CN101451145A - 基于t细胞表位的结核基因疫苗及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了基于T细胞表位的结核基因疫苗，在载体中***嵌合有来自结核杆菌抗原的4个T细胞表位多肽基因的结核杆菌热休克蛋白的全长基因。本发明还公开了疫苗的制备方法，是在HSP65全长基因中***4个来自结核杆菌抗原中的T细胞表位基因EAST－6_189－228、Ag85A_369－405、CFP10_162－207和Ag85B_420－459。本发明还公开了ECANS结核基因疫苗的应用。通过将本发明的基因疫苗肌肉注射免疫小鼠，证实可诱导针对多个结核抗原的特异性抗体应答，能诱导较强的结核特异性杀伤应答，同时可诱导Th1型免疫应答，分泌高水平IFNγ，是一种优良的预防和治疗结核病的疫苗。

Description

基于T细胞表位的结核基因疫苗及其制备方法和应用

技术领域：

本发明属于生物基因工程领域，尤其涉及一种结核病的疫苗及其制备方法和应用，特别是基于T细胞表位的结核基因疫苗及其制备方法和应用。

背景技术：

结核病的死灰复燃是全球重大的健康问题，由于常规BCG疫苗的无效性、结核耐药菌株的出现、以及AIDS病导致的结核感染，结核发病及死亡目前非常严重，全球每年有800万活动性结核患者并导致300万死亡；我国约有5.5亿人口曾经感染结核，每年13万人死于结核，每月约有12万新发病人。2006年结核已一跃成为我国感染性疾病发病的首位，研制新型结核预防疫苗非常迫切。

结核研究表明，诱导Th1型的细胞免疫应答对于清除巨噬细胞感染结核杆菌至关重要，诱导CD4+Th1、CD8+CTL的产生及其分泌的高水平的IFNγ可有效保护动物抵抗结核杆菌攻击。基因疫苗及DNA疫苗，是将外源目的基因构建于真核表达质粒、直接注射动物的第三代疫苗，由于可在体内表达目的抗原，通过外源性、内源性以及交叉抗原提呈途径被DC细胞提呈，有效激活CD4+Th1和CD8+T细胞，因此特别有利于诱导Th1型免疫应答。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种基于T细胞表位的结核基因疫苗及其制备方法和应用，所述的这种基于T细胞表位的结核基因疫苗要解决由于常规BCG疫苗的无效性、以及结核耐药菌株的出现和AIDS病导致的结核感染使得现有技术中的疫苗预防和治疗结核病的效果不佳的技术问题。

本发明提供了一种基于T细胞表位的结核基因疫苗，由一个载体构成，在所述的载体中***有结核杆菌热休克蛋白的全长基因，所述的结核杆菌热休克蛋白HSP65的全长基因中嵌合有来自结核杆菌抗原的4个T细胞表位多肽基因，所述的4个T细胞表位分别是结核杆菌ESAT-6蛋白的189～228位基因，结核杆菌Ag85A蛋白的369～405位基因，结核杆菌CFP-10蛋白的162～207位基因，结核杆菌Ag85B蛋白的420～459位基因。

进一步的，所述的载体为真核表达质粒，所述的真核表达质粒选自pcDNA3.1质粒、或pVAX1质粒。

进一步的，所述的结核杆菌的热休克蛋白HSP65的氨基酸序列SEQ ID如NO：1所示。

进一步的，所述的结核杆菌的热休克蛋白HSP65基因的DNA序列如SEQ ID NO：2所示。

进一步的，所述的结核杆菌ESAT-6蛋白的189～228位基因的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。

进一步的，所述的结核杆菌ESAT-6蛋白的189～228位基因的DNA序列如SEQ ID NO：4所示。

进一步的，所述的结核杆菌Ag85A蛋白的369～405位基因的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示。

进一步的，所述的结核杆菌Ag85A蛋白的369～405位基因的DNA序列如SEQ ID NO：6所示。

进一步的，所述的结核杆菌CFP-10蛋白的162～207位基因的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示。

进一步的，所述的结核杆菌CFP-10蛋白的162～207位基因的DNA序列如SEQ ID NO：8所示。

进一步的，所述的结核杆菌Ag85B蛋白的420～459位基因的氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示。

进一步的，所述的结核杆菌Ag85B蛋白的420～459位基因的DNA序列如SEQ ID NO：10所示。

进一步的，在结核杆菌的热休克蛋白HSP65全长基因中的第438位碱基后***结核杆菌ESAT-6蛋白的189～228位基因、第486位碱基后***结核杆菌Ag85A蛋白的369～405位基因、第1185位碱基后***结核杆菌CFP-10蛋白的162～207位基因和结核杆菌Ag85B蛋白的420～459位基因。

进一步的，所述的结核杆菌CFP-10蛋白的162～207位基因和所述的结核杆菌Ag85B蛋白的420～459位基因之间以gccgcctac基因序列相连接。

进一步的，嵌合了结核杆菌4个T细胞表位基因的结核杆菌热休克蛋白HSP65的全长基因所构成的外源目的基因蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：11所示。

进一步的，嵌合了结核杆菌4个T细胞表位基因的结核杆菌热休克蛋白HSP65的全长基因所构成的外源目的基因的DNA序列如SEQID NO：12所示。

本发明还提供了上述的基于T细胞表位的结核基因疫苗的制备方法，包括以下步骤：

1)提取结核分枝杆菌DNA作为模板，通过PCR方法扩增结核杆菌热休克蛋白HSP65编码基因；

2)以结核杆菌热休克蛋白HSP65基因作为模板，分别通过PCR扩增带彼此有17个碱基重叠的双链DNA片段1、片段2、片段3，所述片段1的双链DNA的序列为：

atggccaaga caattgcgta cgacgaagag gcccgtcgcg gcctcgagcg gggcttgaac

taccggttct gttaacgcat gctgcttctc cgggcagcgc cggagctcgc cccgaacttg

gccctcgccg atgcggtaaa ggtgacattg ggccccaagg gccgcaacgt cgtcctggaa

cgggagcggc tacgccattt ccactgtaac ccggggttcc cggcgttgca gcaggacctt

aagaagtggg gtgcccccac gatcaccaac gatggtgtgt ccatcgccaa ggagatcgag

ttcttcaccc cacgggggtg ctagtggttg ctaccacaca ggtagcggtt cctctagctc

ctggaggatc cgtacgagaa gatcggcgcc gagctggtca aagaggtagc caagaagacc

gacctcctag gcatgctctt ctagccgcgg ctcgaccagt ttctccatcg gttcttctgg

gatgacgtcg ccggtgacgg caccacgacg gccaccgtgc tggcccaggc gttggttcgc

ctactgcagc ggccactgcc gtggtgctgc cggtggcacg accgggtccg caaccaagcg

gagggcctgc gcaacgtcgc ggccggcgcc aacccgctcg gtctcaaacg cggcatcgaa

ctcccggacg cgttgcagcg ccggccgcgg ttgggcgagc cagagtttgc gccgtagctt

aaggccgtgg agaaggtcac cgagaccctg ctcaagggcg ccaaggaggt cgagaccaag

ttccggcacc tcttccagtg gctctgggac gagttcccgc ggttcctcca gctctggttc

gagcagattg cggccaccga gctgaacaac gcgctgcaga acctggcgcg gacgatcgca

ctcgtctaac gccggtggct cgacttgttg cgcgacgtct tggaccgcgc ctgctagcgt

gcgatttcgg cgggtgacca gtccatcg

cgctaaagcc gcccactggt caggtagc

所述的片段2的双链DNA的序列为

            gggtgacca gtccatcggt gacctgatcg ccgagggtct ttcgatggct

            cccactggt caggtagcca ctggactagc ggctcccaga aagctaccga

gcttcttcgg cgctgacgct ggcgatggac aaggtgggca acgagggcgt catcaccgtc

cgaagaagcc gcgactgcga ccgctacctg ggccacccgt tgctcccgca gtagtggcag

gaggagtcca acacctttgg gctgcagctc gagctcaccg agggtatgcg gttcgacaag

ctcctcaggt tgtggaaacc cgacgtcgag ctcgagtggc tcccatacgc caagctgttc

ggctacatct cggggtactt cgtgaccgac ccggagcgtc aggaggcggt cctggaggac

ccgatgtaga gccccatgaa gcactggctg ggcctcgcag tcctccgcca ggacctcctg

ccctacatcc tgctggtcag ctccaaggtg tccactgtca aggatctgct gccgctgctc

gggstgtagg acgaccagtc gaggttccac aggtgacagt tcctagacga cggcgacgag

gagaaggtca tcggagccgg taagccgctg ctgatcatcg ccgaggacgt cgagggcgag

ctcttccagt agcctcggcc attcggcgac gactagtagc ggctcctgca gctcccgctc

gcgctgtcca ccctggtcgt caacaagatc cgcggcacct tcaagtcggt ggcggtcaag

cgcgacaggt gggaccagca gttgttctag gcgccgtgga agttcagcca ccgccagttc

gctcccggct tcggcgaccg ccgcaaggcg atgctgcagg atatggccat tctcaccggt

cgagggccga agccgctggc ggcgttccgc tacgacgtcc tataccggta agagtggcca

ggtcaggtga tcagcgaaga ggtcggcctg acgctggaga acgccgacct gtcgctgcta

ccagtccact agtcgcttct ccagccggac tgcgacctct tgcggctgga cagcgacgat

ggcaaggccc gcaaggtcgt ggtcaccaag gacgagacca ccatcgtcga gggcgccggt

ccgttccggg cgyyccagca ccagtggttc ctgctctggt ggtagcagct cccgcggcca

gacaccgacg ccatcgccgg acgagtggcc cagatccgcc aggagatcga gaacagcgac

ctgtggctgc ggtagcggcc tgctcaccgg gtctaggcgg tcctctagct cttgtcgctg

tccgactacg accgtgagaa gctgcaggag cggctggcca agctggccgg tggtgtcgcg

aggctgatgc tggcactctt cgacgtcctc gccgaccggt tcgaccggcc accacagcgc

gtgatcaagg ccggtgccgc caccgaggtc gaactcaagg agcgcaagca ccgcatcgag

cactagttcc ggccacggcg ggcgttccgc cttgagttcc tcgcgttcgt ggcgtagctc

gtggtgcgct tccaagaagc agccaataag cagaagcagg aactcgccgc ctacc

caccacgcga aggttcttcg tcggttattc gtcttcgtcc ttgagcggcg gatgg

所述的片段3的双链DNA的序列为

                                         gg aactcgccgc ctaccagcag

                                         cc ttgagcggcg gatggtcgtc

ttcatctacg ccggctcgct gtcggccctg ctggatgcgg ttcgcaatgc caaggccgcc

aagtagatgc ggccgagcga cagccgggac gacctacgcc aagcgttacg gttccggcgg

gtcgaggagg gcatcgtcgc cggtgggggt gtgacgctgt tgcaagcggc cccgaccctg

cagctcctcc cgtagcagcg gccaccccca cactgcgaca acgttcgccg gggctgggac

gacgagctga agctcgaagg cgacgaggcg accggcgcca acatcgtgaa ggtggcgctg

ctgctcgact tcgagcttcc gctgctccgc tggccgcggt tgtagcactt ccaccgcgac

gaggccccgc tgaagcagat cgccttcaac tccgggctgg agccgggcgt ggtggccgag

caccggggcg acttcgtcta gcggaagttg aggcccgacc tcggcccgca ccaccggcgc

aaggtgcgca acctgccggc tggccacgga ctgaacgctc agaccggtgt ctacgaggat

ttccacgcgt tggacggccg accggtgcct gacttgcgag tctggccaca gatgctccta

ctgctcgctg ccggcgttgc tgacccggtc aaggtgaccc gttcggcgct gcagaatgcg

gacgagcgac ggccgcaacg actgggccag ttccactggg cagccgcga cgtcttacgc

gcgtccatcg cggggctgtt cctgaccacc gaggccgtcg ttgccgacaa gccggaaaag

cgcaggtagc gccccgacaa ggactggtgg ctccggcagc aacggctgtt cggccttttc

gagaaggctt ccgttcccgg tggcggcgac atgggtggca tggatttc

ctcttccgaa ccgaagggcc accgccgctg tacccaccgt acctaaag；

3)将上述的3个片段混合，变性成为单链，通过彼此重叠的17个碱基互补连接，作为模板，通过PCR方法扩增获得嵌合了4个T细胞表位的结核杆菌热休克蛋白HSP65外源目的基因，将目的基因经双酶切后与经同样双酶切的载体连接，获得权利要求1所述的基于T细胞表位的结核基因疫苗。

具体的，是将上述的片段1和片段2混合，热变性使各自成为单链DNA，由于片段1、2有17个碱基的重叠DNA序列，因此可互补成为双链，再通过PCR法可扩增获得片段(1+2)的片段，再与片段3混合，热变性成为单链，由于片段2和片段3也有17个碱基的重叠DNA序列，因此可互补成为双链，经PCR可扩增获得片段(1+2+3)，即嵌合了4个T细胞表位的结核杆菌热休克蛋白HSP65外源目的基因。

进一步的，以SEQ ID NO：13所示的HSP65上游引物和SEQ IDNO：15所示的引物HSP65 T1序列通过PCR扩增片段1。

进一步的，以SEQ ID NO：16所示的引物HSP65 T2序列和SEQID NO：17所示的引物HSP65 E1序列通过PCR扩增片段2。

进一步的，以SEQ ID NO：18所示的引物HSP65 E2序列和SEQID NO：14所示的HSP65下游引物序列通过PCR扩增片段3。

进一步的，用SEQ ID NO：13所示的HSP65上游引物和SEQ IDNO：14所示的下游引物以片段1、2、3混合、变性、彼此互补连接后的基因为模板，通过PCR方法扩增结核杆菌热休克蛋白HSP65编码基因和嵌合了4个T细胞表位的结核杆菌热休克蛋白HSP65外源目的基因；

进一步的，嵌合了4个T细胞表位的HSP65外源目的基因和***载体的酶切位点分别为EcoRI和Hind III位点。

进一步的，所有抗原来自结核分枝杆菌H37Rv株。

进一步的，所述的载体选自pcDNA3.1质粒、或pVAX1质粒。

本发明还提供了一种药物组合物，含有有效量的上述的基于T细胞表位的结核基因疫苗。进一步的，还含有药学上可接受的载体或者赋形剂。

本发明还提供了上述的基于T细胞表位的结核基因疫苗在制备治疗和预防结核病的药物中的应用。

本发明通过DNA预测软件，从结核分枝杆菌的已知的4种关键抗原Ag85A、Ag85B、ESAT-6和CFP-10中各自筛选了一个T细胞表位，共4个T细胞表位，拟构建含有4个T细胞表位的结核基因疫苗。由于表位的氨基酸序列仅有8—20个，结构太小和简单，免疫原性很弱，通常不能诱导很强的免疫应答。因此拟挑选一种载体基因，将4个T细胞表位***载体基因中，共同构成结核外源目的基因。

本发明选择结核杆菌来源的热休克蛋白65(HSP65)作为嵌入T细胞表位的基因载体。HSP65是热休克蛋白60家族成员，在细菌到人体细胞有很高的同源性。全长1623bp，编码540个氨基酸，分子量65kD。选择结核杆菌来源HSP65作为嵌入T细胞表位的基因载体的原因有两点：1、HSP内含有多个结核T细胞和B细胞表位，本身就是重要的免疫保护性抗原，已证实HSP65作为目的抗原免疫小鼠可产生抗结核强保护性免疫应答，且与产生IFN-γ的CD8⁺/CD44^hi细胞有关。2、HSP作为细胞内伴侣蛋白，参与蛋白质转位、折叠和装配，可帮助嵌入的表位更好地折叠形成空间结构。

本发明选择的4个T细胞表位来自以下4种结核抗原：

1)Ag85A，295氨基酸。结核菌的培养滤液中分泌蛋白的一个主要成分是Ag85复合体(antigen 85 complex)，由Ag85A、Ag85B、Ag85C组成的相对分子质量为38000蛋白家族。Ag85A可刺激机体产生体液免疫，也可激发Th1型细胞免疫，诱导CD8⁺T细胞增殖和IL-2及IFN-γ等上升。

2)Ag85B，蛋白质全长285氨基酸，分子量34.6KD。又称MPT59、Rv1886，是一种分枝杆菌转移酶，与细菌细胞壁合成有关，具有多个T细胞表位，能诱导Th1反应、IFN-γ的产生。

3)ESAT-6，又称Rv3875，全长288bp，95个氨基酸，分子量9.9KD，仅在强毒株中有这种抗原。含有多个T细胞表位，能激活CD4⁺、CD8⁺T细胞，在抗结核保护性免疫应答中起重要作用。ESAT-6还可刺激Mtb病人的外周血T细胞增殖，促进IFN-γ释放。用ESAT-6和佐剂制成的亚单位疫苗免疫小鼠具有较好的保护性。

4)CFP-10，低分子量结核杆菌培养滤液蛋白，全长303bp，100个氨基酸，分子量10000，与结核分枝杆菌毒力有关，刺激机体产生强烈的T细胞免疫应答并释放高水平的IFN-γ。

BCG传代过程中ESAT-6和CFP-10基因丢失，而在绝大多数毒株中这两个基因都存在。

本发明通过BLAST网络数据库比对、DNAstar生物软件分析以及亲疏水性、柔软性、抗原指数、表面可及性等参数的分析，选择各类参数均较好的结构区域作为候选疫苗表位区段；然后通过网络数据库(http://www.syfpeithi.com/scripts/MHCServer.dll/home.htm)分析预测这些区段中存在的T细胞抗原表位、同时与HLAI、II类分子可高亲和力结合的表位。经过计算机分子预测最后获得的4个T细胞表位分别是：结核杆菌ESAT-6蛋白的189～228位基因(EAST-6_189-228)；结核杆菌Ag85A蛋白的369～405位基因(Ag85A_369-405)；结核杆菌CFP-10蛋白的162～207位基因(CFP10_162-207)；结核杆菌Ag85B蛋白的420～459位基因(Ag85B_420-459)。分别***到HSP65基因的第438位碱基、第486位碱基、第1185位碱基后，构建ECANS结核基因疫苗。

本发明在pcDNA3.1或pVAX1质粒中，***一段结核外源目的基因，作为新型结核基因疫苗，该结核外源目的基因由4个结核T细胞表位嵌合到结核HSP65蛋白的3个非关键结构位置所共同构成，经分析，4个表位的嵌入不会影响HSP65本身的正常三级、四级空间结构，因此将这一嵌合有4个T细胞表位的HSP65基因的结核基因疫苗称为ECANS(Epitope Cast in A Natural Structure，ECANS)“在蛋白天然结构中嵌合表位的”结核基因疫苗。

本发明中，所述的真核表达质粒的载体，包括任何可以转染哺乳动物细胞的高效真核表达质粒载体，包括但不限于：pcDNA3.1、pVAX以及常见和市售的真核质粒载体。

本发明中，HSP65蛋白编码基因和4个T细胞表位的获得，可以通过多种方式获得，包括但不限于：1)化学合成DNA；2)通过适当引物以PCR技术扩增得到DNA。

本发明中，将ECANS基因疫苗注射小鼠的方法采用肌肉注射方式，以本领域技术人员熟知的常规技术进行：以注射器吸取<100μl质粒液体直接注射小鼠胫骨前肌肉，可仅注射小鼠一条腿，也可分别取50μl质粒注射于小鼠两条腿。除注射器外，也可选用其他有效的借助于市售仪器的基因免疫的方式，包括但不限于：基因枪技术、电穿孔辅助技术等。

本发明中，“药学上可接受的”成分是适用于人和动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激、***反应)、有合理效益/风险比的物质。

本发明中，“药学上可接受的载体”成分是用于将具有活性的有效成分传送给人或动物的药学上可接受的溶剂、悬浮剂和赋形剂。所述的载体可以是液体、固体或半固体。载体包括但不限于：水、PBS缓冲液、生理盐水、葡萄糖、甘油、叠氮钠及其组合。

本发明的药物组合物，还含有上述有效成分和药学上可接受的载体。通常将其配制于无毒、中性、惰性和药学上可接受的水性载体介质中，pH值通常约6—8。

本发明和与已有技术相对照，其效果是积极和明显的。本发明的基于T细胞表位的HSP65基因的结核基因疫苗是一种质粒DNA疫苗，其中外源目的基因是嵌合有4个T细胞表位的HSP65基因，它们各自均可诱导T细胞应答，而嵌合表位不会影响HSP65蛋白的空间结构。因此理论上这一基因疫苗同时具有至少5种可诱导T细胞应答的结核抗原，具有强有效的激活T细胞免疫应答的作用。通过将本发明的基因疫苗肌肉注射免疫小鼠，证实可诱导针对多个结核抗原的特异性抗体应答，还能诱导较强的结核特异性杀伤应答，同时可诱导Th1型免疫应答，分泌高水平IFNγ，因此可以作为预防和治疗性结核病的优良疫苗。

附图说明

图1显示了本发明的基于T细胞表位的结核基因疫苗的外源目的基因和pcDNA3.1载体质粒的构建模式图。

图2显示了通过HSP65上游引物/T1、T2/E1、E2/HSP65下游引物三对引物分别扩增得到的双链DNA片段1(1-508bp)、片段2(491-1315bp)、片段3(1298-1788bp)，而后通过彼此重叠的17个碱基互补相连得到的嵌合4个T细胞表位的HSP65全长基因，其中，粗体带下划线的序列是***的4个T细胞表位序列。

图3显示了本发明的基于T细胞表位的结核基因疫苗的质粒PCR(图3A)、酶切(图3B)及部分测序鉴定结果(图3C)。

图4显示了本发明的基于T细胞表位的结核基因疫苗免疫小鼠诱导的特异性抗体IgG，图4A显示HSP65抗原特异性IgG的水平；图4B显示Ag85A抗原特异性IgG效价；图4C显示EAST6特异性IgG效价。

图5显示了本发明的基于T细胞表位的结核基因疫苗免疫小鼠诱导的抗原特异性淋巴细胞增殖能力。

图6显示了本发明的基于T细胞表位的结核基因疫苗免疫小鼠诱导的特异性淋巴细胞杀伤活性。

具体实施方式

以下是本发明的具体实施例，所述的实施例是用于描述本发明的使用和用途，而不是限制本发明。

实施例中采用的质粒、菌种、细胞、动物及试剂如下：

质粒、菌种、细胞、动物：结核分枝杆菌标准H37Rv株(上海市疾病预防控制中心结防科提供)。质粒pcDNA3.1(-)、pET32a、宿主细菌DH5α、BL21(Invitrogen公司购买)。基因合成委托上海赛百盛公司。4-6周龄雌性BALB/c(H-2K^d)小鼠购自中国科学院动物中心。

分子生物学试剂：限制性核酸内切酶EcoR I、Hind III(TaKaRa公司)、T4DNA连接酶(MBI公司)；Taq DNA聚合酶(Promega公司)；RNase A(Ameresco公司)；dNTP(Promega和华美生物公司)；LB培养基(英国OXOID公司)，琼脂粉、琼脂糖、SDS、EB(上海化学试剂采购供应站)，Tris(USB公司)，琼脂糖胶回收试剂盒(上海华舜生物制品公司)，大量质粒抽提试剂盒(Qiagen公司)。

免疫学试剂和材料：HRP标记羊抗小鼠IgG多克隆抗体(SantClous公司)；2ml和1ml无菌注射器(米沙瓦医科工业有限公司)。

实施例1：pcDNA3-ECANS基因疫苗的目的抗原基因的预测

通过BLAST网络数据库、DNAstar生物软件、网络数据库(http://www.syfpeithi.com/scripts/MHCServer.dll/home.htm)分析，综合亲疏水性、柔软性、抗原指数、表面可及性、与HLAI、II类分子结合、等参数，预测获得的4个T细胞表位：结核杆菌ESAT-6蛋白的189～228位基因(EAST-6_189-228)；结核杆菌Ag85A蛋白的369～405位基因(Ag85A_369-405)；结核杆菌CFP-10蛋白的162～207位基因(CFP10_162-207)；结核杆菌Ag85B蛋白的420～459位基因(Ag85B_420-459)。

如图1所示，拟以pcDNA3.1或pVAX为质粒载体，以结核分枝杆菌HSP65基因作为嵌合表位的基因载体，在计算机预测其二级结构的基础上，在其中不影响关键结构的位置第438位碱基后***ESAT-6189～228表位基因、第486位碱基后***Ag85A369～405、第1185位碱基后***CFP-10162～207和Ag85B420～459，CFP-10和Ag85B之间以gccgcctac相连接。

实施例2  pcDNA3-ECANS结核基因疫苗的构建

为了不在HSP65基因和T细胞表位基因之间引入酶切位点，本发明利用DNA引物直接合成和PCR的方法，从5‘和3’端依次扩增三段彼此有17个碱基重叠的包含部分HSP65基因和T细胞表位的基因片段，变性后通过彼此重叠的互补序列连接，最后用5‘和3’两端HSP65上、下引物PCR扩增出嵌合有4个T细胞表位的HSP65全长基因。同时在基因两端分别带上EcoR I和Hind III酶切位点，经双酶切后可连接入载体pcDNA3.1(-)或原核表达载体pET32a。

首先提取结核分枝杆菌H37Rv株(上海市疾病预防控制中心结防科)DNA，作为模板，用HSP65上游引物(SEQ ID NO：13)和下游引物(SEQ ID NO：14)通过PCR方法扩增获得HSP65片段，回收并纯化PCR产物(华舜公司小量胶回收试剂盒)。

以HSP65基因作为模板，分别以引物HSP65上游引物(SEQ IDNO：13)和T1引物(SEQ ID NO：15)通过PCR扩增片段1(如图2所示HSP65上游引物和T1相对，经PCR扩增得到的1—508bp双链DNA片段)，所述的片段1的双链DNA的序列为：

atggccaaga caattgcgta cgacgaagag gcccgtcgcg gcctcgagcg gggcttgaac

taccggttct gttaacgcat gctgcttctc cgggcagcgc cggagctcgc cccgaacttg

gccctcgccg atgcggtaaa ggtgacattg ggccccaagg gccgcaacgt cgtcctggaa

cgggagcggc tacgccattt ccactgtaac ccggggttcc cggcgttgca gcaggacctt

aagaagtggg gtgcccccac gatcaccaac gatggtgtgt ccatcgccaa ggagatcgag

ttcttcaccc cacgggggtg ctagtggttg ctaccacaca ggtagcggtt cctctagctc

ctggaggatc cgtacgagaa gatcggcgcc gagctggtca aagaggtagc caagaagacc

gacctcctag gcatgctctt ctagccgcgg ctcgaccagt ttctccatcg gttcttctgg

gatgacgtcg ccggtgacgg caccacgacg gccaccgtgc tggcccaggc gttggttcgc

ctactgcagc ggccactgcc gtggtgctgc cggtggcacg accgggtccg caaccaagcg

gagggcctgc gcaacgtcgc ggccggcgcc aacccgctcg gtctcaaacg cggcatcgaa

ctcccggacg cgttgcagcg ccggccgcgg ttgggcgagc cagagtttgc gccgtagctt

aaggccgtgg agaaggtcac cgagaccctg ctcaagggcg ccaaggaggt cgagaccaag

ttccggcacc tcttccagtg gctctgggac gagttcccgc ggttcctcca gctctggttc

gagcagattg cggccaccga gctgaacaac gcgctgcaga acctggcgcg gacgatcgca

ctcgtctaac gccggtggct cgacttgttg cgcgacgtct tggaccgcgc ctgctagcgt

gcgatttcgg cgggtgacca gtccatcg

cgctaaagcc gcccactggt caggtagc

 ，以T2引物(SEQ ID NO：16)和E1引物(SEQ ID NO：17)通过PCR扩增片段2(如图2所示T2引物和E1相对，经PCR扩增得到的491—1315bp双链DNA片段)，所述片段2的双链DNA的序列为：

            gggtgacca gtccatcggt gacctgatcg ccgagggtct ttcgatggct

            cccactggt caggtagcca ctggactagc ggctcccaga aagctaccga

gcttcttcgg cgctgacgct ggcgatggac aaggtgggca acgagggcgt catcaccgtc

cgaagaagcc gcgactgcga ccgctacctg ggccacccgt tgctcccgca gtagtggcag

gaggagtcca acacctttgg gctgcagctc gagctcaccg agggtatgcg gttcgacaag

ctcctcaggt tgtggaaacc cgacgtcgag ctcgagtggc tcccatacgc caagctgttc

ggctacatct cggggtactt cgtgaccgac ccggagcgtc aggaggcggt cctggaggac

ccgatgtaga gccccatgaa gcactggctg ggcctcgcag tcctccgcca ggacctcctg

ccctacatcc tgctggtcag ctccaaggtg tccactgtca aggatctgct gccgctgctc

gggstgtagg acgaccagtc gaggttccac aggtgacagt tcctagacga cggcgacgag

gagaaggtca tcggagccgg taagccgctg ctgatcatcg ccgaggacgt cgagggcgag

ctcttccagt agcctcggcc attcggcgac gactagtagc ggctcctgca gctcccgctc

gcgctgtcca ccctggtcgt caacaagatc cgcggcacct tcaagtcggt ggcggtcaag

cgcgacaggt gggaccagca gttgttctag gcgccgtgga agttcagcca ccgccagttc

gctcccggct tcggcgaccg ccgcaaggcg atgctgcagg atatggccat tctcaccggt

cgagggccga agccgctggc ggcgttccgc tacgacgtcc tataccggta agagtggcca

ggtcaggtga tcagcgaaga ggtcggcctg acgctggaga acgccgacct gtcgctgcta

ccagtccact agtcgcttct ccagccggac tgcgacctct tgcggctgga cagcgacgat

ggcaaggccc gcaaggtcgt ggtcaccaag gacgagacca ccatcgtcga gggcgccggt

ccgttccggg cgyyccagca ccagtggttc ctgctctggt ggtagcagct cccgcggcca

gacaccgacg ccatcgccgg acgagtggcc cagatccgcc aggagatcga gaacagcgac

ctgtggctgc ggtagcggcc tgctcaccgg gtctaggcgg tcctctagct cttgtcgctg

tccgactacg accgtgagaa gctgcaggag cggctggcca agctggccgg tggtgtcgcg

aggctgatgc tggcactctt cgacgtcctc gccgaccggt tcgaccggcc accacagcgc

gtgatcaagg ccggtgccgc caccgaggtc gaactcaagg agcgcaagca ccgcatcgag

cactagttcc ggccacggcg ggcgttccgc cttgagttcc tcgcgttcgt ggcgtagctc

gtggtgcgct tccaagaagc agccaataag cagaagcagg aactcgccgc ctacc

caccacgcga aggttcttcg tcggttattc gtcttcgtcc ttgagcggcg gatgg

以E2引物(SEQ ID NO：18)和HSP65下游引物(SEQ ID NO：14)通过PCR扩增片段3(如图2所示E2引物和HSP65下游引物相对，经PCR扩增得到的1298—1788bp双链DNA片段)，所述的片段3的双链DNA的序列为：

                                         gg aactcgccgc  ctaccagcag

                                         cc ttgagcggcg gatggtcgtc

ttcatctacg ccggctcgct gtcggccctg ctggatgcgg ttcgcaatgc caaggccgcc

aagtagatgc ggccgagcga cagccgggac gacctacgcc aagcgttacg gttccggcgg

gtcgaggagg gcatcgtcgc cggtgggggt gtgacgctgt tgcaagcggc cccgaccctg

cagctcctcc cgtagcagcg gccaccccca cactgcgaca acgttcgccg gggctgggac

gacgagctga agctcgaagg cgacgaggcg accggcgcca acatcgtgaa ggtggcgctg

ctgctcgact tcgagcttcc gctgctccgc tggccgcggt tgtagcactt ccaccgcgac

gaggccccgc tgaagcagat cgccttcaac tccgggctgg agccgggcgt ggtggccgag

caccggggcg acttcgtcta gcggaagttg aggcccgacc tcggcccgca ccaccggcgc

aaggtgcgca acctgccggc tggccacgga ctgaacgctc agaccggtgt ctacgaggat

ttccacgcgt tggacggccg accggtgcct gacttgcgag tctggccaca gatgctccta

ctgctcgctg ccggcgttgc tgacccggtc aaggtgaccc gttcggcgct gcagaatgcg

gacgagcgac ggccgcaacg actgggccag ttccactggg caagccgcga cgtcttacgc

gcgtccatcg cggggctgtt cctgaccacc gaggccgtcg ttgccgacaa gccggaaaag

cgcaggtagc gccccgacaa ggactggtgg ctccggcagc aacggctgtt cggccttttc

gagaaggctt ccgttcccgg tggcggcgac atgggtggca tggatttc

ctcttccgaa ccgaagggcc accgccgctg tacccaccgt acctaaag；

将上述的片段1和片段2混合，变性使各自成为单链DNA，由于片段1、2有17个碱基的重叠DNA序列，因此可互补成为双链，再以HSP65上游引物和E1引物通过PCR法可扩增获得片段(1+2)的片段，再与片段3混合，变性成为单链，由于片段2和片段3也有17个碱基的重叠DNA序列，因此可互补成为双链，以HSP65上游引物(SEQ ID NO：13)和HSP65下游引物(SEQ ID NO：14)作为引物，通过PCR方法扩增获得获得片段(1+2+3)，即嵌合了4个T细胞表位的HSP目的基因即ECANS编码基因(如图2所示)。PCR鉴定结果显示产物为1807bp，如图3A所示。再将扩增产物经EcoR I和Hind III双酶切，回收酶切片段，与经相应酶切的载体pcDNA3.1(-)连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5α，氨苄青霉素筛选转化菌落。经酶切(图3B)及测序鉴定(图3C)，成功构建了pcDNA3-ECANS真核表达质粒。4段表位基因就以没有酶切位点的方式***HSP65基因了。

将重组质粒ECANS转化大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆，经LB(Amp100μg/ml)液体培养基振荡培养15h，收集菌体，按照QIAGENPlasmid Mega Kit去除杂蛋白、细菌内毒素，得到纯化质粒。

实施例3  pET32a-ECANS原核表达载体的构建及蛋白表达纯化

为获得大量的HSP65或ECANS蛋白抗原，将扩增得到的ECANSHSP65编码基因用EcoRI和HindIII双酶切，与经相应酶切的原核表达载体pET32a连接，构建了pET32a-ECANS和pET32a-HSP65原核表达质粒。

以pET32a-ECANS转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，37℃培养过夜，筛选阳性克隆。经LB(Amp100μg/ml)液体培养基振荡培养至A600达到0.75左右，加入异丙基硫代半糖苷(IPTG)至终浓度为0.5mM。继续振荡培养3小时，4000r/min离心20min收集菌体，1×PBS重悬后超声破碎，12000r/min于4℃离心20min，分别收获上清和沉淀。上清过亲和层析柱，以不同浓度洗脱液洗脱，收集每1ml洗脱液，保存A280大于1.0的洗脱液，最后经12％ SDS-PAGE电泳鉴定表达的蛋白。最后得到纯化融合蛋白ECANS或HSP65。

实施例4  ECANS基因疫苗免疫小鼠

将真核表达质粒pcDNA3-ECANS溶解于无菌、无热源的PBS中，浓度调为1μg/μl。6-8周龄雌性BALB/c(H-2^d)健康小鼠18只，分为3组：(1)pcDNA3.1空质粒对照；(2)pcDNA3.1-HSP65质粒组；(3)pcDNA3.1-ECANS质粒。采用肌肉注射法免疫：BALB/c小鼠采轻度麻醉后，在胫骨前肌肉正中注射100μg质粒，每只小鼠两腿各50μg/μl。于0周、3周、6周肌注免疫小鼠三次。每两周经眼眶采血，血样4℃过夜，6000转/min离心15min获得血清，-20℃冻存。

实施例5  pcDNA3.1-ECANS基因疫苗诱导的特异性抗体应答

间接ELISA法检测免疫小鼠血清中特异的抗结核抗原IgG。以实施例3获得的纯化的HSP65蛋白5μg/ml包被聚苯乙烯微孔板4℃过夜，100μl/孔。以封闭液(10％山羊血清、0.5％牛血清白蛋白、0.05％ Tween-20)封闭板，200μl/孔，37℃1h。抗血清经1：80稀释后，100μl/孔，37℃1h，洗涤后加入1:4000稀释的HRP-羊抗鼠IgG，37℃1h，洗板后以邻苯二胺显色30min，终止反应后测A₄₉₀值。

如图4A显示：pcDNA3.1-ECANS基因疫苗免疫三次以后在小鼠体内诱导产生了HSP65特异性的IgG应答，血清IgG滴度在第14周时达到最高，达1：640，而空质粒注射组则无特异性抗体生成。若检测各表位特异性抗体的产生，发现pcDNA3.1-ECANS基因免疫还诱导了另外两种结核抗原Ag85A和ESAT-6特异性抗体应答。其中，pcDNA3.1-ECANS疫苗诱导的Ag85A特异性IgG效价达10000，显著高于pcDNA3.1-HSP65疫苗的6000(图4B)；其诱导的ESAT-6特异性IgG效价达3200，与pcDNA3.1-HSP65疫苗效果相仿(图4C)。总之，pcDNA3.1-ECANS疫苗肌肉注射免疫小鼠诱导了较强的结核多个抗原特异性抗体应答。

实施例6  pcDNA3.1-ECANS基因疫苗诱导的细胞免疫应答

小鼠免疫第8周处死，取脾细胞，去除红细胞后洗涤2次，以5×10⁵细胞/孔加入96孔板，分别加入非特异性抗原conA(5μg/ml)或纯化的HSP65蛋白(50μg/ml)，37℃、5％ CO₂培养72小时，在收获细胞前18小时每孔加入0.5uCi ³H-TdR，最后以多头细胞收集仪收集细胞于玻璃纤维滤纸上，液体闪烁计数器测量cpm值。以各数值除以空白对照，得到增殖的刺激指数，如图5，pcDNA3.1-ECANS免疫组淋巴细胞增殖能力显著高于对照组，证实被特异性激活。

在淋巴细胞杀伤试中，以4×10⁶细胞/孔加入6孔板中，以ECANS蛋白刺激，第二天加入50μ/ml的IL-2，培养5天后作为效应细胞，以转染了pcDNA3.1-ECANS基因的SP2/0细胞作为靶细胞，用CFSE标记效应细胞后，以10：1、20：1和40：1的效靶比混合加入96孔板，37℃作用6小时后收集细胞，加入PI 4℃染色30分钟，流式细胞仪检测靶细胞调亡，计算杀伤百分比。不同质粒免疫小鼠淋巴细胞的特异性杀伤情况如图6所示，pcDNA3.1-ECANS基因免疫组杀伤在40：1时达到45％，显著高于对照组，证明该基因疫苗能够诱导较强的细胞免疫应答，有抵抗结核分枝杆菌感染的潜能。

序列表

<110>复旦大学

<120>基于T细胞表位的结核基因疫苗及其制备方法和应用

<160>18

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>540

<212>PRT

<213>结核杆菌热休克蛋白65

<400>1

<210>2

<211>1620

<212>DNA

<213>结核杆菌热休克蛋白65

<400>2

<210>3

<211>13

<212>PRT

<213>结核杆菌EAST-6_189-228抗原

<400>3

<210>4

<211>39

<212>DNA

<213>结核杆菌EAST-6_189-228抗原

<400>4

<210>5

<211>12

<212>PRT

<213>结核杆菌Ag85A_369-405抗原

<400>5

<210>6

<211>36

<212>DNA

<213>结核杆菌Ag85A_369-405抗原

<400>6

<210>7

<211>15

<212>PRT

<213>结核杆菌CFP-10_162-207抗原

<400>7

<210>8

<211>45

<212>DNA

<213>结核杆菌CFP-10_162-207抗原

<400>8

<210>9

<211>13

<212>DNA

<213>结核杆菌Ag85B_420-459抗原

<400>9

<210>10

<211>39

<212>PRT

<213>结核杆菌Ag85B_420-459抗原

<400>10

<210>11

<211>596

<212>PRT

<213>嵌合了4个T细胞表位的结核杆菌热休克蛋白65外源目的基因蛋白

<400>11

<210>12

<211>1788

<212>DNA

<213>嵌合了4个T细胞表位的结核杆菌热休克蛋白65外源目的基因

<400>12

<210>13

<211>27

<212>DNA

<213>HSP65上游引物

<400>13

<210>14

<211>27

<212>DNA

<213>HSP65下游引物

<400>14

<210>15

<211>88

<212>DNA

<213>T1引物

<400>15

<210>16

<211>88

<212>DNA

<213>T2引物

<400>16

<210>17

<211>73

<212>DNA

<213>E1引物

<400>17

<210>18

<211>73

<212>DNA

<213>E2引物

<400>18

Claims (27)

1.一种基于T细胞表位的结核基因疫苗，由一个载体构成，其特征在于：在所述的载体中***有结核杆菌热休克蛋白的全长基因，所述的结核杆菌热休克蛋白HSP65的全长基因中嵌合有来自结核杆菌抗原的4个T细胞表位多肽基因，所述的4个T细胞表位分别是结核杆菌ESAT-6蛋白的189～228位基因，结核杆菌Ag85A蛋白的369～405位基因，结核杆菌CFP-10蛋白的162～207位基因，结核杆菌Ag85B蛋白的420～459位基因。

2.根据权利要求1所述的基于T细胞表位的结核基因疫苗，其特征在于：所述的载体为真核表达质粒，所述的真核表达质粒选自pcDNA3.1质粒、或pVAX1质粒。

3.根据权利要求1所述的基于T细胞表位的结核基因疫苗，其特征在于：所述的结核杆菌的热休克蛋白HSP65的氨基酸序列SEQ ID如NO：1所示。

4.根据权利要求1所述的基于T细胞表位的结核基因疫苗，其特征在于：所述的结核杆菌的热休克蛋白HSP65基因的DNA序列如SEQ ID NO：2所示。

5.根据权利要求1所述的基于T细胞表位的结核基因疫苗，其特征在于：所述的结核杆菌ESAT-6蛋白的189～228位基因的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。

6.根据权利要求1所述的基于T细胞表位的结核基因疫苗，其特征在于：所述的结核杆菌ESAT-6蛋白的189～228位基因的DNA序列如SEQ ID NO：4所示。

7.根据权利要求1所述的基于T细胞表位的结核基因疫苗，其特征在于：所述的结核杆菌Ag85A蛋白的369～405位基因的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示。

8.根据权利要求1所述的基于T细胞表位的结核基因疫苗，其特征在于：所述的结核杆菌Ag85A蛋白的369～405位基因的DNA序列如SEQ ID NO：6所示。

9.根据权利要求1所述的基于T细胞表位的结核基因疫苗，其特征在于：所述的结核杆菌CFP-10蛋白的162～207位基因的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示。

10.根据权利要求1所述的基于T细胞表位的结核基因疫苗，其特征在于：所述的结核杆菌CFP-10蛋白的162～207位基因的DNA序列如SEQ ID NO：8所示。

11.根据权利要求1所述的基于T细胞表位的结核基因疫苗，其特征在于：所述的结核杆菌Ag85B蛋白的420～459位基因的氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示。

12.根据权利要求1所述的基于T细胞表位的结核基因疫苗，其特征在于：所述的结核杆菌Ag85B蛋白的420～459位基因的DNA序列如SEQ ID NO：10所示。

13.根据权利要求1所述的基于T细胞表位的结核基因疫苗，其特征在于：在结核杆菌的热休克蛋白HSP65全长基因中的第438位碱基后***结核杆菌ESAT-6蛋白的189～228位基因、第486位碱基后***结核杆菌Ag85A蛋白的369～405位基因、第1185位碱基后***结核杆菌CFP-10蛋白的162～207位基因和结核杆菌Ag85B蛋白的420～459位基因。

14.根据权利要求13所述的基于T细胞表位的结核基因疫苗，其特征在于：所述的结核杆菌CFP-10蛋白的162～207位基因和所述的结核杆菌Ag85B蛋白的420～459位基因之间以gccgcctac基因序列相连接。

15.根据权利要求1所述的基于T细胞表位的结核基因疫苗，其特征在于：嵌合了结核杆菌4个T细胞表位基因的结核杆菌热休克蛋白HSP65的全长基因所构成的外源目的基因蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：11所示。

16.根据权利要求1所述的基于T细胞表位的结核基因疫苗，其特征在于：嵌合了结核杆菌4个T细胞表位基因的结核杆菌热休克蛋白HSP65的全长基因所构成的外源目的基因的DNA序列如SEQID NO：12所示。

17.权利要求1所述的基于T细胞表位的结核基因疫苗，其特征在于：包括以下步骤：

1)提取结核分枝杆菌DNA作为模板，通过PCR方法扩增结核杆菌热休克蛋白HSP65编码基因；

2)以结核杆菌热休克蛋白HSP65基因作为模板，分别通过PCR扩增彼此有17个碱基重叠的双链DNA片段1、片段2、片段3，所述的片段1的双链DNA的序列为

atggccaaga  caattgcgta  cgacgaagag  gcccgtcgcg  gcctcgagca  gggcttgaac

taccggttct  gttaacgcat  gctgcttctc  cgggcagcgc  cggagctcgc  cccgaacttg

accctcgccg  atgcggtaaa  ggtgacatta  ggccccaagg  gccgcaacgt  cgtcctggaa

cgggagcggc  tacgccattt  ccactgtaac  ccggggttcc  cggcgttgca  gcaggacctt

aagaagtggg  gtgcccccac  gatcaccaac  gatggtgtgt  ccatcgccaa  ggagatcgag

ttcttcaccc  cacgggggtg  ctagtggttg  ctaccacaca  ggtagcggtt  cctgtagctc

ctggaggatc  cgtacgagaa  gatcggcgcc  gagctggtca  aagaggtagc  caagaagacc

gacctcctag  gcatgctctt  ctagccgcgg  ctcgaccagt  ttctccatcg  gttcttctgg

gatgacatcg  ccggtgacgg  caccacgacg  gccaccgtgc  tggcccaggc  gttggttcgc

ctactgcagc  ggccactgcc  gtggtgctgc  cggtggcacg  accgggtccg  caaccaagcg

gagggcctgc  gcaacgtcgc  ggccggcgcc  aacccgctcg  gtctcaaacg  cggcagcgaa

ctcccggacg  cgttgcagcg  ccggccgcgg  ttgggcgagc  cagagtttgc  gccgtagctt

aaggccgtgg  agaaggtcac  cgagaccctg  ctcaagggcg  ccaaggaggt  cgagaccaag

ttccggcacc  tcttccagtg  gctctgggac  gagttcccgc  ggttcctcca  gctctggttc

gagcagattg  cggccaccga  gctgaacaac  gcgctgcaga  acctggcgcgg gacgatcgga

ctcgtctaac  gccggtggct  cgacttgttg  cgcgacgtct  tggaccgcgc  ctgctagcgt

gcgatttcgg  cgggtgacca  gtccatcg

cgctaaagcc  gcccactggt  caggtagc

所述的片段2的双链DNA的序列为

            gggtgacca  gtccatcggt  gacctgatcg  ccgagggtct  ttcgatggct

            cccactggt  caggtagcca  ctggactagc  ggctcccaga  aagctaccga

gcttcttcgg  cgctgacgct  ggcgatggac  aaggtgggca  acgagggcgt  catcaccgtc

cgaagaagcc  gcgactgcga  ccgctacctg  ggccacccgt  tgctcccgca  gtagtggcag

gaggagtcca  acacctttgg  actacagctc  gagctcaccg  agggtatgcg  gttcgacaag

ctcctcaggt  tgtggaaacc  cgacgtcgag  ctcgagtggc  tcccatacgc  caagctgttc

ggctacatct  cgggttactt  cgtgaccgac  ccggagcgtc  aggaggcggt  cctggaggac

ccgatgtaga  gccccatgaa  gcactggctg  ggcctcgcag  tcctccgcca  ggacctcctg

ccctacatcc  tgctggtcag  ctccaaggtg  tccactgtca  aggatctgct  gccgctgctc

gggstgtagg  acgaccagtc  gaggttccac  aggtgacagt  tcctagacga  cggcgacgag

gagaaggtca  tcggagccgg  taagccgctg  ctgatcatcg  ccgaggacgt  cgagggcgag

ctcttccagt  agcctcggcc  attcggcgac  gactagtagc  ggctcctgca  gctcccgctc

gcgctgtcca  ccctggtcgt  caacaagatc  cgcggcacct  tcaagtcggt  ggcggtcaag

cgcgacaggt  gggaccagca  gttgttctag  gcgccgtgga  agttcagcca  ccgccagttc

actcccggct  tcggcgaccg  ccgcaaggcg  atgctgcagg  atatggccat  tctcaccggt

cgagggccga  agccgctggc  ggcgttccgc  tacgacgccc  cacaccggca  agagcggcca

ggtcaggtga  tcagcgaaga  ggtcggcctg  acgctggaga  acgccgacct  gtcgctgcta

ccagtccact  agtcgcttct  ccagccggac  cgcgacctct  tgcggctgga  cagcgacgat

ggcaaggccc  gcaaggtcgt  ggtcaccaag  gacgagacca  ccatcgtcga  gggcgccggt

ccgttccggg  cgyyccagca  ccagtggttc  ctgccctggt  ggtagcagct  cccgcggcca

gacaccgacg  ccatcgccgg  acgagtggcc  cagatccgcc  aggagatcga  gaacagcgac

ctgtggctgc  ggtagcggcc  tgctcaccgg  gtctaggcgg  tcctctagct  cttgtcgctg

tccgactacg  accgtgagaa  gctgcaggag  cggctggcca  agctggccgg  tggtgtcgcg

aggctgatgc  tggcactctt  cgacgtcctc  gccgaccggt  tcgaccggcc  accacgagc

gtgatcaagg  ccggtgccgc  caccgaggtc  gaactcaagg  agcgcaagca  ccgcatcgag

cactagttcc  ggccacggcg  ggcgttccgc  cttgagttcc  tcgcgttcgt  ggcgtagctc

gtggtgcgct  tccaagaagc  agccaataag  cagaagcagg  aactcgccgc  ctacc

caccacgcga  aggttcttcg  tcggttattc  gtccccgccc  ccgagcggcg  gatgg

所述的片段3的双链DNA的序列为

                                    gg  aactcgccgg  ctaccagcag

                                    cc  ttgagcggcg  gatggtcgtc

ttcatctacg  ccggctcgct  gtcggccctg  ctggatgcgg  ttcgcaatgc  caaggccgcc

aagtagatgc  ggccgagcga  cagccgggac  gacctacgcc  aagcgttacg  gttccggcgg

gtcgaggagg  gcatcgtcgc  cggtgggggt  gtgacgctgt  tgcaagcggc  cccgaccctg

cagctcctcc  cgtagcagcg  gccaccccca  cactgcgaca  acgttcgccg  gggctgggtc

gacgagctga  agctcgaagg  cgacgaggcg  accggcgcca  acatcgtgaa  ggtggcgctg

ctgctcgact  tcgagcttcc  gctgctccgc  tggccgcggt  tgtagccttc  caccgcgac

gaggccccgc  tgaagcagat  cgccttcaac  tccgggctgg  agccgggcgt  ggtggccgag

caccggggcg  acttcgtcta  gcggaagttg  aggcccgacc  tcggcccgca  ccaccggcgc

aaggtgcgca  acctgccggc  tggccacgga  ctgaacgctc  agaccggtgt  ctacgaggat

ttccacgcgt  tggacggccg  accggtgcct  gacttgcgag  cccggccaca  gacgcccca

ctgctcgctg  ccggcgttgc  tgacccggtc  aaggtgaccc  gttcggcgct  gcagaatgcg

gacgagcgac  ggccgcaacg  acttgggccag  ttccactggg  caagccgcga cgtcttacgc

gcgtccatcg  cggggctgtt  cctgaccacc  gaggccgtcg  ttgccgacaa  gccggaaaag

cgcaggtagc  gccccgacaa  ggactggtgg  ctccggcagc  aacggctgtt  cggccttttc

gagaaggctt  ccgttcccgg  tggcggcgac  atgggtggca  tggatttc

ctcttccgaa  ccgaagggcc  accgccgctg  tacccaccgt  acctaaag；

3)将上述的3段片段混合，变性成为单链，通过彼此重叠的17个碱基互补连接，以此作为模板，通过PCR方法扩增获得嵌合了4个T细胞表位的结核杆菌热休克蛋白HSP65外源目的基因，将目的基因经双酶切后与经同样双酶切的载体连接，获得权利要求1所述的基于T细胞表位的结核基因疫苗。

18.如权利要求17所述的基于T细胞表位的结核基因疫苗的制备方法，其特征在于：以SEQ ID NO：13所示的HSP65上游引物和SEQID NO：15所示的HSP65 T1引物通过PCR扩增片段1。

19.如权利要求17所述的基于T细胞表位的结核基因疫苗的制备方法，其特征在于：以SEQ ID NO：16所示的引物HSP65 T2序列和SEQ ID NO：17所示的引物HSP65 E1序列通过PCR扩增片段2。

20.如权利要求17所述的基于T细胞表位的结核基因疫苗的制备方法，其特征在于：以SEQ ID NO：18所示的引物HSP65 E2序列和SEQ ID NO：14所示的HSP65下游引物序列通过PCR扩增片段3。

21.如权利要求17所述的基于T细胞表位的结核基因疫苗的制备方法，其特征在于：用SEQ ID NO：13所示的HSP65上游引物和SEQID NO：14所示的HSP65下游引物以片段1、2、3混合并变性为单链、互补连接后的基因为模板，通过PCR方法扩增嵌合了4个T细胞表位的结核杆菌热休克蛋白HSP65外源目的基因；

22.如权利要求17所述的基于T细胞表位的结核基因疫苗的制备方法，其特征在于：嵌合了4个T细胞表位的HSP65外源目的基因和***载体的酶切位点分别为EcoRI和Hind III位点。

23.如权利要求17所述的基于T细胞表位的结核基因疫苗的制备方法，其特征在于：所有抗原来自结核分枝杆菌H37Rv株。

24.如权利要求17所述的基于T细胞表位的结核基因疫苗的制备方法，其特征在于：所述的载体选自pcDNA3.1质粒、或pVAX1质粒。

25.一种药物组合物，其特征在于：含有有效量的权利要求1所述的基于T细胞表位的结核基因疫苗。

26.如权利要求1所述的一种药物组合物，其特征在于：还含有药学上可接受的载体或者赋形剂。

27.权利要求1所述的基于T细胞表位的结核基因疫苗在制备治疗和预防结核病的药物中的应用。

Images