CN103194398B - 一株柠檬酸高产菌株及其筛选方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物发酵领域，涉及了一株采用航天诱变手段获得的黑曲霉孢子，通过耐受高糖高酸的定向筛选，设计出高效的科学筛选方案从而实现诱变选育获得高产菌株，该菌株命名为TN‑A09，发明人对其进行了生物保藏，其保藏号为CGMCC No.5751，该菌株是耐高糖高酸、产酸高、转化率高的柠檬酸生产菌株，利用其发酵生产柠檬酸，平均产酸达到18%，发酵周期60小时，转化率99%，远高于黑曲霉液体发酵柠檬酸现有技术水平。

Description

一株柠檬酸高产菌株及其筛选方法

技术领域

本发明涉及生物发酵领域，涉及一株采用航天诱变手段获得的黑曲霉孢子，并通过耐受高糖高酸的定向筛选获得高产柠檬酸菌株。

背景技术

柠檬酸(Citric acid)又名枸橼酸，为白色颗粒状或白色结晶粉末，相对密度为1.6550，无臭，具有令人愉快的强烈的酸味，入口爽快，无后酸味，安全无毒，被广泛用作食品和饮料的酸味剂，全球范围内柠檬酸的生产主要通过产柠檬酸的黑曲霉发酵，黑曲霉属半知菌纲，一般只进行无性繁殖，由孢子发芽开始到新孢子形成，为一个生活周期。黑曲霉利用糖类发酵生成柠檬酸，其生物合成途径现普遍认为是：葡萄糖经EMP、HMP途径降解生成丙酮酸，丙酮酸一方面氧化脱羧生成乙酰CoA，另一方面经CO₂固定化反应生成草酰乙酸，草酰乙酸与乙酰CoA缩合生成柠檬酸。

柠檬酸的工业生产通常采用黑曲霉进行的深层发酵法，原料以薯干和玉米为主。世界柠檬酸工业的集约化程度非常高，除中国外，国外主要的柠檬酸制造商只有5～6家（美国、奥地利、加拿大、巴西等），到2011年我国柠檬酸产量达94万吨，占世界总产量的70%左右，从产量来说是名副其实的生产大国。我国柠檬酸工业的集约化已经达到世界领先水平。随着工业的发展人们对含柠檬酸产品的需求增加，而黑曲霉菌株的产酸能力是制约柠檬酸生产能力的一个瓶颈。因此筛选获得高产柠檬酸的黑曲霉菌株具有重大意义。

国内外有很多关于柠檬酸生产菌黑曲霉育种的研究报道，主要是采用物理和化学手段进行诱变育种。各种诱变剂有其作用的特殊性，人们还无法针对某一目的选择最适宜的诱变剂，在实际工作中一般都是根据经验来证明诱变效果较好的因素。自从上世纪初开始用微生物生产柠檬酸以来，人们对生产柠檬酸的菌种进行了几十年的诱变研究。我国在柠檬酸生产菌黑曲霉的育种方面积累了丰富的经验，认为用复合诱变的方法比用单一的物理方法或化学方法更为有效。目前来看对黑曲霉育种较为有效的诱变因子有：γ-射线、x-射线、紫外线、激光、亚硝基胍(NTG)、亚硝基脲、乙基胺等，此外还有高能电子流、电磁场等。利用这些诱变因子在黑曲霉育种工作中已取得了不少成果。

20世纪50年代末和60年代初，金其荣等人进行了柠檬酸发酵的菌种研究。上海工业微生物研究所，从土壤中经酸性平板分离获得的野生黑曲霉628作为出发菌株，经多次60Co-γ射线和硫酸二乙脂等复合诱变，获得了高产柠檬酸菌株Co827。它可直接利用薯干粉发酵，产酸达12～13%，平均转化率为95%，发酵周期54～64h。无锡工业大学以黑曲霉H-142为出发菌株，通过γ射线、硫酸二乙脂、高温单独或复合诱变处理，通过高温、高酸及高渗培养条件的定向筛选获得HQL-601菌种。它的发酵温度为40～41℃，周期60～64h，20%薯干粉摇瓶产酸13%，其柠檬酸纯度明显优于现有发酵菌。

郝捷应用低能离子注入诱变育种技术，对现有柠檬酸发酵菌进行改良，并改进了产柠檬酸高产菌的初筛方法。经过多次N+注入，在实验室选育获得了2株遗传稳定的玉米原料发酵生产柠檬酸的高产菌株，其中HN-2004摇瓶发酵96h，平均产酸13.8%。尽管HN-2004的产酸比原始出发菌株提高了50%，但仍存在发酵周期长、糖酸转化率低的问题。由此可见，使用单一的诱变因子往往很难达到预期的目的。王军等在黑曲霉的育种中，首次尝试了应用两种核技术手段同时对黑曲霉进行诱变，并证实了采用60Co-γ辐照并复合N⁺注入方法的可行性，获得了1株发酵周期72h、产酸13.68%、转化率达103.45%的M3代菌株CN05。

离子注入是材料表面处理的通用技术，目前，运用离子注入进行作物品种改良已获得了成功，目前可大致将离子注入分为能量沉积、动量传递、粒子注入和电荷交换等四个反应过程。其作用机制较为复杂，很难用单一模式解释清楚。荷能离子注入除具有能量沉积引起机体损伤的特征外，还具有动能交换产生的级联损伤，表现为遗传物质原子转移、重排或基因的缺失，还有慢化离子、移位原子和本底元素复合反应造成的化学损伤以及电荷交换引起的生物分子电子转移造成的损伤。从离子注入的致死率曲线等可以看出，这种诱变手段在机理上有别于传统方法。低能离子注入具有生理损伤小、突变率高等特点，能取得较高的正突变率。因此可将其用于动物和微生物的品种改良

目前，柠檬酸发酵菌黑曲霉已经历了半个多世纪的诱变筛选，用于工业化生产柠檬酸的黑曲霉菌种大都经过物理和化学诱变剂的处理，不同程度地增加了黑曲霉对一些诱变剂的抗性，若再使用同样的方法则很难对现有菌种进行改良。对常用的物理和化学诱变剂产生了一定的抗性，因此如何采用更为先进的技术手段实现对柠檬酸产生菌黑曲霉的诱变育种成为现在亟待解决的问题。

发明内容

本发明针对现有柠檬酸产生菌黑曲霉的诱变育种遇到的技术瓶颈，提供了一种采用航天诱变手段获得的黑曲霉孢子，通过耐受高糖高酸的定向筛选，设计出高效的科学筛选方案从而实现诱变选育获得高产菌株，该菌株命名为TN-A09，发明人对其进行了生物保藏，其保藏号为CGMCC No.5751，该菌株是耐高糖高酸、产酸高、转化率高的柠檬酸生产菌株，利用其发酵生产柠檬酸，平均产酸达到18%，发酵周期60小时，转化率99%，远高于现有黑曲霉液体发酵柠檬酸技术水平。

本发明所采用的生产菌株，是将黑曲霉孢子搭载返回式航天器进行太空诱变后，经过耐高糖高酸的定向筛选获得的，发明人对其进行了生物保藏，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号为CGMCCNo.5751，其状态为存活。

本发明首次以搭载返回式航天器进行太空诱变的方法用于柠檬酸产生菌黑曲霉的诱变育种。不但可以避免黑曲霉对一些诱变剂的抗性，而且有较大的选择空间，更容易得到较为优良的菌种。

在获得上述菌种后，菌株的筛选是菌种诱变后的关联步骤，也是决定优良菌株选育效率的关键步骤。微生物细胞群体经过诱变处理后，突变发生的频率虽比自发突变的频率高的多，但是在整个细胞的群体中，其频率仍很低，即发生变异的细胞绝对数很低。DNA链上突变的发生是随机的，所需要的突变株出现的频率就更低，寻找所需的突变型犹如大海捞针。因此合理的筛选程序与方法在黑曲霉菌种的选育上非常重要。诱变是随机的，但选择是定向的。诱变后需通过正确、灵敏、快速的筛选检测方法，从大量未变和负变的群体中把仍然是很少量的正向突变挑选出来。

现有黑曲霉的诱变选育中，人们常以溴甲酚绿指示性平皿培养基上黄色指示圈的大小作为初筛依据，进行大规模淘汰，以提高筛选效率，但在实际应用中发现，溴甲酚绿明显影响黑曲霉的生长和产酸，不能客观的反映菌株的产酸性能。因此，为了以最少的工作量，在最短的时间内取得最大的筛选效果，本发明的发明人设计高效的科学筛选方案从而实现诱变选育获得高产菌株的目标。最终获得耐高糖高酸且产酸高、转化率高、能耗低、生产成本低的柠檬酸菌种，具有重要的实际生产价值。

本发明的具体技术方案是：

一、航天诱变黑曲霉干孢子的准备

1、将黑曲霉Co827接种于PDA(马铃薯培养基)斜面，在35℃条件下静止培养4天，斜面长满孢子后用无菌水冲洗孢子至带玻璃珠的无菌三角瓶中，每支斜面洗到一只三角瓶中，用纱布包扎；

2、将盛有孢子悬液的三角瓶放摇床上振荡2小时，转速270r/min，温度25℃，充分打散孢子；

3、将灭过菌的真空抽滤瓶放超净工作台内，打开电源真空泵开始工作，将孢子悬液倒入抽滤瓶上的漏斗中，抽滤过程应在漏斗上覆盖四层无菌纱布，抽滤过程持续3分钟；

4、抽滤完毕，用无菌镊子取下抽滤膜，放入无菌的空培养皿中，移入灭菌后的常温干燥器中干燥24h；所述的干燥器事先经70wt%乙醇擦洗两遍达到表面消毒，并在超净工作台内经紫外灯照射30分钟，使干燥器内部空间完全灭菌；

5、在超净工作台中将干燥好的孢子用接种铲刮进无菌的样品瓶内，将样品瓶装满，盖好盖子，样品准备完毕；

6、留存部分干燥好的孢子样品置于干燥且无菌密封管中放在干燥器内，于室温放置与航天诱变相同时间，作为对照样；

其中本发明所述的PDA培养基的配制方法为马铃薯去皮，200克切成块煮沸30min，然后用纱布过滤后补足水至1000mL，然后加入葡萄糖20克，琼脂粉15克，113℃灭菌15min，倒平板。

上述步骤5获得的样品通过搭载返回式航天器进行太空诱变，诱变获得的干孢子经过耐高糖高酸的定向筛选获得的菌株即为目标菌株，具体的筛选方法是：

1、高糖高酸培养基的配制

高糖高酸培养基：

A液制作：马铃薯去皮，200克切成块煮沸30min，然后用纱布过滤后补足水至1000mL，121℃灭菌15min，备用；

B液制作：葡萄糖200-220克，无水柠檬酸170-190克，MgSO₄·7H₂O1.5克，K₂HPO₄3.6，硫酸铵2克，琼脂粉22克，溶于500ml蒸馏水，113℃灭菌15min，备用；

将A液和B液分别加热至50℃，使B液充分融化后，分别取A液、B液各500毫升混合均匀，倒入培养皿中，冷却备用即为高糖高酸培养基。

2、耐高糖高酸的定向筛选

取航天诱变后干孢子100μg到100ml无菌水中摇匀成孢子悬液，然后10倍梯度稀释到10^-4，从10^-3、10^-4稀释度各取100μl均匀涂布于上述高糖高酸培养基上，35℃静止培养96h，观察培养基表面生长出白色小菌落，即为具有耐高糖高酸性能的菌株。

由于B液中含有琼脂粉成分，使得整个的培养基在低于40度后成为固体，故此可以将孢子直接涂布在其表面。

在上述获得的耐高糖高酸性能的菌株的基础上，发明人进一步进行了筛选以获得其中最为适用的菌株，其具体步骤如下：

进行产柠檬酸性能的初步筛选：玉米粉液化清液培养基制作:

取玉米粉液化清液制作：取100克粉碎过60目筛的玉米粉，加入300毫升水，搅拌均匀并加热到60℃，加入高温淀粉酶，如高温α-淀粉酶，以10-15酶活力单位每克玉米粉计算，升温至90℃，保持温度搅拌液化持续4h,用滤布挤压过滤，测定总糖浓度。

取该玉米粉液化清液1000毫升，加入葡萄糖使其总糖浓度达到15%-18%，同时加入MgSO₄·7H₂O1.5克，K₂HPO₄3.6，硫酸铵2克，琼脂粉22克，113℃灭菌15min，备用。

产酸性能的筛选：挖取在高糖高酸培养基中生长的菌落将其转移至玉米粉液化清液培养基中35℃静止培养72h，观察培养基表面透明圈与菌落直径比值大于5的菌落，将这样的菌落转移至PDA培养基的斜面中35℃静止培养96h，待表面长满孢子备用。之所以选择培养基表面透明圈与菌落直径比值大于5的菌落，是由于这种菌落中的菌株生产性能较其他的菌株更好，更适合于生产中的应用。

摇瓶玉米粉液化清液培养基制作:

取玉米粉液化清液制作：取100克粉碎过60目筛的玉米粉，加入300毫升水，搅拌均匀并加热到60℃，加入高温淀粉酶，以10-15酶活力单位每克玉米粉计算，升温至90℃，保持温度搅拌液化持续4h,用滤布挤压过滤，测定总糖浓度。

取该玉米粉液化清液1000毫升，加入葡萄糖使其总糖浓度达到15%-16%，MgSO₄·7H₂O1.5克，K₂HPO₄3.6，硫酸铵2克。每50毫升装入500毫升三角瓶中113℃灭菌15min，备用。

取上述备用孢子，接种到上述500毫升三角瓶内的50毫升玉米粉清液培养基内，35℃，每分钟300转，振荡培养72h后测定培养基中总酸的浓度，与诱变起始菌株比较，将与起始菌株比较产酸浓度高的菌株进行PDA斜面传代，传10代后，分别取2、4、6、8、10代斜面，再次进行摇瓶产酸测试，产酸水平稳定且产酸最高的菌株作为备选。

发明人利用上述获得的备选菌株进行了连续30批500吨发酵柠檬酸试验，结果表明平均产酸达到18%，发酵周期60小时，转化率99%，远高于现有黑曲霉液体发酵柠檬酸技术水平。

发明人对上述筛选出的菌株进行了生物保藏，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号为CGMCC No.5751，其状态为存活。

综上所述，本发明所提供的柠檬酸高产菌株，该菌株命名为TN-A09，发明人对其进行了生物保藏，该菌株是耐高糖高酸、产酸高、转化率高的柠檬酸生产菌株，利用其发酵生产柠檬酸，平均产酸达到18%，发酵周期60小时，转化率99%，远高于现有黑曲霉液体发酵柠檬酸技术水平。

保藏信息

保藏时间：2012年2月10日

保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏编号：CGMCC No.5751

保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所

分类命名:黑曲霉Aspergillus niger

具体实施方式

下面结合实施例来进一步说明本发明，可以使本领域技术人员更全面的理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

实施例1：

航天诱变黑曲霉干孢子的准备

1、将黑曲霉Co827接种于PDA(马铃薯培养基)斜面，在35℃条件下静止培养4天，斜面长满孢子后用无菌水冲洗孢子至带玻璃珠的无菌三角瓶中，每支斜面洗到一只三角瓶中，用纱布包扎；

2、将盛有孢子悬液的三角瓶放摇床上振荡2小时，转速270r/min，温度25℃，充分打散孢子；

3、将灭过菌的真空抽滤瓶放超净工作台内，打开电源真空泵开始工作，将孢子悬液倒入抽滤瓶上的漏斗中，抽滤过程应在漏斗上覆盖四层无菌纱布，抽滤过程持续3分钟；

4、抽滤完毕，用无菌镊子取下抽滤膜，放入无菌的空培养皿中，移入灭菌后的常温干燥器中干燥24h；所述的干燥器事先经70wt%乙醇擦洗两遍达到表面消毒，并在超净工作台内经紫外灯照射30分钟，使干燥器内部空间完全灭菌；

5、在超净工作台中将干燥好的孢子用接种铲刮进无菌的样品瓶内，将样品瓶装满，盖好盖子，样品准备完毕；

6、留存部分干燥好的孢子样品置于干燥且无菌密封管中放在干燥器内，于室温放置与航天诱变相同时间，作为对照样；

其中PDA培养基的配制方法为马铃薯去皮，200克切成块煮沸30min，然后用纱布过滤后补足水至1000mL，然后加入葡萄糖20克，琼脂粉15克，113℃灭菌15min，倒平板。

实施例2：

上述实施例中步骤5获得的样品通过搭载返回式航天器进行太空诱变。

实施例3：

耐高糖高酸的定向筛选

高糖高酸培养基：

A液制作：马铃薯去皮，200克切成块煮沸30min，然后用纱布过滤后补足水至1000mL，121℃灭菌15min，备用；

B液制作：葡萄糖200-220克，无水柠檬酸170-190克，MgSO₄·7H₂O1.5克，K₂HPO₄3.6，硫酸铵2克，琼脂粉22克，溶于500ml蒸馏水，113℃灭菌15min，备用；

将A液和B液分别加热至50℃，使B液充分融化后，分别取A液、B液各500毫升混合均匀，倒入培养皿中，冷却备用即为高糖高酸培养基。

2、耐高糖高酸的定向筛选

取航天诱变后干孢子100μg到100ml无菌水中摇匀成孢子悬液，然后10倍梯度稀释到10^-4，从10^-3、10^-4稀释度各取100μl均匀涂布于上述固化后的高糖高酸培养基上，35℃静止培养96h，观察培养基表面生长出白色小菌落，即为具有耐高糖高酸性能的菌株。

实施例4：产酸性能的初筛

玉米粉液化清液培养基制作:

取玉米粉液化清液制作：取100克粉碎过60目筛的玉米粉，加入300毫升水，搅拌均匀并加热到60℃，加入高温α-淀粉酶以10-15酶活力单位每克玉米粉计算，升温至90℃，保持温度搅拌液化持续4h,用滤布挤压过滤，测定总糖浓度。

取该玉米粉液化清液1000毫升，加入葡萄糖使其总糖浓度达到15-18wt%，同时加入MgSO₄·7H₂O1.5克，K₂HPO₄3.6，硫酸铵2克，琼脂粉22克，113℃灭菌15min，即得玉米粉液化清液培养基，备用。

产酸性能的筛选：挖取实施例3中获得的在高糖高酸培养基中生长的具有耐高糖高酸性能的菌株，将其转移至上述玉米粉液化清液培养基中35℃静止培养72h，观察培养基表面透明圈与菌落直径比值大于5的菌落，将这样的菌落转移至PDA培养基的斜面中35℃静止培养96h，待表面长满孢子备用。

实施例5：摇瓶产酸性能的复筛

摇瓶玉米粉液化清液培养基制作:

取玉米粉液化清液制作：取100克粉碎过60目筛的玉米粉，加入300毫升水，搅拌均匀并加热到60℃，加入高温α-淀粉酶，以10-15酶活力单位每克玉米粉计算，升温至90℃，保持温度搅拌液化持续4h,用滤布挤压过滤，测定总糖浓度。

取该玉米粉液化清液1000毫升，加入葡萄糖使其总糖浓度达到15%-16%，同时加入MgSO₄·7H₂O1.5克，K₂HPO₄3.6，硫酸铵2克，每50毫升装入500毫升三角瓶中113℃灭菌15min，备用。

取实施例4中产酸圈与菌落比值大于5的菌株，在PDA斜面上的孢子，接种到上述500毫升三角瓶内的50毫升玉米粉清液培养基内，35℃，每分钟300转，振荡培养72h后测定培养基中总酸的浓度，与诱变起始菌株比较，将与起始菌株比较产酸浓度高的菌株进行PDA斜面传代，传10代后，分别取2、4、6、8、10代斜面，再次进行摇瓶产酸测试，结果与初始0代时产柠檬酸水平相同，且产酸水平最高的菌种作为备选。发明人对上述筛选出的菌株进行了生物保藏，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号为CGMCC No.5751，其状态为存活，利用其发酵生产柠檬酸，平均产酸达到18%，发酵周期60小时，转化率99%，远高于现有黑曲霉液体发酵柠檬酸技术水平。

Claims (1)

1.一株柠檬酸高产菌株，其特征在于：该菌株命名为TN-A09，其保藏号为CGMCC No.5751。