CN101875913B - 可表达结核分枝杆菌Ag85B和ESAT-6融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种可表达结核分枝杆菌Ag85B和ESAT-6融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌株及其应用。将包含Ag85B和ESAT-6融合蛋白基因的重组质粒电转化入耻垢分枝杆菌，简称为AE-MS，其保藏编号为：CCTCCM2010097。筛选获得的重组耻垢分枝杆菌株AE-MS免疫小鼠，可诱导比耻垢分枝杆菌更强的免疫应答水平。本发明还涉及所构建菌株在制备结核病预防和治疗方面的制剂或药物中的应用。表达Ag85B和ESAT-6融合基因的重组分枝杆菌集中了靶抗原和活载体的优势，免疫接种后可刺激机体更强的免疫应答，提高机体的免疫保护力，因而具有良好的应用前景。

Description

可表达结核分枝杆菌Ag85B和ESAT-6融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌株及其应用

技术领域

本发明属于结核疫苗领域。本发明涉及一种可提高疫苗免疫效果的表达Ag85B和ESAT-6融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌株。本发明还涉及所构建菌株在制备结核病预防和治疗方面的制剂或药物中的应用。 

背景技术

结核病及基因工程疫苗研究现状 

据WHO报告，全世界已有约20亿人感染结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)，其中受耐药菌株感染者可能达到5000万，每年新发患者约1 000万，每年死亡人数高达300万，在所有传染病中结核病(tuberculosis，TB)死亡率仅次于艾滋病。WHO将TB与艾滋病、疟疾一起列为人类最主要的传染性杀手。我国属于全球22个TB高负担国家之一，每年因TB死亡人数约25万，在我国27种法定报告传染病中排第一位，为各种其他传染病和寄生虫病死亡人数总和的2倍。因此，我国***将TB列为全国重点控制的重大疾病之一。 

在TB的预防方面，卡介苗(Bacillus Calmette-Guérin vaccine，BCG)是目前用于TB预防的惟一有效疫苗，主要作为MTB感染前的预防性疫苗，并针对MTB的早期感染，不能预防和控制潜伏感染状态MTB的复发，并且其存在着保护期短，保护性免疫应答较弱等问题，因此亟需研制开发可用于感染者并防止复发的新型TB疫苗。在TB的治疗方面由于TB化疗疗程长达6个月以上，导致患者不能坚持服药和依从性差，并往往引起耐药，特别是出现广泛结核耐药和超级耐药结核菌，这是寻找免疫治疗方法的重要原因。随着对MTB本质认识的逐步深入，已证实TB患者Th1型细胞免疫反应较低，因此可提高机体免疫功能、尤其是Th1型反应的治疗性疫苗具有较好的 应用前景。 

目前正在开发的TB新型疫苗主要包括亚单位疫苗、基因疫苗、重组BCG疫苗、减毒或增强的全菌体活疫苗、营养缺陷型活疫苗、结合DC的疫苗等，但目前还没有一种新型疫苗可以替代传统的BCG，也没有一种疫苗可广泛用于TB的免疫治疗。目前重组活疫苗是研究最多的TB疫苗，它是将编码MTB保护性抗原的基因导入活的微生物载体构成的。在活疫苗的研究中，如何获得理想免疫效果的疫苗株是研究者最关注的问题，其主要的措施有：第一，选择具有免疫佐剂作用的载体；第二，选择合适的靶抗原。 

将外源性基因导入分枝杆菌构建成重组分枝杆菌活疫苗是新型TB疫苗研究的重要方向之一，国内外研究多选用BCG作为分枝杆菌活疫苗载体，但重组BCG疫苗尚存在下述缺点：生长缓慢，营养要求高，培养一代需10多个小时；细胞壁厚，富含脂质，妨碍了外源DNA在内的分子运输；转化效率低；外源基因的表达需特殊载体等。耻垢分枝杆菌(Mycobacteriumsmegmatis，MS)是一种生长快，转化效率高的非致病菌分枝杆菌和强细胞免疫佐剂，具有与BCG相似的免疫学特性，例如Zhu DY，et al.(RecombinantM.smegmatis vaccine targeted delivering IL-12/GLS into macrophages caninduce specific cellular immunity against M.tuberculosis in BALB/c mice.Vaccine，2007；25(4)：638-648.)等构建了表达IL 12和GLS融合基因的rMS，该重组活疫苗能够刺激T淋巴细胞增殖，启动Th1细胞免疫应答，促使分泌各种细胞因子(IFN-γ、IL-2、IL-12等)，提高机体对病原体的吞噬功能及杀灭作用等。Harth等(High extracellular levels of mycobacterium tuberculosisglutamine synthetase and superoxide dismutase in actively growing cultures aredue to high expression and extracellular stability rather than to a protein-specificexport mechanism.Immunol Cell Biol.2003，87(7)：209-215.)将MTB四种分泌型蛋白的转入MS中进行表达，多种指标检测表明重组蛋白与天然蛋白的生化免疫特性几乎完全相同。Rachael(A new Gateway 

vector andexpression protocol for fast and efficient recombinant protein expression inMycobacterium smegmatis.Protein Expression and Purification，2008；57(1)：81-87.)等构建了快速高效的MS表达载体，克隆基因本身的启动子作用下 能稳定地表达重组分泌型蛋白，且其产量为BCG的5～10倍。胡佳杰(重组M.S-Sj26GST疫苗有关毒性实验研究。华南预防医学，2002；28(5)：44-45)等检测了重组BCG-hsp70和重组MS-sj26GST对小鼠的毒性，结果表明这两种重组分枝杆菌所诱导淋巴细胞增殖指数较对照组高，小鼠体重、各脏器重量、各血象指标、血清肌酐和ALT含量与对照组无差异。说明此疫苗能提高小鼠的免疫功能，且对小鼠无***毒性作用。因此，MS是分枝杆菌活疫苗优良载体。 

选择合适的靶抗原可显著提高疫苗的保护效率。分泌蛋白是MTB在对数生长早期分泌释放到菌体外的一组蛋白，是MTB感染早期非常重要的特异性抗原，也是目前所确认的MTB蛋白中能诱发保护性免疫的一类蛋白。Ag85复合物包括Ag85A、Ag85B和Ag85C三个组分，在分枝杆菌分泌蛋白中含量占据首位，其中Ag85B与分枝杆菌细胞壁的合成有关，并与人纤维连接蛋白结合后参与致病过程，该抗原的抗原性在分泌蛋白中最强。比较基因组学发现，现有的BCG菌株均丢失ESAT-6基因，研究者发现ESAT-6亚单位疫苗能够激发一种强的ESAT-6特异性T细胞反应保护性，与BCG作用相当；ESAT-6还是免疫回忆效应细胞的主要靶抗原之一，可在再次MTB感染的早期，诱导其迅速增殖和释放高水平的INF-γ，激活单核巨噬细胞，并控制感染。Olsen等(Protection of Mice with a Tuberculosis Subunit VaccineBased on a Fusion Protein of Antigen 85B and ESAT-6.Infect Immun.2001，69(5)：2773-2778.)在大肠杆菌中表达了Ag85B-ESAT-6融合蛋白，并用纯化的ESAT-6、Ag85B、ESAT-6-Ag85B、Ag85B-ESAT-6、BCG以及佐剂MPL-DDA分别免疫小鼠，结果表明，大肠杆菌表达的重组融合蛋白诱导的保护作用优于单独的Ag85B、ESAT-6蛋白和BCG。此外，Ag85B-ESAT-6融合蛋白能在小鼠中诱导长期的抗MTB免疫记忆。因此，Ag85B和ESAT-6的融合蛋白具有更好的免疫原性。 

发明内容

本发明的目的是获得可表达Ag85B和ESAT-6融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌株。所述的菌株可用于结核病新型预防和/或治疗性疫苗(制剂)的研制。 

本发明是这样实现的： 

选择结核分枝杆菌繁殖期优势抗原Ag85B和ESAT-6，首先利用限制性酶切位点和PCR引物设计的方法，在Ag85B和ESAT-6蛋白基因之间连接一段48bp的(Gly3Ser)4疏水性linker，将融合基因克隆入分枝杆菌-大肠杆菌穿梭表达载体，得到可表达Ag85B和ESAT-6融合蛋白的重组质粒。制备耻垢分枝杆菌感受态细胞，将重组质粒电转化入细菌，潮霉素抗性平板筛选阳性克隆，使用PCR法和限制性酶切分析鉴定其基因型，通过Western-blot分析其表型，阳性菌株命名为可表达结核分枝杆菌Ag85B和ESAT-6融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌株(Ag85B-ESAT-6-Mycobacterium smegmatis)，简称为AE-MS。菌株AE-MS于2010年4月22日送中国典型培养物保藏中心保藏，其保藏编号为：CCTCC M2010097。 

所述的重组耻垢分枝杆菌株在制备用于预防和治疗结核病的疫苗及制剂中的应用。 

所述的重组耻垢分枝杆菌株刺激机体免疫应答的结果：本发明菌株扩大培养后，取10⁷皮下免疫小鼠，检测体液免疫应答水平包括抗体滴度和抗体亚类测定；检测细胞免疫应答水平，包括外周血CD4⁺/CD8⁺比例、脾淋巴细胞杀伤效应、ELISPOT检测IFN-γ产生细胞频数。检测结果表明，筛选获得的表达结核分枝杆菌Ag85B和ESAT-6融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌株免疫小鼠，可诱导比耻垢分枝杆菌更高的的体液和细胞免疫应答水平。表达Ag85B和ESAT-6融合基因的重组分枝杆菌株集中了靶抗原和活载体的优势，免疫接种后可刺激机体更强的免疫应答，提高机体的免疫保护力，因而具有良好的应用前景。 

附图说明：

图1：AE-MS基因型鉴定PCR结果图。 

图2：AE-MS基因型鉴定酶切鉴定结果图。 

图3：AE-MS表型鉴定的Western-blot分析结果图。 

图4：AE-MS免疫小鼠外周血CD4+/CD8+比例检测数据示意图。 

图5：AE-MS免疫小鼠的脾淋巴细胞杀伤效应检测数据示意图。 

图6：AE-MS免疫小鼠ELISPOT检测IFN-γ产生细胞频数数据示意图。 

具体实施方式

重组质粒pDE-AEL的构建： 

根据MTB H37Rv株的基因组序列，设计2对引物。ag85b序列的引物为： 

P1：5’-TAGGATCCATGACCGCGGGCGCGTTCTC-3’，含BamHI酶切位点； 

P2：5’-GCGAAGCTTTCATGCGAACATCCCAGTGA-3’，含HindIII酶切位点。 

esat-6序列的引物为： 

P1：5’-GCATCGATGGTGGCTCAGGTGGCTCCGGTGGAGGCGGAAGCGGCGGTGGA GGA TC AACAGAGCAGCAGTGGAATTT-3’，含ClaI酶切位点和48bp的linker序列； 

P2：5’-GCGAAGCTTTCATGCGAACATCCCAGTGA-3’，含HindIII酶切位点。 

将目的基因PCR产物克隆入测序用的pGEM-T载体，序列鉴定正确后，按照各自不同的酶切位点克隆入pDE22载体(分枝杆菌分泌型表达载体)，序列测定表明，成功构建融合蛋白基因的大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达重组质粒pDE-AEL，其全基因序列如SEQ ID NO：1所示。 

电穿孔感受态细胞的制备： 

MS感受态的制备：从改良罗氏培养基保存菌种中挑取一接种环的MS，接种于5ml 7H9培养基，30℃，100rpm振荡过夜培养，按1∶100的比例转接于200ml培养基，继续培养至OD600nm＝0.8～1左右，冰浴1.5h。4℃、5 000rpm离心10min，收集细菌，沉淀悬浮于预冷的10％甘油溶液中，4℃、5 000rpm离心10min，共洗涤三次，每次重悬10％甘油溶液体积减半。最后将细菌沉淀按照100∶1比例重悬于10％甘油溶液中，-70℃保存至使用。 

E.coli感受态制备：活化的E.coli接种于100ml LB培养液中，37℃培养至OD₆₀₀约为0.6，离心集菌，用10mM HEPES液洗涤两次，用预冷的10％甘油溶液洗涤一次，离心集菌后重悬于10％甘油溶液，-70℃分装保存。 

重组质粒电转化MS感受态细胞： 

取0.4ml MS感受态细胞冰浴融化，与5μg用乙醇沉淀的重组质粒混匀， 冰上放置10min，转入0.2cm预冷的电穿孔杯，电穿一次，参数为：电压2.5kV，电容25μF，电阻1 000Ω，冰浴2min，转入5ml 7H9培养基，30℃培养2h后涂布于含OADC和潮霉素150μg/ml的7H10平板中，设空白质粒作为对照，30℃培养5～7d直至形成可见菌落。 

AE-MS基因型鉴定： 

挑取电转化MS平板上单菌落，用PCR法检测，在约1200bp处可见扩增的目的条带，如图1所示。将其重悬于20μl10％甘油溶液中，取1μl菌液和40μl E.coli电穿细胞混匀，冰浴10min，MS-E.coli直接电穿孔法转化，参数：0.2cm的电穿孔杯，电压2.5kV，电容45μF，冰浴2min，转入4ml LB培养基，37℃培养1h，涂平板，培养12～16h，至菌落生成。挑取菌落，常规方法培养，提取质粒，酶切鉴定可切除约1 200bp大小片度，如图2所示。PCR法和酶切鉴定均为阳性的克隆命名为可表达结核分枝杆菌Ag85B和ESAT-6融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌株，简称为AE-MS。 

AE-MS表型鉴定： 

挑取基因型鉴定阳性的AE-MS菌株接种于含潮霉素的7H9培养基，培养至OD₆₀₀大于1,6000rpm离心10min收获细菌。PEG 6 000浓缩细菌培养上清，备用。另取菌重悬于PBS中，在冰浴中进行超声破菌，功率为300W，每次时间为10s，共3min，充***菌，取样进行SDS-PAGE分析。重组菌培养上清分别用蔗糖和PEG 6 000浓缩，然后进行SDS-PAGE。取预先处理的PVDF膜与PAGE胶相贴，在恒压100V条件下转移电泳1h，50g/L脱脂奶封闭后，加入抗ESAT-6单抗和抗Ag85B多抗，4℃过夜；PBST洗涤后，加入HRP-羊抗鼠IgG，37℃放置1h；PBS洗涤后，加入底物液显色。在约40kDa处可见明显的目的条带，且在菌体裂解物上清和沉淀中均有表达，如图3所示。鉴定结果表明可分泌表达结核分枝杆菌Ag85B和ESAT-6融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌株构建成功。其保藏编号为：CCTCC M2010097。 

AE-MS免疫应答水平检测： 

实验动物分组及免疫：取60只C57BL/6小鼠随机分为3组(每组20只)，分别通过皮下接种AE-MS菌株、普通MS以及生理盐水，AE-MS和MS免疫接种剂量均为10⁷CFU/只。 

1、AE-MS免疫小鼠抗体水平 

ELISA法检测各组免疫小鼠血清中特异性抗体的结果表明，AE-MS免疫两周后就可检测到抗体，加强免疫后抗体水平逐渐升高，初次免疫4周后最高可达1∶6 400，超过BCG组和MS免疫组抗体水平，与重组的Ag85B和ESAT-6融合蛋白免疫组抗体水平相当。对抗体亚类分析结果表明，AE-MS免疫组IgG2a/IgG1比例显著增加，为2.1，显著高于MS免疫组合生理盐水对照组(P＜0.01)。 

2、AE-MS免疫小鼠细胞免疫测定 

(1)外周血CD4+/CD8+细胞比率检测： 

在小鼠免疫后第1周至第6周每周剪尾采血0.5ml/只，肝素抗凝，3只/组。红细胞裂解液裂解红细胞6min，2 000rpm离心5min，PBSD细胞洗涤液洗涤3次(3ml/次/管)。细胞沉淀用不含血清的RPMI 1640培养液重悬，FITC：CD4/RPE：CD8双标避光染色40min。同上洗涤细胞3次，加入细胞固定液0.5ml/管待检。流式细胞仪检测细胞样品，结果见表1，如图4所示，分析各组CD4+/CD8+细胞比率结果表明：各组CD4+/CD8+细胞比率随免疫时间延长有增高的趋势，AE-MS实验组呈显著增高趋势(NS：生理盐水免疫；AE：AE蛋白免疫；BCG：卡介苗免疫；MS：耻垢分枝杆菌免疫)。 

(2)脾淋巴细胞杀伤效应： 

免疫后6周，取各组免疫小鼠，分别分离脾淋巴细胞，用含10％FCS的RPMI 1640完全培养液将分离的淋巴细胞浓度分别调整至2×10⁷/ml、 1×10⁷/ml、5×10⁶/ml及2.5×10⁶/ml，100μl/孔加入96孔板中，靶细胞P815-AE浓度调至4×10⁵/ml，加入50μl/孔，37℃5％CO₂培养5h后，1 000rpm、5min离心，每孔取50μl上清，加入LDH分析液50μl/孔，作用30min后终止反应。490nm可见光检测OD值。结果见表2，如图5所示，在效应细胞与靶细胞比值为1∶50时，免疫组CTL杀伤效应最高(P＜0.01)。 

(3)分析IFN-γ产生细胞频数：免疫后6周，取各组免疫小鼠，分别分离脾淋巴细胞，用含10％FCS的RPMI 1640完全培养液将分离的淋巴细胞浓度分别调整至2.5×10⁶/ml，用相应抗原刺激，ELISPOT检测IFN-γ产生细胞频数。如表3和图6所示，AE-MS免疫组小鼠IFN-γ产生细胞频率明显高于对照组(P＜0.01)，表明AE-MS免疫可诱导小鼠IFN-γ水平增加。 

序列表

<110>中国人民解放军第四军医大学

<120>可表达结核分枝杆菌Ag85B和ESAT-6融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌株及其应用

<160>1

<210>1

<211>1221

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>包含编码Ag85B和ESAT-6蛋白的基因，通过引物设计在两个基因间***48bp的Linker序列，以利于融合蛋白各个结构域的正确折叠。

<220>

<221>CDS

<222>(7)…(876)

<223>Ag85B蛋白

<220>

<221>CDS

<222>(931)…(1215)

<223>ESAT-6蛋白

<400>1

ggatccatga ccgcgggcgc gttctcccgg ccggggctgc cggtcgagta cctgcaggtg    60

ccgtcgccgt cgatgggccg cgacatcaag gttcagttcc agagcggtgg gaacaactca   120

cctgcggttt atctgctcga cggccagcgc gcccaagacg actacaacgg ctgggatatc   180

aacaccccgg cgttcgagtg gtactaccag tcgggactgt cgatagtcat gccggtcggc   240

gggcagtcca gcttctacag cgactggtac agcccggcct gcggtaaggc tggctgccag   300

acttacaagt gggaaacctt cctgaccagc gagctgccgc aatggttgtc cgccaacagg   360

gccgtgaagc ccaccggcag cgctgcaatc ggcttgtcga tggccggctc gtcggcaatg   420

atcttggccg cctaccaccc ccagcagttc atctacgccg gctcgctgtc ggccctgctg   480

gacccctctc aggggatggg gcctagcctg atcggcctcg cgatgggtga cgccggcggt   540

tacaaggccg cagacatgtg gggtccctcg agtgacccgg catgggagcg caacgaccct   600

acgcagcaga tccccaagct ggtcgcaaac aacacccggc tatgggttta ttgcgggaac   660

ggcaccccga acgagttggg cggtgccaac atacccgccg agttcttgga gaacttcgtt   720

cgtagcagca acctgaagtt ccaggatgcg tacaacgccg cgggcgggca caacgccgtg   780

ttcaacttcc cgcccaacgg cacgcacagc tgggagtact ggggcgctca gctcaacgcc   840

atgaagggtg acctgcagag ttcgttaggc gccggcatcg atggtggctc aggtggctcc   900

ggtggaggcg gaagcggcgg tggaggatca acagagcagc agtggaattt cgcgggtatc   960

gaggccgcgg caagcgcaat ccagggaaat gtcacgtcca ttcattccct ccttgacgag  1020

gggaagcagt ccctgaccaa gctcgcagcg gcctggggcg gtagcggttc ggaggcgtac  1080

cagggtgtcc agcaaaaatg ggacgccacg gctaccgagc tgaacaacgc gctgcagaac  1140

ctggcgcgga cgatcagcga agccggtcag gcaatggctt cgaccgaagg caacgtcact  1200

gggatgttcg catagaagct t                                            1221

Claims (2)

1.一种可表达结核分枝杆菌Ag85B和ESAT-6融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌株(recombinant Mycobacterium smegmatis)，简称为AE-MS，其保藏编号为：CCTCC M2010097。

2.权利要求1中所述的重组耻垢分枝杆菌株在制备用于预防和治疗结核病的疫苗及制剂中的应用。

Images