小鼠IFN-γ、PE-Cy7大鼠抗小鼠TNF克隆和PE大鼠抗小鼠IL-2(BD Biosciences,SanDiego,CA)。染色之后，细胞用含2％多聚甲醛的PBS溶液固定。制备的细胞使用装有BDFACSDiva软件的LSR II流式细胞仪(BD Biosciences,San Jose,CA)来获取。所获取的数据使用最新版本的FlowJo软件(Tree Star,Ashland,OR)进行分析。使用下列门序列来分离CD4+和CD8+事件：来自FSC-A对FSC-H的单线态、来自FSC-A对SSC-A的所有脾细胞、来自ViViD染料(Pacific Blue)对SSC-A的活细胞、来自CD3(APC-Cy7)对SSC-A的CD3+细胞以及来自CD4(PerCP-Cy5.5：阳性–CD4+，阴性–CD8+)对SSC-A的CD4+或CD8+。后两个群体分别针对Alexa Fluor 700、PE-Cy7和PE进行门控以观察IL-2、IFN-γ和TNF-α产生的变化。
对细胞进行门控以使得细胞内细胞因子染色数据可通过CD4+和CD8+细胞应答进行区分。当用HPV6 E6和E7特异性肽刺激时，接种p6E6E7的小鼠分别展现出0.163％(σ＝0.09)、0.003％(σ＝0.07)和0.188％(σ＝0.20)的产生IFN-γ、TNF-α和IL-2的总CD4+细胞的平均值(图5A)。同一组的小鼠分别具有3.323％(σ＝1.39)、0.838％(σ＝0.32)和1.172％(σ＝1.81)的产生IFN-γ、TNF-α和IL-2的总CD8+细胞的平均值。在用HPV11 E6和E7抗原孵育之后使用接种p11E6E7的小鼠的脾细胞收集相同的细胞内细胞因子数据(图5B)。在p11E6E7接种小鼠的所有CD4+细胞当中，平均为0.051％(σ＝0.04)产生IFN-γ、0.068％(σ＝0.09)产生TNF-α，并且0.026％(σ＝0.037)产生IL-2。另外，在p11E6E7接种小鼠的所有CD8+细胞当中，产生IFN-γ、TNF-α和IL-2的平均值分别为4.52％(σ＝2.53)、2.08％(σ＝1.56)和0.21％(σ＝0.22)。除了少数组之外，处理组与它们相应未处理组相比，产生细胞因子的细胞的百分比具有统计学显著性，置信水平为89％或更高。观察了CD4+细胞与CD8+T细胞的细胞因子产生的量值的比较，可得到结论：由p6E6E7和p11E6E7引发的免疫应答高度趋向于驱动CD8+淋巴细胞，所述免疫应答在所有模型中与它们的细胞清除率相关联。
统计学分析
进行学生t检验以分析此研究中所产生的所有定量数据的统计学显著性。除非另外指出，否则p值被计算来确定不同置信水平下的统计学显著性。
此研究已显示出有力的证据证明DNA疫苗能够实现在使用其它流行且传统的疫苗平台的实验中发现的免疫原性水平。在其它类似的E6和E7特异性HPV DNA疫苗研究中测量的高水平的细胞应答与表明预防性和治疗性抗瘤功效的数据相关联。大多数HPV相关性研究和疾病挑战模型聚焦于子***。考虑到HPV6和HPV11不像其它HPV血清型那样与子***相关，p6E6E7和p11E6E7的治疗功效不能完全使用常规HPV疾病挑战模型来评估。可预见在可获得适当的疾病挑战模型时确定p6E6E7和p11E6E7的保护和治疗潜力。因此，人们只能够通过观察由ELISpot测定和细胞内细胞因子染色定量的IFN-γ和细胞因子产生的高水平来推断p6E6E7和p11E6E7的免疫原性功效。然而，发现这类水平的量值明显较高并且显示出两种构建体将引发高水平的细胞免疫应答的前景。由于HPV相关性恶性肿瘤通常继发于多种血清型的并发感染，所以急需进一步研究组合靶向不同病毒血清型的疫苗的可行性。保证研究T细胞动力学和疫苗竞争的未来研究进一步表征两种质粒的并行疫苗接种的效果。
细胞内细胞因子染色显示接种p6E6E7和p11E6E7能够引发显著百分比的产生IFN-γ、TNF-α和IL-2的T细胞。鉴于IFN-γ当前已知的在免疫***中的功能，在历史上IFN-γ已被用作细胞免疫应答的指标。这些重要作用中的一些包括调节和刺激先天性和适应性免疫的能力。此外，广泛公认原则上IFN-γ的产生者是T细胞，使得IFN-γ产生成为测量给定疫苗抗原暴露后的细胞免疫原性的可接受的模式。TNF-α是免疫***的调控中所涉及的另一种细胞因子。TNF-α已知的诱导细胞凋亡和调控肿瘤增殖的能力使其成为在表征疫苗接种后免疫应答时重要的考虑参数。考虑到HPV6和HPV11的潜在肿瘤增殖特性，TNF-α产生可能更受到关注。IL-2是另一种信号传导分子，已观察到它在T细胞在免疫***中的增殖和分化中起到中枢作用。结果是，IL-2经常与其它细胞因子一起检查以获得对特定免疫应答的量值和品质的进一步的总体认识。鉴于上文，接种p6E6E7之后产生IFN-γ、TNF-α和IL-2的CD4+和CD8+细胞的显著百分比表明疫苗成功诱导有效的免疫应答。除分泌IL-2的CD4+细胞之外，相同趋势适用于从接种p11E6E7的小鼠中分离的细胞。此外，值得注意的是，观察到CD8+细胞在疫苗接种小鼠中驱动强烈的免疫应答，这是在评估两种质粒的抗瘤功效中重要的特征。
实施例3
小鼠和处理组疫苗接种
可使用6至8周龄之间的C57BL/6雌性小鼠。小鼠可从杰克逊实验室(JacksonLaboratory；Bar Harbor,ME)获得。小鼠可被分为四只一组以用于免疫。可用以下组合中的一种来免疫小鼠：a)编码HPV16E6E7的质粒、编码HPV18E6E7的质粒、编码HPV6E6E7的质粒、编码HPV11E6E7的质粒、编码HPV31E6E7的质粒、编码HPV33E6E7的质粒、编码HPV52E6E7的质粒以及编码HPV58E6E7的质粒；b)编码HPV16E6E7的质粒、编码HPV18E6E7的质粒、编码HPV31E6E7的质粒、编码HPV33E6E7的质粒、编码HPV52E6E7的质粒以及编码HPV58E6E7的质粒；c)编码HPV16E6E7的质粒、编码HPV18E6E7的质粒、编码HPV31E6E7的质粒以及编码HPV33E6E7的质粒；d)编码HPV16E6E7的质粒、编码HPV18E6E7的质粒、编码HPV6E6E7的质粒以及编码HPV11E6E7的质粒；以及用作阴性对照的pVAX组。
DNA疫苗接种和电穿孔
每只小鼠以14天的间隔总共给予三次剂量的20μg的各DNA质粒。DNA构建体经由肌内注射右四头肌来施用，随后是通过CELLECTRA电穿孔仪(Inovio Pharmaceuticals,BlueBell,PA)产生的方波脉冲。电穿孔仪被配置成在0.2Amps下以52ms/脉冲、间隔1秒延迟递送两个电脉冲。如先前所述进行电穿孔程序，如在Inovio Pharmaceuticals的CELLECTRA信息平台(information courtesy)中所述。
IFN-γELISpot测定
处理组和对照组的小鼠都在第三次免疫1周后处死。从每个小鼠收集脾脏并将其转移至具有10％FBS和抗生素的RPMI-1640培养基(R10)中。使用均质袋(SewardLaboratory Systems,Bohemia,NY)将脾脏粉碎并随后转移通过细胞滤网并悬浮在ACK裂解缓冲液中。在去除红细胞之后，分离脾细胞并悬浮于R10培养基中。高蛋白IP 96孔Multiscreen板(Millipore,Bedford,MA)用单克隆小鼠IFN-γ捕捉抗体(R&D Systems,Minneapolis,MN)预涂覆并在4℃下孵育过夜。在用1X PBS洗涤三次之后，在环境温度下将板用1％BSA和5％蔗糖的1×PBS溶液封闭2小时。对R10培养基中的分离的脾细胞进行计数并且以每孔2×105个细胞一式三份地添加至孔中。涵盖每个HPV质粒的共有E6/E7序列的两组肽在DMSO(GenScript USA,Piscataway,NJ)中复原。所述肽含有15个氨基酸序列，其中8个残基与每个连续肽重叠。将每个HPV质粒的肽以在DMSO中2μg/mL的浓度各自分成两个池—一个池是E6且另一个池是E7。保留用于阳性对照和阴性对照的孔分别接收刀豆素A(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)和R10培养基代替肽。随后将板放置在5％CO2气氛孵育器中。在37℃下孵育24小时之后，用1×PBS洗涤孔。将生物素化的抗小鼠IFN-γ检测抗体(R&DSystems,Minneapolis,MN)添加至每个孔中并且接着在4℃下孵育过夜。随后洗涤板并按照R&D Systems提供的显色方案使用抗生蛋白链菌素-AP和BCIP/NBT Plus(R&D Systems,Minneapolis,MN)进行处理。将孔风干过夜，并且通过装有
Figure BDA0003440678440000591
和
Figure BDA0003440678440000592
软件的ELISpot板读取***(Cellular Technology Ltd.,ShakerHeights,OH)对孔内的斑点进行扫描并计数。使用算法转换所报告的斑点形成细胞计数以表示每1×106个脾细胞的斑点形成单位。
考虑到IFN-γELISpot测定的灵敏度和说明T细胞活性的能力，使用它们来测定响应于HPV 6或11E6和E7肽刺激的抗原特异性IFN-γ分泌细胞的数目。
实例4来自VGX-3100阶段1的人类结果
(HPV16 E6E7和HPV18 E6E7的组合)
具有先前处理过的CIN 2/3的患者
使用
Figure BDA0003440678440000593
恒定电流EP装置肌内(IM)递送VGX-3100组合DNA疫苗。
参见Bagarazzi等Sci Transl Med 4,155ra138(2012)，其在此整体并入。
群组 患者数目 剂量(mg)
1 6 0.3X2质粒(HPV16/HPV18)
2 6 1X2质粒(HPV16/HPV18)
3 6 3X2质粒(HPV16/HPV18)
抗体应答：
针对具有15/18(83％)的高滴度和在所有中确认蛋白质印迹的所有4种抗原的抗体持续至9个月。
HPV16、18 E6、E7的抗原特异性细胞应答：
-通过IFN-γELISpot的14/18(78％)POS(>50SFU/106PBMC)
-对于1Ag，将w/剂量增加至>2500SFU/106PBMC，对于所有4种抗原，>5,670SFU/106PBMC
-5个受试者对所有4种抗原应答
-在初次系列后，应答持续至9个月
-第4次剂量促使T细胞应答长达>2年
-HLA DR+/CD38+CD8+T细胞释放用于细胞杀伤的粒酶B/穿孔素。
序列表
<110> 宾夕法尼亚大学理事会
艾诺奥医药品有限公司
<120> 用于人***状瘤病毒的改进疫苗及其使用方法
<130> UPVG0025 WO3
<150> 61777198
<151> 2013-03-12
<160> 26
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 873
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HPV6 E6E7 DNA序列
<400> 1
ggtaccggat ccgccaccat ggactggacc tggattctgt tcctggtggc cgctgccaca 60
cgggtgcaca gcgaaagcgc caatgccagc accagcgcta caaccatcga ccagctgtgc 120
aagaccttca acctgagcat gcacaccctg cagatcaact gcgtgttctg caagaacgcc 180
ctgaccaccg ccgagatcta cagctacgcc tacaagcagc tgaaggtgct gttcagaggc 240
ggctacccct atgccgcctg cgcctgctgc ctggaatttc acggcaagat caaccagtac 300
cggcacttcg actacgccgg ctacgccacc accgtggaag aggaaacaaa gcaggacatc 360
ctggacgtgc tgatccggtg ctacctgtgc cacaagcccc tgtgcgaggt ggaaaaagtg 420
aagcacatcc tgaccaaggc ccggttcatc aagctgaact gcacctggaa gggccggtgc 480
ctgcactgct ggaccacctg tatggaagat atgctgccca gaggccggaa gcggcggagc 540
catggcagac acgtgaccct gaaggacatc gtgctggacc tgcagccccc cgatcctgtg 600
ggcctgcact gttacgagca gctggtggac agcagcgagg acgaggtgga cgaagtggac 660
ggccaggaca gccagcccct gaagcagcac ttccagatcg tgacctgctg ctgcggctgc 720
gacagcaacg tgcggctggt ggtgcagtgc accgagacag acatcagaga ggtccagcag 780
ctcctgctgg gcaccctgaa catcgtgtgc cccatctgcg cccccaagac ctacccttac 840
gacgtgcccg actacgcctg atgactcgag ctc 873
<210> 2
<211> 280
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HPV6 E6E7蛋白序列
<400> 2
Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val
1 5 10 15
His Ser Glu Ser Ala Asn Ala Ser Thr Ser Ala Thr Thr Ile Asp Gln
20 25 30
Leu Cys Lys Thr Phe Asn Leu Ser Met His Thr Leu Gln Ile Asn Cys
35 40 45
Val Phe Cys Lys Asn Ala Leu Thr Thr Ala Glu Ile Tyr Ser Tyr Ala
50 55 60
Tyr Lys Gln Leu Lys Val Leu Phe Arg Gly Gly Tyr Pro Tyr Ala Ala
65 70 75 80
Cys Ala Cys Cys Leu Glu Phe His Gly Lys Ile Asn Gln Tyr Arg His
85 90 95
Phe Asp Tyr Ala Gly Tyr Ala Thr Thr Val Glu Glu Glu Thr Lys Gln
100 105 110
Asp Ile Leu Asp Val Leu Ile Arg Cys Tyr Leu Cys His Lys Pro Leu
115 120 125
Cys Glu Val Glu Lys Val Lys His Ile Leu Thr Lys Ala Arg Phe Ile
130 135 140
Lys Leu Asn Cys Thr Trp Lys Gly Arg Cys Leu His Cys Trp Thr Thr
145 150 155 160
Cys Met Glu Asp Met Leu Pro Arg Gly Arg Lys Arg Arg Ser His Gly
165 170 175
Arg His Val Thr Leu Lys Asp Ile Val Leu Asp Leu Gln Pro Pro Asp
180 185 190
Pro Val Gly Leu His Cys Tyr Glu Gln Leu Val Asp Ser Ser Glu Asp
195 200 205
Glu Val Asp Glu Val Asp Gly Gln Asp Ser Gln Pro Leu Lys Gln His
210 215 220
Phe Gln Ile Val Thr Cys Cys Cys Gly Cys Asp Ser Asn Val Arg Leu
225 230 235 240
Val Val Gln Cys Thr Glu Thr Asp Ile Arg Glu Val Gln Gln Leu Leu
245 250 255
Leu Gly Thr Leu Asn Ile Val Cys Pro Ile Cys Ala Pro Lys Thr Tyr
260 265 270
Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala
275 280
<210> 3
<211> 873
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HPV11 E6E7 DNA序列
<400> 3
ggtaccggat ccgccaccat ggactggacc tggattctgt tcctggtggc cgctgccaca 60
agagtgcaca gcgagagcaa ggatgccagc accagcgcca ccagcatcga ccagctgtgc 120
aagaccttca acctgagcct gcacaccctg cagatccagt gcgtgttctg ccggaacgcc 180
ctgaccaccg ccgagatcta cgcctacgcc tacaagaacc tgaaggtcgt gtggcgggac 240
aacttcccct tcgccgcctg cgcctgctgc ctggaactgc agggcaagat caaccagtac 300
cggcacttca actacgccgc ttacgccccc accgtggaag aggaaacaaa cgaggacatc 360
ctgaaggtgc tgatccggtg ctacctgtgc cacaagcccc tgtgcgagat cgagaagctg 420
aagcacatcc tgggcaaggc ccggttcatc aagctgaaca accagtggaa gggccggtgc 480
ctgcactgct ggaccacctg tatggaagat ctgctgccca gaggccggaa gcggagaagc 540
cacggcagac tggtcaccct gaaggacatc gtgctggacc tgcagccccc cgatcctgtg 600
ggcctgcact gttacgagca gctggaagat agcagcgagg acgaggtgga caaagtggac 660
aagcaggacg cccagcccct gacccagcac taccagatcc tgacctgctg ctgcggctgc 720
gacagcaacg tgcggctggt ggtggaatgc accgacggcg acatccggca gctccaggat 780
ctgctgctgg gcaccctgaa catcgtgtgc cccatctgcg cccccaagcc ctacccctac 840
gacgtgcccg actacgcctg atgactcgag ctc 873
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<211> 280
<212> PRT
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<220>
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<400> 4
Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val
1 5 10 15
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Leu Cys Lys Thr Phe Asn Leu Ser Leu His Thr Leu Gln Ile Gln Cys
35 40 45
Val Phe Cys Arg Asn Ala Leu Thr Thr Ala Glu Ile Tyr Ala Tyr Ala
50 55 60
Tyr Lys Asn Leu Lys Val Val Trp Arg Asp Asn Phe Pro Phe Ala Ala
65 70 75 80
Cys Ala Cys Cys Leu Glu Leu Gln Gly Lys Ile Asn Gln Tyr Arg His
85 90 95
Phe Asn Tyr Ala Ala Tyr Ala Pro Thr Val Glu Glu Glu Thr Asn Glu
100 105 110
Asp Ile Leu Lys Val Leu Ile Arg Cys Tyr Leu Cys His Lys Pro Leu
115 120 125
Cys Glu Ile Glu Lys Leu Lys His Ile Leu Gly Lys Ala Arg Phe Ile
130 135 140
Lys Leu Asn Asn Gln Trp Lys Gly Arg Cys Leu His Cys Trp Thr Thr
145 150 155 160
Cys Met Glu Asp Leu Leu Pro Arg Gly Arg Lys Arg Arg Ser His Gly
165 170 175
Arg Leu Val Thr Leu Lys Asp Ile Val Leu Asp Leu Gln Pro Pro Asp
180 185 190
Pro Val Gly Leu His Cys Tyr Glu Gln Leu Glu Asp Ser Ser Glu Asp
195 200 205
Glu Val Asp Lys Val Asp Lys Gln Asp Ala Gln Pro Leu Thr Gln His
210 215 220
Tyr Gln Ile Leu Thr Cys Cys Cys Gly Cys Asp Ser Asn Val Arg Leu
225 230 235 240
Val Val Glu Cys Thr Asp Gly Asp Ile Arg Gln Leu Gln Asp Leu Leu
245 250 255
Leu Gly Thr Leu Asn Ile Val Cys Pro Ile Cys Ala Pro Lys Pro Tyr
260 265 270
Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala
275 280
<210> 5
<211> 828
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HPV33 E6E7 DNA序列
<400> 5
ggtaccgtcg acggatccgc caccatggac tggacctgga ttctgttcct ggtggccgct 60
gctacccggg tgcacagctt ccaggacacc gaggaaagcg gccggaccct gcacgatctg 120
tgccaggccc tggaaaccac catccacaac atcgagctgc agtgcgtgga atgcaagaag 180
cccctgcagc ggagcgaggt gtacgacgcc gacctgaccg tggtgtacag agagggcaac 240
cccttcggca tctgcaagct gtgcctgcgg ttcctgagca agatcagcga gtaccggcac 300
tacaactaca gcgtgtacgg caacaccctg gaacagaccg tgaagaagcc tctgaacgag 360
atcctgatcc ggtgcatcat ctgccagcgg cccctgaagc ggcacgtgga cctgaacaag 420
cggttccaca atatcagcgg cagatgggcc ggcagatgcg ccgcctgttg gagaagccgg 480
cggagagaga cagccctgcg gggcagaaag cggcggagca gaggccacaa gcccaccctg 540
aaagaatacg tgctggacct gtaccccgag cccaccgacc tgtacggcta cggccagctg 600
agcgacagca gcgacgagga cgagggcctg gacagacctg atggacaggc ccagcccgcc 660
accgccgact actacatcgt gacctgctgc cacacctgta acaccaccgt gcggctgtgc 720
gtgaacagca ccgccagcga cctgcggaca atccagcagc tcctgatggg caccgtgaac 780
atcgtgtgcc ctacctgcgc ccagctgtga ctcgagacgc gtgagctc 828
<210> 6
<211> 261
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HPV33 E6E7蛋白序列
<400> 6
Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val
1 5 10 15
His Ser Phe Gln Asp Thr Glu Glu Ser Gly Arg Thr Leu His Asp Leu
20 25 30
Cys Gln Ala Leu Glu Thr Thr Ile His Asn Ile Glu Leu Gln Cys Val
35 40 45
Glu Cys Lys Lys Pro Leu Gln Arg Ser Glu Val Tyr Asp Ala Asp Leu
50 55 60
Thr Val Val Tyr Arg Glu Gly Asn Pro Phe Gly Ile Cys Lys Leu Cys
65 70 75 80
Leu Arg Phe Leu Ser Lys Ile Ser Glu Tyr Arg His Tyr Asn Tyr Ser
85 90 95
Val Tyr Gly Asn Thr Leu Glu Gln Thr Val Lys Lys Pro Leu Asn Glu
100 105 110
Ile Leu Ile Arg Cys Ile Ile Cys Gln Arg Pro Leu Lys Arg His Val
115 120 125
Asp Leu Asn Lys Arg Phe His Asn Ile Ser Gly Arg Trp Ala Gly Arg
130 135 140
Cys Ala Ala Cys Trp Arg Ser Arg Arg Arg Glu Thr Ala Leu Arg Gly
145 150 155 160
Arg Lys Arg Arg Ser Arg Gly His Lys Pro Thr Leu Lys Glu Tyr Val
165 170 175
Leu Asp Leu Tyr Pro Glu Pro Thr Asp Leu Tyr Gly Tyr Gly Gln Leu
180 185 190
Ser Asp Ser Ser Asp Glu Asp Glu Gly Leu Asp Arg Pro Asp Gly Gln
195 200 205
Ala Gln Pro Ala Thr Ala Asp Tyr Tyr Ile Val Thr Cys Cys His Thr
210 215 220
Cys Asn Thr Thr Val Arg Leu Cys Val Asn Ser Thr Ala Ser Asp Leu
225 230 235 240
Arg Thr Ile Gln Gln Leu Leu Met Gly Thr Val Asn Ile Val Cys Pro
245 250 255
Thr Cys Ala Gln Leu
260
<210> 7
<211> 835
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HPV58 E6E7 DNA序列
<400> 7
ggtaccgttt aaacggatcc gccaccatgg actggacctg gattctgttc ctggtggccg 60
ctgctacccg ggtgcacagc ttccaggatg ccgaggaaag cggccggacc ctgcacgatc 120
tgtgccaggc cctggaaacc agcgtgcacg agatcgagct gaagtgcgtg gaatgcaaga 180
aaaccctgca gcggagcgag gtgtacgacg ccgacctgcg gatcgtgtac cgggacggca 240
accccttcgc cgtgtgcaaa gtgtgcctgc ggctgctgag caagatcagc gagtaccggc 300
actacaacta cagcctgtac ggcgacaccc tggaacagac cctgaagaag tgcctgaacg 360
agatcctgat ccggtgcatc atctgccagc ggcccctgaa gcggcacgtg gacctgaaca 420
agcggttcca caacatcagc ggccggtgga ccggcagatg cgccgtgtgt tggaggccca 480
ggcggagaca gacccaggtg cgcggcagaa agcggcggag cagaggcaac aaccccaccc 540
tgagagagta catcctggac ctgcaccccg agcccaccga cctgtttggc tacggccagc 600
tgtgcgacag cagcgacgag gacgagatcg gcctggacgg ccctgatgga caggcccagc 660
ccgccaccgc caactactac atcgtgacct gctgctacac ctgtggcacc accgtgcggc 720
tgtgcatcaa cagcaccacc accgacgtgc gcaccctgca gcagctcctg atgggcacct 780
gtaccatcgt gtgccccagc tgcgcccagc agtgactcga ggcggccgcg agctc 835
<210> 8
<211> 262
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HPV58 E6E7蛋白序列
<400> 8
Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val
1 5 10 15
His Ser Phe Gln Asp Ala Glu Glu Ser Gly Arg Thr Leu His Asp Leu
20 25 30
Cys Gln Ala Leu Glu Thr Ser Val His Glu Ile Glu Leu Lys Cys Val
35 40 45
Glu Cys Lys Lys Thr Leu Gln Arg Ser Glu Val Tyr Asp Ala Asp Leu
50 55 60
Arg Ile Val Tyr Arg Asp Gly Asn Pro Phe Ala Val Cys Lys Val Cys
65 70 75 80
Leu Arg Leu Leu Ser Lys Ile Ser Glu Tyr Arg His Tyr Asn Tyr Ser
85 90 95
Leu Tyr Gly Asp Thr Leu Glu Gln Thr Leu Lys Lys Cys Leu Asn Glu
100 105 110
Ile Leu Ile Arg Cys Ile Ile Cys Gln Arg Pro Leu Lys Arg His Val
115 120 125
Asp Leu Asn Lys Arg Phe His Asn Ile Ser Gly Arg Trp Thr Gly Arg
130 135 140
Cys Ala Val Cys Trp Arg Pro Arg Arg Arg Gln Thr Gln Val Arg Gly
145 150 155 160
Arg Lys Arg Arg Ser Arg Gly Asn Asn Pro Thr Leu Arg Glu Tyr Ile
165 170 175
Leu Asp Leu His Pro Glu Pro Thr Asp Leu Phe Gly Tyr Gly Gln Leu
180 185 190
Cys Asp Ser Ser Asp Glu Asp Glu Ile Gly Leu Asp Gly Pro Asp Gly
195 200 205
Gln Ala Gln Pro Ala Thr Ala Asn Tyr Tyr Ile Val Thr Cys Cys Tyr
210 215 220
Thr Cys Gly Thr Thr Val Arg Leu Cys Ile Asn Ser Thr Thr Thr Asp
225 230 235 240
Val Arg Thr Leu Gln Gln Leu Leu Met Gly Thr Cys Thr Ile Val Cys
245 250 255
Pro Ser Cys Ala Gln Gln
260
<210> 9
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IgE前导DNA序列
<400> 9
atggactgga cctggatcct gttcctggtg gccgctgcca cacgggtgca cagc 54
<210> 10
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IgE前导蛋白
<400> 10
Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val
1 5 10 15
His Ser
<210> 11
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HPV6肽7
<400> 11
Thr Ala Glu Ile Tyr Ser Tyr Ala Tyr Lys Gln Leu Lys Val Leu
1 5 10 15
<210> 12
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HPV11肽7
<400> 12
Thr Ala Glu Ile Tyr Ala Tyr Ala Tyr Lys Asn Leu Lys Val Val
1 5 10 15
<210> 13
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HPV11肽27
<400> 13
His Cys Tyr Glu Gln Leu Glu Asp Ser Ser Glu Asp Glu Val Asp
1 5 10 15
<210> 14
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HPV亚优势肽6
<400> 14
Phe Cys Lys Asn Ala Leu Thr Thr Ala Glu Ile Tyr Ser Tyr Ala
1 5 10 15
<210> 15
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HPV亚优势肽9
<400> 15
Leu Phe Arg Gly Gly Tyr Pro Tyr Ala Ala Cys Ala Cys Cys Leu
1 5 10 15
<210> 16
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HPV亚优势肽13
<400> 16
Tyr Ala Gly Tyr Ala Thr Thr Val Glu Glu Glu Thr Lys Gln Asp
1 5 10 15
<210> 17
<211> 792
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pGX3005***物HPV31 E6/E7 DNA序列
<400> 17
atggactgga catggattct gttcctggtc gccgccgcaa ctagagtgca ttcattcaaa 60
aaccccgccg agtctgggag aaaactgcac gagctgagct ccgcactgga gatcccctac 120
gatgaactga ggctgaactg cgtgtattgt aaaggacagc tgactgagac cgaagtgctg 180
gacactgatc tgaccattgt ctaccgagac gatacacctt atggcgtgtg cactaaatgt 240
ctgcgcttct actcaaaggt gagcgagttt agatggtaca ggtatagcgt ctatggcacc 300
acactggaaa aactgacaaa caaggggatc tgcgacctgc tgatcaggtg cattacttgt 360
cagcgccctc tgcagcgaca cctggataag aagaagcggt tccataatat cggcgggcgg 420
tggaccggga gatgcatcgt gtgctggcgg agaccacgga cagagactca ggtccgaggg 480
cggaaaaggc gctctagagg agaaacccca acactgcagg actacgtgct ggatctgcag 540
cccgaggcca cagacctgca tggatatggc cagctgcccg actctagtga tgaggaagac 600
gtgatcgata gtcccgccgg ccaggctaag cctgatacct ccaactacaa tattgtcaca 660
ttttgctgtc agtgcgaatc cactctgagg ctgtgcgtgc agtctaccca ggtcgacatc 720
cgcattctgc aggaactgct gatgggatct ttcggaatcg tgtgccctaa ttgctccacc 780
agactgtgat aa 792
<210> 18
<211> 262
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pGX3005***物HPV31 E6/E7蛋白序列
<400> 18
Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val
1 5 10 15
His Ser Phe Lys Asn Pro Ala Glu Ser Gly Arg Lys Leu His Glu Leu
20 25 30
Ser Ser Ala Leu Glu Ile Pro Tyr Asp Glu Leu Arg Leu Asn Cys Val
35 40 45
Tyr Cys Lys Gly Gln Leu Thr Glu Thr Glu Val Leu Asp Thr Asp Leu
50 55 60
Thr Ile Val Tyr Arg Asp Asp Thr Pro Tyr Gly Val Cys Thr Lys Cys
65 70 75 80
Leu Arg Phe Tyr Ser Lys Val Ser Glu Phe Arg Trp Tyr Arg Tyr Ser
85 90 95
Val Tyr Gly Thr Thr Leu Glu Lys Leu Thr Asn Lys Gly Ile Cys Asp
100 105 110
Leu Leu Ile Arg Cys Ile Thr Cys Gln Arg Pro Leu Gln Arg His Leu
115 120 125
Asp Lys Lys Lys Arg Phe His Asn Ile Gly Gly Arg Trp Thr Gly Arg
130 135 140
Cys Ile Val Cys Trp Arg Arg Pro Arg Thr Glu Thr Gln Val Arg Gly
145 150 155 160
Arg Lys Arg Arg Ser Arg Gly Glu Thr Pro Thr Leu Gln Asp Tyr Val
165 170 175
Leu Asp Leu Gln Pro Glu Ala Thr Asp Leu His Gly Tyr Gly Gln Leu
180 185 190
Pro Asp Ser Ser Asp Glu Glu Asp Val Ile Asp Ser Pro Ala Gly Gln
195 200 205
Ala Lys Pro Asp Thr Ser Asn Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys Gln
210 215 220
Cys Glu Ser Thr Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr Gln Val Asp Ile
225 230 235 240
Arg Ile Leu Gln Glu Leu Leu Met Gly Ser Phe Gly Ile Val Cys Pro
245 250 255
Asn Cys Ser Thr Arg Leu
260
<210> 19
<211> 792
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pGX3007***物HPV52 E6/E7 DNA序列
<400> 19
atggactgga cctggattct gttcctggtg gctgctgcta cacgggtgca ttcatttgaa 60
gaccctgcta catctggacg aactctgcac gagctgtgcg aagtgctgga ggaatctgtc 120
catgagatca ggctgcagtg cgtgcagtgt aagaaagagc tgcagcggag agaagtgtac 180
aagaccgacc tgcggattgt ctacagagat aacaatccct atggagtgtg catcatgtgc 240
ctgcggttcc tgtctaaaat tagtgaatac agacactacc agtattccct gtatggcaag 300
acactggagg aacgagtgcg gaaaccactg tctgagatca ccattcgctg catcatttgt 360
cagacacccc tggaacgaca cgtcaacgca aacaagcggt tccataacat catgggaagg 420
tggactggcc gctgcagtga gtgttggaga ccaaggcctg tgacccaggt ccgcggacga 480
aaacggcgga gccggggcga caaggcaacc atcaaagact acattctgga tctgcagcct 540
gagaccacag atctgcatgg ctatgggcag ctgggggaca gctccgatga ggaagacaca 600
gatggggtgg acagaccaga tggacaggcc gaacaggcta caagcaatta ctatatcgtc 660
acttattgcc actcatgtga cagcactctg aggctgtgca ttcattccac tgctaccgat 720
ctgcgcacac tgcagcagat gctgctggga acactgcagg tggtctgtcc aggatgtgcc 780
cgactgtgat aa 792
<210> 20
<211> 262
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pGX3007***物HPV52 E6/E7蛋白序列
<400> 20
Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val
1 5 10 15
His Ser Phe Glu Asp Pro Ala Thr Ser Gly Arg Thr Leu His Glu Leu
20 25 30
Cys Glu Val Leu Glu Glu Ser Val His Glu Ile Arg Leu Gln Cys Val
35 40 45
Gln Cys Lys Lys Glu Leu Gln Arg Arg Glu Val Tyr Lys Thr Asp Leu
50 55 60
Arg Ile Val Tyr Arg Asp Asn Asn Pro Tyr Gly Val Cys Ile Met Cys
65 70 75 80
Leu Arg Phe Leu Ser Lys Ile Ser Glu Tyr Arg His Tyr Gln Tyr Ser
85 90 95
Leu Tyr Gly Lys Thr Leu Glu Glu Arg Val Arg Lys Pro Leu Ser Glu
100 105 110
Ile Thr Ile Arg Cys Ile Ile Cys Gln Thr Pro Leu Glu Arg His Val
115 120 125
Asn Ala Asn Lys Arg Phe His Asn Ile Met Gly Arg Trp Thr Gly Arg
130 135 140
Cys Ser Glu Cys Trp Arg Pro Arg Pro Val Thr Gln Val Arg Gly Arg
145 150 155 160
Lys Arg Arg Ser Arg Gly Asp Lys Ala Thr Ile Lys Asp Tyr Ile Leu
165 170 175
Asp Leu Gln Pro Glu Thr Thr Asp Leu His Gly Tyr Gly Gln Leu Gly
180 185 190
Asp Ser Ser Asp Glu Glu Asp Thr Asp Gly Val Asp Arg Pro Asp Gly
195 200 205
Gln Ala Glu Gln Ala Thr Ser Asn Tyr Tyr Ile Val Thr Tyr Cys His
210 215 220
Ser Cys Asp Ser Thr Leu Arg Leu Cys Ile His Ser Thr Ala Thr Asp
225 230 235 240
Leu Arg Thr Leu Gln Gln Met Leu Leu Gly Thr Leu Gln Val Val Cys
245 250 255
Pro Gly Cys Ala Arg Leu
260
<210> 21
<211> 818
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HPV基因型16 E6-E7 DNA序列
<400> 21
gaattcgcca ccatggactg gacctggatc ctgttcctgg tggccgccgc cacacgggtg 60
cacagcttcc aggaccccca ggagagcggc agaaagctgc ctcagctgtg taccgagctg 120
cagaccacca tccacgacat catcctggag tgtgtgtact gtaagcagca gctgctgagg 180
agagaggtgt acgaccggga cctgtgtatc gtgtacaggg acggcaatcc ctacgccgtg 240
tgtgacaagt gcctgaagtt ctacagcaag atcagcgagt accggcacta ctgctacagc 300
ctgtacggca ccaccctgga gcagcagtac aacaagcccc tgtgtgacct gctgatccgg 360
tgtatcaact gccagaagcc cctgcagaga cacctggaca agaagcagcg gttccacaac 420
atcaggggca gatggaccgg cagatgtatg agctgctgcc ggagcagcag aaccagaagg 480
gagacccagc tgagaggccg gaagagaaga agccacggcg atacccccac cctgcacgag 540
tacatgctgg acctgcagcc tgagaccacc gatctgtacg gctacggcca gctgaatgac 600
agcagcgagg aggaggatga gatcgacggc cctgccggcc aggccgagcc cgacagagcc 660
cactacaaca tcgtgacctt ttgctgtaag tgtgacagca ccctgagact gtgcgtgcag 720
agcacccacg tggacatcag aaccctggag gatctgctga tgggcaccct gggcatcgtg 780
tgtcccatct gctcccagaa accctgatga gcggccgc 818
<210> 22
<211> 264
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HPV基因型16 E6-E7蛋白序列
<400> 22
Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val
1 5 10 15
His Ser Phe Gln Asp Pro Gln Glu Ser Gly Arg Lys Leu Pro Gln Leu
20 25 30
Cys Thr Glu Leu Gln Thr Thr Ile His Asp Ile Ile Leu Glu Cys Val
35 40 45
Tyr Cys Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg Glu Val Tyr Asp Arg Asp Leu
50 55 60
Cys Ile Val Tyr Arg Asp Gly Asn Pro Tyr Ala Val Cys Asp Lys Cys
65 70 75 80
Leu Lys Phe Tyr Ser Lys Ile Ser Glu Tyr Arg His Tyr Cys Tyr Ser
85 90 95
Leu Tyr Gly Thr Thr Leu Glu Gln Gln Tyr Asn Lys Pro Leu Cys Asp
100 105 110
Leu Leu Ile Arg Cys Ile Asn Cys Gln Lys Pro Leu Gln Arg His Leu
115 120 125
Asp Lys Lys Gln Arg Phe His Asn Ile Arg Gly Arg Trp Thr Gly Arg
130 135 140
Cys Met Ser Cys Cys Arg Ser Ser Arg Thr Arg Arg Glu Thr Gln Leu
145 150 155 160
Arg Gly Arg Lys Arg Arg Ser His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu
165 170 175
Tyr Met Leu Asp Leu Gln Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Gly Tyr Gly
180 185 190
Gln Leu Asn Asp Ser Ser Glu Glu Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro Ala
195 200 205
Gly Gln Ala Glu Pro Asp Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys
210 215 220
Cys Lys Cys Asp Ser Thr Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val
225 230 235 240
Asp Ile Arg Thr Leu Glu Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val
245 250 255
Cys Pro Ile Cys Ser Gln Lys Pro
260
<210> 23
<211> 837
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HPV基因型18 E6-E7 DNA序列
<400> 23
atggactgga cctggatcct gttcctggtg gccgctgcca cacgggtgca cagcgccaga 60
ttcgaggacc ccaccaggag cggctacaag ctgcccgatc tgtgtaccga gctgaacacc 120
agcctgcagg acatcgagat cacctgtgtg tactgtaaga ccgtgctgga gctgaccgag 180
gtgttcgaga aggacctgtt cgtggtgtac agggacagca tcccccacgc cgcctgccac 240
aagtgtatcg acttctacag ccggatccgg gagctgagac actacagcga cagcgtgtac 300
ggcgataccc tggagaagct gaccaacacc ggcctgtaca acctgctgat ccggtgcctg 360
agatgccaga agcccctgct gagacacctg aacgagaagc ggcggttcca caacatcgcc 420
ggccactaca gaggccagtg ccacagctgc tgtaacaggg ccaggcagga gagactgcag 480
cggagaagag agacccaggt gaggggcagg aagagaagaa gccacggccc caaggccacc 540
ctgcaggata tcgtgctgca cctggagccc cagaatgaga tccccgtgga tctgctgggc 600
cacggccagc tgtccgacag cgaggaggag aacgacgaga tcgacggcgt gaatcaccag 660
cacctgcctg ccagaagagc cgagcctcag aggcacacca tgctgtgtat gtgctgtaag 720
tgtgaggccc ggatcgaact ggtggtggag agcagcgccg acgacctgag agccttccag 780
cagctgttcc tgaacaccct gagcttcgtg tgtccttggt gtgccagcca gcagtga 837
<210> 24
<211> 278
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HPV基因型18 E6-E7蛋白序列
<400> 24
Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val
1 5 10 15
His Ser Ala Arg Phe Glu Asp Pro Thr Arg Ser Gly Tyr Lys Leu Pro
20 25 30
Asp Leu Cys Thr Glu Leu Asn Thr Ser Leu Gln Asp Ile Glu Ile Thr
35 40 45
Cys Val Tyr Cys Lys Thr Val Leu Glu Leu Thr Glu Val Phe Glu Lys
50 55 60
Asp Leu Phe Val Val Tyr Arg Asp Ser Ile Pro His Ala Ala Cys His
65 70 75 80
Lys Cys Ile Asp Phe Tyr Ser Arg Ile Arg Glu Leu Arg His Tyr Ser
85 90 95
Asp Ser Val Tyr Gly Asp Thr Leu Glu Lys Leu Thr Asn Thr Gly Leu
100 105 110
Tyr Asn Leu Leu Ile Arg Cys Leu Arg Cys Gln Lys Pro Leu Leu Arg
115 120 125
His Leu Asn Glu Lys Arg Arg Phe His Asn Ile Ala Gly His Tyr Arg
130 135 140
Gly Gln Cys His Ser Cys Cys Asn Arg Ala Arg Gln Glu Arg Leu Gln
145 150 155 160
Arg Arg Arg Glu Thr Gln Val Arg Gly Arg Lys Arg Arg Ser His Gly
165 170 175
Pro Lys Ala Thr Leu Gln Asp Ile Val Leu His Leu Glu Pro Gln Asn
180 185 190
Glu Ile Pro Val Asp Leu Leu Gly His Gly Gln Leu Ser Asp Ser Glu
195 200 205
Glu Glu Asn Asp Glu Ile Asp Gly Val Asn His Gln His Leu Pro Ala
210 215 220
Arg Arg Ala Glu Pro Gln Arg His Thr Met Leu Cys Met Cys Cys Lys
225 230 235 240
Cys Glu Ala Arg Ile Glu Leu Val Val Glu Ser Ser Ala Asp Asp Leu
245 250 255
Arg Ala Phe Gln Gln Leu Phe Leu Asn Thr Leu Ser Phe Val Cys Pro
260 265 270
Trp Cys Ala Ser Gln Gln
275
<210> 25
<211> 279
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HPV45 E6/E7蛋白序列
<400> 25
Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val
1 5 10 15
His Ser Ala Arg Phe Asp Asp Pro Lys Gln Ser Gly Tyr Lys Leu Pro
20 25 30
Asp Leu Cys Thr Glu Leu Asn Thr Ser Leu Gln Asp Val Ser Ile Ala
35 40 45
Cys Val Tyr Cys Lys Ala Thr Leu Glu Arg Thr Glu Val Tyr Gln Lys
50 55 60
Asp Leu Cys Ile Val Tyr Arg Asp Cys Ile Ala Tyr Ala Ala Cys His
65 70 75 80
Lys Cys Ile Asp Phe Tyr Ser Arg Ile Arg Glu Leu Arg Tyr Tyr Ser
85 90 95
Asn Ser Val Tyr Gly Glu Thr Leu Glu Lys Ile Thr Asn Thr Glu Leu
100 105 110
Tyr Asn Leu Leu Ile Arg Cys Leu Arg Cys Gln Lys Pro Leu Arg Arg
115 120 125
His Leu Lys Asp Lys Arg Arg Phe His Ser Ile Ala Gly Gln Tyr Arg
130 135 140
Gly Gln Cys Asn Thr Cys Cys Asp Gln Ala Arg Gln Glu Arg Leu Arg
145 150 155 160
Arg Arg Arg Glu Thr Gln Val Arg Gly Arg Lys Arg Arg Ser His Gly
165 170 175
Pro Arg Ala Thr Leu Gln Glu Ile Val Leu His Leu Glu Pro Gln Asn
180 185 190
Glu Leu Asp Pro Val Asp Leu Leu Gly Tyr Gly Gln Leu Ser Glu Ser
195 200 205
Glu Glu Glu Asn Asp Glu Ala Asp Gly Val Ser His Ala Gln Leu Pro
210 215 220
Ala Arg Arg Ala Glu Pro Gln Arg His Lys Ile Leu Cys Val Cys Cys
225 230 235 240
Lys Cys Asp Gly Arg Ile Glu Leu Thr Val Glu Ile Ser Ala Glu Asp
245 250 255
Leu Arg Thr Leu Gln Gln Leu Phe Leu Ser Thr Leu Ser Phe Val Cys
260 265 270
Pro Trp Cys Ala Thr Asn Gln
275
<210> 26
<211> 282
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HPV39 E6/E7蛋白序列
<400> 26
Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val
1 5 10 15
His Ser Ala Arg Phe His Asn Pro Ala Glu Ser Gly Tyr Lys Leu Pro
20 25 30
Asp Leu Cys Thr Thr Leu Asp Thr Thr Leu Gln Asp Ile Thr Ile Ala
35 40 45
Cys Val Tyr Cys Arg Arg Pro Leu Gln Gln Thr Glu Val Tyr Glu Ser
50 55 60
Asp Leu Tyr Val Val Tyr Arg Asp Gly Glu Pro Leu Ala Ala Cys Gln
65 70 75 80
Ser Cys Ile Lys Phe Tyr Ala Lys Ile Arg Glu Leu Arg Tyr Tyr Ser
85 90 95
Asp Ser Val Tyr Ala Thr Thr Leu Glu Asn Ile Thr Asn Thr Lys Leu
100 105 110
Tyr Asn Leu Leu Ile Arg Cys Met Cys Cys Leu Lys Pro Leu Leu Arg
115 120 125
His Leu Asn Ser Lys Arg Arg Phe His Lys Ile Ala Gly Ser Tyr Thr
130 135 140
Gly Gln Cys Arg Arg Cys Trp Thr Thr Lys Arg Glu Asp Arg Arg Leu
145 150 155 160
Thr Arg Arg Glu Thr Gln Val Arg Gly Arg Lys Arg Arg Ser Arg Gly
165 170 175
Pro Lys Pro Thr Leu Gln Glu Ile Val Leu Asp Leu Cys Pro Tyr Asn
180 185 190
Glu Ile Gln Pro Val Asp Leu Val Gly His Gly Gln Leu Gly Glu Ser
195 200 205
Glu Asp Glu Ile Asp Glu Pro Asp His Ala Val Asn His Gln His Gln
210 215 220
Leu Leu Ala Arg Arg Asp Glu Pro Gln Arg His Thr Ile Gln Cys Ser
225 230 235 240
Cys Cys Lys Cys Asn Asn Thr Leu Gln Leu Val Val Glu Ala Ser Arg
245 250 255
Asp Thr Leu Arg Gln Leu Gln Gln Leu Phe Met Asp Ser Leu Gly Phe
260 265 270
Val Cys Pro Trp Cys Ala Thr Ala Asn Gln
275 280

Claims (10)

1.一种组合物，其包含至少一种核苷酸序列，所述核苷酸序列包含选自由以下组成的组的HPV E6-E7融合抗原：HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV39、HPV45、HPV52和HPV58。
2.根据权利要求1所述的组合物，所述核苷酸序列包含HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV52和HPV58。
3.根据权利要求1所述的组合物，所述核苷酸序列包含HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV52和HPV58。
4.根据权利要求1所述的组合物，所述核苷酸序列包含HPV6、HPV11、HPV16和HPV18。
5.根据权利要求1所述的组合物，所述核苷酸序列包含HPV16、HPV31和HPV52。
6.根据权利要求1所述的组合物，其包含一种或多种核苷酸序列，所述核苷酸序列编码选自由以下组成的组的HPV E6-E7融合抗原：
编码SEQ ID NO:2的核苷酸序列；编码SEQ ID NO:4的核苷酸序列；编码SEQ ID NO:6的核苷酸序列；编码SEQ ID NO:8的核苷酸序列；编码SEQ ID NO:18的核苷酸序列；编码SEQID NO:20的核苷酸序列；编码SEQ ID NO:22的核苷酸序列；编码SEQ ID NO:24的核苷酸序列；编码SEQ ID NO:25的核苷酸序列；编码SEQ ID NO:26的核苷酸序列；
与编码SEQ ID NO:2的核苷酸序列具有至少95％同源性的核酸序列；与编码SEQ IDNO:4的核苷酸序列具有至少95％同源性的核酸序列；与编码SEQ ID NO:6的核苷酸序列具有至少95％同源性的核酸序列；与编码SEQ ID NO:8的核苷酸序列具有至少95％同源性的核酸序列；与编码SEQ ID NO:18的核苷酸序列具有至少95％同源性的核酸序列；与编码SEQID NO:20的核苷酸序列具有至少95％同源性的核酸序列；与编码SEQ ID NO:22的核苷酸序列具有至少95％同源性的核酸序列；与编码SEQ ID NO:24的核苷酸序列具有至少95％同源性的核酸序列；与编码SEQ ID NO:25的核苷酸序列具有至少95％同源性的核酸序列；与编码SEQ ID NO:26的核苷酸序列具有至少95％同源性的核酸序列；
编码SEQ ID NO:2的核苷酸序列的片段；编码SEQ ID NO:4的核苷酸序列的片段；编码SEQ ID NO:6的核苷酸序列的片段；编码SEQ ID NO:8的核苷酸序列的片段；编码SEQ IDNO:18的核苷酸序列的片段；编码SEQ ID NO:20的核苷酸序列的片段；编码SEQ ID NO:22的核苷酸序列的片段；编码SEQ ID NO:24的核苷酸序列的片段；编码SEQ ID NO:25的核苷酸序列的片段；编码SEQ ID NO:26的核苷酸序列的片段；
与编码SEQ ID NO:2的核苷酸序列的片段具有至少95％同源性的核酸序列；与编码SEQID NO:4的核苷酸序列的片段具有至少95％同源性的核酸序列；与编码SEQ ID NO:6的核苷酸序列的片段具有至少95％同源性的核酸序列；与编码SEQ ID NO:8的核苷酸序列的片段具有至少95％同源性的核酸序列；与编码SEQ ID NO:18的核苷酸序列的片段具有至少95％同源性的核酸序列；与编码SEQ ID NO:20的核苷酸序列的片段具有至少95％同源性的核酸序列；与编码SEQ ID NO:22的核苷酸序列的片段具有至少95％同源性的核酸序列；与编码SEQ ID NO:24的核苷酸序列的片段具有至少95％同源性的核酸序列；与编码SEQ ID NO:25的核苷酸序列的片段具有至少95％同源性的核酸序列；以及与编码SEQ ID NO:26的核苷酸序列的片段具有至少95％同源性的核酸序列。
7.根据权利要求1所述的组合物，其包含一种或多种核苷酸序列，所述核苷酸序列编码选自由以下组成的组的HPV E6-E7融合抗原：
SEQ ID NO:1；SEQ ID NO:3；SEQ ID NO:5；SEQ ID NO:7；SEQ ID NO:17；SEQ ID NO:19；SEQ ID NO:21；SEQ ID NO:23；
与SEQ ID NO:1具有至少95％同源性的核酸序列；与SEQ ID NO:3具有至少95％同源性的核酸序列；与SEQ ID NO:5具有至少95％同源性的核酸序列；与SEQ ID NO:7具有至少95％同源性的核酸序列；与SEQ ID NO:17具有至少95％同源性的核酸序列；与SEQ ID NO:19具有至少95％同源性的核酸序列；与SEQ ID NO:21具有至少95％同源性的核酸序列；与SEQ ID NO:23具有至少95％同源性的核酸序列；
SEQ ID NO:1的片段；SEQ ID NO:3的片段；SEQ ID NO:5的片段；SEQ ID NO:7的片段；SEQ ID NO:17的片段；SEQ ID NO:19的片段；SEQ ID NO:21的片段；SEQ ID NO:23的片段；
与SEQ ID NO:1的片段具有至少95％同源性的核酸序列；与SEQ ID NO:3的片段具有至少95％同源性的核酸序列；与SEQ ID NO:5的片段具有至少95％同源性的核酸序列；与SEQID NO:7的片段具有至少95％同源性的核酸序列；与SEQ ID NO:17的片段具有至少95％同源性的核酸序列；与SEQ ID NO:19的片段具有至少95％同源性的核酸序列；与SEQ ID NO:21的片段具有至少95％同源性的核酸序列；以及与SEQ ID NO:23的片段具有至少95％同源性的核酸序列。
8.根据权利要求6所述的组合物，其中所述HPV E6-E7融合抗原选自由以下组成的组：
编码SEQ ID NO:2的核苷酸序列；编码SEQ ID NO:4的核苷酸序列；编码SEQ ID NO:6的核苷酸序列；编码SEQ ID NO:8的核苷酸序列；编码SEQ ID NO:18的核苷酸序列；编码SEQID NO:20的核苷酸序列；编码SEQ ID NO:22的核苷酸序列；编码SEQ ID NO:24的核苷酸序列；
与编码SEQ ID NO:2的核苷酸序列具有至少95％同源性的核酸序列；与编码SEQ IDNO:4的核苷酸序列具有至少95％同源性的核酸序列；与编码SEQ ID NO:6的核苷酸序列具有至少95％同源性的核酸序列；与编码SEQ ID NO:8的核苷酸序列具有至少95％同源性的核酸序列；与编码SEQ ID NO:18的核苷酸序列具有至少95％同源性的核酸序列；与编码SEQID NO:20的核苷酸序列具有至少95％同源性的核酸序列；与编码SEQ ID NO:22的核苷酸序列具有至少95％同源性的核酸序列；与编码SEQ ID NO:24的核苷酸序列具有至少95％同源性的核酸序列；
编码SEQ ID NO:2的核苷酸序列的片段；编码SEQ ID NO:4的核苷酸序列的片段；编码SEQ ID NO:6的核苷酸序列的片段；编码SEQ ID NO:8的核苷酸序列的片段；编码SEQ IDNO:18的核苷酸序列的片段；编码SEQ ID NO:20的核苷酸序列的片段；编码SEQ ID NO:22的核苷酸序列的片段；编码SEQ ID NO:24的核苷酸序列的片段；
与编码SEQ ID NO:2的核苷酸序列的片段具有至少95％同源性的核酸序列；与编码SEQID NO:4的核苷酸序列的片段具有至少95％同源性的核酸序列；与编码SEQ ID NO:6的核苷酸序列的片段具有至少95％同源性的核酸序列；与编码SEQ ID NO:8的核苷酸序列的片段具有至少95％同源性的核酸序列；与编码SEQ ID NO:18的核苷酸序列的片段具有至少95％同源性的核酸序列；与编码SEQ ID NO:20的核苷酸序列的片段具有至少95％同源性的核酸序列；与编码SEQ ID NO:22的核苷酸序列的片段具有至少95％同源性的核酸序列；以及与编码SEQ ID NO:24的核苷酸序列的片段具有至少95％同源性的核酸序列。
9.根据权利要求6所述的组合物，其中所述HPV E6-E7融合抗原选自由以下组成的组：
编码SEQ ID NO:6的核苷酸序列；编码SEQ ID NO:8的核苷酸序列；编码SEQ ID NO:18的核苷酸序列；编码SEQ ID NO:20的核苷酸序列；编码SEQ ID NO:22的核苷酸序列；编码SEQ ID NO:24的核苷酸序列；
与编码SEQ ID NO:6的核苷酸序列具有至少95％同源性的核酸序列；与编码SEQ IDNO:8的核苷酸序列具有至少95％同源性的核酸序列；与编码SEQ ID NO:18的核苷酸序列具有至少95％同源性的核酸序列；与编码SEQ ID NO:20的核苷酸序列具有至少95％同源性的核酸序列；与编码SEQ ID NO:22的核苷酸序列具有至少95％同源性的核酸序列；与编码SEQID NO:24的核苷酸序列具有至少95％同源性的核酸序列；
编码SEQ ID NO:6的核苷酸序列的片段；编码SEQ ID NO:8的核苷酸序列的片段；编码SEQ ID NO:18的核苷酸序列的片段；编码SEQ ID NO:20的核苷酸序列的片段；编码SEQ IDNO:22的核苷酸序列的片段；编码SEQ ID NO:24的核苷酸序列的片段；
与编码SEQ ID NO:6的核苷酸序列的片段具有至少95％同源性的核酸序列；与编码SEQID NO:8的核苷酸序列的片段具有至少95％同源性的核酸序列；与编码SEQ ID NO:18的核苷酸序列的片段具有至少95％同源性的核酸序列；与编码SEQ ID NO:20的核苷酸序列的片段具有至少95％同源性的核酸序列；与编码SEQ ID NO:22的核苷酸序列的片段具有至少95％同源性的核酸序列；以及与编码SEQ ID NO:24的核苷酸序列的片段具有至少95％同源性的核酸序列。
10.根据权利要求6所述的组合物，其中所述HPV E6-E7融合抗原选自由以下组成的组：
编码SEQ ID NO:2的核苷酸序列；编码SEQ ID NO:4的核苷酸序列；编码SEQ ID NO:22的核苷酸序列；编码SEQ ID NO:24的核苷酸序列；
与编码SEQ ID NO:2的核苷酸序列具有至少95％同源性的核酸序列；与编码SEQ IDNO:4的核苷酸序列具有至少95％同源性的核酸序列；与编码SEQ ID NO:22的核苷酸序列具有至少95％同源性的核酸序列；与编码SEQ ID NO:24的核苷酸序列具有至少95％同源性的核酸序列；
编码SEQ ID NO:2的核苷酸序列的片段；编码SEQ ID NO:4的核苷酸序列的片段；编码SEQ ID NO:22的核苷酸序列的片段；编码SEQ ID NO:24的核苷酸序列的片段；
与编码SEQ ID NO:2的核苷酸序列的片段具有至少95％同源性的核酸序列；与编码SEQID NO:4的核苷酸序列的片段具有至少95％同源性的核酸序列；与编码SEQ ID NO:22的核苷酸序列的片段具有至少95％同源性的核酸序列；以及与编码SEQ ID NO:24的核苷酸序列的片段具有至少95％同源性的核酸序列。
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