CN101445793A - 利用冻干制剂快速分离人全血或悬浮红细胞上清的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及利用冻干制剂快速分离人全血或悬浮红细胞上清的方法，该方法将植物凝集素或抗红细胞抗体预包被于磁性聚合物微球上，制成液态全血或悬浮红细胞的分离试剂；用非可溶性多聚物吸附该液态全血或悬浮红细胞的分离试剂，经冻干后，切割成薄片制成冻干全血或悬浮红细胞的分离试剂；将此冻干全血或悬浮红细胞的分离试剂加到人全血或悬浮红细胞中混匀后置于磁体上方，迅速分离上清。本发明方法可制得长期常温保存的冻干制剂，并且在不需要电力和离心机保障的情况下，高效快速地从人全血或悬浮红细胞中分离上清。

Description

利用冻干制剂快速分离人全血或悬浮红细胞上清的方法

技术领域

本发明涉及用一种冻干制剂快速分离人全血或悬浮红细胞上清的方法，特别是一种涉及使用冻干预包被植物凝集素或抗红细胞抗体的含有磁性材料的聚合物微球分离人全血或悬浮红细胞中上清的方法。本发明可广泛应用于临床检验和医学科学研究等领域。

背景技术

分离全血或悬浮红细胞的上清是临床和科研使用最多的一种技术之一，常用的分离方法包括自然沉降和离心，前者需要耗费较长的时间，后者需要离心机和电力的保障。

发明内容

本发明的目的是提供一种不需要电力和离心机保障的快速高效分离人全血或悬浮红细胞中上清的方法，特别是提供一种冻干的使用预包被植物凝集素或抗红细胞抗体的含有磁性材料的聚合物微球作为载体，利用外部磁力从人全血或悬浮红细胞中分离上清的方法。

本发明的分离方法包括以下步骤：将植物凝集素或抗红细胞抗体预包被于磁性聚合物微球上，制成液态全血或悬浮红细胞的分离试剂；用非可溶性多聚物吸附该液态全血或悬浮红细胞的分离试剂，经冻干后，切割成薄片制成冻干全血或悬浮红细胞的分离试剂，单独包装。将此冻干全血或悬浮红细胞的分离试剂加到人全血或悬浮红细胞中混合均匀；混匀后置于磁体上方，迅速分离上清。本发明利用由永磁体或电磁体提供的磁力吸附预包被植物凝集素或抗红细胞抗体的磁性聚合物微球，将被微球吸附的红细胞从均相互溶状态转变为异相分离状态，从而达到分离全血或悬浮红细胞中上清的目的。

本发明所说的“均相互溶状态”是指悬浮红细胞与全血中除红细胞外的其他成分处于均匀混和的状态。

本发明所说的“异相分离状态”是指红细胞在空间上富集在一起且与全血或悬浮红细胞的其他绝大部分成分分开，处于相对分离的状态。

本发明所说的“人全血”是指从人体采集的，未经自然分离或人工分离的全血标本。

本发明所说的“悬浮红细胞”是指全血将血浆分离出后添加了红细胞保存液的红细胞悬液。

本发明所说的“抗红细胞抗体”是使用人红细胞免疫小鼠，常规制备的抗红细胞单克隆抗体。

本发明所说的“磁性聚合物微球”是指四氧化三铁表面包覆一层聚合物，该聚合物能与植物凝集素以物理吸附或化学键作用相结合。其中，所述的聚合物优选聚苯乙烯或聚乙烯。

本发明所说的磁体为永磁体或电磁体，可以由永磁铁或电磁铁提供磁力。

本发明所说的“植物凝集素”是来源于含有植物凝集素的物质如赤小豆(semen Phaseoli)、刀豆(Semen Canavaliae)等，也可市售获得。本发明采用的植物凝集素可将赤小豆用纯水洗净并浸泡约24小时后机械粉碎成乳浆状，然后离心(6000g，30min)分离出上清后采用常规的饱和硫酸氨法进一步提纯得到。

本发明所述的非可溶性多聚物是指玻璃纤维或无纺布等类似物。另外，本发明所述的百分含量均为重量百分含量。

本发明所述的预包被可以将磁性聚合物微球溶于PBS缓冲液中，快速搅拌下加入凝集素或抗红细胞抗体并室温搅动，反应25-35分钟，然后加入牛血清白蛋白至牛血清白蛋白的终浓度0.15-0.25％，再次室温下搅动，反应10-20分钟，最后10000g离心15-25分钟后弃上清，再用PBS缓冲液重悬沉淀，即得到液态全血或悬浮红细胞分离试剂。

根据本发明的一个优选实施方案，可以按下述方法使用凝集素或抗红细胞抗体预包被磁性聚合物微球：预先将磁性聚合物微球溶于PBS缓冲液(含0.05％吐温-20的pH7.4的磷酸盐缓冲液(50mM，pH7.4))中，微球在缓冲液中浓度为10％(m/v)，快速搅拌下加入凝集素或抗红细胞抗体，100转/分钟的转速室温搅动反应30分钟，然后加入牛血清白蛋白(BSA)，使牛血清白蛋白终浓度0.2％，再次以100转/分钟的转速室温下搅动反应15分钟，最后10000g离心20分钟后弃上清，再用PBS缓冲液(50mM，pH7.4)重悬沉淀，得到标记好的磁性聚合物微球溶液，即液态全血或悬浮红细胞分离试剂。

现针对本发明的几个主要步骤，分别详述如下：

1.液态的全血或悬浮红细胞上清分离试剂的制备

其主要技术发明是将植物凝集素或抗红细胞抗体按常规方法预包被于磁性聚合物微球上。本发明采用的是优化的预包被方法：首先优化了预包被pH值，比较了在pH5.0、pH6.0、pH7.0、pH8.0、pH9.0、pH10.0时的预包被效率，结果发现pH7-8时最好，继续优化比较，发现pH7.4时预包被效率最高，使用时将PBS缓冲液盐浓度从常规的10mM提高到50mM，有助于预包被后的稳定性，尤其是加入到全血样品后的稳定性，减少植物凝集素或抗红细胞抗体的脱落，提高吸附效率。另外采用高磁性四氧化三铁制备的聚合物(聚苯乙烯或聚乙烯)微球，可以大大提高借助磁力分离的速度，同时也比较了不同的微球直径(40nm、60nm、100nm、150nm、200nm、300nm)的预包被及分离效果，结果100nm的微球的预包被和分离效率是最好的。

2.全血或悬浮红细胞上清分离试剂的冻干

首先将片状非可溶性多聚物浸泡于磁性聚合物微球溶液中，浸泡半小时，使多聚物充分吸附全血或悬浮红细胞分离试剂。将充分吸附全血或悬浮红细胞分离分离试剂的片状非可溶性多聚物平放于托盘上，置于冻干机，关闭进料口，开动冻干机，打开制冷功能，将温度降到-60℃，持续冷冻4小时。停止制冷，打开真空泵，持续抽真空24小时。关闭真空泵，打开冻干机进料口。在相对湿度低于20％的干燥条件下，将冻干的全血分离试剂从冻干机中取出，分切成1cm²大小薄片。每一薄片用铝箔袋单独包装。成品可以常温下保存两年。使用时打开铝箔袋，置于0.5ml抗凝全血或悬浮红细胞中，摇动，并置于磁铁上方，可迅速分离上清。

3.利用磁力分离上清

本发明采用的磁力来源可以是永磁体或电磁体，永磁体包括普通的磁铁和高磁力的合金磁铁。电磁铁可以控制磁力通断，可在不移动容器的情况下实现同位置分离上清。磁体可置于容器的多个位置，包括底部、侧壁、顶端甚至容器内部等，可以是一端，也可以环绕于容器。

与现有技术比较本发明的有益效果：

本方法将预包被植物凝集素或抗红细胞抗体的磁性聚合物微球用非可溶性多聚物吸附后制成可长期常温保存的冻干制剂。将此冻干制剂与全血或悬浮红细胞混合，在不需要电力和离心机保障的情况下，可最短在2～3分钟内使用磁力分相达到快速分离全血或悬浮红细胞上清的目的，其分离效果与离心法相当。

另外，本发明采用了强磁性的聚合物微球和强磁力的永磁体，使得磁力分离的速度大大加快。另外，本发明还可采用各种磁体，便于设计不同成本和性能的装置，满足不同应用和需求，利于推广应用。

附图说明

图1为显示底端固定磁体的磁力分离装置分离全血或悬浮红细胞上清的示意图。

图中，向全血中加入全血或悬浮红细胞分离试剂。

具体实施方式

以下结合附图，通过下面给出的本发明的实施例进一步了解本发明，但本发明并不受实施例的限定。

实施例1：采用植物凝集素预包被磁性颗粒分离全血或悬浮红细胞上清的方法

取100g赤小豆，用纯水洗净，浸泡于200ml纯水中24小时，用榨汁机将赤小豆打碎成豆乳浆，打碎过程中加入50ml纯水以提高研磨效率，乳浆于6000g离心30分钟，保留上清并用常规饱和硫酸氨法进一步提纯，获得植物凝集素纯品备用。

按照每毫升10％浓度的磁性聚合物微球(平均直径100nm)溶液预包被20μg植物凝集素的比例，预先将磁性聚苯乙烯微球溶于PBS(50mM，pH7.4)缓冲液中，微球在溶液中浓度10％(m/v)，在快速搅拌的情况下加入植物凝集素，室温下以100转/分钟的转速搅动反应30分钟。然后加入BSA至BSA终浓度0.2％，以100转/分钟的转速室温下搅动反应15分钟，最后10000g离心20分钟后弃上清，用PBS(50mM pH7.4)缓冲液重悬沉淀，获得标记好植物凝集素的磁性聚苯乙烯微球溶液，微球终浓度10％(m/v)，即液态全血或悬浮红细胞分离试剂。

将片状玻璃纤维浸泡于液态全血或悬浮红细胞分离试剂中，浸泡半小时，使多聚物充分吸附液态全血或悬浮红细胞分离试剂。将充分吸附液态全血或悬浮红细胞分离试剂的片状玻璃纤维平放于托盘上，置于冻干机，关闭进料口，开动冻干机，打开制冷功能，将温度降到-60℃，持续冷冻4小时。停止制冷，打开真空泵，持续抽真空24小时。关闭真空泵，打开冻干机进料口。在相对湿度低于20％的干燥条件下，将冻干全血或悬浮红细胞分离试剂从冻干机中取出，分切成1cm²大小薄片。

采集新鲜正常人全血样本5ml，用枸橼酸抗凝，备用。同时准备一个底部预置好磁铁的试管架，每0.5ml全血加入1片冻干全血或悬浮红细胞分离试剂，混匀后置于磁力架上，静置2～3分钟后可见明显的分层现象：上层是清亮的血浆，下层是红色的红细胞。

经红细胞计数检测分离后的上清，计算得该方法去除红细胞的效果达到99.6％。

实施例2：采用抗红细胞抗体预包被磁性颗粒分离悬浮红细胞上清的方法

取购自北京新创生物工程有限公司的抗红细胞抗体1mg。按照每毫升10％浓度的磁性聚合物微球，微球平均直径100nm，溶液预包被20μg抗红细胞抗体的比例，预先将磁性聚合物微球溶于PBS缓冲液(50mM pH7.4)中，微球在缓冲液中的浓度10％(m/v)，在快速搅拌的情况下加入抗红细胞抗体，室温下以100转/分钟的转速搅动反应30分钟，加入BSA至BSA在溶液中的终浓度0.2％，室温下以100转/分钟的转速搅动反应15分钟，最后10000g离心20分钟后弃上清，用PBS(50mM pH7.4)缓冲液重悬沉淀，获得标记好抗红细胞抗体的磁性聚合物微球溶液(微球终浓度10％(m/v))，即液态全血或悬浮红细胞分离试剂。采集新鲜正常人全血样本5ml，不加任何凝集素或其它试剂，备用。

将无纺布浸泡于液态全血或悬浮红细胞分离试剂中，浸泡半小时，使无纺布充分吸附液态全血或悬浮红细胞分离试剂。将充分吸附液态全血或悬浮红细胞分离试剂的无纺布平放于托盘上，置于冻干机，关闭进料口，开动冻干机，打开制冷功能，将温度降到-60℃，持续冷冻4小时。停止制冷，打开真空泵，持续抽真空24小时。关闭真空泵，打开冻干机进料口。在相对湿度低于20％的干燥条件下，将冻干全血或悬浮红细胞分离试剂从冻干机中取出，分切成1cm²大小薄片。

准备一个底部预置好磁铁的试管架，按照每毫升全血加入2片冻干全血或悬浮红细胞分离试剂，静置10分钟后，可见明显的分层现象：上层是清亮的血浆，下层是红色的红细胞。

经红细胞计数检测分离后的上清，计算得该方法去除红细胞的效果达到99.8％。

Claims (8)

1、一种利用冻干制剂快速分离人全血或悬浮红细胞上清的方法，其特征在于该方法包括以下步骤：

(1)将植物凝集素或抗红细胞抗体预包被于磁性聚合物微球上，制成液态全血或悬浮红细胞的分离试剂；

(2)用非可溶性多聚物吸附该液态全血或悬浮红细胞的分离试剂，经冻干后，切割成薄片制成冻干全血或悬浮红细胞的分离试剂；

(3)将上述冻干全血或悬浮红细胞的分离试剂加到人全血或悬浮红细胞中混合均匀；

(4)混匀后置于磁体上方，静置分离上清。

2、根据权利要求1所述的利用冻干制剂快速分离人全血或悬浮红细胞上清的方法，其特征在于所述的植物凝集素是将赤小豆洗净并浸泡24小时后粉碎成乳浆状，然后离心分离得到的上清采用饱和硫酸氨法提纯。

3、根据权利要求1所述的利用冻干制剂快速分离人全血或悬浮红细胞上清的方法，其特征在于所述的预包被是将磁性聚合物微球溶于PBS缓冲液中，快速搅拌下加入凝集素或抗红细胞抗体并室温搅动，反应25-35分钟，然后加入牛血清白蛋白至牛血清白蛋白的终浓度0.15-0.25％，再次室温下搅动，反应10-20分钟，最后10000g离心15-25分钟后弃上清，再用PBS缓冲液重悬沉淀，即得到液态全血或悬浮红细胞分离试剂。

4、根据权利要求1所述的利用冻干制剂快速分离人全血或悬浮红细胞上清的方法，其特征在于所述的磁性聚合物微球是四氧化三铁表面包覆一层聚合物，该聚合物能与植物凝集素以物理吸附或化学键作用相结合。

5、根据权利要求4所述的利用冻干制剂快速分离人全血或悬浮红细胞上清的方法，其特征在于所述的聚合物是聚苯乙烯或聚乙烯。

6、根据权利要求1所述的利用冻干制剂快速分离人全血或悬浮红细胞上清的方法，其特征在于所述的非可溶性多聚物是玻璃纤维或无纺布。

7、根据权利要求3所述的利用冻干制剂快速分离人全血或悬浮红细胞上清的方法，其特征在于所述的PBS缓冲液盐浓度为50mM，pH7-8。

8、根据权利要求1所述的利用冻干制剂快速分离人全血或悬浮红细胞上清的方法，其特征在于所述的磁体为永磁体或电磁体。

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