CN102807975B - 一种从生物样本中快速提取核酸的方法 - Google Patents
一种从生物样本中快速提取核酸的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102807975B CN102807975B CN201110143241.8A CN201110143241A CN102807975B CN 102807975 B CN102807975 B CN 102807975B CN 201110143241 A CN201110143241 A CN 201110143241A CN 102807975 B CN102807975 B CN 102807975B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- chelex
- extracting
- aqueous solution
- pcr reaction
- sample
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 65
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title abstract description 7
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title abstract description 7
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 title abstract description 7
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 title abstract 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 37
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims abstract description 30
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 claims abstract description 22
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 claims abstract description 18
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims abstract description 13
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims abstract description 5
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 claims description 6
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 claims description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 abstract description 55
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 abstract description 26
- CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N O-Xylene Chemical compound CC1=CC=CC=C1C CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 19
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 abstract description 5
- 229940057995 liquid paraffin Drugs 0.000 abstract description 4
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 abstract description 2
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 abstract description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 abstract 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 abstract 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 abstract 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 abstract 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 abstract 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 abstract 1
- 239000008096 xylene Substances 0.000 abstract 1
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 12
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 230000008569 process Effects 0.000 description 11
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 10
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 10
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 8
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 8
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 7
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 6
- 235000011389 fruit/vegetable juice Nutrition 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 230000009514 concussion Effects 0.000 description 4
- 229960000935 dehydrated alcohol Drugs 0.000 description 4
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 210000000582 semen Anatomy 0.000 description 4
- 102100031181 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 3
- 241000521257 Hydrops Species 0.000 description 3
- 206010030113 Oedema Diseases 0.000 description 3
- 229960004756 ethanol Drugs 0.000 description 3
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 3
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 3
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 3
- 239000001993 wax Substances 0.000 description 3
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N monobenzene Natural products C1=CC=CC=C1 UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- RIZUCYSQUWMQLX-UHFFFAOYSA-N 2,3-dimethylbenzoic acid Chemical compound CC1=CC=CC(C(O)=O)=C1C RIZUCYSQUWMQLX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 229910000906 Bronze Inorganic materials 0.000 description 1
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- PPBRXRYQALVLMV-UHFFFAOYSA-N Styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1 PPBRXRYQALVLMV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 238000007605 air drying Methods 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 239000010974 bronze Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000013522 chelant Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- KUNSUQLRTQLHQQ-UHFFFAOYSA-N copper tin Chemical compound [Cu].[Sn] KUNSUQLRTQLHQQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000013016 damping Methods 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003398 denaturant Substances 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 238000002386 leaching Methods 0.000 description 1
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000007479 molecular analysis Methods 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 238000002205 phenol-chloroform extraction Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000012797 qualification Methods 0.000 description 1
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 1
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000002626 targeted therapy Methods 0.000 description 1
- KAKZBPTYRLMSJV-UHFFFAOYSA-N vinyl-ethylene Natural products C=CC=C KAKZBPTYRLMSJV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003809 water extraction Methods 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及一种从生物样本中快速提取核酸的方法。该方法为：取生物样本，置于chelex-100的水溶液或chelex-100的DEPC水溶液中，在80～100℃加热1～50分钟；将抽提柱放入离心管，将上述液体加入到抽提柱中，1000～20000转/分钟离心2～120秒；取离心后的液体用于PCR或RT-PCR反应。本发明采用chelex-100与高温加热的方法进行提取，省去了蛋白酶水解的步骤，对石蜡切片省去了脱蜡的步骤，消除了有机溶剂二甲苯，时间大为缩短；通过在抽提柱放置截留膜，去除了液态石蜡和chelex-100对PCR或RT-PCR反应的不良影响，提高了PCR或RT-PCR反应的灵敏度。
Description
技术领域
本发明涉及一种从生物样本中快速提取核酸的方法。
背景技术
DNA分子是分子生物学研究的基本材料，依不同的实验目的可采取不同的抽提方法获取数量和质量不等的DNA。目前抽提DNA的方法一般有以下几种：
(1)阴离子去污剂法：用SDS或二甲苯酸钠等去污剂使蛋白质变性，可以直接从生物材料中提取DNA。细胞中DNA与蛋白质之间常借静电引力或配位键结合，由于阴离子去污剂能够破坏这种价键，所以常用阴离子去污剂提取DNA，但阴离子去污剂常常影响后续的PCR反应。
(2)水抽提法：利用核酸溶解于水的性质，将组织细胞破碎后，用低盐溶液除去RNA，然后将沉淀溶于水中，使DNA充分溶解于水中，离心后收集上清液。在上清中加入固体氯化钠调节至2.6M。加入2倍体积95％乙醇，立即用搅拌法搅出，然后分别用66％，80％和95％乙醇以及丙铜洗涤，最后在空气中干燥，既得DNA样品，此法提取的DNA中蛋白质含量较高，故一般不用。
(3)苯酚抽提法：苯酚作为蛋白变性剂，同时抑制了DNase的降解作用。用苯酚处理匀浆液时，由于蛋白与DNA联结键已断，蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。离心分层后取出水层，多次重复操作，再合并含DNA的水相，利用核酸不溶于醇的性质，用乙醇沉淀DNA。此时DNA是十分粘稠的物质，可用玻璃漫漫绕成一团，取出。此法的特点是使提取的DNA保持天然状态。
苯酚抽提法是抽提DNA最常规的方法，但是因为要使用苯酚，对实验者有害，因此目前也有利用吸附过柱的方法提取DNA的商业化试剂盒。因为需要蛋白酶K处理过程，一般需要经过3-4小时的抽提过程，才能进入后续的PCR反应。
医院病理科存在大量各种疾病甲醛固定石蜡包埋组织(formalin fixed and paraffinembedded tissues，FFPET)，为分子病理研究提供了大量的信息来源，近年来的靶向治疗使从石蜡包埋组织中抽提DNA成为研究的热点。然而***固定后的蜡块包埋组织DNA降解严重，存档FFPET组织切片取量有限，传统酚氯仿提取DNA步骤繁杂，提取过程损失严重等都制约了石蜡组织在分子病理学中的研究应用，如何高效、高质量提取微量石蜡组织中DNA对利用石蜡组织进行分子研究及诊断至关重要。
传统从石蜡组织里抽提DNA需要先用二甲苯脱蜡，然后用无水乙醇去除二甲苯，脱蜡过程繁琐，至少需要3～4小时，而且二甲苯是有机溶剂，对实验操作者的身体有害。脱完蜡后，标本也需要再经过3～4小时的抽提，才能进入后续的PCR反应。
Chelex-100是一种由苯乙烯和苯二乙烯共聚体组成的螫合树脂，其悬液在碱性环境(pH10～11)和100℃条件下，可导致细胞膜破裂并使DNA变性释放出来，并且Chelex-100可高选择性的结合多价阳离子，去除样品和缓冲液中的多价金属离子，避免煮沸过程中模板DNA的降解。Chelex-100提取DNA具有经济、简便、高效等优点，目前已被用于从全血或血液、***或精斑、混合斑、毛发、培养细胞等提取DNA。但一般也需要经过2～3小时的抽提过程，才能进入后续的PCR反应。
目前已经有采用Chelex-100提取石蜡切片中的遗传物质的报道，如在2010年海南医学学院学报上发表的文章“四种微量石蜡组织DNA提取方法的比较”一文中，就采用了Chelex-100提取石蜡切片中的DNA，但在该文献中，在采用Chelex-100提取前，还是采用了二甲苯脱蜡、乙醇洗涤的步骤，从而使得步骤繁琐，操作不够简单快捷。为此，发明人提出了一种简单快捷、效果良好的从生物样本中提取DNA的方法。
但目前尚没有采用Chelex-100提取RNA的报道，为此，发明人提出了一种采用Chelex-100简单快速、效果良好的从生物样本中提取RNA的方法。
发明内容
本发明的发明目的在于提出一种核酸的快速提取方法。
为了实现本发明的发明目的，所采用的技术方案为：
本发明涉及一种从生物样本中快速提取DNA的方法，所述的方法包括以下步骤：
1.取少量生物样本，所述生物样本选自病理组织石蜡切片样本、血斑精斑或***样本、组织液样本、脑脊液样本、血液样本、血清样本、血浆样本、尿液样本、积液样本、组织细胞样本；
2.将生物样本置于chelex-100的水溶液中，所述的chelex-100的水溶液的浓度为1～80g/100ml；
3.80～100℃条件下加热1～50分钟；
4.将抽提柱放入离心管中，将步骤3中获得的液体加入到抽提柱中，1000～20000转/分钟，离心2～120秒；
5.收集离下的液体，用于PCR反应。
本发明还涉及一种从生物样本中快速提取RNA的方法，其特征在于，所述的方法包括以下步骤：
1.取少量生物样本，所述生物样本选自病理组织石蜡切片样本、血斑精斑或***样本、组织液样本、脑脊液样本、血液样本、血清样本、血浆样本、尿液样本、积液样本、毛发样本、组织细胞样本；
2.置于1～80％chelex-100的DEPC水溶液中；
3.80～100℃条件下加热1～50分钟；
4.将抽提柱管放入离心管中，将步骤(3)中获得的液体加入到抽提柱管中，1000～20000转/分钟，离心2～120秒；
5.收集离下的液体，用于RT-PCR反应。
其中，本发明的第一优选技术方案为，所述的方法抽提柱为，在抽提柱底部有一层起物理阻挡的膜。
本发明的第二优选技术方案为，所述的chelex-100的水溶液的浓度为2～50g/100ml，更优选3～10g/100ml。
本发明的第三优选技术方案为，所述的chelex-100的EDPC水溶液的浓度为2～50g/100ml，优选3～10g/100ml。
本发明的第四优选技术方案为，所述的加热温度为90～100℃，优选90～95℃。
本发明的第五优选技术方案为，所述的加热时间为5～30分钟，优选8～10分钟。
本发明的第六优选技术方案为，所述的离心的时间为2～120秒，优选10～30秒。
本发明的第七优选技术方案为，所述的离心的转速为5000～20000转/分钟，优选10000～20000转/分钟，更优选15000～20000转/分钟。
其中，本发明中的生物样本选自病理组织石蜡切片样本、血斑精斑或***样本、组织液样本、脑脊液样本、血液样本、血清样本、血浆样本、尿液样本、积液样本、毛发样本、组织细胞样本；当生物样本为组织细胞样本或石蜡切片时，在步骤1中采用研磨棒对生物组织进行研磨，当提取RNA时，则需要在冰上进行研磨，以减少RNA降解，提高生物组织中RNA的释放，提高检验效率。
本发明的技术优势为：
1.本发明方法简单，时间短，且不使用有害有机溶剂。传统方法中一般从石蜡包埋组织中抽提DNA需要先用二甲苯脱蜡，然后用无水乙醇去除二甲苯，所用的时间长，过程繁琐，至少需要3～4小时才能完成，而且二甲苯是有机溶剂，对人体有害。脱完蜡后，标本需要再经过蛋白酶K的处理，以去除蛋白质，这个过程也需要3～4小时，故通常方法抽提石蜡包埋组织中DNA，进入后续PCR反应，需要6～8小时以上。本发明的方法简便易行，不使用挥发性有害有机溶剂二甲苯，不会对实验人员造成伤害，并且所需时间大为缩短，仅需10余分钟即可完成；
2.本发明采用高温加热进行提取，不仅使石蜡变成液态，而且使组织中的蛋白质变性，DNA或RNA被释放出来，省去了需要蛋白酶K水解需要3～4个小时的过程；
3.通常液态石蜡和chelex-100都会对PCR或RT-PCR反应造成不良影响，通过本发明，可将液态石蜡和chelex-100截留在抽提柱的膜上，从而消除了液态石蜡和chelex-100对PCR或RT-PCR反应的不良影响，提高了PCR或RT-PCR反应的灵敏度；
4.目前尚没有采用Chelex-100提取RNA的报道，发明人在本发明中提出了一种采用Chelex-100简单快速、效果良好的从生物样本中提取RNA的方法。
附图说明
图1为实施例1中采用两种方法抽提的基因组DNA琼脂糖凝胶电泳图，其中，M代表分子量标记，1代表的是用试剂盒抽提的基因组DNA琼脂糖凝胶电泳图，2代表的是用本发明的方法抽提的基因组DNA琼脂糖凝胶电泳图。
下面对本发明的具体实施方式做进一步的解释和说明，但并不对本发明的内容构成限制。本发明所用的试剂均为市售试剂，所用的实验仪器均为实验室常用仪器。
具体实施方式
实施例1
1.用两种方法提取石蜡包埋组织切片中的DNA，每种方法抽提3个标本，平行比较。
1)用北京百泰克生物技术有限公司生产的石蜡组织切片DNA提取试剂盒抽提石蜡包埋组织切片中的DNA
a.取2片5um的医用石蜡(型号：型号：BX12M311398，北京中西远大科技有限公司生产)包埋组织切片放入1.5mL的离心管中。
b.加入1ml二甲苯，震荡混匀，55℃水浴10分钟。13000转5分钟，吸弃上清。
c.重复第2步一到三次。
d.加1ml无水乙醇，震荡混匀。13000转5分钟，吸弃上清。
e.重复第4步一次。
f.将沉降下来的标本烘干。
g.加入200μl Buffer 1，混匀。
h.加入25μl Proteinase K，震荡混匀。55℃水浴消化过夜。
i.13000转离心5分钟，上清转移到一干净的1.5mL离心管中。
j.加入220μl Buffer 2，震荡混匀。70℃水浴10分钟
k.加入220μl无水乙醇，混匀。
l.将抽提柱放入收集管中，移入第5步的混合液体，室温静置3分钟。
m.13000转离心2分钟，把液体重新转入柱子，重新过柱。
n.13000转离心2分钟，弃液体。
o.把柱子移入新的收集管内，加入500μl Buffer 3。
p.把柱子移入新的收集管内，13000转离心1分钟，弃液体。加入600μl Wash Buffer。(Wash Buffer按包装预加适量无水乙醇)
q.13000转离心1分钟，弃液体。加入600μl DNA Wash Buffer。
r.13000转离心1分钟，弃液体。13000转离心2分钟，开盖挥发4-5分钟。
s.、把柱子移入1.5mL的带盖离心管中，在膜中央加入40μl Elution Buffer(须70℃预热)。室温静置3分钟。
t.13000转离心1分钟，收集液体，取5ul用于PCR反应。
2)本发明的方法抽提石蜡包埋组织切片中的DNA
a.取2片5um的医用石蜡(型号：型号：BX12M311398，北京中西远大科技有限公司生产)包埋组织切片；
b.置于200ul的溶液1中，所述的溶液为10％chelex-100(sigma公司)的水溶液；
c.90℃条件下加热20分钟；
d.将抽提柱放入离心管中，将步骤3中获得的液体加入到抽提柱里，12000转/分钟离心30秒；所述的抽提柱为：
e.收集离下的液体，取5ul用于PCR反应。
2.DN A鉴定方法：
2.1 DNA质量的琼脂糖凝胶电泳鉴定：
因为石蜡切片中的DNA含量较低，用普通琼脂糖凝胶电泳方法不能检测到DNA的量，因此将用每种方法抽提的三个标本基因组DNA，各取20μL混合，真空抽去部分水分后，加5μL的DNA loading buffer混匀上样，在2％的琼脂糖凝胶中80V电泳30min，在紫外凝胶成像仪下观察所提取DNA基因组的质量并拍照存档。图1为两种方法抽提的基因组DNA琼脂糖凝胶电泳图，其中，M代表分子量标记，1代表的是用试剂盒抽提的基因组DNA琼脂糖凝胶电泳图，2代表的是用本发明的方法抽提的基因组DNA琼脂糖凝胶电泳图。
2.2荧光定量PCR检测所提取DNA基因组的浓度
选择针对人β-2actin基因组DNA的引物和TaqMan荧光探针，采用Primer Express软件自行设计，由上海生物工程公司(Sangong)合成。引物序列见表1。
表1：引物和探针的序列表
| 上游引物 | 5′-GGACCTGACTGACTACCTCATGAA-3′ |
| 下游引物 | 5′-CTTAATGTCACGCACGATTTCC-3′ |
| 探针 | 5′Fam-CACCGAGCGCGGCTACAGCTTC-TAMARA 3′ |
PCR反应体系：模板DNA 2μl，10×buffer(无Mg2+)2.5ul，2.5mmoL/L dNTP 2ul，25mmoL/L MgCl2 1.5ul，引物10mmol/L 0.5ul，10mmol/L探针0.4ul，5U/ul Taq聚合酶0.5μl，余下由灭菌去离子水补足
PCR扩增条件：94℃3min，94℃15s，60℃60s，40个循环，60℃检测荧光，每次PCR反应均设阳性、阴性对照。
共选了三个标本，每个标本重复5次，分别用荧光定量PCR检测人每个标本中β-2actin基因组DNA的量，用Ct值表示，比较两种抽提方法所获得的DNA的质和量，实验结果如表2所示。
从表2可见，用本发明方法抽提得到的基因组DNA所扩增的β-2actin的Ct值较试剂盒抽提的Ct值小，提示用本发明方法抽提得到的基因组DNA含量和质量都较试剂盒抽提的好。
表2：采用两种方法提取DNA的Ct值
实施例2
1.将精斑样本置于chelex-100的水溶液中，所述的chelex-100的水溶液的浓度为20g/100ml；
2.95℃条件下加热10分钟；
3.将抽提柱放入离心管中，将步骤3中获得的液体加入到抽提柱中，20000转/分钟，离心20秒；
4.收集离下的液体，用于PCR反应。
其中，抽提柱为市售；PCR反应采用和实施例1相同的条件，并得到了相似的实验结果。
实施例3
1.将组织液样本置于chelex-100的水溶液中，所述的chelex-100的水溶液的浓度为10g/100ml；
2.100℃条件下加热50分钟；
3.将抽提柱放入离心管中，将步骤3中获得的液体加入到抽提柱中，15000转/分钟，离心30秒；
4.收集离下的液体，用于PCR反应。
其中，抽提柱为市售；PCR反应采用和实施例1相同的条件，并得到了相似的实验结果。
实施例4
1.将组织细胞样本用研磨棒进行研磨后，置于chelex-100的水溶液中，所述的chelex-100的水溶液的浓度为15g/100ml；
2.80℃条件下加热10分钟；
3.将抽提柱放入离心管中，将步骤3中获得的液体加入到抽提柱中，15000转/分钟，离心30秒；
4.收集离下的液体，用于PCR反应。
其中，抽提柱为市售；PCR反应采用和实施例1相同的条件，并得到了相似的实验结果。
实施例5
1.将血斑样本置于chelex-100的水溶液中，所述的chelex-100的水溶液的浓度为20g/100ml；
2.95℃条件下加热10分钟；
3.将抽提柱放入离心管中，将步骤3中获得的液体加入到抽提柱中，20000转/分钟，离心20秒；
4.收集离下的液体，用于PCR反应。
其中，抽提柱为市售；PCR反应采用和实施例1相同的条件，并得到了相似的实验结果。
实施例6
1.快速提取石蜡包埋组织切片中的RNA：
a)取3片5um的医用石蜡(型号：BX12M311398，北京中西远大科技有限公司生产)包埋组织切片在冰上研磨后，放入1.5mL的离心管中；
b)置于200ul的溶液1中，所述的溶液为10％chelex-100的DEPC水溶液；
c)90℃条件下加热20分钟；
d)将抽提柱管放入离心管中，将步骤3中获得的液体加入到抽提柱管里，12000转/分钟离心30秒；
e)收集离下的液体，取5ul用于RT-PCR反应。
2.荧光定量RT-PCR检测所提取RNA的浓度
选择针对人GAPDH引物和TaqMan荧光探针，采用Primer Express软件自行设计，由上海生物工程公司(Sangong)合成。引物序列见表1。
表1为引物、探针的核苷酸序列：
| 上游引物 | 5′-CATCTTCCAGGAGCGAGA-3′ |
| 下游引物 | 5′-TGTTGTCATACTTCTCAT-3′ |
| 探针 | 5′Fam-CCTCACCACCATGGAGAAGGCT-TAMARA 3′ |
40μL反应体系中含有：2.5μL 10×PCR reaction buffer(Mg2+free)，3mmol/L Mg2+，0.125mmol/L dNTP，0.25μmol/L引物，0.156μmol/L探针，聚合酶2U，UNG酶0.2U，RT酶100u，模板量为3μL，补充水至40μL。
PCR扩增条件：42℃30min，94℃，5min；94℃15s，60℃60s，40个循环，60℃检测荧光，每次PCR反应均设阳性、阴性对照。
随机选取8个石蜡包埋组织切片，进行RT-PCR针对GAPDH的mRNA扩增，每个标本都能扩增出GAPDH，提示该方法是快速可行的，见表2。
表2为本发明样本的Ct值：
| 标本号 | Ct值 |
| 1 | 32.1382 |
| 2 | 32.694 |
| 3 | 29.1025 |
| 4 | 28.9604 |
| 5 | 24.662 |
| 6 | 24.5847 |
| 7 | 21.0877 |
| 8 | 21.1414 |
实施例7
1.将精斑样本置于100μl chelex-100的DEPC水溶液中，所述的chelex-100的DEPC水溶液的浓度为20g/100ml；
2.95℃条件下加热10分钟；
3.将抽提柱放入离心管中，将步骤3中获得的液体加入到抽提柱中，20000转/分钟，离心20秒；
4.收集离下的液体，用于RT-PCR反应。
其中，抽提柱为市售；RT-PCR反应采用和实施例6相同的条件，并得到了相似的实验结果。
实施例8
1.将组织液样本置于200μl chelex-100的DEPC水溶液中，所述的chelex-100的DEPC水溶液的浓度为10g/100ml；
2.100℃条件下加热50分钟；
3.将抽提柱放入离心管中，将步骤3中获得的液体加入到抽提柱中，15000转/分钟，离心30秒；
4.收集离下的液体，用于RT-PCR反应。
其中，抽提柱为市售；RT-PCR反应采用和实施例6相同的条件，并得到了相似的实验结果。
实施例9
1.将组织细胞样本在冰上用研磨棒进行研磨后，置于400μl chelex-100的DEPC水溶液中，所述的chelex-100的DEPC水溶液的浓度为15g/100ml；
2.80℃条件下加热10分钟；
3.将抽提柱放入离心管中，将步骤3中获得的液体加入到抽提柱中，15000转/分钟，离心30秒；
4.收集离下的液体，用于RT-PCR反应。
其中，抽提柱为市售；RT-PCR反应采用和实施例6相同的条件，并得到了相似的实验结果。
实施例10
1.将血斑样本置于800μl chelex-100的DEPC水溶液中，所述的chelex-100的DEPC水溶液的浓度为20g/100ml；
2.95℃条件下加热10分钟；
3.将抽提柱放入离心管中，将步骤3中获得的液体加入到抽提柱中，20000转/分钟，离心20秒；
4.收集离下的液体，用于RT-PCR反应。
其中，抽提柱为市售；RT-PCR反应采用和实施例6相同的条件，并得到了相似的实验结果。
Claims (11)
1.一种从生物样本中快速提取DNA的方法，其特征在于，所述的方法包括以下步骤：
(1)取少量病理组织石蜡切片样本；
(2)将病理组织石蜡切片样本置于chelex-100的水溶液中，所述的chelex-100的水溶液的浓度为2～50g/100ml；
(3)80～100℃条件下加热5～30分钟；
(4)将抽提柱放入离心管中，将步骤(3)中获得的液体加入到抽提柱中，1000～20000转/分钟，离心2～120秒；
(5)收集离下的液体，用于PCR反应。
2.一种从生物样本中快速提取RNA的方法，其特征在于，所述的方法包括以下步骤：
(1)取少量病理组织石蜡切片样本；
(2)置2～50g/100ml chelex-100的DEPC水溶液中；
(3)80～100℃条件下加热1～50分钟；
(4)将抽提柱管放入离心管中，将步骤(3)中获得的液体加入到抽提柱管中，1000～20000转/分钟，离心2～120秒；
(5)收集离下的液体，用于RT-PCR反应。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的抽提柱为，在抽提柱中底部有一层起物理阻挡的膜。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的chelex-100的水溶液的浓度为3～10g/100ml，所述的chelex-100的DEPC水溶液的浓度为3～10g/100ml。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的加热温度为90～100℃。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的加热温度为90～95℃。
7.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的加热时间为8～10分钟。
8.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的离心的时间为10～30秒。
9.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的离心的转速为5000～20000转/分钟。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的离心的转速为10000～20000转/分钟。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述的离心的转速为15000～20000转/分钟。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201110143241.8A CN102807975B (zh) | 2011-05-30 | 2011-05-30 | 一种从生物样本中快速提取核酸的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201110143241.8A CN102807975B (zh) | 2011-05-30 | 2011-05-30 | 一种从生物样本中快速提取核酸的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN102807975A CN102807975A (zh) | 2012-12-05 |
| CN102807975B true CN102807975B (zh) | 2014-10-29 |
Family
ID=47231846
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201110143241.8A Active CN102807975B (zh) | 2011-05-30 | 2011-05-30 | 一种从生物样本中快速提取核酸的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN102807975B (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2595816C1 (ru) * | 2015-11-09 | 2016-08-27 | государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Кемеровская государственная медицинская академия" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Способ подготовки суспензии лимфоцитов человека в этанол-уксусном фиксаторе для выделения днк |
Families Citing this family (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| TWI462930B (zh) * | 2013-06-06 | 2014-12-01 | Rbc Bioscience Corp | 福馬林固定石蠟包埋樣本核酸分離方法 |
| CN103757095B (zh) * | 2013-10-19 | 2016-08-17 | 中国医科大学 | 单***捕获线粒体dna分型区别混合精斑中个体的方法 |
| CN103882012B (zh) * | 2014-04-21 | 2016-10-05 | 山东省农业科学院生物技术研究中心 | 一种快速从牛羊液态奶和奶粉等奶制品中高效提取dna的方法 |
| CN104531682A (zh) * | 2015-01-23 | 2015-04-22 | 四川农业大学 | 一种pcr仪法提取毛发基因组dna的试剂盒及其应用 |
| CN105779438A (zh) * | 2016-03-22 | 2016-07-20 | 北京交通大学 | 石蜡包埋组织样本中交联dna的快速分离与检测的方法 |
| CN106086166A (zh) * | 2016-06-07 | 2016-11-09 | 苏州贝斯派生物科技有限公司 | 检测石蜡切片dna质量的试剂及其制备方法与应用 |
| CN106350512A (zh) * | 2016-11-24 | 2017-01-25 | 深圳华大基因股份有限公司 | 一种真核细胞核酸提取方法 |
| CN106755467B (zh) * | 2017-01-12 | 2020-10-16 | 天津诺禾医学检验所有限公司 | 一种检测ffpe样本dna含量及完整性的方法 |
| CN106987587A (zh) * | 2017-04-11 | 2017-07-28 | 江苏睿玻生物科技有限公司 | 一种用于荧光定量pcr检测的快速提取核酸方法 |
| CN107271239A (zh) * | 2017-07-06 | 2017-10-20 | 浙江大学 | 一种溶解石蜡组织切片的方法及应用 |
| CN110819622A (zh) * | 2019-10-09 | 2020-02-21 | 广州达正生物科技有限公司 | 一种快速提取石蜡组织rna的方法 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101586162A (zh) * | 2009-06-10 | 2009-11-25 | 戴立忠 | 一种提取靶核酸并进行pcr扩增检测的方法 |
-
2011
- 2011-05-30 CN CN201110143241.8A patent/CN102807975B/zh active Active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101586162A (zh) * | 2009-06-10 | 2009-11-25 | 戴立忠 | 一种提取靶核酸并进行pcr扩增检测的方法 |
Non-Patent Citations (7)
| Title |
|---|
| C S Edwin Shiaw et al..Evaluation of DNA and RNA Extraction Methods.《Med J Malaysia》.2010,第65卷(第2期),第134页右栏第4段. |
| C. Arnal et al..Comparison of seven RNA extraction methods on stool and shellfish samples prior to hepatitis A virus amplification.《Journal of Virological Methods》.1999,第77卷第20页Extraction 6. |
| Comparison of seven RNA extraction methods on stool and shellfish samples prior to hepatitis A virus amplification;C. Arnal et al.;《Journal of Virological Methods》;19991231;第77卷;第20页Extraction 6 * |
| Evaluation of DNA and RNA Extraction Methods;C S Edwin Shiaw et al.;《Med J Malaysia》;20100630;第65卷(第2期);第134页右栏第4段 * |
| 周月琴等.用chelex-100快速提取微量血痕中的DNA.《复旦学报(医学版)》.2003,第30卷(第4期),第379页chelex-100提取法. * |
| 张幼芳等.微量体表脱落上皮细胞的DNA检验.《法律与医学杂志》.2003,第10卷(第2期),第110页（二）DNA提取，第112页右栏第2段. |
| 微量体表脱落上皮细胞的DNA检验;张幼芳等;《法律与医学杂志》;20031231;第10卷(第2期);第110页（二）DNA提取，第112页右栏第2段 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2595816C1 (ru) * | 2015-11-09 | 2016-08-27 | государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Кемеровская государственная медицинская академия" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Способ подготовки суспензии лимфоцитов человека в этанол-уксусном фиксаторе для выделения днк |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN102807975A (zh) | 2012-12-05 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN102807975B (zh) | 一种从生物样本中快速提取核酸的方法 | |
| CN102807976B (zh) | 一种核酸快速提取试剂盒及其应用 | |
| WO2023150171A1 (en) | Methods, compositions, and systems for capturing analytes from glioblastoma samples | |
| KR20100001826A (ko) | 핵산 추출 장치 | |
| JP2020170009A (ja) | 細胞含有液体サンプルのための固定用組成物 | |
| CN105368817B (zh) | 宫颈细胞保存及dna快速提取一体试剂盒和提取方法 | |
| KR20100001827A (ko) | 핵산 추출 방법 | |
| TWI462930B (zh) | 福馬林固定石蠟包埋樣本核酸分離方法 | |
| CN102146112A (zh) | 从***固定石蜡包埋组织中提取脱氧核糖核酸的方法 | |
| CN107201361A (zh) | 一种外泌体总rna的提取方法 | |
| CN104634626A (zh) | 一种改进的冰冻切片方法及其应用 | |
| CN104561360A (zh) | Top2a基因异常检测探针、试剂盒以及方法 | |
| CN111487404A (zh) | 体液肿瘤细胞dna提取试剂盒 | |
| CN103820320A (zh) | 一种非冻型rna保护液 | |
| CN104232802A (zh) | 检测鸡传染性喉气管炎病毒、鸡新城疫病毒和鸡传染性支气管炎病毒的试剂盒 | |
| Liu et al. | The use of combined PCR, fluorescence in situ hybridisation and immunohistochemical staining to diagnose mucormycosis from formalin‐fixed paraffin‐embedded tissues | |
| CN109913556A (zh) | 一种用于快速鉴定鸽性别的引物、试剂盒及其方法 | |
| CN104293976A (zh) | 检测猪流行性乙型脑炎病毒和/或猪繁殖与呼吸综合征病毒的基因芯片以及试剂盒 | |
| CN105506154A (zh) | 原位杂交检测鼻咽癌组织中长链非编码rna loc284454试剂的应用 | |
| CN106350510B (zh) | 快速提取哈蟆油基因组dna的方法、试剂盒及其应用 | |
| CN109371009A (zh) | 一种高通量玉米叶片dna提取的方法 | |
| CN112195239B (zh) | 一种食管鳞癌转移组织及血清外泌体标志物及其应用 | |
| CN103952399A (zh) | 一种使用含有指示剂的酚胍盐裂解液提取核糖核酸的方法 | |
| CN103243089B (zh) | 一种鞣制动物标本皮张dna的提取方法 | |
| CN105779638A (zh) | 用于直肠癌诊断的miRNA生物标志物及检测试剂盒 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| EE01 | Entry into force of recordation of patent licensing contract |
Application publication date: 20121205 Assignee: SUZHOU YUNTAI BIOLOGICAL PHARMACEUTICAL CO., LTD. Assignor: Xiong Hui Contract record no.: 2014320010178 Denomination of invention: Method for rapidly extracting nucleic acid from biological sample Granted publication date: 20141029 License type: Exclusive License Record date: 20141226 |
|
| LICC | Enforcement, change and cancellation of record of contracts on the licence for exploitation of a patent or utility model | ||
| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20160120 Address after: 201403 Building 5, building 2066, 3 hope road, Shanghai, Fengxian District Patentee after: Shanghai Rui Rui Biological Technology Co., Ltd. Address before: 201101, room 99, No. 88, Lane 1102, Bao Ming Road, Shanghai, Minhang District Patentee before: Xiong Hui |
|
| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20160621 Address after: 201403 Building 5, building 2066, 3 hope road, Shanghai, Fengxian District Patentee after: Shanghai Rui Rui Biological Technology Co., Ltd. Address before: 201101, room 99, No. 88, Lane 1102, Bao Ming Road, Shanghai, Minhang District Patentee before: Xiong Hui |
|
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20180326 Address after: Xiangcheng District Economic Development Zone, Suzhou City, Jiangsu province 215131 Huayuan Road No. 9 Building No. 6 Patentee after: SUZHOU YUNTAI BIOLOGICAL PHARMACEUTICAL CO., LTD. Address before: 201403 Building 5, building 2066, 3 hope road, Shanghai, Fengxian District Patentee before: Shanghai Rui Rui Biological Technology Co., Ltd. |
|
| TR01 | Transfer of patent right |