CN101586162A - 一种提取靶核酸并进行pcr扩增检测的方法 - Google Patents
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Abstract
一种提取靶核酸并进行PCR扩增检测的方法，其包括如下步骤：将一种裂解液、一种含靶核酸的样品和一种进行PCR扩增的反应液加入PCR反应管中，混合均匀，置于PCR仪上进行PCR扩增。本发明只需简单器材，即可从样品中快速高效提取靶核酸并同步进行实时荧光定量PCR扩增检测；检测线性范围宽，对于不同浓度的样本，定量准确，特异性好，重复性好；操作格外简便，适用于不同类型的PCR仪，可广泛应用于病原微生物的检测，法医学鉴定，组织和血液分型，基因突变的检测等领域。
Description
技术领域
本发明涉及一种提取靶核酸并进行PCR扩增检测的方法。
背景技术
自1985年PCR技术问世以来，这一技术已被应用到生命科学的各信息领域，因其敏感性高、特异性强、操作简便、所需时间短等优点，目前已被广泛用于病原微生物的检测。由于临床标本中含有蛋白质、脂类等物质，可干扰PCR反应，故在做PCR反应前必须进行核酸提取。PCR检测技术的第一步就是模板DNA的制备，即样本中DNA的提取，这直接影响着PCR反应的结果。长期以来，样本中DNA的提取和纯化一直是耗时、繁琐的过程，严重减慢了检测速度。
目前，样品中DNA的提取方法包括两个步骤：裂解细胞和提取核酸。裂解细胞，使DNA释放出来的常用方法包括物理法(煮沸、冻融、微波、超声、研磨等)、化学方法(高盐、表面活性剂SDS、热酚等)和酶解法(裂解酶、溶菌酶、蛋白酶K等)。
酚抽提法、异丙醇沉淀法及甲酰胺裂解法是提取DNA最为经典的方法，目前很多方法的改进都是在这些方法的基础上进行的，这三种方法均是利用蛋白酶K和十二烷基硫酸钠(SDS)消化破碎细胞。在前两种方法中，裂解液先用酚/氯仿去除蛋白质，再分别用乙醇或异丙醇沉淀DNA。甲酰胺法是利用高浓度的甲酰胺解聚蛋白质与DNA的结合，然后利用透析来处理DNA样品。这些经典方法获得的DNA纯度很高，能够满足各种试验的要求，但操作繁琐，用时长，且所用试剂具有一定的毒性。
目前应用于实时荧光定量PCR检测的核酸提取方法主要有三种，即碱裂解法、煮沸裂解法和磁珠法。
碱裂解法是在NaOH提供的高pH(12.0～12.6)条件下，用强阳离子去垢剂SDS破坏细胞壁，裂解细胞，与NaOH共同使细胞的蛋白质发生变性，释放出DNA。裂解后，细胞壁碎片与变性的蛋白质和其他杂质形成大的复合物，这些复合物在高钾盐条件下，可有效沉淀，而DNA保留于上清液中，再通过无水乙醇沉淀、乙醇洗涤等步骤纯化DNA。碱裂解法虽然快速简便，但去蛋白效果欠佳，明显影响了PCR效果。
煮沸裂解法原理，是在煮沸时将样品中的DNA通过含蛋白酶K等裂解缓冲液的作用释放出来，溶解在缓冲液中，沸水浴裂解细胞的同时，可破坏DNA链的碱基配对，并使细胞的蛋白质与染色体DNA变性。通过离心沉淀去除变性的蛋白质和其他杂质，然后回收上清液中的DNA用于PCR扩增。然而，经高温煮沸，蛋白凝固使部分核酸被包裹并随离心沉淀丢失，直接导致上清液中模板核酸量减少；另外，虽经煮沸并高速沉淀，上清液中仍含有少量抑制扩增的成分如蛋白、肝素及微量血红蛋白等，抑制了扩增效率。
磁珠法是近几年才发展起来的核酸提取方法，磁珠法提取核酸是通过细胞裂解液裂解细胞，从细胞中游离出来的核酸分子被特异的吸附到磁性颗粒表面，而蛋白质等杂质不被吸附，而留在溶液中。反应一定时间之后，再在磁场作用下，使磁性颗粒与液体分开，回收颗粒(即磁珠-DNA混合物)，再用洗脱液洗脱，得到纯净的DNA。由于其系列试剂不含氯仿、苯酚等毒性大的有机溶剂，提取步骤更简单，对核酸样本的回收率高和纯度好等优势而倍受研究者青睐。不过产品基本上为国外所垄断，价格非常昂贵，从而限制了其在我国的广泛应用。
无论是经典方法还是各种改良法，都必须关注以下三个要点：第一、目的基因的得率；第二、操作程序的简繁程度；第三、材料和时间的消耗。以上各种方法都必须在提取纯化核酸后才可进行PCR检测，处理大量临床样本的时候难免会比较吃力。
发明内容
本发明的目的在于提供一种所用器材简单，操作简便，成本低的提取靶核酸并进行PCR扩增检测的方法。
本发明之提取核酸并进行PCR扩增的方法包括如下步骤：将一种裂解液、一种含靶核酸的样品和一种进行PCR扩增的反应液加入PCR反应管中，混合均匀，置于PCR仪上进行PCR扩增。
裂解液、含靶核酸的样品和PCR扩增反应液混匀后，宜静置3-8分钟，然后再置于PCR仪上进行PCR扩增。
所述裂解液由0.01～0.5mM(质量体积比)的表面活性肽溶解于50～200mM的KCl(质量体积比)，0.01％～2％(体积)的SDS、LLS、Chelex-100(质量体积比)，以及0.05％～1％(体积)的乙醇组成。
含靶核酸的待测样品可以为血清、血浆、分泌液或痰液。
所述核酸可以是DNA或RNA。
PCR扩增反应液(以下简称“PCR反应液”)包括PCR扩增缓冲液，选自dATP、dCTP、dGTP、dTTP或dUTP中的4种dNTP的混合物，DNA聚合酶，镁离子，针对靶基因设计的上下游引物；根据实时荧光定量PCR的不同目的，还包括荧光染料或者根据靶序列专门设计的引物和与靶序列特异杂交的探针。这些物质的配比一般是根据不同实验的反应体系调整，如1-5U的DNA聚合酶、3-5.5mM的Mg2+、0.2-0.4mM的dNTPs、1×PCR buffer；50-900nM的上游引物、50-900nM的下游引物，确定浓度后再确定加入物质的量(参见后述实施例)
所述4种dNTP的混合物配比，dATP∶dCTP∶dGTP∶dTTP的比例一般为1∶1∶1∶1；dATP∶dCTP∶dGTP∶dUTP的比例为1∶1∶1∶2。
所述裂解液、含靶核酸的待测样品、PCR反应液这三种物质之间配比无限制，即可以是任何比例，但较优选的配比为1∶1-3∶10-25；混配顺序也无严格限制，但PCR反应液宜最后添加。
除裂解液、含靶核酸的待测样品、PCR反应液之外，还可根据需要加入内标。
所述内标为已知低含量的与模板扩增效率相似的一段DNA片段，将它加入PCR反应液中，与模板共同扩增，可反应每管真实的扩增情况，如果内标和样品都未扩增出结果，则表示该管扩增无效。
所述PCR扩增包括简单PCR、线性扩增和实时荧光定量PCR。
本发明的优点是：只需简单的器材，如移液枪、PCR反应管；两种简单的试剂(裂解液、PCR反应液)，即可从样品中快速高效提取靶核酸并同步进行实时荧光定量PCR扩增检测。
同时，本发明方法检测线性范围宽，对于不同浓度的样本，定量准确，特异性好，重复性好。
与目前已有的核酸提取及PCR检测方法相比较，本发明操作格外简便，接近自动化的操作保证了实验结果稳定，避免人工操作引起的差异及错误，适用于不同类型的PCR仪，可广泛应用于病原微生物的检测，法医学鉴定，组织和血液分型，基因突变的检测等领域。
附图说明
图1(a)为本发明方法检测HBV DNA国家标准品的阳性参考品；
图1(b)为本发明方法检测HBV DNA国家标准品的阴性参考品；
图2为本发明方法检测HBV DNA阳性血清，从左至右浓度分别为1.0×107IU/ml，1.0×106IU/ml，1.0×105IU/ml，1.0×104IU/ml
图3(a)为本发明方法检测HBV DNA阳性血清，浓度为500IU/ml
图3(b)为本发明方法检测HBV DNA阳性血清，浓度为300IU/ml
图3(c)为本发明方法检测HBV DNA阳性血清，浓度为200IU/ml
图4为本发明方法检测HBV DNA及相应内标。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作出进一步说明：
实施例1：HBV DNA的荧光定量PCR检测实施例
用带滤芯吸嘴吸取2微升裂解液(0.1mM的表面活性肽溶于80mM KCl、0.1％SDS、0.5％乙醇)，3微升待测样本(已知HBV DNA阳性的血清或血浆)，加入PCR反应管中，移液枪头吸打混匀，静置5min后，用带滤芯吸嘴吸取45ul已配好的PCR反应液，于Stratagene Mx3000P或ABI7300 PCR仪上进行实时荧光定量PCR扩增。
PCR反应液各成分浓度及比例如下：
| 成分 | 单人份用量 |
| (上游)引物HBV-F1(50pmol/μl) | 0.2μl |
| (下游)引物HBV-F1(50pmol/μl) | 0.2μl |
| HBV探针HBV-P1(50pmol/μl) | 0.1μl |
| ROX溶液(10μmol/L) | 1μl |
| dNTPs | 0.4μl |
| 10×PCR buffer | 5μl |
| 灭菌纯化水 | 38.1μl |
| 总量 | 45μl |
PCR反应程序为：
1)以HBV国家标准品中的阴阳性参考品作为待检样本，采用本发明方法在StratageneMx3000P仪器上检测，检测阴阳性符合率。如图1(a)为国家标准品中的9个阳性参考品，运用本发明检测全为阳性，图1(b)为8个阴性参考品，经检测全为阴性。运用本发明方法进行HBV DNA荧光定量PCR检测具有良好的特异性。
2)以中国生物制品检定所(中检所)乙型肝炎病毒(HBV)核酸定量标准品标定的4种浓度的HBV DNA阳性血清为待测样本，浓度分别为1.0×107IU/ml，1.0×106IU/ml，1.0×105IU/ml，1.0×104IU/ml，每一浓度重复实验3次，结果如图2所示，CT值的变异系数分别为：0.25％，0.44％，0.48％，0.36％，变异系数均在1％以内，由此可以看出运用本发明方法检测血清样本的重复性很好。
3)以中检所乙型肝炎病毒(HBV)核酸定量标准品标定的HBV阳性血清为初始样本，稀释至500IU/ml，300IU/ml，200IU/ml，每一浓度重复5次，如图3，500IU/ml，300IU/ml的样本均100％的扩增，而200IU/ml的仅1个的样本无扩增，故运用本发明方法进行荧光定量PCR检测灵敏度可达300IU/ml。
4)以HBV国家标准品中的线性灵敏度参考品为待测样本，以梯度稀释的阳性标准品(浓度分别为1.0×107IU/ml，1.0×106IU/ml，1.0×105IU/ml，1.0×104IU/ml)采用本发明的快速方法进行检测，分析检测值与理论值的符合性：
| 线性灵敏度参考品 | 质量标准(IU/ml) | 理论浓度对数值 | 检测值 | 检测浓度对数值 |
| L0 | 7.762×107～6.165×108 | 8.342 | 2.55×108 | 8.407 |
| L1 | 1.479×107～1.175×108 | 7.619 | 3.54×107 | 7.549 |
| L2 | 1.585×106～1.259×107 | 6.649 | 4.43×106 | 6.646 |
| L3 | 1.659×105～1.318×106 | 5.672 | 3.41×105 | 5.382 |
| L4 | 1.820×104～1.479×105 | 4.715 | 1.38×104 | 4.140 |
| L5 | 1.514×103～1.230×104 | 3.636 | 1.71×103 | 3.233 |
| L6 | 3.890×101～3.090×102 | 2.043 | 5.64×101 | 1.751 |
理论浓度和检测浓度的双对数曲线线性相关系数(r)为0.9993，运用此方法进行实时荧光定量PCR检测定量很准确。
实施例2：HBV DNA及相应内标的快速荧光定量PCR检测实施例
如实施例1的方法，用带滤芯吸嘴吸取2微升裂解液(0.1mM的表面活性肽溶于80mM KCl、0.1％SDS、0.5％乙醇)，3微升待测样本(已知HBV DNA阳性的血清或血浆)，加入PCR反应管中，移液枪头吸打混匀，静置约5min。根据反应数按照每反应加入0.3ul内标(104copies/ul)的比例将内标加入PCR反应液中。本实施例选用了低浓度HBV DNA样本(浓度为500IU/ml、200IU/ml)以及一个阴性样本作为待测样本。如图4，荧光信号较高的一组为内标的扩增曲线，荧光信号较低的一组为待测样本的扩增曲线，内标扩增正常且对于低浓度检测样本无影响。内标为已知低含量的与模板扩增效率相似的一段DNA片段，将它加入PCR反应液中，与模板共同扩增，可反应每管真实的扩增情况，如果内标和样品都未扩增出结果，则表示该管扩增无效，本快速方法可加入内标监控并具有很好的效果。
通过对乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸(HBV DNA)运用Taqman实时荧光定量PCR进行绝对定量实验证明，本发明方法检测线性范围宽，对于不同浓度的样本，定量准确，特异性好，重复性好。
对照例1：煮沸法提取HBV DNA及荧光定量PCR检测
目前国内有很多采用煮沸法提取核酸并进行HBV定量检测，但灵敏度仅能达到500IU/ml或103IU/ml以上，而本发明方法灵敏度较煮沸法高，且操作更简便。
对照例2：磁珠法提取HBV DNA及荧光定量PCR检测
磁珠法：待测样本中加入细胞裂解液，待细胞裂解后，向裂解液中加入磁珠，当溶液的PH值小于6.5时，磁珠选择性的与优化的DNA结合，此时将吸附有DNA的磁珠置于磁场中，通过缓冲液去除没有被吸附的杂质(蛋白等)，然后将磁珠置于PH值8.5的缓冲液中，纯化的DNA即可进入缓冲液，将洗脱的DNA加入PCR反应液中上机进行实时荧光定量PCR检测。
目前已知的资料中，运用磁珠法提取核酸并扩增的灵敏度可达到10IU/ml本发明方法灵敏度较磁珠法稍低，但在操作上相对简便很多。
Claims (10)
1、一种提取靶核酸并进行PCR扩增检测的方法，其特征在于，包括如下步骤：将一种裂解液、一种含靶核酸的样品和一种进行PCR扩增的反应液加入PCR反应管中，混合均匀，置于PCR仪上进行PCR扩增。
2、根据权利要求1所述的提取靶核酸并进行PCR扩增检测的方法，其特征在于，将裂解液、含靶核酸的样品和PCR扩增反应液混匀后，先静置3-8分钟，然后再置于PCR仪上进行PCR扩增。
3、根据权利要求1或2所述的提取靶核酸并进行PCR扩增检测的方法，其特征在于，所述裂解液由0.01～0.5mM(质量体积比)的表面活性肽溶解于50～200mM的KCl(质量体积比)，0.01％～2％(体积)的SDS、LLS、Chelex-100(质量体积比)，以及0.05％～1％(体积)的乙醇组成。
4、根据权利要求1或2所述的提取靶核酸并进行PCR扩增检测的方法，其特征在于，所述核酸是DNA或RNA。
5、根据权利要求1或2所述的提取靶核酸并进行PCR扩增检测的方法，其特征在于，进行PCR扩增的反应液包括PCR扩增缓冲液，选自dATP、dCTP、dGTP、dTTP和dUTP中的4种dNTP的混合物，DNA聚合酶，镁离子，针对靶基因设计的上下游引物。
6、根据权利要求5所述的提取靶核酸并进行PCR扩增检测的方法，其特征在于，所述4种dNTP的混合物配比，dATP∶dCTP∶dGTP∶dTTP的比例为1∶1∶1∶1；dATP∶dCTP∶dGTP∶dUTP的比例为1∶1∶1∶2。
7、根据权利要求5所述的提取靶核酸并进行PCR扩增检测的方法，其特征在于，还包括荧光染料或者根据靶序列专门设计的引物和与靶序列特异杂交的探针。
8、根据权利要求1或2所述的提取靶核酸并进行PCR扩增检测的方法，其特征在于，含靶核酸的待测样品为血清、血浆、分泌液或痰液。
9.根据权利要求1或2所述的提取靶核酸并进行PCR扩增检测的方法，其特征在于，PCR扩增为简单PCR、线性扩增或实时荧光定量PCR。
10、根据权利要求5所述的提取靶核酸并进行PCR扩增检测的方法，其特征在于，裂解液、含靶核酸的待测样品、PCR反应液之间的配比为1∶1-3∶10-25。
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