JP2005536511A - ４−１ｂｂ結合物質を用いる治療及び予防 - Google Patents

Abstract

自己免疫疾患、リンパ増殖性疾患、及びアレルギーを治療又は予防するために４−１ＢＢアゴニストを用いるための材料及び方法を提供する。

Description

本出願は米国特許仮出願第６０／３９５，８９６号（２００２年７月１５日出願）に基づき優先権を主張する。

本発明は、自己免疫疾患、アレルギー、及びリンパ増殖性疾患を治療及び／又は予防するための材料及び方法に関し、さらに具体的には自己免疫疾患、アレルギー、及びリンパ増殖性疾患を治療及び／又は予防するために４−１ＢＢアゴニストを使用するための材料及び方法に関する。

アポトーシスによる末梢リンパ組織における自己反応性リンパ球の排除は、免疫寛容を維持するための重要なメカニズムである。このことは、自己免疫になりやすいバックグラウンドでのＦａｓ受容体遺伝子のリンパ増殖性（ｌｐｒ）変異を保持するＭＲＬ／ｌｐｒマウスで実証された。これらのマウスは、機能的Ｆａｓ／Ｆａｓリガンドの相互作用の欠如が原因でリンパ増殖性疾患及び狼瘡様自己免疫疾患を自然発症する。ＭＲＬ／ｌｐｒマウスは、活性化誘導細胞死（ＡＩＣＤ）によって自己反応性リンパ球を適切に枯渇させることもできない（TheofilopoulosとDixon(1981) Immunol.Rev.55:179〜216;CohenとEisenberg(1991) Annu.Rev.Immunol.9:243〜269）。ｌｐｒ変異の顕著な特徴は、Ｂ２２０（ＣＤ４５）抗原を異常発現する胸腺由来ＣＤ４及びＣＤ８ダブルネガティブＴ細胞（ＤＮＴＣ）（ＴＣＲ−α／β^＋）という独特な細胞集団が蓄積することである（Wofsyら(1984) J.Immunol.132:2686〜2689;Morseら(1982) J.Immunol.129:2612〜2615）。同様に、ヒト自己免疫性リンパ増殖症候群は、活性化リンパ球においてＦａｓにより誘導されるアポトーシスが不全であることが原因である（Snellerら(1992) J.Clin.Invest.90:334〜341;Lenardoら(1999) Annu.Rev.Immunol.17:221〜253(1999)）。

狼瘡の患者を治療するための免疫療法の数は限られ、狼瘡の罹患率と死亡率は比較的高いままである。マウス自己免疫疾患モデルでは、免疫療法はＴＣＲ及び共刺激受容体を介したシグナル伝達を阻害する遮断性ペプチド、抗体、及び他の薬剤を投与することによりＴ細胞の活性化を防止することを試みた（Kaliyaperumalら(1999) J.Immunol.162:5775〜5783;Wofsy(1993) Immunol.Ser.59:221〜236;Mohanら(1995) J.Immunol.154;1470〜1480;Finckら(1994) Science265:1225〜1227;Kalledら(1998) J.Immunol.160:2158〜2165;Liangら(2000) J.Immunol.165:3436〜3443）。さらに他の方法ではサイトカインのアゴニスト及びアンタゴニストを利用している（TheofilopoulosとLawson(1999) Ann.Rheum.Dis.58Suppl.1:I49〜55;KelleyとWuthrich(1999) Semin.Nephrol.19:57〜66;Lawsonら(2000) J.Clin.Invest.106:207〜215）。これらの治療法のいくつかの欠点として、長期の治療が必要であること、及び自己反応性リンパ球を枯渇させて疾患の進行を逆転させることができないことがある。

本発明は、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）のネズミモデルにおいて、Ｔ細胞共刺激受容体４−１ＢＢに特異的なアゴニスト抗体を用いた治療が、リンパ節症の軽減、自己抗体の産生の減少、腎疾患の軽減、及び生存の延長を生じたという発見に基づく。疾患の顕性症状の発症前又は発症後に処理された動物ではいずれも有益な効果が観察された。本発明は特定の作用機作に限定されないが、４−１ＢＢ特異的抗体の治療効果及び予防効果は明らかにＣＤ４⁻、ＣＤ８⁻ダブルネガティブＴ細胞（ＤＮＴＣ）及びＢ細胞のアポトーシスの増加によって媒介された。よって本発明は、自己免疫疾患、過剰増殖性疾患（例えばリンパ増殖性疾患）、及びアレルギーを治療及び／又は予防するためにＤＮＴＣ及び／又は自己反応性Ｂ細胞を枯渇させる４−１ＢＢアゴニストを使用する方法を提供する。さらに、本発明はＤＮＴＣの死滅を誘導する方法を提供する。

一態様では、本発明は被験体におけるダブルネガティブＴ細胞を枯渇させる方法を特徴とする。この方法は、（ａ）自己免疫疾患、リンパ増殖性疾患又はアレルギーを患う又はそのリスクのある被験体を特定すること、及び（ｂ）その被験体に有効量の４−１ＢＢアゴニストを投与することを含み得る。その被験体はヒトであり得る。この方法はその被験体における自己反応性Ｂ細胞を枯渇させることをさらに含み得る。このとき、その４−１ＢＢアゴニストは自己反応性Ｂ細胞を枯渇させるために有効である。４−１ＢＢアゴニストは、４−１ＢＢと結合する抗体（例えば２Ａなどのモノクローナル抗体）であり得る。４−１ＢＢ結合物質は４−１ＢＢリガンド又はその断片であり得る。この方法は、インターフェロンγ又はＧｒ−１結合物質（例えばＧｒ−１と結合する抗体）を被験体に投与することをさらに含み得る。この方法は（ｃ）自己免疫疾患、リンパ増殖性疾患又はアレルギーの症状について被験体をモニターすることをさらに含み得る。

自己免疫疾患又はリンパ増殖性疾患は全身性エリテマトーデス又はインスリン依存性糖尿病であり得る。あるいは、自己免疫疾患又はリンパ増殖性疾患は、炎症性腸疾患、セリアック病、自己免疫性甲状腺疾患、シェーグレン症候群、自己免疫性胃炎、悪性貧血、自己免疫性肝炎、皮膚自己免疫疾患、自己免疫性拡張型心筋症、心筋炎、重症筋無力症、脈管炎、筋自己免疫疾患、精巣自己免疫疾患、卵巣自己免疫疾患、及び眼自己免疫疾患からなる群より選択され得る。そのアレルギーは、花粉抗原、真菌抗原、昆虫抗原、細菌抗原、哺乳動物抗原、又は昆虫毒液抗原に対するものであり得る。

投与は、４−１ＢＢアゴニストをコードするポリヌクレオチドを含有する核酸をその被験体に送達することを含み得る。このときそのポリヌクレオチドは転写調節因子と機能的に連結されている。あるいは、その投与は、（ｉ）その被験体由来の細胞を用意し、（ｉｉ）転写調節因子と機能的に連結されている４−１ＢＢアゴニストをコードするポリヌクレオチドを含有する核酸を、その細胞又はその細胞の子孫にトランスフェクト又は形質導入すること、及び（ｉｉｉ）そのトランスフェクト若しくは形質導入細胞、又はそのトランスフェクト若しくは形質導入細胞の子孫を被験体に投与することを含み得る。

別の態様では、本発明はダブルネガティブＴ細胞の死滅を誘導する方法を特徴とする。この方法は、そのダブルネガティブＴ細胞と有効量の４−１ＢＢアゴニストを接触させることを含み得る。４−１ＢＢアゴニストは４−１ＢＢと結合する抗体（例えば２Ａなどのモノクローナル抗体）であり得る。４−１ＢＢアゴニストは４−１ＢＢリガンド又はその断片であり得る。この方法は、自己反応性Ｂ細胞と有効量の４−１ＢＢアゴニストを接触させ、その自己反応性Ｂ細胞の死滅を誘導することもさらに含み得る。

ダブルネガティブＴ細胞はｉｎ ｖｉｔｒｏ又は被験体（例えばヒト）に存在し得る。被験体は自己免疫疾患、リンパ増殖性疾患、又はアレルギーを患うか又はそのリスクがあるものであり得る。自己免疫疾患又はリンパ増殖性疾患は全身性エリテマトーデス又はインスリン依存性糖尿病であり得る。自己免疫疾患又はリンパ増殖性疾患は、炎症性腸疾患、セリアック病、自己免疫性甲状腺疾患、シェーグレン症候群、自己免疫性胃炎、悪性貧血、自己免疫性肝炎、皮膚自己免疫疾患、自己免疫性拡張型心筋症、心筋炎、重症筋無力症、脈管炎、筋自己免疫疾患、精巣自己免疫疾患、卵巣自己免疫疾患、及び眼自己免疫疾患からなる群より選択され得る。アレルギーは、花粉抗原、真菌抗原、昆虫抗原、細菌抗原、哺乳動物抗原、又は昆虫毒液抗原に対するものであり得る。

その接触は、被験体に４−１ＢＢアゴニストを投与することを含み得る。その接触は４−１ＢＢアゴニストをコードするポリヌクレオチドを含有する核酸をその被験体に投与することを含み得る。このとき、そのポリヌクレオチドは転写調節因子と機能的に連結されている。あるいは、その接触は、（ａ）その被験体由来の細胞を用意し、（ｂ）転写調節因子と機能的に連結されている４−１ＢＢアゴニストをコードするポリヌクレオチドを含有する核酸を、その細胞又はその細胞の子孫にトランスフェクト又は形質導入すること、及び（ｃ）そのトランスフェクト若しくは形質導入細胞、又はそのトランスフェクト若しくは形質導入細胞の子孫を被験体に投与することを含み得る。

別の実施形態では、本発明は自己免疫疾患、リンパ増殖性疾患、又はアレルギーを治療又は予防するための医薬を調製するための４−１ＢＢアゴニストの使用を特徴とする。このとき４−１ＢＢアゴニストはダブルネガティブＴ細胞の死滅を誘導することに有効である。４−１ＢＢアゴニストは自己反応性Ｂ細胞の死滅を誘導することにもまた有効であり得る。

米国仮特許出願第６０／３２８，００４号及び第６０／３９５，８９６号はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

他に定義しない限りは、本明細書において使用する全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する当業者に共通に理解されるものと同様の意味を有する。本明細書に記載されたものと類似又は同等の方法及び材料を本発明の実施に使用できるが、適した方法及び材料を以下に記載する。本明細書において言及した全ての刊行物、特許出願、特許及び他の参照文献はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。不一致がある場合は、定義を含めた本明細書で調整する。さらに、材料、方法及び実施例は例示に過ぎず、限定する趣旨はない。

本発明の１つ又は複数の実施形態の詳細を添付の図面と以下の説明に記載する。本発明の他の特徴、目的及び利点は、この説明及び図面から、並びに特許請求の範囲から明らかとなろう。

図面の簡単な説明
図１ａ、１ｂ及び１ｃは、アゴニスト抗４−１ＢＢ抗体（２Ａ）又はラットＩｇＧ対照で処理されたＢ６／ｌｐｒマウス由来の脾臓細胞のフローサイトメトリーによって作成した散布図である。数は各四半分中の細胞百分率を示し、平均±ＳＤ（ｎ＝３）で表したものである。図１ｄは最初の処理後３週間の脾臓細胞、Ｔ細胞サブセット、Ｂ細胞及びＤＮＴＣの総細胞数を示すグラフである。白棒線：対照、黒棒線：２Ａ処理（ｎ＝３）。図１ｅは表示のように２Ａ又はＩｇＧ対照で処理されたマウスの血清中の総ＩｇＧレベル及び抗ＤＮＡ性ＩｇＧレベルを示すドットプロットである。白丸：対照、黒丸：２Ａ処理、^＊：Ｐ＜０．０５、^＊＊：Ｐ＜０．０１（ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定による）。

図２ａは対照（白丸）及び２Ａ処理（黒丸）のＭＲＬ／ｌｐｒマウス（ｎ＝１０）における触知できる末梢リンパ節（ｐＬＮ）の数を示すグラフである。図２ｂは、２Ａ処理マウス（黒棒線）における脾臓、プールした末梢リンパ節（ｐＬＮ；鼠径、腋窩及び頚部リンパ節を含む）及び腸間膜リンパ節（ｍＬＮ）の重量を対照群（白棒線）と比較したグラフである。図２ｃは４カ月齢の対照マウス（白棒線）及び２Ａ処理マウス（黒棒線）（ｎ＝３）の脾臓及び鼠径ＬＮにおける種々の細胞サブセットの細胞数を示すグラフである。^＊：Ｐ＜０．０５、^＊＊：Ｐ＜０．０１（ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定による）。

図３は、ラットＩｇＧ対照（白棒線）又は２Ａ（黒棒線）で処理したＭＲＬ／ｌｐｒマウスにおける皮膚損傷のグレードを示すグラフである。

図４ａは、２Ａ（黒丸）又はラットＩｇＧ（白丸）で処理したＭＲＬ／ｌｐｒマウスにおける尿中タンパク質レベルを示すグラフである。尿中タンパク質レベルを毎月評価し、半定量的にグレード決定した。図４ｂは、表示のように２Ａ又は対照ＩｇＧで処理したマウスの腎臓における炎症の量とカテゴリーを示すグラフである。

図５ａ及び５ｂは、２Ａ（黒丸）又は対照ＩｇＧ（白丸）で処理したＭＲＬ／ｌｐｒマウスにおける抗ＤＮＡ性ＩｇＧ及び総ＩｇＧのレベルをそれぞれ示すグラフである。２カ月齢での処理の開始前に測定を行い、以後１カ月に１回２カ月間行った。図５ｃはマウスにおける総ＩｇＧに対する抗ＤＮＡ性ＩｇＧの比を示すグラフである。図５ｄ及び５ｅは、抗ＤＮＡ性ＩｇＧ２ａ及び抗ＤＮＡ性ＩｇＧ１のレベルをそれぞれプロットしたグラフである。図５ｆは、処理マウス及び未処理の対照マウスの生存を示すグラフである。全てのグラフにおいてｎ＝１０で、^＊：Ｐ＜０．０５、^＊＊：Ｐ＜０．０１である。

図６ａは２Ａ又は対照ＩｇＧと共に０時間（左側）又は６時間（中央）にわたりｉｎ ｖｉｔｒｏで培養したＴｈｙ−１^＋Ｂ２２０^＋脾臓細胞におけるアポトーシスのレベルを示す一連のヒストグラムである。右側のヒストグラムは２Ａ又はＩｇＧで処理後のＣＤ６９発現ＤＮＴＣのアポトーシスのレベルを示すヒストグラムである。図６ｂは２Ａで処理した１週間後のＢ６／ｌｐｒマウス由来の脾臓の抗ＤＮＡ分泌Ｂ細胞（脾臓）数を示すグラフである。Ｂ細胞１００００個あたりの抗ＤＮＡ分泌Ｂ細胞数としてデータを表す。図６ｃは、２Ａ又は対照ＩｇＧで処理したＢ６／ｌｐｒマウス由来のＴ細胞におけるＩＦＮ−γ産生レベルを示す図であり、フローサイトメトリーにより作成した散布図を含む。図６ｄは、フローサイトメトリーにより作成した一連の散布図であり、２Ａ又はＩｇＧで処理したＢ６／ｌｐｒマウスにおけるＣＤ１１ｂ^＋ＧＲ−１^＋細胞数を示している。上記の結果は、全て３つの実験を代表したものである。図６ｅは、２Ａ及び／又は抗ＩＦＮ−γで処理されたＭＲＬ／ｌｐｒマウス（ｎ＝３）の血清中の抗ＤＮＡ性ＩｇＧレベルを示すグラフである。

本発明は、ＳＬＥのネズミモデルにおいて４−１ＢＢに特異的な抗体で処理することによってリンパ節症の軽減、自己抗体産生の減少、及び腎疾患の軽減が生じ、生存の延長につながるという発見に基づく。疾患の発症前又は発症後に処理された動物ではいずれにせよ有益な効果が観察された。本発明は特定のメカニズムにより限定されないが、４−１ＢＢ特異的抗体の治療効果及び予防効果は明らかにＤＮＴＣ及び自己反応性Ｂ細胞のアポトーシスの増加により媒介された。よって本発明は、ＤＮＴＣ及び自己反応性Ｂ細胞の枯渇による自己免疫疾患、リンパ増殖性疾患、及びアレルギーの治療法及び／又は予防法を提供する。さらに、本発明はＤＮＴＣ及び自己反応性Ｂ細胞の死滅を誘導する方法を提供する。

４−１ＢＢは腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体スーパーファミリーのメンバーであり、共刺激受容体分子である（VinayとKwon(1998) Semin.Immunol.10:481〜489;Kwonら(2000) Mol.Cells 10:119〜126）。４−１ＢＢは活性化Ｔ細胞（Pollokら(1993) J.Immunol.150:771〜781）及びＮＫ細胞（Meleroら、Cell.Immunol.190:167〜172）上に主に発現する。４−１ＢＢに対する天然リガンドは４−１ＢＢリガンド（４−１ＢＢＬ）であり、それは活性化Ｂ細胞、活性化Ｔ細胞、マクロファージ及び樹状細胞上で検出されている（Goodwinら(1993) Eur.J.Immunol.23:2631〜2641;Pollokら(1994) Eur.J.Immunol.24:367〜374;Aldersonら(1994) Eur.J.Immunol.24:2219〜2227）。本明細書に記載するように、４−１ＢＢＬ及び抗４−１ＢＢ抗体のような４−１ＢＢアゴニストを、ＤＮＴＣ及び自己反応性Ｂ細胞のＡＩＣＤを刺激するために使用できる。

ポリペプチドと抗体
本発明は４−１ＢＢと結合する分子を提供する。本明細書において提供するこれらの分子は、例えばポリペプチドであり得る。本明細書に使用するポリペプチドは長さ又は翻訳後修飾（例えばリン酸化又はグリコシル化）にかかわらずアミノ酸鎖である。本明細書において提供するポリペプチドは４−１ＢＢと特異的に結合でき、哺乳動物（例えばマウス又はヒト）に投与すると、免疫応答を活性化し、ＤＮＴＣ及び／又は自己反応性Ｂ細胞のＡＩＣＤを引き起こし得る。本発明のポリペプチドは、免疫細胞と共にｉｎ ｖｉｔｒｏで培養したときにも、ＤＮＴＣ及び自己反応性Ｂ細胞のＡＩＣＤを生じ得る。本明細書において使用する「ＤＮＴＣ」とはＣＤ４及びＣＤ８を発現しないＴ細胞である。

本明細書において提供する分子は、概して４−１ＢＢアゴニストである。本明細書において使用する特定の受容体に対する「アゴニスト」とは、その受容体と相互作用しその活性を刺激し得る分子である。４−１ＢＢに対する天然リガンドは４−１ＢＢＬである。他の４−１ＢＢアゴニストは４−１ＢＢ活性を刺激して４−１ＢＢＬと同様又は類似した作用を生じ得る。

本明細書において提供する方法に有用な４−１ＢＢアゴニストは、４−１ＢＢＬ又は４−１ＢＢＬの機能的断片、すなわち完全長４−１ＢＢＬが４−１ＢＢと結合し受容体を活性化して免疫応答を増強するように機能するときのアビディティの少なくとも２０％（例えば少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、９９．５％又は１００％さえある）で４−１ＢＢと結合する４−１ＢＢＬ断片である。

あるいは、４−１ＢＢアゴニストは４−１ＢＢに対する特異的結合活性を有する抗体であり得る。「抗体」及び「複数の抗体」という用語は、４−１ＢＢと結合可能な無傷分子及びそのフラグメントを含む。抗体はＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ及びＩｇＧを含めた免疫グロブリン（Ｉｇ）のいかなるクラス並びにそのサブクラスであり得、概してＩｇＭクラスの抗体は五価であり、１つの抗体分子が複数の４−１ＢＢポリペプチドと架橋できることから特に有用でありうる。架橋（例えば架橋ＩｇＧ）し、したがって多価であるＩｇ分子を含有する免疫複合体も複数の４−１ＢＢ分子と架橋可能であり、特に有用でありうる。

本明細書おいて使用する「エピトープ」とは、抗体が結合する抗原分子の部分である。抗原は同時に１つを超えるエピトープを提示できる。ポリペプチド抗原については、エピトープは概して約４〜６個のアミノ酸長である。２つの異なる免疫グロブリンが、同様のエピトープ又はエピトープセットと結合するばあいには、それらの免疫グロブリンは同じエピトープ特異性を有し得る。

「抗体」及び「複数の抗体」という用語は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化又はキメラ抗体、並びに一本鎖Ｆｖ抗体フラグメント、Ｆａｂフラグメント及びＦ（ａｂ）_２フラグメントのような抗体フラグメントを包含する。ポリクローナル抗体は特定の抗原に特異的な抗体分子の不均一集団であるが、モノクローナル抗体は抗原に含まれる特定のエピトープに対する抗体の均一集団である。

ポリクローナル抗体は、例えば免疫された動物の血清から単離され得る。ポリクローナル抗体の単離法には、限定されるものではないが、クロマトグラフィーを含む技術を用いて哺乳動物の血清から精製することが挙げられる。

モノクローナル抗体は、例えば標準的なハイブリドーマ法を用いて調製できる。具体的には、例えばKohlerら(1975) Nature256:495〜497に記載されたような連続継代性細胞系の培養、Kosborら(1983) Immunology Today 4:72及びCoteら(1983) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:2026〜2030のヒトＢ細胞ハイブリドーマ法、並びにColeら「Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy」Alan R.Liss,Inc.77〜96頁(1983)のＥＢＶハイブリドーマ法による抗体分子の産生をもたらす技術を用いてモノクローナル抗体を得ることができる。本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏで培養できる。例えば、（ａ）マウス４−１ＢＢ−Ｉｇで免疫したラットの脾臓細胞と、（ｂ）マウスＳｐ２／０ミエローマ細胞とを融合させることによって生じたハイブリドーマは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでモノクローナル抗体２Ａを産生した（Wilcoxら(2002) J.Clin.Invest.109:651〜659）。

４−１ＢＢと結合する抗体は、例えば宿主動物（例えばウサギ、ニワトリ、マウス、モルモット又はラット）を４−１ＢＢで免疫することによっても作製し得る。４−１ＢＢポリペプチド又は４−１ＢＢポリペプチドの一部を、組換えにより、化学合成により、又は天然タンパク質の精製により生成でき、そのポリペプチドの注射により動物に対する免疫に使用できる。宿主の種に応じて免疫応答を増強するためにアジュバントを使用できる。適当なアジュバントには、フロイントの（完全又は不完全）アジュバント；水酸化アルミニウムのような鉱物ゲル；リゾレシチン、プルロニックポリオール、多価アニオン、ペプチド、油エマルション、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）及びジニトロフェノールのような界面活性剤がある。宿主動物の血清から４−１ＢＢ免疫原に応答して生じた抗体を単離するためには標準法を使用できる。そのような方法は２Ａと類似した特徴（例えば類似したエピトープ特異性及び他の機能的類似性）を有する抗体の作製に有用である。

２Ａのような抗体は組換えにより作製することもできる。本明細書において提供する抗体のアミノ酸配列（例えば部分アミノ酸配列）は標準法により決定でき、その抗体又はその抗体の一部をコードするｃＤＮＡは、その抗体がもともと単離された被験体（例えばヒト患者又は免疫された宿主動物）の血清から単離できる。標準法を用いてそのｃＤＮＡを発現ベクターにクローニングできる。発現ベクターを適当な宿主細胞（例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞、ＣＯＳ細胞、又はハイブリドーマ細胞）にトランスフェクトでき、抗体を発現させ、精製することができる。

４−１ＢＢに対して特異的な結合親和性を有し、架橋機能を保持する抗体フラグメントも上に開示したような方法で作製できる。そのような抗体フラグメントには、抗体分子のペプシン分解により生成し得るＦ（ａｂ’）_２フラグメント、及びＦ（ａｂ’）_２フラグメントのジスルフィド架橋の還元により生成し得るＦａｂフラグメントがあるが、それらに限定する趣旨はない。あるいは、Ｆａｂ発現ライブラリーを構築できる。例えばHuseら(1989) Science 246:1275〜1281を参照のこと。一本鎖Ｆｖ抗体フラグメントは、アミノ酸架橋（例えばアミノ酸１５〜１８個）を介してＦｖ領域の重鎖断片及び軽鎖断片を連結して、一本鎖ポリペプチドを生じさせることによって形成する。一本鎖Ｆｖ抗体フラグメントは米国特許第４，９４６，７７８号に開示されたような標準法によって製造できる。例えばビオチン化及び架橋によりそのようなフラグメントを多価にすることができ、それによって複数の４−１ＢＢ分子と架橋できる抗体フラグメントが得られる。

核酸、ベクター、及び宿主細胞
本発明は、４−１ＢＢと特異的に結合する分子（例えばポリペプチド及び抗体）をコードする核酸も提供する。本明細書において使用する「核酸」という用語は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ及び合成ＤＮＡ（例えば化学合成ＤＮＡ）を含めたＲＮＡとＤＮＡの両者を指す。核酸分子は二本鎖又は一本鎖（すなわちセンス又はアンチセンス一本鎖）であり得る。本発明の核酸には、例えば２Ａモノクローナル抗４−１ＢＢ抗体の軽鎖及び重鎖をコードするｃＤＮＡが含まれる。

「単離された核酸」は、脊椎動物のゲノムにおいて核酸の一方又は両方の側に通常隣接する核酸を含めた、脊椎動物のゲノムに存在する他の核酸分子から分離された核酸を指す。核酸に関して本明細書において使用する「単離された」という用語は、いずれの非天然核酸配列も包含する。それは、そのような非天然配列は自然界にみられず、天然ゲノムに直接連続する配列を有さないからである。

単離された核酸は、例えばＤＮＡ分子であり得る。このとき天然ゲノムにおいてそのＤＮＡ分子に直接隣接することが通常みられる核酸配列の１つが除去されたか存在しないことを条件とする。よって、単離された核酸には、他の配列とは独立した別々の分子として存在するＤＮＡ分子（例えば、化学合成された核酸、又はＰＣＲ若しくは制限エンドヌクレアーゼ処理により生成したｃＤＮＡ若しくはゲノムＤＮＡ）と、ベクター、自律複製プラスミド、ウイルス（例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス若しくはヘルペスウイルス）、又は原核生物若しくは真核生物のゲノムＤＮＡに組み込まれたＤＮＡとがあるが、それに限定する趣旨はない。さらに、単離された核酸は、ハイブリッド核酸又は融合核酸の一部であるＤＮＡ分子のような操作された核酸を含み得る。例えばｃＤＮＡライブラリー若しくはゲノムライブラリー、又はゲノムＤＮＡ制限酵素分解産物を含有するゲル片に存在する数百から数百万の他の核酸に混じって存在する核酸は、単離された核酸とはみなされない。

限定されるものではないが、通常の分子クローニング法及び核酸の化学合成法を含む標準法により、本明細書において提供するような単離された核酸分子を製造できる。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を、２Ａ又は２Ａの一部をコードする単離された核酸分子を得るために利用できる。本発明の単離された核酸を（例えばホスホルアミダイト法を用いた３’から５’方向への自動ＤＮＡ合成を用いて）単一核酸分子として、又は一連のポリヌクレオチドとして化学合成することもできる。例えば、希望の配列を含有する１つ又は複数の対の長鎖ポリヌクレオチド（例えば１００個を超えるヌクレオチド）を合成できる。その各対は相補的短鎖セグメント（例えば約１５個のヌクレオチド）を含有するため、そのポリヌクレオチド対をアニーリングすると二本鎖が形成する。ポリヌクレオチドを伸長するためにＤＮＡポリメラーゼを用いることによって、ポリヌクレオチド１対あたり１つの二本鎖核酸分子が生じる。

本発明は上記のような核酸を含有するベクターも提供する。本明細書において使用する「ベクター」は、プラスミド、ファージ又はコスミドのようなレプリコンであり、そのレプリコンに別のＤＮＡセグメントが挿入され、その挿入されたセグメントの複製を引き起こすことができる。本発明のベクターは発現ベクターであり得る。「発現ベクター」は１つ又は複数の発現制御配列を包含するベクターであり、「発現制御配列」は別のＤＮＡ配列の転写及び／又は翻訳を制御及び調節するＤＮＡ配列である。同様に、「転写調節因子」は別のＤＮＡ配列の転写を制御及び調節する発現制御配列である。

本発明の発現ベクターにおいて、核酸（例えば２Ａの軽鎖及び／又は重鎖をコードする核酸）は１つ又は複数の発現制御配列と機能的に連結される。本明細書において使用する「機能的に連結されている」とは、遺伝子構築物に組み込まれ、発現制御配列が効果的に目的のコード配列の発現を制御することを意味する。発現制御配列の例には、プロモーター、エンハンサー及び転写終結領域がある。プロモーターは転写が開始する（一般にＲＮＡポリメラーゼＩＩの開始部位に近接している）点の上流、概して１００ヌクレオチド以内のＤＮＡ分子の領域から構成される発現制御配列である。コード配列をプロモーターの制御下に置くためには、プロモーターから１〜約５０ヌクレオチド下流のポリペプチドの翻訳読み枠の翻訳開始部位に位置する必要がある。エンハンサーは時間、位置及びレベルの点で発現特異性をもたらす。プロモーターとは異なり、エンハンサーは転写部位から様々な距離に位置して機能できる。エンハンサーは転写開始部位から下流にも位置し得る。ＲＮＡポリメラーゼがコード配列をｍＲＮＡに転写できるとき、コード配列は細胞内で転写制御因子と「機能的に連結」されて「制御下」にある。次に、そのｍＲＮＡをコード配列によりコードされるタンパク質に翻訳できる。よって、本明細書において提供する発現ベクターは、２Ａ、及び４−１ＢＢと結合して４−１ＢＢを活性化する他の分子の製造に有用である。

適当な発現ベクターには、例えばプラスミド、並びにバクテリオファージ、バキュロウイルス、タバコモザイクウイルス、ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルスに由来するウイルスベクターがあるが、限定する趣旨はない。多数のベクターと発現系がＮｏｖａｇｅｎ（マディソン、ウィスコンシン州）、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（パロ・アルト、カリフォルニア州）、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（ラ・ホーヤ、カリフォルニア州）及びＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（カールスバッド、カリフォルニア州）のような会社から市販されている。

発現ベクターは、発現した核酸配列のその後の操作（例えば精製又は局在化）を可能にするように設計されたタグ配列を含み得る。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ポリヒスチジン、ｃ−ｍｙｃ、ヘマグルチニン又はＦｌａｇ（商標）タグ（Ｋｏｄａｋ、ニュー・ヘーブン、コネチカット州）の配列のようなタグ配列は典型的にコードされるポリペプチドとの融合体として発現させる。そのようなタグをカルボキシル末端又はアミノ末端を含めてポリペプチドのいかなる部位にも挿入できる。

本発明は本発明のベクターを含有する宿主細胞も提供する。「宿主細胞」という用語は、組換え発現ベクターを導入できる原核細胞又は真核細胞を包含することを意図する。本明細書に使用する「形質転換」、「トランスフェクション」及び「形質導入」はいくつかの方法の１つによって細胞に核酸分子（例えばベクター）を導入することを含む。特定の方法に限定する趣旨はないが、これらのいくつかの方法は当技術分野で十分に確立されている。例えば、エレクトロポレーション又は塩化カルシウム介在性形質転換により、核酸を用いて原核細胞を形質転換できる。例えばリン酸カルシウム共沈、ＤＥＡＥ−デキストラン介在性トランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーション又はマイクロインジェクションを含む方法により核酸を哺乳動物細胞にトランスフェクトできる。宿主細胞を形質転換し宿主細胞にトランスフェクトするための適当な方法はSambrookら、「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」(第2版)、Cold Spring Harbor Laboratory、ニューヨーク(1989)に見いだされ、形質転換及び／又はトランスフェクション用の試薬は市販されている（例えばＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、Ｆｕｇｅｎｅ（Ｒｏｃｈｅ、インディアナポリス、インディアナ州）及びＳｕｐｅｒＦｅｃｔ（Ｑｉａｇｅｎ、バレンシア、カリフォルニア州））。

治療方法及び／又は予防方法
本発明は自己免疫疾患、過剰増殖性（例えばリンパ増殖性）疾患、及びアレルギーのような疾患を治療又は予防するための方法を提供する。特定の作用機序に拘束されることなしに、本明細書において提供する方法を使用して、免疫応答を活性化すること、並びにＣＤ４⁻／ＣＤ８⁻ダブルネガティブＴ細胞（ＤＮＴＣ）及び／又は自己反応性Ｂ細胞を枯渇させることによってそのような疾患を治療又は予防できる。よって、本発明はＤＮＴＣ及び／又は自己反応性Ｂ細胞を枯渇させる方法も提供する。本明細書において提供する方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又は被験体において４−１ＢＢアゴニストのような４−１ＢＢ結合物質と細胞とを接触させることを含む。ある実施形態では、ＤＮＴＣ及び／又は自己反応性Ｂ細胞はＡＩＣＤが原因で枯渇する。

本明細書において使用する被験体又はｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて特定の細胞型を「枯渇させる」ことは、４−１ＢＢアゴニストの投与後に特定の型の細胞（例えばＤＮＴＣ）数が減少することを意味する。典型的に、処理後に細胞数は少なくとも２０％（例えば少なくとも２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、又は１００％さえある）が枯渇する。本明細書において使用する特定の細胞の「死滅を誘導する」という用語は、４−１ＢＢアゴニストで処理後に細胞が死滅することを意味する。ＤＮＴＣ又は自己反応性Ｂ細胞の死滅は、例えば細胞に４−１ＢＢアゴニストを投与後のＡＩＣＤによって生じる場合がある。４−１ＢＢアゴニストをｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏのいずれかでそのような細胞に投与してもよい。

本明細書において使用する「予防」は、疾患の症状の防止、疾患の発症の遅延、又はその後に確立した疾患の症状の重症度の低下を意味し得る。「防止」は疾病（例えば感染）の症状が必然的にないことを意味しうる。本明細書において使用する「治療」は、疾患の症状の完全な消失又はその疾患の症状の重症度の低減を意味し得る。本明細書において使用する「防御」免疫応答は予防及び／又は治療の免疫応答である。

本発明の分子は、典型的に「有効量」で被験体又は細胞に投与される。本明細書において使用する「有効量」は、被験体においてＤＮＴＣ及び／若しくは自己反応性Ｂ細胞を枯渇させる、又は被験体若しくはｉｎ ｖｉｔｒｏのどちらかにおいてＤＮＴＣ若しくは自己反応性Ｂ細胞の死滅を引き起こす分子（例えばアゴニスト抗４−１ＢＢ抗体）の量である。

被験体においてＤＮＴＣ及び／又は自己反応性Ｂ細胞を枯渇させる方法は、（ａ）自己免疫疾患、リンパ増殖性疾患又はアレルギーを患う若しくは発症するか又はそのリスクのある被験体を特定すること、及び（ｂ）その被験体に有効量の４−１ＢＢ結合分子（例えば２Ａのようなアゴニスト抗４−１ＢＢ抗体又はそのような抗体を含有する組成物）を投与すること、を含み得る。本発明の方法は、そのような治療を必要とする被験体を特定するステップ及び／又は治療された被験体を症状についてモニターするステップも含み得る。本発明の方法で治療しうる疾患には、限定されるものではないが、ＳＬＥ、インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）、炎症性腸疾患、セリアック病、自己免疫性甲状腺疾患、シェーグレン症候群、自己免疫性胃炎、悪性貧血、自己免疫性肝炎、皮膚自己免疫疾患、自己免疫性拡張型心筋症、心筋炎、重症筋無力症、脈管炎、眼自己免疫疾患、筋自己免疫疾患、精巣自己免疫疾患、卵巣自己免疫疾患、過剰増殖性（例えばリンパ増殖性）疾患、又はアレルギーが挙げられる。

ＳＬＥは多くの症状の発現を伴う慢性自己免疫疾患である。自己抗体の産生は免疫複合体の形成を生じ、その後多くの組織（例えば糸球体、皮膚、肺、滑膜、及び中皮）に沈着する。ＳＬＥの症状には、例えば発疹、発熱、口又は鼻の潰瘍、関節痛及び／又は腫脹、頭痛、並びに筋肉痛及び／又は圧痛がある。免疫複合体がしばしば腎糸球体に沈着するため、腎疾患がＳＬＥでは一般的である。治療にもかかわらず、通常は慢性腎不全に進行する。ＳＬＥのマウスモデルでは、顕著なタンパク尿が観察され、同時にＤＮＡ及びヒストンに対する抗体、並びにＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、及びＩｇＧ２ｂサブクラスの免疫複合体が血清に出現する。そのようなマウスの生存期間の中央値は６カ月であり、死因は概して腎不全である。Ｂ細胞と自己抗体が疾患の発生に必須の役割を演じると考えられ、自己抗体産生を妨害する薬剤がその疾患を軽減することが示された。

ＩＤＤＭは、膵臓β細胞の破壊を特徴とする慢性自己免疫疾患で、その破壊は多様な代謝経路の障害として出現する（Zimmet(1997) Medicine 25:1〜3）。ＩＤＤＭは糖質の代謝に影響し、グルコース寛容減損（すなわち血中グルコース濃度の増加）が最もはっきりした作用である［Hunter、「Effective Care in Pregnancy and Childbirth」、第1巻、Chalmers、Enkin及びKeirse編、Oxford University Press、578〜593頁(1989)］。他の症状には過度の口渇、頻尿、極端な空腹、疲労、及び体重減少がある。ＩＤＤＭを有すると重症のインスリン欠乏症が突然発症し、ケトーシスの傾向もある。ＩＤＤＭを有する被験体は概して外因性インスリンに依存性である。

リンパ増殖性疾患は不均一な群のモノクローナル又はオリゴクローナルの増殖性リンパ系腫瘍である。リンパ増殖性疾患には、例えば自己免疫リンパ増殖性症候群、無ガンマグロブリン血症、アミロイドーシス、白血病、リンパ腫、移植後リンパ増殖性疾患、サルコイドーシス、Ｘ連鎖リンパ増殖性症候群、及びヴァルデンストレームマクログロブリン血症がある。それらの疾患は年齢と共に次第によくみられるようになる。小児ではリンパ増殖性疾患は免疫機能不全の背景でのみ発生する。免疫機能不全の小児で真に悪性であるリスクは、免疫適格小児におけるリスクよりも１０〜３００倍高い。身体症状には、しばしばリンパ節肥大、巨脾腫、又は増殖するリンパクローンの臓器への浸潤に起因する症状がある。あるサブタイプでは消化管又は肺が選択的に冒されるおそれがあるため、腹部鼓脹又は肺の所見が身体検査の優位を占める場合がある。

アレルギーは即時型又は遅延型過敏アレルギーであり得る。それらは概して即時型過敏アレルギーである。関連するアレルゲンには、例えば植物、細菌、昆虫及び哺乳動物という多様な起源の抗原がある。植物抗原には、例えば花粉抗原がある。花粉抗原は例えば、芝、カバノキ、ヒマラヤスギ、ヌマトスギ又はブタクサの花粉に存在し得る。細菌抗原は、例えばスタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus；黄色ブドウ球菌）に由来し得る。（酵母を含む）真菌抗原、例えば真菌胞子抗原は、例えばアスペルジルス・フミガーツス（Aspergillus fumigatus）、アルテルナリア属（Alternari）、担子菌類、放線菌、ビポラリス・スピシフェラ（Bipolaris spicifera）、ドレシュスレラ属（Drechslera）、エクセロヒラム（Excerohilum）、トリコフィトン属（Trichophyton）、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、又はピチロスポリウム・オバル（Pityrosporium ovale）由来であり得る。昆虫抗原は、例えばガ、ハエ、コオロギ、アリ、甲虫、ゴキブリ、ダニ、クモ、カ、及びノミを含めた昆虫の体の部分、血液（例えばヘモグロビン）、糞又は唾液に由来し得る。毒液抗原、例えばヒアリの毒液、又は例えばミツバチ、イエロー・ジャケット、ハチ、若しくはスズメバチなどのハチ目の構成生物の毒液の対象となる。本発明の方法は、哺乳動物抗原、例えばヒト、ネコ、イヌ、ラット、マウス、モルモット、アレチネズミ、又はウサギの鱗屑又は尿に存在する抗原に対するアレルギーを有する被験体にも適用できる。それ以外の対象アレルゲンは当業者に周知である［参照によりその全体が本明細書に組み込まれるPlatts-Mills（Allergens）、「Samter's Immunologic Diseases」第5版、第II巻、Frank、Austen、Claman及びUnanue編。Little, Brown, and Company、ボストン、ニューヨーク、トロント、及びロンドン、1231〜1256頁(1995)を例えば参照のこと］。

本明細書において提供する方法に有用な分子（例えば４−１ＢＢアゴニスト）は、当技術分野で周知の方法を含めたいくつかの方法によって投与できる。投与方法は概して、局所又は全身治療が望ましいか、そしてどの部位を治療するべきかというような要因に依存するであろう。投与は、例えば局所（例えば経皮、舌下、点眼、又は鼻腔内）、肺（例えば粉末又はエーロゾルの吸入又は吹入）、経口、又は（例えば皮下、脊髄内、脳室内、筋肉内、若しくは腹腔内注射、又は点滴静注による）非経口であり得る。投与は（例えば注射による）急速の場合もあるし、（例えば緩速輸液又は徐放製剤の投与により）ある時間持続する場合もある。中枢神経系の組織の治療には、好ましくは血液脳関門を通過してポリペプチドの透過を促進できる１つ又は複数の薬剤と共に、脳脊髄液に注射又は注入することにより４−１ＢＢアゴニストを投与できる。

本発明の方法では、４−１ＢＢ結合性ポリペプチド（例えばアゴニスト抗４−１ＢＢ抗体）を被験体又はＤＮＴＣに直接送達できる。あるいは、被験体への送達又はＤＮＴＣとの接触は、そのポリペプチドをコードし、転写調節因子と機能的に連結されているポリヌクレオチドを含有する核酸を被験体に投与することを含みうる。あるいは、被験体への送達又は被験体におけるＤＮＴＣとの接触には、（ａ）その被験体に由来する細胞を用意すること、（ｂ）その細胞又はその細胞の子孫を、４−１ＢＢアゴニストをコードし、転写調節因子と機能的に連結されているポリヌクレオチドを含有する核酸でトランスフェクト又は形質導入すること、及び（ｃ）そのトランスフェクト若しくは形質導入細胞、又はそのトランスフェクト若しくは形質導入細胞の子孫をその被験体に投与することを含み得る。当然、被験体に投与される細胞はトランスフェクト又は形質導入細胞の子孫であり、そのような子孫細胞はトランスフェクション又は形質導入に使用される核酸に含まれる（４−１ＢＢアゴニストをコードする）ポリヌクレオチドを保有し発現するはずである。

本発明の方法は、４−１ＢＢアゴニストを投与することに加えてインターフェロンγ及び／又はＧｒ−１と結合する物質（例えば抗体）を投与することも含み得る。Ｇｒ−１は脊髄系列の細胞上に発現する脊髄系分化抗原であり、顆粒球の成熟のマーカーとして機能する（Hestdalら(1991) J.Immunol.147:22〜28;Flemingら(1993) J.Immunol.151:2399〜2408）。

本発明の方法において、被験体は哺乳動物被験体、例えばヒト、非ヒト霊長類、ウシ、ウマ、ロバ、ラバ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、ウサギ、ラット、マウス、アレチネズミ、モルモット、又はハムスターであり得る。あるいは、被験体はニワトリ又はシチメンチョウのような鳥であり得る。

組成物と製品
４−１ＢＢアゴニスト（例えば２Ａのようなアゴニスト抗４−１ＢＢ抗体）を本明細書に記載する方法のいずれか（例えば自己免疫疾患、アレルギー、及びリンパ増殖性疾患を治療するための自己反応性細胞の枯渇方法）に使用するための医薬の調製に使用しうる。これらの方法により、免疫応答を増強し、自己反応性Ｂ細胞及びＤＮＴＣのＡＩＣＤを刺激することによって軽減できる疾患又は障害（例えばＳＬＥ）を有する被験体（例えばヒト又は別の哺乳動物）に、本発明に係る抗体又は組成物を投与しうる。概して疾患又は自己免疫応答に伴う状態を有する疑いのある被験体に１つ又は複数の４−１ＢＢアゴニスト又は組成物を投与しうる。あるいは、ＤＮＴＣ又は自己反応性Ｂ細胞にｉｎ ｖｉｔｒｏで１つ又は複数の４−１ＢＢアゴニスト又は組成物を投与できる。

本発明の組成物は、本明細書に記載する１つ又は複数のポリペプチド及び化合物を概して含有する。４−１ＢＢアゴニストを薬学的に許容できる担体又は希釈剤中に入れることができ、特定の疾患の性質、その重症度及び被験体の全般状態に応じて異なるであろう量及び期間で投与できる。概して、その分子は有効量（すなわち被験体におけるＤＮＴＣ及び／又は自己反応性Ｂ細胞を枯渇させるために有効な量、あるいはその分子と接触する細胞の死滅を誘導するために有効な量）で投与される。本発明の分子と方法は、予防的、例えば自己免疫疾患のリスクのある被験体において自己免疫を最小化するためにも使用できる。

４−１ＢＢアゴニストがＤＮＴＣ又は自己反応性Ｂ細胞を枯渇させる能力は、例えばそのアゴニストで処置された被験体の血清試料から得られた細胞のフローサイトメトリーにより評価できる。あるいは、４−１ＢＢアゴニストが自己反応性細胞を枯渇させる能力は、処置された被験体の血清の酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）により測定できる。例えば本明細書の実施例を参照されたい。

治療用組成物の処方とその後の投与の方法は当業者に周知である。用量は一般に治療すべき疾患状態の重症度と応答性に依存し、治療期間は数日から数カ月又はそれよりも長くか、あるいは治療の効果が現れるか疾患状態の軽減に達するまで続く。当業者は慣用により至適用量、投与法及び投与回数を決定している。至適用量は個々のポリペプチドの相対効力に応じて変動する可能性があり、一般にｉｎ ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ ｖｉｖｏの動物モデルで有効であると分かったＥＣ_５０に基づいて推定できる。概して、用量は０．０１μｇ〜１００ｇ／ｋｇ体重であり、１回又は複数回を毎日、１週間に２回、毎週、毎月又はそれよりも低い頻度で投与できる。治療の成功後は、疾患の状態の再発を防止するための維持療法を患者に受けさせることが望ましいであろう。

本発明は、本発明の４−１ＢＢ結合分子を包含する医薬組成物及び製剤を提供する。したがって、そのような分子を例えば、取込み、分布及び／又は吸収を促進するためのリポソーム、ポリエチレングリコール、受容体標的分子、又は経口用、直腸用、局所用若しくは他の製剤のような他の分子、分子構造、又は化合物混合物と混合し、封入し、抱合し又はさもなければ会合させることができる。

「薬学的に許容できる担体」（本明細書では「賦形剤」とも呼ばれる）は、１つ又は複数の治療用化合物（例えばアゴニスト抗４−１ＢＢ抗体）を被験体に送達するための薬学的に許容できる溶媒、懸濁化剤、又は他の薬学的に不活性なビヒクルである。薬学的に許容できる担体は液体でも固体であり得、投与計画を念頭において１つ又は複数の治療用化合物及び他の所与の医薬組成物の成分と組み合わせたときに望みのかさ、稠性、並びに他の適切な輸送及び化学的性質をもたらすように選択できる。アミノ酸と有害反応しない典型的な薬学的に許容できる担体には、水、生理食塩水、結合剤（例えばポリビニルピロリドン又はヒドロキシプロピルメチルセルロース）、充填剤（例えば乳糖及び他の糖、ゼラチン又は硫酸カルシウム）、滑沢剤（例えばデンプン、ポリエチレングリコール又は酢酸ナトリウム）、崩壊剤（例えばデンプン又はデンプングリコール酸ナトリウム）、及び湿潤剤（例えばラウリル硫酸ナトリウム）があるが、これらは例示であり限定する趣旨はない。

本発明の医薬組成物は、局所又は全身療法が望ましいかに応じて、そして治療される部位に応じていくつかの方法で投与できる。上記のように、投与は例えば局所、肺内、経口又は非経口であり得る。

４−１ＢＢアゴニストの局所投与用の製剤には、例えば滅菌及び非滅菌水溶液、アルコールのような通常の溶媒を用いた非水溶液、又は液体若しくは固体油性基剤における溶液がある。そのような溶液は、緩衝剤、希釈剤及び他の適当な添加剤も含有し得る。局所投与用の医薬組成物及び製剤は経皮パッチ、軟膏、ローション剤、クリーム剤、ゲル剤、滴剤、坐剤、噴霧剤、液剤、及び散剤を含み得る。点鼻噴霧剤が特に有用で、例えば噴霧器又は別の点鼻噴霧装置により投与できる。吸入器による投与も特に有用である。従来の医薬用担体、水性、粉末又は油性基剤、粘稠化剤なども必要か又は望ましいことがある。

経口投与用の組成物及び製剤には、例えば散剤又は顆粒剤、水又は非水性溶媒を用いた懸濁剤又は溶剤、カプセル剤、サシェ剤又は錠剤がある。そのような組成物に粘稠化剤、着香料、希釈剤、乳化剤、分散補助剤、又は結合剤を組み合わせることもできる。

非経口、脊髄内又は脳室内投与用の組成物及び製剤は、滅菌水溶液を含んでもよく、緩衝剤、希釈剤及び他の適当な添加剤（例えば浸透促進剤、担体化合物及び他の薬学的に許容できる担体）も含有し得る。

本発明の医薬組成物には、液剤、乳剤、水性懸濁剤、及びリポソーム含有製剤があるが、限定する趣旨はない。これらの組成物を例えば予め形成した液体、自己乳化性固体及び自己乳化性半固体を含む様々な成分から作り出すことができる。乳剤は、しばしば完全に混合して互いに分散した不混和性の液体２相を含む二相系である。一般に、乳剤は油中水（ｗ／ｏ）型又は水中油（ｏ／ｗ）型のどちらかである。乳剤は製剤化が容易で、可溶化、吸収及びバイオアベイラビリティの効率がよいことから治療薬の経口送達に広く用いられている。

リポソームは脂溶性物質で形成された膜と送達させる組成物を含有できる水性内部とを有する小胞である。薬物送達の見地からみると、リポソームは特異性及びもたらす作用持続時間が理由となって特に有用であり得る。例えば、リポソーム組成物をホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルグリセロール、又はジオレオイルホスファチジルエタノールアミンから形成させることができる。Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カールスバッド、カリフォルニア州）及びＥｆｆｅｃｔｅｎｅ（商標）（Ｑｉａｇｅｎ、バレンシア、カリフォルニア州）を含めた多数の親油性剤が市販されている。

本発明のポリペプチドは、薬学的に許容できる塩、エステル、若しくはそのようなエステルの塩、又は動物（例えばヒト）に投与すると生体活性代謝物若しくはその残渣を（直接若しくは間接的に）もたらすことが可能な他の化合物をさらに含む。したがって、例えば本発明は、ポリペプチドの薬学的に許容できる塩、プロドラッグ及びそのようなプロドラッグの薬学的に許容できる塩、並びに他の生体同等物を提供する。「プロドラッグ」という用語は、不活性型で調製され、内因性酵素又は他の化学物質及び／若しくは条件の作用により体内又は細胞内で活性型（すなわち薬剤）に変換される治療薬を意味する。「薬学的に許容できる塩」という用語は、本発明のポリペプチドの生理学的及び薬学的に許容できる塩（すなわち望ましくない毒性作用を付与することなしに親ポリペプチドの望ましい生物学的活性を保持する塩）を指す。薬学的に許容できる塩の例には、カチオン（例えばナトリウム、カリウム、カルシウム、又はスペルミンのようなポリアミン）と共に形成した塩、無機酸（例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、又は硝酸）と共に形成した酸付加塩、及び有機酸（例えば酢酸、クエン酸、シュウ酸、パルミチン酸、又はフマル酸）と共に形成した塩があるが、それらに限定する趣旨はない。

本発明のポリペプチドを含有する医薬組成物は、動物の皮膚へのポリペプチドの効率的な送達を促進する浸透増強剤を混合することもできる。浸透増強剤は細胞膜を介した脂溶性及び非脂溶性薬剤の拡散を促進できる。浸透増強剤は５つの広いカテゴリー、すなわち界面活性剤（例えばラウリル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル及びポリオキシエチレン−２０−セチルエーテル）、脂肪酸（例えばオレイン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸及びステアリン酸）、胆汁酸塩（例えばコール酸、デヒドロコール酸及びデオキシコール酸）、キレート剤（例えばエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム、クエン酸、及びサリチル酸塩）、及び非キレート非界面活性剤（例えば不飽和環状尿素）の１つに属すると分類できる。あるいは、阻害性ポリペプチドをイオン導入により送達できる。イオン導入は真皮を介してそのポリペプチドを「駆動する」ための電荷を有する経皮パッチを含む。

本発明のある実施形態は、（ａ）１つ又は複数の４−１ＢＢアゴニストと、（ｂ）異なるメカニズムで機能する１つ又は複数の他の薬剤とを含有する医薬組成物を提供する。例えば、抗炎症薬（例えば限定するものではないが、非ステロイド系抗炎症薬及びコルチコステロイドを含む）、並びに抗ウイルス薬（例えば限定するものではないが、リビビリン、ビダラビン、アシクロビル及びガンシクロビルを含む）を本発明の組成物に包含させることができる。他の非ポリペプチド薬剤（例えば化学療法剤）も本発明の範囲に入る。そのような組み合わせ化合物を同時又は連続的に使用できる。

本発明の組成物は、医薬組成物に従来見い出される他の補助成分を付加的に含有し得る。よって、その組成物は、例えば止痒剤、収斂剤、局所麻酔薬若しくは抗炎症薬という適合性の薬学的に活性な物質、又は本発明の組成物を多様な剤形に物理的に製剤する際に有用な、着色料、着香料、保存剤、抗酸化剤、乳白剤、粘稠化剤及び安定化剤のような付加的な物質も含み得る。さらにその組成物は、例えば滑沢剤、保存剤、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を与えるための塩類、緩衝剤、着色料、着香料及び芳香物質である補助剤と混合することもできる。しかし、添加の際にそのような物質は本発明の組成物中のポリペプチド成分の生物学的活性を過度に妨害してはならない。所望であれば製剤を滅菌することもできる。

本発明の医薬製剤は、単位用量剤形で適宜提供され得るが、医薬業界で周知の慣用技術に従って調製できる。そのような技術には、活性成分（例えばアゴニスト抗４−１ＢＢ抗体）を希望の薬学用担体又は添加剤と会合させるステップを包含する。概して、その活性成分を、液体担体、微細に分割された固体の担体、又はそれらの両方と均質に十分に会合させ、次に必要に応じて製品を成形することによって製剤を調製できる。希望に応じて製剤を滅菌できるが、滅菌法が製剤に含まれるポリペプチドの有効性を妨害しないことが条件である。

本発明の組成物は、限定する趣旨なしに錠剤、カプセル剤、液状シロップ剤、軟ゲル剤、坐剤及び浣腸剤のような多くの考えられる剤形の任意のものに製剤化できる。本発明の組成物は、水性溶媒、非水性溶媒又は混合溶媒を用いた懸濁剤としても製剤化できる。水性懸濁剤は、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール及び／又はデキストランを含めた、懸濁液の粘度を上げる物質をさらに含有し得る。懸濁液は安定化剤を含むこともできる。

本明細書において提供する４−１ＢＢアゴニストを包装材と組み合わせて、ＤＮＴＣ及び／又は自己反応性Ｂ細胞を枯渇させ、疾患を治療又は予防するためのキットとして販売できる。製品を製造するための構成要素と方法は周知である。製品を上の節で述べた１つ又は複数の４−１ＢＢアゴニストと組み合わせる場合もある。さらに、その製品は例えばＤＮＴＣ及び／又は自己反応性Ｂ細胞の枯渇のための、又は枯渇をモニターするための緩衝液又は他の調節試薬を包含する場合もある。ＤＮＴＣの枯渇又は疾患の治療／予防にアゴニストがどのように有効であるかを記載した説明書をそのようなキットに入れることもできる。

以下の実施例で本発明をさらに記述するが、特許請求の範囲に記載した本発明の範囲を限定する趣旨はない。

材料と方法
マウス：Ｂ６．ＭＲＬ−Ｔｎｆｒｓｆ６^ｌｐｒ（Ｂ６／ｌｐｒ）マウス、ＭＲＬ／ＭｐＪ−Ｔｎｆｒｓｆ６^ｌｐｒ（ＭＲＬ／ｌｐｒ）マウス、及びＭＲＬ．１２９Ｐ２（Ｂ６）−Ｔｎｆｓｆ６^{ｔｍｌｑｓａ}（Ｆａｓ^−／−）マウスをＴｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（バー・ハーバー、メイン州）から購入した。Ｃ５７ＢＬ／６野生型（Ｂ６／ｗｔ）マウスを国立癌研究所（フレデリック、メリーランド州）から購入した。

抗体によるｉｎ ｖｉｖｏ処理：４−１ＢＢに対するアゴニスト・モノクローナル抗体（ｍＡｂ）である２Ａを以前に記載されたように作製した(Wilcoxら、上記)。ラットＩｇＧをＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（セントルイス、ミズーリ州）から購入し、対照抗体として使用した。２〜３カ月齢で開始し、２Ａ又はラットＩｇＧを２００μｇ／マウスの用量で週１回、３週間にわたりマウスに腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。

フローサイトメトリー分析：以下の抗体をＢＤ−ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ（サンディエゴ、カリフォルニア州）から購入した。Ｃｙ−Ｃｈｒｏｍｅ（商標）標識ＣＤ４（Ｈ１２９．１９）、Ｒ−フィコエリトリン（Ｒ−ＰＥ）結合抗マウスＣＤ８ａ（５３−６．７）、Ｒ−ＰＥ結合抗マウスＴｈｙ−１．２（５３−２．１）、フルオレセイン（ＦＩＴＣ）標識抗マウスＣＤ４５Ｒ／Ｂ２２０（ＲＡ３−６Ｂ２）、ＦＩＴＣ標識抗マウスＣＤ６９（Ｈ１．２Ｆ３）、Ｃｙ−Ｃｈｒｏｍｅ（商標）標識抗マウスＣＤ４４（ＩＭ７）Ｒ−ＰＥ結合抗マウスＣＤ６２Ｌ（ＭＥＬ−１４）、ＦＩＴＣ標識抗マウスＧｒ−１（ＲＢ６−８Ｃ５）及びビオチン標識抗マウスＣＤ１１ｂ（Ｍ１／７０）、並びにＦＩＴＣ標識抗マウスＩＦＮ−γ（ＸＭＧ１．２）。Ｒ−ＰＥ結合ストレプトアビジンをＩｍｍｕｎｏｔｅｃｈ（マルセイユ、フランス）から入手した。標準法に従って表示した抗体で細胞を二重又は三重染色し、ＦＡＣＳｃａｎ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、マウンテン・ヴュー、カリフォルニア州）でＣｅｌｌＱｕｅｓｔプログラムを使って分析した。アポトーシスを検出するために細胞を製造業者のプロトコールに従ってアネキシンＶ（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）で染色した。細胞内のＩＦＮ−γを染色するために、脾臓から得た単細胞懸濁液を２０μｇ／ｍｌのブレフェルジンＡの存在下で５０ｎｇ／ｍｌのＰＭＡと５００ｎｇ／ｍｌのイオノマイシンを使用して３７℃で４時間刺激した。ホルムアルデヒド（４％）で固定後に、細胞を透過性にするための０．５％サポニンの存在下で細胞内のＩＦＮ−γを染色し、続いて細胞表面マーカーを染色した。分析では、実験全体で全ての脾臓細胞を前方散乱対側方散乱でゲート設定し、場合によっては関連する図で指摘したようにＴ細胞サブセットをさらにゲート設定した。

ＥＬＩＳＡによる抗体の検出：血清試料を１カ月に１回採取しＥＬＩＳＡで自己抗体の存在を試験した。抗ＤＮＡ自己抗体のアイソタイプを以下のように試験した。すなわち１０^−２から始まる段階希釈した血清を、２５０μｇ／ｍｌのニシン***ＤＮＡ（Ｓｉｇｍａ）をコーティングしたＥＬＩＳＡプレート（Ｄｙｎｅｘ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、チャンティリー、バージニア州）に入れて室温で２時間インキュベートした。その後、ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体、ＩｇＧ１抗体、ＩｇＧ２ａ抗体、ＩｇＧ２ｂ抗体、及びＩｇＧ３抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、バーミンガム、アラバマ州）と結合したアルカリホスファターゼ（ＡＰ）をそのプレートに加えた。プレートをｐ−ニトロフェニルリン酸基質（Ｓｉｇｍａ）と共にインキュベートし、ＯＤ（４０５ｎｍ）を分光光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、サニーヴェール、カリフォルニア州）で測定した。総ＩｇＧの検出のためにヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、バーミンガム、アラバマ州）をＥＬＩＳＡプレートをコーティングするために使用した。別々の実験から得た実験値をｍｇ／ｍｌで表すか又は各アッセイで使用した単一のＭＲＬ−ｌｐｒ／ｌｐｒ陽性対照血清に対して正規化する（任意に１００Ｕと定義）。

肉眼による病状：皮膚の病状を１カ月に１回肉眼で評点した。脱毛及びか皮の形成から成る皮膚の損傷を損傷数と損傷面積に基づいて０から３に評点した（０：なし、１：１つで＜０．５ｃｍ、２：２つ以上で＜０．５ｃｍ、３：多数で＞０．５ｃｍ）。触知可能な結節の数からリンパ節症を１カ月に１回評価した。脾臓とリンパ節の腫脹を処理の２カ月後に評価した。

タンパク尿：尿中タンパク質レベルを尿検査紙（Ｌａｂｓｔｉｘ；Ｂａｙｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、エルクハート、インディアナ州）を用いて評価した。タンパク質レベルを半定量的にグレード決定した（０：なし、１：３０〜１００ｍｇ／ｄｌ、２：１００〜３００ｍｇ／ｄｌ、３：３００〜２０００ｍｇ／ｄｌ、４：＞２０００ｍｇ／ｄｌ）。日を続けて尿を採取し測定することで各月の値を決定した。

組織検査：腎臓組織及び皮膚組織を採取し直ちに１０％中性緩衝ホルマリン（Ｆｉｓｈｅｒ、ピッツバーグ、ペンシルヴェニア州）に浸漬した。ホルマリン固定した組織をパラフィン包埋し、４μｍの切片をヘマトキシリンとエオジンで染色して、光学顕微鏡で評価した。盲験化して腎臓試料を倍率２０×及び４０×で病理観察した。血管内膜炎、糸球体半月、リンパ組織過形成、ループ状病変の形成、及びメサンギウム細胞過形成の存在について病理評価した。腎臓１個あたり２００枚の糸球体横断切片（ｇｃｓ）を計数し、各糸球体を炎症なし、炎症の分節性発生、及び炎症の全節性発生と評点することによって糸球体を評価した。

免疫蛍光による腎臓におけるＩｇＧ及びＣ３の沈着の評価：腎臓をＯＣＴ化合物（Ｍｉｌｅｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ネーパーヴィル、イリノイ州）に包埋し、−７０℃で急速冷凍した。４μｍの切片を風乾し、アセトンで固定し、ヤギ血清で前処理し、ＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇＧ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、バーミンガム、アラバマ州）及び抗マウスＣ３ Ａｂ（ＩＣＮ／Ｃａｐｐｅｌ、オーロラ、オハイオ州）で染色した。蛍光をＵＶ−蛍光顕微鏡で観察した。

ＥＬＩＳＰＯＴによるＤＮＡ分泌Ｂ細胞の検出：脾臓細胞を連続５倍希釈したものを２５０μｇ／ｍｌのニシン***ＤＮＡ（Ｓｉｇｍａ）を予めコーティングした９６ウエルＥＬＩＳＡスポットプレート（Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、クリーブランド、オハイオ州）に３回の反復実験で入れた。３７℃で一晩インキュベート後に結合した抗ＤＮＡ性ＩｇＧをＡＰ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ）を加えて室温で３時間インキュベートすることで検出した。ニトロブルー・テトラゾリウム基質溶液（Ｓｉｇｍａ）で発色させた。

ＩＦＮ−γとＴＮＦの遮断：ＩＮＦ−γを遮断するために、ラットＩｇＧ又は（ラットハイブリドーマＸＭＧ１．２を接種したＲＡＧ−１ノックアウトマウスから採取した腹水から得た）抗ＩＦＮ−γ５００μｇを４日毎にマウスに腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。ＴＮＦを遮断するために、（Ｊｅｆｆ Ｂｒｏｗｎｉｎｇ、Ｂｉｏｇｅｎ、マサチューセッツ州の快い分与による）３００μｇのＴＮＦＲＩ−ｈＩｇを１週間に１回２週間にわたりマウスに腹腔内注射した。

ＩＦＮ−γ活性化マクロファージが誘導するＢ細胞のアポトーシスの検出：Ｂ６／ｌｐｒ脾臓細胞（５×１０^５／ウエル）を、種々の用量の組換えＩＦＮ−γ（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）の存在下で、腹腔マクロファージ（１：１）の存在下又は非存在下で培養した。脾臓細胞を種々の時点で回収し、アポトーシス途中のＢ細胞の割合を、ＰＥ−Ｔｈｙ１．２及びＣｙ−Ｃｈｒｏｍｅ−Ｂ２２０と組み合わせてＦＩＴＣ標識アネキシンＶを用いて染色することで決定した。

統計：群間差の統計的有意性を決定するためにＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定を使用した。対照及び抗４−１ＢＢで処理したＭＲＬ／ｌｐｒ雌マウスの生存をＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法で分析し、ログランク検定で有意差を決定した。

アゴニスト抗４−１ＢＢ ｍＡｂ（２Ａ）によるＢ６／ｌｐｒマウスの処理はＣＤ８ ^＋ Ｔ細胞を選択的に活性化するがＤＮＴＣ及びＢ細胞数を減少させる
Ｂ６／ｌｐｒマウスはＦａｓを生まれつき欠損し、生後まもなく自己反応性リンパ球の蓄積を特徴とするリンパ増殖性疾患を患う。活性化自己反応性リンパ球における４−１ＢＢシグナル伝達の役割を探るために、２〜３カ月齢のＢ６／ｌｐｒマウス及びＢ６／ｗｔマウスをアゴニスト抗４−１ＢＢ ｍＡｂ（２Ａ）又は対照ラットＩｇＧで処理した。マウスを１週間毎に３週間処理し、種々の時点で脾臓細胞をフローサイトメトリーで分析した。処理開始から３週間後までに、対照マウスと比べて２Ａ処理マウスの脾臓ではＣＤ８^＋Ｔ細胞の比率（％）は約３〜４倍に増加したが、ＣＤ４^＋Ｔ細胞の比率は同じままであった（図１ａ、左側）。さらに、ＣＤ４^＋Ｔ細胞数は２Ａ処理マウスでは減少したが、ＣＤ８^＋Ｔ細胞数は増加した。これらの変化は、ＣＤ４^＋Ｔ細胞サブセットではなく、ＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットにおけるＣＤ６９及びＣＤ４４活性化マーカーのアップレギュレーションと、ＣＤ６２Ｌのダウンレギュレーションに相関した（図１ａ、右側、及び図１ｂ）。これらの結果は、４−１ＢＢシグナル伝達がＦａｓシグナル伝達の非存在下でＣＤ８^＋Ｔ細胞を選択的に活性化することを示唆している。

２Ａ処理の２〜３週間後までに、脾臓ＤＮＴＣ及びＢ細胞の比率と数は劇的に減少した（図１ｃと図１ｄ）。減少した脾臓の細胞質はＢ細胞、ＤＮＴＣ及びＣＤ４^＋Ｔ細胞集団の有意な減少が原因であった。最終処理の１週間後に血清を採取し、抗ＤＮＡ性ＩｇＧレベルと総ＩｇＧレベルをＥＬＩＳＡで検出した。Ｂ細胞数の減少は抗ＤＮＡ性ＩｇＧ及び総ＩｇＧの生成の減少を伴っていた。これらのＩｇＧは野生型マウスで観察されたレベルまで減少した（図１ｅ）。さらに、Ｂ６／ｌｐｒ成体マウスで通常観察された自己抗体レベルの上昇は、２Ａ処理の終了後８週間で観察されなかった。ＤＮＴＣ及びＢ細胞の比率の有意な減少は、処理された動物のリンパ節、骨髄及び末梢血でも観察されたが、これらのリンパ球は種々の非リンパ組織では全く検出されなかった。

２Ａの投与はＭＲＬ／ｌｐｒマウスにおけるリンパ節症を大きく改善する
ＭＲＬ／ｌｐｒマウスは概してＢ６／ｌｐｒマウスよりも若齢で、より重症のリンパ増殖性疾患を示し、狼瘡様特徴を実際に発現する。９〜１０週齢のＭＲＬ／ｌｐｒマウスは一般に顕著な数の異常ＤＮＴＣを有し、これは血清中に高レベルの抗ＤＮＡ性ＩｇＧ自己抗体が存在することを実証している。２Ａが自己免疫疾患の治療において潜在的な治療効果を有するかどうかを試験するために、９〜１０週齢のＭＲＬ／ｌｐｒマウスを毎週２００μｇの２Ａ又は対照ラットＩｇＧで３週間にわたり処理した。対照マウスは全て徐々に重症のリンパ節症を発現したが、２Ａ処理群のマウスでは１０匹中わずか２匹だけが５カ月齢までに１〜２個の触知できる小さなリンパ節（ＬＮ）を形成した（図２ａ）。さらに、４カ月齢の２Ａ処理マウスは対照マウスよりもかなり小さな脾臓と末梢ＬＮを有していた（図２ｂ）。リンパ球数と総細胞数は２Ａ処理マウスの脾臓及び末梢リンパ節で有意に減少していた（図２ｃ）。最も急激に減少したのは、ＭＲＬ／ｌｐｒマウスにおけるリンパ節症の主要構成要素であるＤＮＴＣの数であった。これらの結果は、４−１ＢＢに対するアゴニストｍＡｂは活性化リンパ球を刺激し、それによりＦａｓに依存せずにＡＩＣＤを生じる可能性があることを示唆している。

２Ａ処理はＭＲＬ／ｌｐｒマウスにおける皮膚損傷の発生を防止する
ＭＲＬ／ｌｐｒマウスは概して進行性の自然発生皮膚疾患を発症し、５カ月齢までに事実上全てのＭＲＬ／ｌｐｒマウスは後頚部に大きな斑様皮膚損傷を有する。この皮膚疾患に対する２Ａの効果を評価するために、９〜１０週齢のＭＲＬ／ｌｐｒ雌マウスを１週間間隔で３回２Ａ又は対照ラットＩｇＧで処理した。２Ａ処理マウスのいずれにも皮膚損傷が検出されなかったように（図３）、２Ａによる処理は群全体での肉眼上の病理的な皮膚損傷を完全に防止した。対照マウスの皮膚の組織切片（後頚部）は顕著な表皮肥厚と皮膚への慢性炎症細胞の著明な浸潤を示した。２Ａ処理マウスの同様の切片は正常な構造と形態を示した。よって、２Ａ処理プロトコールはＭＲＬ／ｌｐｒマウスにおける皮膚狼瘡様損傷の治療に有効であった。

２Ａ処理はＭＲＬ／ｌｐｒマウスにおける腎疾患を軽減する
腎疾患は狼瘡を患う者の主要な死因とみなされている。２Ａ処理がＭＲＬ／ｌｐｒマウスの腎臓の機能に及ぼす作用を毎月のタンパク尿レベルを決定することで検討した。ＭＲＬ／ｌｐｒ雌マウスを上記のように２Ａ又は対照ＩｇＧで処理した。尿検査用の検査紙を用いて尿中タンパク質レベルを毎月評価し、実施例１で述べたように半定量的にグレード決定した。処理マウスではタンパク尿が有意に減少した（図４ａ）。５カ月齢で腎臓を採取しホルマリンで固定し、切片をヘマトキシリンとエオジンで染色した。糸球体腎炎について１群あたりマウス４匹から得た腎臓切片を評点し、炎症なし、炎症の分節性発生、又は炎症の全節性発生として結果を分類した。ラットＩｇＧで処理した対照マウスにおける腎臓の病状は、総糸球体の８０％以上に及ぶ重症のびまん性全節性増殖性糸球体腎炎を表出し、残りの糸球体の大部分は分節性糸球体腎炎を有していた（図４ｂ）。対照マウスの組織切片は、主にリンパ球及び形質細胞から成る炎症細胞の血管周囲への著しい浸潤、並びに毛細管内外での壊死性及び硬化性病変を大部分の糸球体に示した。これに対して、２Ａ処理マウスの腎臓切片は巣状増殖性糸球体腎炎を主に発現し、約４０％が分節性で４０％未満が全節性であった。２Ａ処理マウスの２０％を超える糸球体は完全に正常な外観であった。血管周囲に斑状浸潤を認めたが、対照マウスで観察されたよりもずっと程度は低かった（図４ｂ）。

自己抗体介在性の直接組織損傷と補体固定性の免疫複合体の沈着によって狼瘡モデルを特性決定した。腎臓での補体Ｃ３の沈着はループス腎炎における主要な病理所見である（Passwellら(1988)、J.Clin.Invest.82:1676〜1684）。２Ａ処理マウス及び対照マウスの腎臓をＦＩＴＣ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ又は補体Ｃ３で染色し、ＩｇＧ及び補体Ｃ３の沈着を調べた。これらの実験からＩｇＧの沈着と補体Ｃ３の沈着の両方が２Ａ処理マウスでは有意に減少したことを示した。

２Ａ処理は自己抗体産生を有意に減少させＭＲＬ／ｌｐｒマウスの生存期間を延長する
自己抗体がＳＬＥの顕著な特徴であることから（CohenとEisenberg(1991)、Annu.Rev.Immunol.9:243〜269;Hoffman(2001)、Front.Biosci.6:D1369〜1378）、ＭＲＬ／ｌｐｒマウスにおける自己抗体の産生に２Ａ処理が及ぼす作用を検討した。上記のようにマウスを２Ａ又は対照ラットＩｇＧで処理した。２カ月齢時の処理前と、次に処理の開始後毎月に、血清を採取し、ＥＬＩＳＡで総ＩｇＧレベルと自己抗体レベルを検出した。２Ａを用いた処理により抗ＤＮＡ性ＩｇＧ自己抗体レベルは有意に減少し（図５ａ）、それよりも程度は低いが総ＩｇＧ生成も減少した（図５ｂ）。ＭＲＬ／ｌｐｒマウスにおいて総ＩｇＧレベルに対する抗ＤＮＡ性ＩｇＧレベルの比率も減少した（図５ｃ）。ｌｐｒモデルではＩｇＧ２ａアイソタイプレベルの増加は疾患の発生と関連している（Jacobsonら(1997) Immunol.Rev.156:103〜110）。２Ａを用いた処理により、抗ＤＮＡ性のＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ１アイソタイプレベルは大きく低下したが（図５ｄと５ｅ）、ＩｇＧ２ｂ及びＩｇＧ３アイソタイプのレベルは低下しなかった。

重要なことに、２Ａ処理はＭＲＬ／ｌｐｒマウスの生存も有意に延長した（図５ｆ）。対照マウスの大部分は２４週までに死亡したが、２Ａ処理マウスは実験を終了したさらに２カ月後の時点まで健康を維持した。よって、これらのデータは４−１ＢＢに対するアゴニスト抗体が自然発生自己免疫疾患を治療し生存期間を延長するための強力な臨床薬剤となり得ることを示している。自然発生自己免疫疾患に対する免疫療法のプロトコールの臨床的妥当性を決定するために最も重要な基準は、十分に確立し臨床的に特定できる自己免疫疾患の進行をその治療が防止するか遅らせることができるかどうかである。この基準を試験するために１〜２個の触知できるＬＮと皮膚損傷を有する３カ月齢のＭＲＬ／ｌｐｒマウスを１週間の用量が２００μｇの２Ａ又は対照ラットＩｇＧで３週間処理した。２Ａ処理による治療方式では抗ＤＮＡ性ＩｇＧ自己抗体レベルが減少し、リンパ節症の進行が遅れた。これらの結果は、２Ａを用いた処理が臨床環境で潜在的な妥当性を有しうることを示唆している。

２Ａ処理はＦａｓ及びＴＮＦＲに依存しないアポトーシスメカニズムにより活性化Ｔ細胞及びＢ細胞の枯渇を誘導する
２Ａ処理後の二次リンパ器官におけるＤＮＴＣ及びＢ細胞数の減少を媒介するメカニズムを検討するために、これらの細胞の運命を評価してこれらの細胞が再分布又はアポトーシスを受けるかどうかを調べた。リンパ節、骨髄、及び末梢血におけるＤＮＴＣ及びＢ細胞の分析はそれぞれの組織で同様のパターンを示した。ＤＮＴＣ及びＢ細胞は種々の非リンパ組織では検出されなかった。これらの結果は、二次リンパ組織におけるリンパ球数の減少は２Ａ処理の結果としての枯渇が原因のようであることを示唆している。雌マウスを２００μｇの２Ａ又は対照ＩｇＧで処理した。処理の５〜７日後に、脾臓細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで０時間又は６時間培養してから、アネキシンＶと組み合わせた抗Ｔｈｙ−１及び抗Ｂ２２０を用いて染色した。２Ａ処理マウスではアポトーシス性ＤＮＴＣの比率の一貫した増加を検出した（図６ａ、左側、０時間）。細胞を６時間培養すると、２Ａ処理マウスの脾臓由来ＤＮＴＣは対照細胞に比べてアポトーシスの増加を示した（図６ａ、中央）。処理の２週間後に脾臓細胞を抗ＣＤ６９と組み合わせて抗Ｔｈｙ−１及び抗Ｂ２２０で染色した。ＣＤ６９陰性細胞と比べてＣＤ６９を発現しているＤＮＴＣは選択的に抹消された（図６ａ右側）。さらに、対照マウス（８±１．７％）に比べて２Ａ処理マウス（１５±３．７％）では処理の５日後にアポトーシス性Ｂ細胞の比率が約８０％増加したことがアネキシンＶによる染色で検出された。Ｂ６／ｌｐｒマウスを２Ａで処理した１週間後にＥＬＩＳＰＯＴアッセイ用に脾臓細胞を採取し、そのアッセイは抗ＤＮＡを分泌するＢ細胞数が２Ａ処理により大きく減少したことを示した（図６ｂ）。

Ｆａｓ及びＴＮＦＲを介したシグナル伝達はアポトーシスを誘導し得る。ｌｐｒマウスはＦａｓ抗原の弱い転写発現を有することから（Adachiら(1993)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:1756〜1760;SudaとNagata(1997)、J.Allergy Clin.Immunol.100:S97〜101）、強力な４−１ＢＢ共刺激シグナルはリンパ球表面でのＦａｓの発現を促進しアポトーシスを誘導すると考えられる。この可能性を試験するために、Ｆａｓ欠損マウスを２Ａで処理した。これらの実験はｌｐｒマウスで得られたものと同様の結果を与え、Ｂ細胞数とＤＮＴＣ数の両方が有意に減少した。ＴＮＦＲ−Ｉｇ（３００μｇ／マウス）を２Ａと共に毎週投与することによって、ＴＮＦの遮断も２Ａ処理ｌｐｒマウスにおけるＢ細胞数及びＤＮＴＣ数の枯渇に影響しないことが分かった。これらのデータは、２Ａ処理が誘導するリンパ球のアポトーシスがＦａｓ及びＴＮＦＲに依存しないことを示唆している。

２Ａ処理が仲介する自己反応性Ｂ細胞の減少はＩＦＮ−γに依存する
自己反応性Ｂ細胞の減少がＩＦＮ−γ依存性であるかどうかを評価するために、Ｂ６／ｌｐｒマウスを対照ＩｇＧ又は抗４−１ＢＢで処理した。その１週間後に、脾臓細胞をＴｈｙ−１．２で染色し、細胞内のＩＦＮ−γを染色してからフローサイトメトリーで分析した。２Ａ処理がＣＤ４^＋Ｔ細胞、ＣＤ８^＋Ｔ細胞及びＤＮＴＣを含めたＩＦＮ−γ産生細胞数を有意に増加させたことから、これらの実験はＩＦＮ−γが自己反応性Ｂ細胞数の減少に寄与している可能性があることを示した（図６ｃ）。さらに、処理後１週間には対照マウスよりも２Ａ処理ＭＲＬ／ｌｐｒマウスでずっと高いレベルのＩＦＮ−γが検出された。ＩＦＮ−γはマクロファージを活性化でき、そのマクロファージが次には活性化リンパ球を潜在的にアポトーシスに至らせ得ることから（Dingら(1988) J.Immunol.141:2407〜2412；Williamsら(1998) J.Immunol.161:6526〜6531;Haendelerら(1999) Vitam.Horm.57:49〜77）、２Ａ処理がＣＤ１１ｂ^＋Ｇｒ−１^＋マクロファージ／顆粒球数に及ぼす作用をＢ６／ｌｐｒマウスで検討した。２Ａ処理後の脾臓においてこれらの細胞の比率及び数に有意な増加を観察した（図６ｄ）。

Ｂ細胞の枯渇がＩＦＮ−γ依存性であるかどうかを試験するために、２Ａと共に抗ＩＦＮ−γでマウスを処理した。この組合せ処理は、Ｂ６／ｌｐｒマウスを２Ａ単独で処理する作用を逆転し、マクロファージ／顆粒球の増殖が減少しＢ細胞の比率が増加した。抗ＩＦＮ−γ処理単独では作用を認めなかった。この結果は、２Ａ処理による自己反応性Ｂ細胞の枯渇はＩＦＮ−γに依存することを示唆した。この知見によると、この組合せ処理は、ＭＲＬ／ｌｐｒマウスを２Ａ単独で処理したときに最初に観察された抗ＤＮＡ性ＩｇＧ自己抗体レベルの減少も逆転した（図６ｅ）。２Ａ処理を抗ＧＲ−１投与と組み合わせると、Ｂ細胞数の有意に劇的な減少を伴うＣＤ１１ｂ^＋ＧＲ−１^＋細胞のより大きな増殖が観察された。これらの結果は、Ｂ細胞の枯渇の媒介にＣＤ１１ｂ^＋ＧＲ−１^＋細胞が役割を果たしていること意味している。この仮説を直接試験するために、Ｂ細胞のアポトーシスがＩＦＮ−γ活性化マクロファージにより誘導されることを確認するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ実験を行った。多様な用量のＩＦＮ−γの非存在下又は存在下で、腹腔マクロファージの存在下又は非存在下でＢ６／ｌｐｒマウスの脾臓細胞を培養した。１８時間及び４０時間に脾臓細胞を回収し、ＦＩＴＣ標識アネキシンＶ及び細胞表面マーカーで染色することによりアポトーシスを検出した。これらの実験はＩＦＮ−γの存在下でマクロファージがＢ細胞のアポトーシスを大きく促進することを実証した（表１）。しかし、マクロファージの非存在下では、ＩＦＮ−γ単独で用量を増加させてもＢ細胞のアポトーシスは増強しなかった。

他の実施形態
本発明の詳細な説明と共に本発明を記述したが、上の記述は例示することを意図し、本発明の範囲を限定する趣旨はないことを理解されたい。本発明の範囲は添付する特許請求の範囲により定義されている。他の態様、利点及び変更は以下の特許請求の範囲内に属する。

図１ａは、アゴニスト抗４−１ＢＢ抗体（２Ａ）又はラットＩｇＧ対照で処理されたＢ６／ｌｐｒマウス由来の脾臓細胞のフローサイトメトリーによって作成した散布図である。 図１ｂは、アゴニスト抗４−１ＢＢ抗体（２Ａ）又はラットＩｇＧ対照で処理されたＢ６／ｌｐｒマウス由来の脾臓細胞のフローサイトメトリーによって作成した散布図である。 図１ｃは、アゴニスト抗４−１ＢＢ抗体（２Ａ）又はラットＩｇＧ対照で処理されたＢ６／ｌｐｒマウス由来の脾臓細胞のフローサイトメトリーによって作成した散布図である。 図１ｄは最初の処理後３週間の脾臓細胞、Ｔ細胞サブセット、Ｂ細胞及びＤＮＴＣの総細胞数を示すグラフである。 図１ｅは表示のように２Ａ又はＩｇＧ対照で処理されたマウスの血清中の総ＩｇＧレベル及び抗ＤＮＡ性ＩｇＧレベルを示すドットプロットである。 図２ａは対照（白丸）及び２Ａ処理（黒丸）のＭＲＬ／ｌｐｒマウス（ｎ＝１０）における触知できる末梢リンパ節（ｐＬＮ）の数を示すグラフである。 図２ｂは、２Ａ処理マウス（黒棒線）における脾臓、プールした末梢リンパ節（ｐＬＮ；鼠径、腋窩及び頚部リンパ節を含む）及び腸間膜リンパ節（ｍＬＮ）の重量を対照群（白棒線）と比較したグラフである。 図２ｃは４カ月齢の対照マウス（白棒線）及び２Ａ処理マウス（黒棒線）（ｎ＝３）の脾臓及び鼠径ＬＮにおける種々の細胞サブセットの細胞数を示すグラフである。 ラットＩｇＧ対照（白棒線）又は２Ａ（黒棒線）で処理したＭＲＬ／ｌｐｒマウスにおける皮膚損傷のグレードを示すグラフである。 図４ａは、２Ａ（黒丸）又はラットＩｇＧ（白丸）で処理したＭＲＬ／ｌｐｒマウスにおける尿中タンパク質レベルを示すグラフである。 図４ｂは、表示のように２Ａ又は対照ＩｇＧで処理したマウスの腎臓における炎症の量とカテゴリーを示すグラフである。 図５ａは、２Ａ（黒丸）又は対照ＩｇＧ（白丸）で処理したＭＲＬ／ｌｐｒマウスにおける抗ＤＮＡ性ＩｇＧ及び総ＩｇＧのレベルをそれぞれ示すグラフである。 図５ｂは、２Ａ（黒丸）又は対照ＩｇＧ（白丸）で処理したＭＲＬ／ｌｐｒマウスにおける抗ＤＮＡ性ＩｇＧ及び総ＩｇＧのレベルをそれぞれ示すグラフである。 図５ｃはマウスにおける総ＩｇＧに対する抗ＤＮＡ性ＩｇＧの比を示すグラフである。 図５ｄは、抗ＤＮＡ性ＩｇＧ２ａ及び抗ＤＮＡ性ＩｇＧ１のレベルをそれぞれプロットしたグラフである。 図５ｅは、抗ＤＮＡ性ＩｇＧ２ａ及び抗ＤＮＡ性ＩｇＧ１のレベルをそれぞれプロットしたグラフである。 図５ｆは、処理マウス及び未処理の対照マウスの生存を示すグラフである。 図６ａは２Ａ又は対照ＩｇＧと共に０時間（左側）又は６時間（中央）にわたりｉｎ ｖｉｔｒｏで培養したＴｈｙ−１^＋Ｂ２２０^＋脾臓細胞におけるアポトーシスのレベルを示す一連のヒストグラムである。 図６ｂは２Ａで処理した１週間後のＢ６／ｌｐｒマウス由来の脾臓の抗ＤＮＡ分泌Ｂ細胞（脾臓）数を示すグラフである。 図６ｃは、２Ａ又は対照ＩｇＧで処理したＢ６／ｌｐｒマウス由来のＴ細胞におけるＩＦＮ−γ産生レベルを示す図であり、フローサイトメトリーにより作成した散布図を含む。 図６ｄは、フローサイトメトリーにより作成した一連の散布図であり、２Ａ又はＩｇＧで処理したＢ６／ｌｐｒマウスにおけるＣＤ１１ｂ^＋ＧＲ−１^＋細胞数を示している。 図６ｅは、２Ａ及び／又は抗ＩＦＮ−γで処理されたＭＲＬ／ｌｐｒマウス（ｎ＝３）の血清中の抗ＤＮＡ性ＩｇＧレベルを示すグラフである。

Claims (36)

1. 被験体においてダブルネガティブＴ細胞を枯渇させる方法であって、
   （ａ）自己免疫疾患、リンパ増殖性疾患又はアレルギーを患う又はそのリスクのある被験体を特定するステップ、
   （ｂ）該被験体に有効量の４−１ＢＢアゴニストを投与するステップ、
   を含む、上記方法。
2. 前記被験体がヒトである、請求項１に記載の方法。
3. 前記被験体において自己反応性Ｂ細胞を枯渇させるステップをさらに含み、前記４−１ＢＢアゴニストが前記自己反応性Ｂ細胞を枯渇させるのに有効である、請求項１に記載の方法。
4. 前記４−１ＢＢアゴニストが４−１ＢＢと結合する抗体である、請求項１に記載の方法。
5. 前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項４に記載の方法。
6. 前記抗体が２Ａである、請求項４に記載の方法。
7. 前記被験体にインターフェロンγを投与するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
8. 前記被験体にＧｒ−１結合物質を投与するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
9. 前記Ｇｒ−１結合物質がＧｒ−１と結合する抗体である、請求項８に記載の方法。
10. 前記自己免疫疾患又は前記リンパ増殖性疾患が全身性エリテマトーデスである、請求項１に記載の方法。
11. 前記自己免疫疾患がインスリン依存性糖尿病である、請求項１に記載の方法。
12. 前記自己免疫疾患又は前記リンパ増殖性疾患が、炎症性腸疾患、セリアック病、自己免疫性甲状腺疾患、シェーグレン症候群、自己免疫性胃炎、悪性貧血、自己免疫性肝炎、皮膚自己免疫疾患、自己免疫性拡張型心筋症、心筋炎、重症筋無力症、脈管炎、筋自己免疫疾患、精巣自己免疫疾患、卵巣自己免疫疾患、及び眼自己免疫疾患からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
13. 前記アレルギーが、花粉抗原、真菌抗原、昆虫抗原、細菌抗原、哺乳動物抗原、又は昆虫毒液抗原に対するものである、請求項１に記載の方法。
14. 前記４−１ＢＢ結合物質が４−１ＢＢリガンド又はその断片である、請求項１に記載の方法。
15. 前記投与ステップが前記４−１ＢＢアゴニストをコードするポリヌクレオチドを含む核酸を前記被験体に送達するステップを含み、前記ポリヌクレオチドが転写調節因子と機能的に連結されている、請求項１に記載の方法。
16. 前記投与するステップが、
    （ｉ）前記被験体由来の細胞を用意するステップ、
    （ｉｉ）前記細胞又は前記細胞の子孫に、前記４−１ＢＢアゴニストをコードするポリヌクレオチドを含む核酸をトランスフェクト又は形質導入するステップであって、前記ポリヌクレオチドは転写調節因子と機能的に連結されている、上記ステップ、及び
    （ｉｉｉ）前記トランスフェクト若しくは形質導入細胞、又は前記トランスフェクト若しくは形質導入細胞の子孫を前記被験体に投与するステップ、
    を含む、請求項１に記載の方法。
17. （ｃ）前記自己免疫疾患、リンパ増殖性疾患又はアレルギーの症状について前記被験体をモニターするステップ、
    をさらに含む、請求項１に記載の方法。
18. ダブルネガティブＴ細胞の死滅を誘導する方法であって、前記ダブルネガティブＴ細胞と有効量の４−１ＢＢアゴニストを接触させるステップを含む、上記方法。
19. 前記４−１ＢＢアゴニストが４−１ＢＢと結合する抗体である、請求項１８に記載の方法。
20. 前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１９に記載の方法。
21. 前記抗体が２Ａである、請求項１９に記載の方法。
22. 前記４−１ＢＢアゴニストが４−１ＢＢリガンド又はその断片である、請求項１８に記載の方法。
23. 自己反応性Ｂ細胞の死滅を誘導するステップをさらに含み、前記自己反応性Ｂ細胞を前記有効量の前記４−１ＢＢアゴニストと接触させる、請求項１８に記載の方法。
24. 前記ダブルネガティブＴ細胞がｉｎ ｖｉｔｒｏに存在する、請求項１８に記載の方法。
25. 前記ダブルネガティブＴ細胞が被験体中にある、請求項１８に記載の方法。
26. 前記被験体がヒトである、請求項２５に記載の方法。
27. 前記被験体が自己免疫疾患、リンパ増殖性疾患又はアレルギーを患うか又はそのリスクがある、請求項２５に記載の方法。
28. 前記自己免疫疾患又は前記リンパ増殖性疾患が全身性エリテマトーデスである、請求項２７に記載の方法。
29. 前記自己免疫疾患がインスリン依存性糖尿病である、請求項２７に記載の方法。
30. 前記自己免疫疾患又は前記リンパ増殖性疾患が、炎症性腸疾患、セリアック病、自己免疫性甲状腺疾患、シェーグレン症候群、自己免疫性胃炎、悪性貧血、自己免疫性肝炎、皮膚自己免疫疾患、自己免疫性拡張型心筋症、心筋炎、重症筋無力症、脈管炎、筋自己免疫疾患、精巣自己免疫疾患、卵巣自己免疫疾患、及び眼自己免疫疾患からなる群より選択される、請求項２７に記載の方法。
31. 前記アレルギーが、花粉抗原、真菌抗原、昆虫抗原、細菌アレルゲン、哺乳動物抗原、又は昆虫毒液抗原に対するものである、請求項２７に記載の方法。
32. 前記接触ステップが前記被験体に前記４−１ＢＢアゴニストを投与するステップを含む、請求項２５に記載の方法。
33. 前記接触ステップが前記４−１ＢＢアゴニストをコードするポリヌクレオチドを含む核酸を前記被験体に投与するステップを含み、前記ポリヌクレオチドは転写調節因子と機能的に連結されている、請求項２５に記載の方法。
34. 前記接触ステップが、
    （ａ）前記被験体由来の細胞を用意するステップ、
    （ｂ）前記細胞又は前記細胞の子孫細胞に、前記４−１ＢＢアゴニストをコードするポリヌクレオチドを含む核酸をトランスフェクト又は形質導入するステップであって、前記ポリヌクレオチドは転写調節因子と機能的に連結されている、上記ステップ、及び
    （ｃ）前記トランスフェクト若しくは形質導入細胞、又は前記トランスフェクト若しくは形質導入細胞の子孫を前記被験体に投与するステップ、
    を含む、請求項２５に記載の方法。
35. 自己免疫疾患、リンパ増殖性疾患又はアレルギーを治療又は予防するための医薬を調製するための４−１ＢＢアゴニストの使用であって、前記４−１ＢＢアゴニストがダブルネガティブＴ細胞の死滅を誘導することに有効である、上記使用。
36. 前記４−１ＢＢアゴニストが自己反応性Ｂ細胞の死滅を誘導することにもまた有効である、請求項３５に記載の使用。

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