CN114397464B - 一种红细胞膜碎片与载体的偶联复合物、其偶联方法和应用 - Google Patents

一种红细胞膜碎片与载体的偶联复合物、其偶联方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于血型抗体检测领域，具体地说，涉及一种红细胞膜碎片与载体的偶联复合物、其偶联方法和应用。所述的偶联复合物由红细胞膜碎片与载体偶联而成，所述的载体为乳胶微球。其制备方法为：超声破碎、载体活化、偶联、透析封闭、离心收集和储存。本发明通过对偶联物膜碎片进行超声破碎处理，使其成为表结构均匀的小片段，经过透析处理，除去超声破碎产生的杂质，及去除静电吸引力，使膜碎片尽量处于舒展状态。保障膜碎片的各个部位都可以充分的与载体微球接触连接，能够显著的提高偶联效率。偶联后封闭的过程为封闭液体系透析，可以使封闭液等充分的与偶联复合物接触，达到更好的液态封闭效果。

Description

一种红细胞膜碎片与载体的偶联复合物、其偶联方法和应用
技术领域
本发明属于血型抗体检测领域，具体地说，涉及一种红细胞膜碎片与载体的偶联复合物、其偶联方法和应用。
背景技术
对人体细胞膜抗原及其特异性抗体的研究和检测是生物科学、免疫学实验研究和临床检测的最基本内容之一。人A、B、O和Rh血型抗原/抗体检测是临床常规检测项目。血型鉴定是基于抗原-抗体反应导致的细胞凝集反应。使用红细胞表面抗原检测血清中的血型抗体称之为反定型。在临床输血中，必须保证正、反定型法鉴定结果一致，才能确保输血的安全性。
对血型抗体检测，传统技术为试管法、纸片法或柱凝集法，这些方法都需要新鲜的红细胞指示剂，这种红细胞指示剂为红细胞悬液，因红细胞存活周期只可以做到保存3-6个月，且需要冷链运输。红细胞为血液制品在使用上存在一定风险。
红细胞膜能够更好地保护被运载物质的活性，具有更长和更可控的生命期。这些性能使“载体红细胞”成为极具价值的一种运输载体。
CN101387648A公开了一种红细胞膜抗原磁珠试剂盒及在血型抗体检测方面的应用，描述了在表面包被血型抗原的磁珠，试图代替红细胞用于血型的反定型检测。然而，已知的是血型抗原为膜蛋白，其在体外难以维持体内环境下所具有的三维结构，会逐渐失去抗原性（与相应血型抗体的反应能力）。因此，这种包被血型抗原的磁珠并不能解决红细胞难以长期保存的问题。
常见的显色型标记物有酶、胶体金以及乳胶微球。酶作为标记材料的技术虽然比较成熟，但酶受温度影响较大，稳定性差，产品有效期短；胶体金是目前商品化试纸条中使用最多的标记材料，但其信号方法成本高，无法用于精确检测；乳胶微球在液体中可以形成稳定的交替，与胶体金相比，微球颗粒更大，可以节省抗体用量，灵敏度更高；同时可以进行大规模生产，成本更低；稳定性与灵敏度更优。因此，通过在表面携带不同基团的乳胶微球上与抗体实现共价结合形成结构稳定的复合物，以应用于疾病诊断和生物医药等领域是目前研究的热点。
然而现有载体标记抗原过程中，大部分为小分子量天然抗原或合成抗原。红细胞膜碎片与载体偶联不适应传统标记方法，采用现有的标记方法将会导致载体微球与红细胞膜碎片偶联效率和偶联强度较低，进而使得抗原性较低。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种红细胞膜碎片与载体的偶联复合物、其偶联方法和应用，以解决现有技术中由于标记方法不合适、导致载体微球与红细胞膜碎片偶联效率和偶联强度较低进而使得抗原性较低的问题。
为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：
一种红细胞膜碎片与载体的偶联复合物，其中，所述的偶联复合物由红细胞膜碎片与载体偶联而成，所述的载体为乳胶微球。
本发明所提供的红细胞膜碎片与载体的偶联复合物具有更高的抗原性，可用于人血型抗体检测，能够准确的反映出血型抗体种类，达到了代替新鲜红细胞的目的，为血型抗体的检测提供了方便，打破了血型抗体的检测依赖于红细胞的局限。
进一步地，所述的红细胞膜碎片与载体的浓度比为35-45：1，优选40：1。
本发明中，所述的乳胶微球为羧基乳胶微球。
本发明还提供一种红细胞膜碎片与载体的偶联方法，其中，所述的偶联方法包括如下步骤：
S1、超声破碎：冰浴条件下，将红细胞膜碎片进行超声破碎，重悬，透析，得到超声破碎后的红细胞膜碎片；
S2、载体活化：将乳胶微球超声活化，活化缓冲液离心、清洗，加入EDC的MES溶液，立即混匀，离心，得到活化后的乳胶微球，常温避光，备用；
S3、偶联：将超声破碎后的红细胞膜碎片与备用的活化后的乳胶微球混匀，离心，得到偶联复合物，常温避光，备用；
S4、透析封闭：将备用的偶联复合物用封闭液复溶，混匀，透析，得到透析后的偶联复合物；
S5、离心收集：将透析后的偶联复合物离心，弃上清；
S6、储存：加入储存缓冲液，重悬偶联复合物，冷藏保存。
本发明将提取制备的红细胞膜碎片与载体通过免疫标记技术进行偶联，通过标记物的增强放大作用来显示反应体系中抗原的形式和含量。这种与红细胞偶联的载体不局限于胶体金、磁珠、乳胶、荧光素、荧光微球、酶或放射性核素等。
本发明通过对偶联物膜碎片进行超声破碎处理，使其成为表结构均匀的小片段，经过透析处理，除去超声破碎产生的杂质，及去除静电吸引力，使膜碎片尽量处于舒展状态；保障膜碎片的各个部位都可以充分的与载体微球接触连接，能够显著的提高偶联效率，提高检测结果；偶联后封闭的过程为封闭液体系透析，可以使封闭液等充分的与偶联复合物接触，达到更好的液态封闭效果。
进一步地，步骤S2中，所述的超声活化为在频率40kHz下超声活化30min。
本发明中，考察了载体活化过程中超声活化时间对制得的偶联复合物检测A、B抗体稀释灵敏度的影响。结果表明，与超声活化20min或40min相比，超声活化30min所得的偶联复合物具有较高的抗原性，能够更好地提高载体乳胶微球与膜抗原的偶联效率，提高检测结果。因此，本发明的超声活化选择在频率40kHz下超声活化30min。
进一步地，步骤S1中，所述的超声破碎在功率200W下进行，每超声5S停5S，超声破碎总时间为30min。
进一步地，步骤S3中，红细胞膜碎片与乳胶微球的浓度比为35-45：1，优选40：1。
进一步地，
步骤S1中，所述的重悬为采用0.1M、pH=8.0的Tris-cl重悬浮至体积10ml；所述的透析为采用截留分子量为10KD的透析袋、生理盐水作为透析缓冲液进行透析，透析时间为24h；
步骤S4中，所述的透析为采用截留分子量为100KD的透析袋、封闭液作为透析缓冲液进行透析，透析时间为8h。
进一步地，
步骤S2中，所述的离心为以1000rpm离心30min；
步骤S3中，所述的离心为以1000rpm离心2.5h；
步骤S5中，所述的离心为以18000rpm离心15min。
进一步地，
EDC的MES溶液为使用0.05M的MES配制EDC，配制后所得的溶液的浓度为10mg/mL；
所述的活化缓冲液为0.05M、pH=6.1的MES缓冲液；
所述的封闭液为质量分数为7.5%的Gly、质量分数为1%的BSA溶液和质量分数为0.05%的NaN3；其中，Gly为甘氨酸，占整个所述封闭液的质量分数为7.5%；质量分数为1%的BSA溶液是指BSA溶液占整个所述封闭液的质量分数为1%；质量分数为0.05%的NaN3是指NaN3占整个所述封闭液的质量分数为0.05%；
所述的储存缓冲液为0.05M、pH=8.1的Tris缓冲液、质量分数为1%的BSA溶液和质量分数为0.05%的NaN3；其中，0.05M、pH=8.1的Tris缓冲液是指pH为8.1的Tris缓冲液占整个所述储存缓冲液的浓度为0.05M；质量分数为1%的BSA溶液是指BSA溶液占整个所述储存缓冲液的质量分数为1%；质量分数为0.05%的NaN3是指NaN3占整个所述储存缓冲液的质量分数为0.05%。
本发明还提供所述的偶联复合物在血型抗体检测方面或在制备检测血型抗体试剂盒中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
（1）本发明所提供的红细胞膜碎片与载体的偶联复合物具有更高的抗原性，可用于人血型抗体检测，能够准确的反映出血型抗体种类，达到了代替新鲜红细胞的目的，为血型抗体的检测提供了方便，打破了血型抗体的检测依赖于红细胞的局限；
（2）本发明通过对偶联物膜碎片进行超声破碎处理，使其成为表结构均匀的小片段，经过透析处理，除去超声破碎产生的杂质，及去除静电吸引力，使膜碎片尽量处于舒展状态；保障膜碎片的各个部位都可以充分的与载体微球接触连接，能够显著的提高偶联效率，提高检测结果；偶联后封闭的过程为封闭液体系透析，可以使封闭液等充分的与偶联复合物接触，达到更好的液态封闭效果。
附图说明
图1为本发明的偶联复合物检测A、B抗体原倍灵敏度；
图2为本发明的偶联复合物检测A、B抗体稀释2倍灵敏度；
图3为本发明的偶联复合物检测A、B抗体稀释4倍灵敏度；
图4为本发明的偶联复合物检测A、B抗体稀释8倍灵敏度；
图5为本发明的偶联复合物检测A、B抗体稀释16倍灵敏度；
图6为本发明的偶联复合物检测A、B抗体稀释32倍灵敏度；
图7为本发明的偶联复合物检测A、B抗体稀释64倍灵敏度；
图8为对比例的偶联复合物检测A、B抗体原倍灵敏度；
图9为对比例的偶联复合物检测A、B抗体稀释2倍灵敏度；
图10为对比例的偶联复合物检测A、B抗体稀释4倍灵敏度；
图11为对比例的偶联复合物检测A、B抗体稀释8倍灵敏度；
图12为对比例的偶联复合物检测A、B抗体稀释16倍灵敏度；
图13为对比例的偶联复合物检测A、B抗体稀释32倍灵敏度；
图14为对比例的偶联复合物检测A、B抗体稀释64倍灵敏度；
图15为超声活化20min的偶联复合物检测A、B抗体原倍灵敏度；
图16为超声活化20min的偶联复合物检测A、B抗体稀释2倍灵敏度；
图17为超声活化20min的偶联复合物检测A、B抗体稀释4倍灵敏度；
图18为超声活化20min的偶联复合物检测A、B抗体稀释8倍灵敏度；
图19为超声活化20min的偶联复合物检测A、B抗体稀释16倍灵敏度；
图20为超声活化20min的偶联复合物检测A、B抗体稀释32倍灵敏度；
图21为超声活化40min的偶联复合物检测A、B抗体原倍灵敏度；
图22为超声活化40min的偶联复合物检测A、B抗体稀释2倍灵敏度；
图23为超声活化40min的偶联复合物检测A、B抗体稀释4倍灵敏度；
图24为超声活化40min的偶联复合物检测A、B抗体稀释8倍灵敏度；
图25为超声活化40min的偶联复合物检测A、B抗体稀释16倍灵敏度；
图26为超声活化40min的偶联复合物检测A、B抗体稀释32倍灵敏度。
具体实施方式
以下为本发明的具体实施方式，所述的实施例是为了进一步描述本发明，而不是限制本发明。
以下实施例中，所采用的红细胞碎片采用如下方法制备得到：
1）取3mL抗凝混合全血（取自6-10个A型或其他血型血样），加入装有10mL0.01mol/L的PBS（pH7.2）的15m L离心管中，以3000r/min离心5min，弃上清和上清下的白细胞、血小板层，获得约1.5mL压积红细胞；
2）用相当于压积红细胞3倍体积的4℃预冷0.01mol/L的PBS（pH7.2）洗涤2次，每次在4℃下以5000r/min离心15min；
3）以V:V=40：1的比例加4℃预冷的0.01mol/L的PBS（pH7.2）与沉淀物混合，4℃放置2h，再以9000r/min离心20min，弃上清；
4）再重复步骤3）4次，直至无肉眼可见的红细胞，所获得的约800μL沉淀物即为携带膜抗原的红细胞膜碎片样本。
以此方式进行多次制备，获得的红细胞膜碎片或者立即使用（用于膜抗原检测），或者直接分装后分别在4℃或-20℃下保存。
以下实施例中，EDC的MES溶液为使用0.05M的MES配制EDC，配制后所得的溶液的浓度为10mg/mL；
所述的活化缓冲液为：0.05M、pH=6.1的MES缓冲液；
所述的封闭液为：质量分数为7.5%的Gly、质量分数为1%的BSA溶液和质量分数为0.05%的NaN3；其中，Gly为甘氨酸，占整个所述封闭液的质量分数为7.5%；质量分数为1%的BSA溶液是指BSA溶液占整个所述封闭液的质量分数为1%；质量分数为0.05%的NaN3是指NaN3占整个所述封闭液的质量分数为0.05%；
所述的储存缓冲液为：0.05M、pH=8.1的Tris缓冲液、质量分数为1%的BSA溶液和质量分数为0.05%的NaN3；其中，0.05M、pH=8.1的Tris缓冲液是指pH为8.1的Tris缓冲液占整个所述储存缓冲液的浓度为0.05M；质量分数为1%的BSA溶液是指BSA溶液占整个所述储存缓冲液的质量分数为1%；质量分数为0.05%的NaN3是指NaN3占整个所述储存缓冲液的质量分数为0.05%。
实施例1
S1、冰浴超声破碎：取1个烧杯，放入冰块，将装有5mLA型红细胞膜碎片（5mg/ml）的西林瓶固定放在烧杯中心位置。烧杯放在超声平台上。打开细胞破碎仪，设置功率200W，工作总时间30M，超声开时间5S，超声关时间5S。用0.1M、pH=8.0的Tris-cl重悬浮至体积10ml。将超声后的A型红细胞膜碎片放入截留分子量为10KD的透析袋，生理盐水作为透析缓冲液透析24小时。消除静电，平衡缓冲体系。
S2、载体活化：将JSR114nm乳胶微球超声活化30min频率40kHz，活化缓冲液离心清洗2次，使用0.05M的MES配制EDC10mg/mL，加入后立即旋涡混匀（现配现用），将离心管固定在摇床上，以1000rpm离心30min，常温避光。
S3、偶联：处理后的A型红细胞膜碎片与JSR114nm乳胶微球按照40：1的浓度比进行投料，立即旋涡混匀。将离心管固定在摇床上，以1000rpm离心2.5h，常温避光。
S4、透析封闭：将偶联后的复合物用3000mL封闭液复溶，震荡混匀。加入截留分子量为100KD的透析袋，透析缓冲液为封闭液进行透析，透析时间为8h。
S5、离心收集：将透析后的偶联复合物以18000rpm离心15min，弃上清。
S6、储存：加入800uL储存缓冲液，重悬偶联复合物，4℃保存。
实施例2
参照实施例1，与实施例1所不同的是所用的红细胞膜碎片为B型红细胞膜碎片。
实施例3
参照实施例1，与实施例1所不同的是所用的红细胞膜碎片为O型红细胞膜碎片。
实施例4
参照实施例1，与实施例1所不同的是所用的红细胞膜碎片为AB型红细胞膜碎片。
实施例5
参照实施例1，与实施例1所不同的是步骤S3的偶联过程中处理后的A型红细胞膜碎片与JSR114nm乳胶微球按照35：1的浓度比进行投料。
实施例6
参照实施例1，与实施例1所不同的是步骤S3的偶联过程中处理后的A型红细胞膜碎片与JSR114nm乳胶微球按照45：1的浓度比进行投料。
对比例
1）取装有5mLA型红细胞膜碎片（5mg/ml）的西林瓶，放置室温；
2）载体活化：将JSR114nm乳胶微球超声活化30min频率40kHz，活化缓冲液离心清洗2次，使用0.05M的MES配制EDC10mg/mL，加入后立即旋涡混匀（现配现用），将离心管固定在摇床上，以1000rpm离心30min，常温避光；
3）偶联：处理后的A型红细胞膜碎片与JSR114nm乳胶微球按照40：1的浓度比进行投料，立即旋涡混匀。将离心管固定在摇床上，以1000rpm离心2.5h，常温避光；
4）离心收集：将离心后的偶联复合物以18000rpm离心15min，弃上清；
5）储存：加入800uL储存缓冲液，重悬偶联复合物，4℃保存。
试验例1
本试验例考察了本发明制得的偶联复合物检测A、B抗体稀释灵敏度。
实验材料：实施例1制得的由A型红细胞膜碎片偶联JSR114nm乳胶微球后的偶联复合物（记为2号A膜球），Millipore-A抗体，Millipore-B抗体，生理盐水，5%PEG6000生理盐水溶液，偶联微球稀释缓冲液（即前述的储存缓冲液）。
实验方法：将实施例1制得的由A型红细胞膜碎片偶联JSR114nm乳胶微球后的偶联复合物（即2号A膜球），用偶联微球稀释缓冲液将2号A膜球稀释40倍，分别与A、B抗体或样本混合反应，340nm波长检测反应时间内OD值变化曲线。
检测A、B抗体稀释灵敏度结果：
A抗原偶联微球（即2号A膜球）分别与A、B抗体和生理盐水稀释的A、B抗体混合反应，检测OD值结果如下（检测抗体-虚线为阴性，实线为阳性）。
检测结果见图1至图7。
试验例2
本试验例考察了对比例制得的偶联复合物检测A、B抗体稀释灵敏度。
实验材料：对比例制得的由A型红细胞膜碎片偶联JSR114nm乳胶微球后的偶联复合物（记为1号A膜球），Millipore-A抗体，Millipore-B抗体，生理盐水，5%PEG6000生理盐水溶液，偶联微球稀释缓冲液（即前述的储存缓冲液）。
实验方法：将对比例制得的由A型红细胞膜碎片偶联JSR114nm乳胶微球后的偶联复合物（即1号A膜球），用偶联微球稀释缓冲液将1号A膜球稀释40倍，分别与A、B抗体或样本混合反应，340nm波长检测反应时间内OD值变化曲线。
检测A、B抗体稀释灵敏度结果：
A抗原偶联微球（即1号A膜球）分别与A、B抗体和生理盐水稀释的A、B抗体混合反应，检测OD值结果如下（检测抗体-虚线为阴性，实线为阳性）。
检测结果见图8至图14。
从试验例1和试验例2的结果可以看出，本申请实施例的偶联方法与对照例中的偶联方法相比，采用本申请实施例的偶联方法制得的偶联物具有更高的抗原性，能够更好的提高载体乳胶微球与膜抗原的偶联效率，提高检测结果。
试验例3
本试验例考察了载体活化过程超声活化时间对制得的偶联复合物检测A、B抗体稀释灵敏度的影响。
试验方法：参照实施例1，所不同的是超声活化时间分别为20min和40min，其中20min得到的偶联复合物记为3号A膜球，40min得到的偶联复合物记为4号A膜球。将3号A膜球和4号A膜球分别用偶联微球稀释缓冲液稀释40倍，按照试验例1的方法检测A、B抗体稀释灵敏度结果。
其中超声活化20min的检测结果见图15至图20，超声活化40min的检测结果见图21至图26（检测抗体-虚线为阴性，实线为阳性）。
从本试验结果，并结合试验例1的结果可以看出，与超声活化20min或40min相比，超声活化30min所得的偶联复合物具有较高的抗原性，能够更好地提高载体乳胶微球与膜抗原的偶联效率，提高检测结果。

Claims (10)

1.一种红细胞膜碎片与载体的偶联方法，其特征在于，所述的偶联方法包括如下步骤：
S1、超声破碎：冰浴条件下，将红细胞膜碎片进行超声破碎，重悬，透析，得到超声破碎后的红细胞膜碎片；
S2、载体活化：将乳胶微球超声活化，活化缓冲液离心清洗，加入EDC的MES溶液，立即混匀，离心，得到活化后的乳胶微球，常温避光，备用；
S3、偶联：将超声破碎后的红细胞膜碎片与备用的活化后的乳胶微球混匀，离心，得到偶联复合物，常温避光，备用；
S4、透析封闭：将备用的偶联复合物用封闭液复溶，混匀，透析，得到透析后的偶联复合物；
S5、离心收集：将透析后的偶联复合物离心，弃上清；
S6、储存：加入储存缓冲液，重悬偶联复合物，冷藏保存。
2.根据权利要求1所述的偶联方法，其特征在于，步骤S2中，所述的超声活化为在频率40kHz下超声活化30min。
3.根据权利要求1所述的偶联方法，其特征在于，步骤S1中，所述的超声破碎在功率200W下进行，每超声5S停5S，超声破碎总时间为30min。
4.根据权利要求1所述的偶联方法，其特征在于，步骤S3中，红细胞膜碎片与乳胶微球的浓度比为35-45：1。
5.根据权利要求4所述的偶联方法，其特征在于，红细胞膜碎片与乳胶微球的浓度比为40：1。
6.根据权利要求1所述的偶联方法，其特征在于，步骤S1中，所述的重悬为采用0.1M、pH=8.0的Tris-cl重悬浮至体积10ml；所述的透析为采用截留分子量为10KD的透析袋、生理盐水作为透析缓冲液进行透析，透析时间为24h；
步骤S4中，所述的透析为采用截留分子量为100KD的透析袋、封闭液作为透析缓冲液进行透析，透析时间为8h。
7.根据权利要求1所述的偶联方法，其特征在于，
步骤S2中，所述的离心为以1000rpm离心30min；
步骤S3中，所述的离心为以1000rpm离心2.5h；
步骤S5中，所述的离心为以18000rpm离心15min。
8.根据权利要求1-7任意一项所述的偶联方法，其特征在于，
EDC的MES溶液为使用0.05M的MES配制EDC，配制后所得的溶液的浓度为10mg/mL；
所述的活化缓冲液为0.05M、pH=6.1的MES缓冲液；
所述的封闭液为质量分数为7.5%的Gly、质量分数为1%的BSA溶液和质量分数为0.05%的NaN3；
所述的储存缓冲液为0.05M、pH=8.1的Tris缓冲液、质量分数为1%的BSA溶液和质量分数为0.05%的NaN3。
9.一种权利要求1-8任意一项所述的偶联方法得到的偶联复合物在血型抗体检测方面的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，血型抗体检测方面的应用为制备检测血型抗体试剂盒。
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