CN105950596B - 一种双功能酸性脲酶基因及其表达与应用 - Google Patents

一种双功能酸性脲酶基因及其表达与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种双功能酸性脲酶基因及其表达与应用，属于生物工程技术领域。本发明的双功能酸性脲酶是来自于普罗威登斯菌(Providencia sp.LBBE)，基因排列顺序为D、A、B、C、E、F、G，能够耐受高浓度乙醇的同时高效降解氨基甲酸乙酯和尿素。本发明利用大肠杆菌表达***BL21(DE3)/pRSFDuet‑1，成功实现了具有双功能酸性脲酶基因的高效表达，以EC为底物时酶活达到0.39U/ml，以尿素为底物时酶活达到4.82U/ml。重组酶在20％的乙醇中37℃保留4h，以EC为底物时仍可保留其93％以上的活性。本发明所发现的双功能酸性脲酶是一种新的脲酶，所制备的重组酶为实现黄酒中EC及尿素的消除，实现EC水解酶工业化生产奠定了基础，具有巨大的经济及社会效益。

Description

一种双功能酸性脲酶基因及其表达与应用
技术领域
本发明涉及一种双功能酸性脲酶基因及其表达与应用，属于生物工程技术领域。
背景技术
脲酶(Urease，EC 3.5.1.5)，广泛存在于动物、植物、细菌、真菌等中，其能专一性的催化尿素水解产生两分子氨和一分子碳酸。脲酶是世界上首次成功获得的结晶态的酶，它于1926年由Summer首次从刀豆中提取出。根据脲酶作用的最适pH值，可将脲酶分为酸性脲酶、中性脲酶和碱性脲酶。
氨基甲酸乙酯(Ethyl Carbamate或Urethane，简称EC)，具有遗传毒性及致癌性，广泛存在于多种发酵食品(如酱油、食醋、泡菜)和酒精饮料(如黄酒、白酒、葡萄酒等)中。研究证实发酵食品(如黄酒、酱油等)中尿素是EC形成的主要前体物质，它和乙醇自发的反应生成EC，从而严重影响人类的健康。双功能酸性脲酶可以高效消除发酵食品(如酒精类饮料)中的尿素的同时也可以高效降解EC，从而可以实现从源头到终端对发酵食品(尤其是酒精类饮料)中EC的消除。
本发明所获得的双功能酸性脲酶其在高浓度乙醇(20％v/v)中仍具有高效尿素及EC降解酶活力，使得其在黄酒中具有巨大的应用价值，其基因序列的解析为脲酶及EC降解酶的工业化生产奠定了基础。
本发明的脲酶基因序列由结构基因及其辅助基因构成，结构基因编脲酶蛋白，其辅助基因起到辅助结构基因表达，对结构基因表达的蛋白进行修饰(比如向催化活性中心传递金属离子)从而形成成熟的脲酶。不同来源的脲酶其单体结构不同。其中来源于细菌的脲酶通常由三个不同的亚基A、B、C构成多聚体，它的催化活性中心位于C亚基。本发明中所获得的脲酶由三个结构基因ureA、ureB、ureC(分别编码亚基A、B、C)及4个辅助基因ureD、ureE、ureF、ureG构成，其催化活性中心位于C亚基，最终成熟的蛋白质是A、B及C三个亚基组成的三聚体。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种能耐受高浓度乙醇同时高效降解氨基甲酸乙酯和尿素的双功能酸性脲酶及其基因序列。
所述双功能酸性脲酶的结构亚基UreA、UreB、UreC的氨基酸序列：(a)分别如SEQID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示；(b)是在(a)中氨基酸序列的基础上经过取代、缺失或者添加一个或几个氨基酸得到的，且编码具有氨基甲酸乙酯水解酶及脲酶活性的由(a)衍生的蛋白质，比如在C端或N端添加或缺失一个或数个氨基酸残基、添加融合标签等，虽然在形式上进行修饰但不改变蛋白的酶活。
所述双功能酸性脲酶的结构亚基按照UreA、UreB、UreC依次排列。
所述双功能酸性脲酶来源于普罗威登斯菌(Providencia sp.LBBE)，Providenciasp.LBBE已于2015年9月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M2015541。
所述双功能酸性脲酶由三个结构基因ureA、ureB、ureC(分别编码亚基A、B、C)及4个辅助基因ureD、ureE、ureF、ureG构成，这些基因在基因组上的排布顺序为ureD、ureA、ureB、ureC、ureE、ureF、ureG。
在本发明的一种实施方式中，所述双功能酸性脲酶具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。
在本发明的一种实施方式中，所述双功能酸性脲酶基因序列，是通过对不同来源的脲酶结构基因保守性分析，通过保守性位点设计简并引物，以普罗威登斯菌(Providencia sp.LBBE)基因组为模板进行PCR，对PCR产物进行测序，而后根据所测序列利用染色体步移方法最终得到完整的脲酶序列。
本发明的第二个目的是提供一种表达所述双功能酸性脲酶的重组质粒或重组菌。
在本发明的一种实施方式中，所述的重组质粒，可以是市售的质粒、粘粒、噬菌体等经分子生物学技术手段将所述双功能酸性脲酶的基因序列连接入而构建而成，其中优选pRSFDuet-1。
在本发明的一种实施方式中，所述重组菌，是将SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列连接到表达质粒载体上构建重组表达质粒，然后将重组表达质粒转化宿主菌后得到的。
在本发明的一种实施方式中，所述宿主菌，可以是大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、乳酸乳球菌或酵母菌中的任意一种，其中优选大肠杆菌BL21DE3。
在本发明的一种实施方式，所述宿主菌的构建具体是：(1)获取核苷酸序列如SEQID NO.1所示的脲酶基因urePS；(2)将目的基因urePS连接到载体pRSFDuet-1得到重组质粒pRSFDuet-urePS；(3)将步骤2获得的重组质粒导入大肠杆菌BL21DE3中获得重组大肠杆菌BL21DE3(pRSFDuet-urePS)，双功能酸性脲酶基因在重组菌中表达受T7启动子调控；(4)利用重组菌BL21DE3(pRSFDuet-urePS)发酵生产双功能酸性脲酶。
本发明的第三个目的是提供一种生产所述双功能酸性脲酶的方法，是将重组菌E.coli BL21(DE3)/pRSFDuet-urePS培养到一定菌体浓度(如OD600＝0.6-0.8)，添加诱导剂(如IPTG最终浓度为1mM)，培养一定时间(如10-30h)，高效表达双功能酸性脲酶。
本发明的第四个目的是提供一种降解尿素和氨基甲酸乙酯的方法，是利用本发明所述的双功能酸性脲酶来降解尿素和氨基甲酸乙酯。
所述双功能酸性脲酶含有以下特征之一：(a)结构亚基UreA、UreB、UreC的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示；(b)结构亚基的氨基酸序列是在(1)中氨基酸序列的基础上经过取代、缺失或者添加一个或几个氨基酸得到的，且编码具有氨基甲酸乙酯水解酶及脲酶活性的由(a)衍生的蛋白质；(c)具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。
在本发明的一种实施方式中，所述双功能酸性脲酶,是通过从普罗威登斯菌(Providencia sp.LBBE)基因组上克隆获得双功能酸性脲酶基因，然后将双功能酸性脲酶基因在宿主菌中进行表达而得到的。
本发明的第五个目的是提供一种所述双功能酸性脲酶的纯化方法。
所述纯化方法，是利用重组菌BL21DE3(pRSFDuet-urePS)发酵产酶，然后超声破碎菌体得到粗酶液；粗酶液依次经乙醇分级沉淀、第一次离子交换层析、疏水层析、凝胶过滤层析、第二次离子交换层析处理。
在本发明的一种实施方式中，所述乙醇分级沉淀，是30-60％乙醇沉淀；所述第一次离子交换层析为DEAE离子交换层析，第二次离子交换层析为MonoQ离子交换层析；疏水层析为phenyl疏水作用层析。
本发明还要求保护所述双功能酸性脲酶在消除黄酒等发酵食品中的氨基甲酸乙酯和尿素方面的应用。
本发明的有益效果：
本发明发现了一个新的双功能酸性脲酶基因，该酶在高浓度乙醇(20％v/v)中仍具有高效尿素及EC降解酶活力，可以应用于降解酒精饮料的尿素及氨基甲酸乙酯。本发明的双功能酸性脲酶的基因簇排列顺序为D、A、B、C、E、F、G。本发明利用大肠杆菌表达***BL21(DE3)/pRSFDuet-1，成功实现了具有双功能酸性脲酶基因的高效表达，以EC为底物时酶活达到0.39U/ml，以尿素为底物时酶活达到4.82U/ml。重组酶在20％的乙醇中37℃保留4h，以EC为底物时仍可保留其93％以上的活性。本发明所发现的双功能酸性脲酶是一种新的脲酶，所制备的重组酶为实现黄酒中EC及尿素的消除，实现EC水解酶工业化生产奠定了基础，具有巨大的经济及社会效益。
生物材料保藏
一株普罗威登斯菌，分类学命名为Providencia sp.LBBE，已于2015年9月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:M2015541。
附图说明
图1：普罗威登斯菌(Providencia sp.LBBE)双功能脲酶urePS基因簇排列顺序；
图2：重组表达质粒pRSFDuet-urePS的构建示意图；
图3：重组菌E.coli BL21(DE3)/pRSFDuet-urePS表达的双功能酸性脲酶蛋白纯化过程SDS-PAGE蛋白电泳图；其中1为重组菌诱导后细胞破壁上清液，2为30-60％乙醇沉淀后酶液，3为DEAE离子交换层析酶液，4为phenyl疏水作用层析酶液，5为凝胶过滤层析酶液，6为MonoQ离子交换层析酶液；
图4：基因工程菌株表达的双功能脲酶以EC为底物时的乙醇耐受性图谱。
具体实施方式
材料与方法
LB培养基：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L(固定培养基另加1.5％的琼脂粉)
TB培养基：将下列组分溶解在0.9L水中：蛋白胨12g，酵母提取物24g，甘油4ml。各组分溶解后高压灭菌。冷却到60℃，再加100ml灭菌的0.17mmol/L KH2PO4，0.72mmol/LK2HPO4的溶液。
所使用的限制性内切酶购自Fermentas公司，胶回收试剂盒购自TAKARA公司，具体的反应条件和使用方法参考其说明书。基因组抽提试剂盒购自Omega公司，使用参考其说明书。
下面的商品化质粒和大肠杆菌用于基因克隆和表达：
pRSFDuet-1(Novagen，美国)
E.coli BL21(DE3)(Novagen，美国)
氯化铵标准曲线的绘制：
用超线水配制0.1mmol/L、0.2mmol/L、0.3mmol/L、0.4mmol/L、0.5mmol/L的NH4+标准溶液。用移液管准确移取1mL NH4+标准梯度液分别置于顺序编号的10mL比色管中。37℃下恒温保温30min，立即用吸1mL终止剂于比色管中，振荡混匀。再依次加入1mL显色剂I和显色剂II，强烈振荡，使之充分混匀，反应20min。超纯水定容至10mL，在625nm下比色测定OD值，以OD值为纵坐标，NH4+梯度为横坐标作图，得到标准曲线。
脲酶或氨基甲酸乙酯水解酶酶活测定方法：
取两支10mL比色管，分别加入1mL酶液和1mL灭活的酶液。然后在两管中分别加入1mL 3％尿素或EC(用20mM pH 4.5的柠檬酸缓冲液配制)，在37℃恒温水浴箱中反应30min后，在两管各加入1mL终止剂(10％三氯乙酸)，混匀后加入1mL的显色剂I(15g苯酚和0.625g亚硝基铁***用超纯水定容至250mL)和1mL显色剂II(13.125g NaOH和7.5mLNaClO用超纯水定容至250mL)，强烈震荡，继续在37℃恒温水浴箱中保温20min后取出，用超纯水稀释到10mL，625nm处比色，测定OD值，计算酶活(采用氯化铵绘制标准曲线)。
脲酶酶活单位定义：在常压，20mM pH4.5柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液及37℃条件下，每分钟降解尿素生成2μmol NH4 +所需要的酶量为一个酶活力单位。
氨基甲酸乙酯水解酶酶活单位定义：在常压，20mM pH4.5柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液及37℃条件下，每分钟降解EC生成1μmol NH4 +所需要的酶量为一个酶活力单位。
实施例1：双功能酸性脲酶urePS基因的鉴定及克隆
按照细菌基因组提取试剂盒(OMEGA)使用说明提取普罗威登斯菌(Providenciasp.LBBE)基因组DNA。根据正向引物F及反向引物R，正向引物加上BamHI酶切位点及其保护碱基，反向引物加上Xho I酶切位点及其保护碱基，如下：
正向引物F：5'-CGCGGATCCGATGTCTGATTTTTCAGGATCAGGCTG-3'(核苷酸序列如SEQID NO.5所示)
反向引物R：5'-CCGCTCGAG TTAACGTCTTAACATGCCTTTATC-3'(核苷酸序列如SEQ IDNO.6所示)
以地衣芽孢杆菌基因组DNA为模板，上述特异性引物为引物，对urePS基因(核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)进行扩增。扩增体系：按照PrimerSTAR HS DNA Polymerase(TAKARA)试剂盒说明书配制50μl反应体系。扩增条件为：98℃30s 1个循环，98℃10s，54℃10s，72℃5min 48s，30个循环，72℃10min一个循环。PCR产物采用0.8％琼脂糖凝胶电泳进行切胶回收，回收约5.1kb的DNA片段(如图1所示)，回收方法参照胶回收试剂盒(TAKARA)说明书进行。回收产物送上海生工生物公司测定核苷酸序列。
实施例2：表达载体和表达体系的构建
实施例1方法所获得的PCR产物经BamHI和Xho I双酶切，切胶回收后，与经BamHI和Xho I双酶切的pRSFDuet-1质粒连接，转入E.coli BL21DE3感受态细胞，涂布在含有50μg/ml卡那霉素的LB固体平板上，37℃培养12h，用正向引物F及反向引物R，PCR鉴定阳性克隆。将菌落PCR鉴定正确的阳性克隆接入含有50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中培养，提取质粒，进行质粒双酶切验证。经BamHI和Xho I双酶切验证正确的质粒(如图2所示)送往上海生工生物公司测序。由此得到重组脲酶的外源表达体系BL21(DE3)/pRSFDuet-urePS。
实施例3：双功能脲酶的重组表达
挑取基因工程菌BL21(DE3)/pRSFDuet-urePS单菌落，接种于25mL、含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃震荡培养过夜。第二天按1％接种量转接至含有50μg/mL卡那霉素的TB培养基中，培养至菌浓OD600＝0.6时，加入IPTG至终浓度为1mmol/L诱导，同时添加终浓度为2mM的NiCl2，30℃培养10h，离心收集菌体，用20mM pH4.5柠檬酸-柠檬酸缓冲液重悬细胞，通过超声破壁、离心取上清，测定酶活，酶活力为：以EC为底物时酶活达到0.39U/ml，以尿素为底物时酶活达到4.82U/ml。
实施例4：重组双功能脲酶的纯化
(1)基因工程菌BL21(DE3)/pRSFDuet-urePS粗酶液的制备
挑取基因工程菌BL21(DE3)/pRSFDuet-urePS单菌落，接种于25mL、含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃震荡培养过夜。第二天按1％接种量转接至含有50μg/mL卡那霉素的TB培养基中，培养至菌浓OD600＝0.6时，加入IPTG至终浓度为1mmol/L诱导，同时添加终浓度为2mM的NiCl230℃培养10h，离心收集菌体，并重悬于50mM pH4.5的柠檬酸缓冲液中，菌体终浓度为0.1g/ml。将菌体置于冰水浴中进行超声破碎，超声破碎的条件为：功率70W，工作2s间隔4s，重复工作30min，至菌体溶液变清澈为止。将破碎液于4℃12000rpm离心10min，转移上清液于干净的离心管中低温保存。
(2)乙醇分级沉淀
将冷乙醇缓慢加入到粗酶液中，并不断搅拌至饱和度为30％，4℃静置4h，10000rpm离心20min弃沉淀取上清，并向上清中继续加入冷乙醇至饱和度为60％，如上述条件进行沉淀离心弃上清取沉淀。然后将蛋白沉淀溶解于适量20mmol·L-1pH 7.0的磷酸盐缓冲溶液中，用透析袋在相同的缓冲溶液中对蛋白样品透析。
(3)离子交换层析
起始缓冲液A：20mmol·L-1pH 7.0的磷酸盐缓冲溶液。洗脱缓冲液B：含1mol·L- 1NaCl的20mmol·L-1pH 7.0的磷酸盐缓冲溶液。采用HiTrap DEAE HL 5mL阴离子交换柱，先用起始缓冲液平衡柱子，流速为5mL·min-1，上样后用洗脱缓冲液梯度洗脱蛋白，采用梯度20％，40％，60％，80％，100％B液。合并活性管并透析除盐。
(4)疏水层析
起始缓冲液C：20mmol·L-1pH 7.0的磷酸盐缓冲溶液。洗脱缓冲液D：含1mol·L-1(NH4)2SO4的20mmol·L-1pH 7.0的磷酸盐缓冲溶液。向蛋白样品中缓慢加入固体硫酸铵至终浓度为1mol·L-1，经0.22μm滤膜过滤，上样于提前经D液平衡的Phenyl HP 5mL疏水柱，采用梯度洗脱100％D，80％D，60％D，40％D，20％D，流速为5mL·min-1。分别测定收集各管酶活性，合并活性管并透析除盐。
(5)凝胶过滤层析
Superdex-200 prep grade凝胶柱，进样量为0.5mL，柱体积120mL，缓冲液为20mmol·L-1pH 7.0的磷酸盐缓冲溶液，流速1mL·min-1。收集出峰处，测定不同出峰处酶活，合并有酶活各管，用于后续实验。
(6)离子交换层析
起始缓冲液E：20mmol·L-1pH 7.0的磷酸盐缓冲溶液。洗脱缓冲液F：含1mol·L- 1NaCl的20mmol·L-1pH 7.0的磷酸盐缓冲溶液。经上步纯化的蛋白上样于Mono Q 5/50GL离子柱，采用线性洗脱方式，流速为1mL·min-1。测定各管收集液酶活，合并有活性各管。
最终纯化效果如图3所示。
实施例5：双功能脲酶以EC为底物时的乙醇耐受性
将BL21(DE3)/pRSFDuet-urePS发酵获得的纯化的脲酶，置于20％乙醇中，37℃保温若干小时，每隔一小时取一次样测定酶活，按照材料与方法中所述氨基甲酸乙酯水解酶的酶活测定方法，以未经20％乙醇处理的酶液活性作为100％，测定结果如图4所示。
图4显示，酶液在20％的乙醇中37℃保温2h后依然可以保持其93％及以上的活性。由此说明，此脲酶以EC为底物时具有高的乙醇耐受性，对于黄酒中氨基甲酸乙酯的消除具有巨大的应用价值。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (9)

1.一种双功能酸性脲酶，其特征在于，所述双功能酸性脲酶为：(1)由氨基酸序列分别如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示的结构亚基UreA、UreB、UreC组成或(2)核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.权利要求1所述的双功能酸性脲酶，其特征在于，编码所述双功能酸性脲酶的整个基因簇的基因在基因组上的排布顺序为ureD、ureA、ureB、ureC、ureE、ureF、ureG。
3.含有权利要求1-2任一所述的双功能酸性脲酶编码基因的重组菌。
4.根据权利要求3所述的重组菌，其特征在于，所述宿主菌是大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、乳酸乳球菌或酵母菌中的任意一种。
5.一种生产权利要求1所述双功能酸性脲酶的方法，其特征在于，所述方法是将表达权利要求1所述双功能酸性脲酶的重组菌E.coli BL21(DE3)/pRSFDuet-urePS培养到一定菌体浓度，添加诱导剂，培养一定时间；所述重组菌E.coli BL21(DE3)/pRSFDuet-urePS的构建具体是：(1)获取核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的脲酶基因urePS；(2)将目的基因urePS连接到载体pRSFDuet-1得到重组质粒pRSFDuet-urePS；(3)将步骤(2)获得的重组质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)中获得重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pRSFDuet-urePS，双功能酸性脲酶基因在重组菌中表达受T7启动子调控。
6.一种权利要求1所述双功能酸性脲酶的纯化方法，其特征在于，所述方法利用重组菌E.coli BL21(DE3)/pRSFDuet-urePS发酵产酶，然后超声破碎菌体得到粗酶液；粗酶液依次经乙醇分级沉淀、第一次离子交换层析、疏水层析、凝胶过滤层析、第二次离子交换层析处理；所述重组菌E.coli BL21(DE3)/pRSFDuet-urePS的构建具体是：(1)获取核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的脲酶基因urePS；(2)将目的基因urePS连接到载体pRSFDuet-1得到重组质粒pRSFDuet-urePS；(3)将步骤(2)获得的重组质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)中获得重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pRSFDuet-urePS，双功能酸性脲酶基因在重组菌中表达受T7启动子调控。
7.权利要求1所述双功能酸性脲酶在降解氨基甲酸乙酯和/或尿素方面的应用。
8.权利要求1所述双功能酸性脲酶在发酵食品方面的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述发酵食品为酒精饮料。
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