CN111662869A - 用于分离红细胞的免疫磁珠及其制备方法和应用 - Google Patents

用于分离红细胞的免疫磁珠及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明是关于一种用于分离红细胞的免疫磁珠及其制备方法和应用，涉及免疫磁珠制备技术领域。该免疫磁珠的制备方法包括：步骤S1、用活化剂对磁珠进行活化，所述磁珠与活化剂的重量比例为1:0.1‑5；所述活化的时间为5‑30min；步骤S2、将抗红细胞抗体加入步骤S1得到的活化产物中，进行超声处理；步骤S3、将封闭剂加入步骤S2得到的产物中进行封闭，强磁分离，得到用于分离红细胞的免疫磁珠。本发明方法得到的免疫磁珠用于分离血浆中的红细胞，可以在1‑2min内完成血细胞的分离，节约时间，为快速检测提供基础，同时避免了因离心等因素导致的溶血现象，从而提高了检测结果的准确性。

Description

用于分离红细胞的免疫磁珠及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于免疫磁珠制备技术领域，特别是涉及一种用于分离红细胞的免疫磁珠及其制备方法和应用。
背景技术
免疫磁珠分选法(Immunomagnetic separation，IMS)是近年来兴起的一种用于细胞分选的方法，它是在磁珠表面包被具免疫反应性的抗体进行抗原-抗体反应，在细胞表面形成“抗原-抗体-磁珠”免疫复合物。这些结合了磁珠的细胞一旦置于强大的磁场下，就会定向移动，使免疫复合物与其他未被结合的细胞分群。当具超顺磁性的磁珠脱离磁场后，磁性立即消失，从而达到阳性或阴性选择特定细胞的目的。
临床检查中的血液成分的检查需要将全血中的血清或血浆与含血球的成分予以分离。在临床上，目前常用的血浆分离法为通过离心或者静置将红细胞、白细胞、血小板与血浆分开。但是红细胞会干扰常规试剂盒中免疫磁珠捕获抗原，同时红细胞的破裂会造成大量的血红蛋白、高浓度离子或酶释放引起测量误差，从而降低了标本检测的准确性。
在传统分离方法中，静置分离耗时过长；离心操作不当时可能会造成血细胞的破裂，不利于快速检测。与此同时，某些项目的分子标志物半衰期较短，快速分离血细胞进行检测可以更加真实准确的反映血浆中待测分子的含量；在心肌梗塞患者中，快速准确的结果更有利于为患者争取宝贵的时间，以便在第一时间内进行有效的治疗。
发明内容
本发明的主要目的在于，提供一种用于分离红细胞的免疫磁珠及其制备方法和应用，所要解决的技术问题是现有分离方法存在静置分离耗时过长，离心操作不当会造成血细胞的破裂，不利于快速检测。
本发明的目的及解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。依据本发明提出的一种用于分离红细胞的免疫磁珠的制备方法，其包括：
步骤S1、用活化剂对磁珠进行活化，所述磁珠与活化剂的重量比例为1:0.1-5；所述活化的时间为5-30min；
步骤S2、将抗红细胞抗体加入步骤S1得到的活化产物中，进行超声处理；
步骤S3、将封闭剂加入步骤S2得到的产物中进行封闭，强磁分离，得到用于分离红细胞的免疫磁珠。
本发明的目的及解决其技术问题还可采用以下技术措施进一步实现。
优选的，前述的用于分离红细胞的免疫磁珠的制备方法，其中所述的磁珠为包覆有四氧化三铁或三氧化二铁的微球，表面带有羧基、氨基或羟基。
优选的，前述的用于分离红细胞的免疫磁珠的制备方法，其中所述的磁珠为包裹有四氧化三铁的聚苯乙烯微球。
优选的，前述的用于分离红细胞的免疫磁珠的制备方法，其中所述的磁珠的粒径为1-5μm。
优选的，前述的用于分离红细胞的免疫磁珠的制备方法，其中所述的活化剂包括1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺、戊二醛、过碘酸盐和氯胺-T中的至少一种。
优选的，前述的用于分离红细胞的免疫磁珠的制备方法，其中步骤S2中，所述的抗红细胞抗体与磁珠的质量比为：1：10-1000。
优选的，前述的用于分离红细胞的免疫磁珠的制备方法，其中步骤S3中，所述封闭剂选自1-5wt％牛血清白蛋白溶液、0.1-5wt％酪蛋白溶液和10-50mM甘氨酸中的至少一种。
优选的，前述的用于分离红细胞的免疫磁珠的制备方法，其中所述步骤S3还包括：将得到的用于分离红细胞的免疫磁珠进行清洗，加入保存液中，分散均匀后，按照所需的量分成小份，进行真空干燥，所述保存液为50mM的三羟甲基氨基甲烷和0.5wt％的牛血清白蛋白，所述保存液的pH值为7.8。
优选的，前述的用于分离红细胞的免疫磁珠的制备方法，其中所述的真空干燥包括：将所述的免疫磁珠在压力为10-30Pa、温度低于-30℃下进行真空冷冻干燥处理。
本发明的目的及解决其技术问题还采用以下的技术方案来实现。依据本发明提出的一种用于分离红细胞的免疫磁珠，其是由前述任一项所述的制备方法制备得到。
本发明的目的及解决其技术问题还采用以下的技术方案来实现。依据本发明提出的一种前述的免疫磁珠在分离血浆中的红细胞的应用。
借由上述技术方案，本发明提出的用于分离红细胞的免疫磁珠及其制备方法和应用至少具有下列优点：
本发明的方法通过活化磁珠使磁珠与抗红细胞抗体能更好的结合，经封闭剂封闭后去除未结合的物质，经离心分离，得到用于分离红细胞的免疫磁珠。本发明方法得到的免疫磁珠用于分离血浆中的红细胞，可以在1-2min内完成血细胞的分离，节约时间，为快速检测提供基础，同时避免了因离心等因素导致的溶血现象，从而提高了检测结果的准确性。
本发明得到的免疫磁珠可与红细胞连接在一起，经磁性分离可简单、快速地分离血浆和血细胞，通过免疫反应分离血细胞，对待测物质无影响。利用本发明的免疫磁珠分离去除红细胞，操作简单，可大幅缩短分离红细胞的时间，并大大减少了溶血现象的发生，可应用于全自动和半自动化学发光仪，配合相应的体外诊断试剂盒进行全血样本的检测。
本发明的免疫磁珠保质期长，且能一直保有较高的活性，且简单便携，节省空间。
本发明方法操作简单、易实现，得到的免疫磁珠可结合POCT发光试剂盒，用于全血检测。
本发明的免疫磁珠可帮助化学发光检测装置或免疫比浊检测装置进行全血检测，在保证检测准确度的同时更方便，适用范围更广；同时也可应用于免疫层析检测，全血中血细胞的存在会对检测准确性产生一定干扰，通过添加本发明的免疫磁珠，可有效降低检测时全血中血细胞的影响，使检测结果更准确。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。
附图说明
图1示出了本发明一个实施方式提供的在全血样品中加入免疫磁珠前的示意图；
图2示出了本发明一个实施方式提供的在全血样品中加入免疫磁珠后的示意图。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明为达成预定发明目的所采取的技术手段及功效,以下结合附图及较佳实施例，对依据本发明提出的用于分离红细胞的免疫磁珠及其制备方法和应用其具体实施方式、结构、特征及其功效，详细说明如后。在下述说明中，不同的“一实施例”或“实施例”指的不一定是同一实施例。此外，一或多个实施例中的特定特征、结构或特点可由任何合适形式组合。
本发明的一个实施方式提出一种用于分离红细胞的免疫磁珠的制备方法，其包括：
步骤S1、清洗磁珠，去除杂质，向清洗后的磁珠沉淀中加入磷酸缓冲液，使pH值在5.0-6.5的范围内，优选pH 6.0，酸性条件更有利于基团的活化，超声混匀磁珠溶液，超声的目的是为了混合均匀，优先超声条件为40kHz，6min，向磁珠中加入活化剂，并超声混匀，优先超声条件为40kHz，6min，所述磁珠与活化剂的重量比例为1:0.1-5，之后将该活化后溶液放置于摇床上，在37℃，100rpm下震荡反应24min。
步骤S2、将抗红细胞抗体加入步骤S1得到的活化产物中，进行超声处理；超声处理使得磁珠与抗红细胞抗体反应更均匀，结合更充分，防止微珠下沉聚集。
步骤S3、将封闭剂加入步骤S2得到的产物中进行封闭，强磁分离，得到用于分离红细胞的免疫磁珠。
本发明实施方式所说的磁珠是指通过一定方法将磁性无机离子与有机高分子结合形成的具有一定磁性及特殊结构的体积在几纳米到几十微米之间的载体微球。载体微球常为铁的氧化物或者铁的硫化物，核心外包裹一层高分子材料，最外层是功能集团，使其具有疏水-亲水、非极性-极性、带正电荷-带负电荷等不同的物理性质；同时具有磁响应性，在外磁场作用下具有磁导向型。为了满足后续磁分离需要，本发明的磁珠应具备以下特点：粒径比较小，比表面积较大，具有较大的吸附容量；物理和化学性能稳定，具有较高的机械强度，使用寿命长；具有可活化的反应基团，以用于亲和配基的固定化；粒径均一，能形成单分散体系；悬浮性好，便于反应的有效进行。
磁珠经活化剂活化后，打开磁珠表面的羧基或羟基等活性基团，使磁珠与抗体可以更加快速的结合，增加磁珠的反应活性。
在一些实施方式中，在所述步骤S2中，所述活化的时间为5-30min；所述的活化剂包括1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺、戊二醛、过碘酸盐和氯胺-T中的至少一种。
在一些实施方式中，磁珠为包覆有四氧化三铁或三氧化二铁的微球，其表面有羧基、氨基或羟基等活性基团。
本实施方式中，磁珠为包裹有磁性无机离子的有机高分子，表面带有活性基团的微球，如氨基化三氧化二铁磁性微球、带羧基的四氧化三铁磁性微球等。
在一些实施方式中，所述的磁珠为包裹有四氧化三铁的聚苯乙烯微球。
该磁珠经活化后可以快速与抗红细胞抗体结合，并在磁力的作用下发生聚沉。
在一些实施方式中，所述的磁珠的粒径为1-5μm。
磁珠的粒径大于5μm不易于与抗体偶联，磁珠的粒径小于1μm不易于强磁分离，优选磁珠的粒径为2-4μm。
在一些实施方式中，所述的抗红细胞抗体与活化磁珠的质量比或体积比为：1：(10-1000)。
抗红细胞抗体与磁珠结合原理：磁珠中含有羧基，经活化后可以增加其反应活性，与抗红细胞抗体中的氨基反应。
在一些实施方式中，在步骤S3中，所述封闭剂选自1-5wt％牛血清白蛋白溶液、0.1-5wt％酪蛋白溶液和10-50mM甘氨酸中的至少一种。封闭的时间为5min-30min；转速为100-200rpm。
进一步的，上述实施方式的制备方法还包括：
将得到的用于分离红细胞的免疫磁珠进行清洗，加入保存液中，分散均匀后，按照所需的量分成小份，进行真空干燥。
该步骤中使用的清洗剂与步骤S3中的封闭剂相同，加入清洗剂后超声重悬磁珠，然后进行强磁分离，再清洗两遍。根据保存液与磁珠的比例，分装到西林瓶中进行冷冻干燥。
保存液一般为含BSA的Tris溶液，加入保存液的免疫磁珠可以4℃保存14天。
在一些实施方式中，所述保存液为50mM的三羟甲基氨基甲烷和0.5wt％的牛血清白蛋白，所述保存液的pH值为7.8。
在一些实施方式中，所述的真空干燥包括：将所述的免疫磁珠在压力为10-30Pa、温度低于-30℃下进行真空冷冻干燥处理。
本发明实施方式使用真空冷冻干燥，可使免疫磁珠更好的保持原有的特性，减少品质的损失。真空干燥使蒸发和沸腾同时进行，加快汽化速度，抽真空又快速抽出汽化的蒸汽，并在磁珠周围形成负压状态，使磁珠的表面与周围介质形成较大的适度梯度，加快汽化，以期达到快速干燥。
本发明的方法通过活化磁珠使磁珠与抗红细胞抗体能更好的结合，经封闭剂封闭后去除未结合的物质，经离心分离，得到用于分离红细胞的免疫磁珠。该本发明方法操作简单、易实现。
本发明的一个实施方式还提出一种用于分离红细胞的免疫磁珠，所述的免疫磁珠是由前述的制备方法制备得到。
本发明得到的免疫磁珠可结合POCT发光试剂盒，用于全血检测。本发明中使用的样本为新鲜全血，可以单独做全血处理装置使用，也可以作为POCT化学发光试剂的一部分进行使用。
本发明的一个实施方式还提出一种免疫磁珠在分离血浆中的红细胞的应用。
如图1-2所示，给出了本发明实施方式的免疫磁珠在分离血浆中的红细胞的应用，图1为加入免疫磁珠前的示意图，先将待测的全血样品(包括血浆2和红细胞3)放置在一个玻璃管1中，加入得到的免疫磁珠4，1mL的全血样品加入0.1-10mg的免疫磁珠；图2为加入免疫磁珠后的示意图，加入免疫磁珠4后，玻璃管1中的红细胞3与免疫磁珠4结合成红细胞-磁珠免疫复合物5，将玻璃管1的底部放置在强磁性的磁铁6上，在强磁性的磁铁的作用下，玻璃管1中的红细胞-磁珠免疫复合物5向玻璃管1的底部运动，而血浆2留在上层，使血浆2和红细胞3分离，得到血浆2，用于检测。
本发明的工作原理为：通过化学手段将抗血红细胞抗体与磁珠进行连接得到免疫磁珠，该免疫磁珠接触全血时，会与血红细胞进行反应，生成红细胞-抗红细胞抗体-磁珠复合物，进而通过磁性分离达到去除红细胞的目的。本发明基于免疫磁珠分离技术，可以简单快速的分离血浆和血细胞。
免疫磁珠分离技术是一种特异性磁分离技术。免疫磁珠既可结合活性蛋白质(抗体)，又可被磁铁所吸引，经过一定的处理后，可将抗体结合在磁珠上，使之成为抗体的载体，磁珠上抗体与特异性抗原物质结合后，则形成抗原-抗体-磁珠免疫复合物，这种复合物在磁力的作用下，发生力学移动，使复合物与其他物质分离，而达到分离特异性抗原的目的。本发明免疫磁珠作用方式为直接法，先用抗体包被磁珠，使抗体与磁珠结合(物理吸附或化学结合)，再加入抗原物质，二者结合形成复合物，在磁力的作用下，与其他物质分离。
本发明可以为部分检测方法学进行全血检测提供帮助。如在使用化学发光法、免疫比浊法相关设备检测样本时，若样本类型为全血，其中的血细胞对检测结果影响较大，一般应用化学发光或免疫比浊等方法学进行检测时，样本需要是血浆或血清，全血无法进行检测，使用本发明的免疫磁珠后，可帮助化学发光检测装置或免疫比浊检测装置进行全血检测，在保证检测准确度的同时更方便，适用范围更广；同时也可应用于免疫层析检测，全血中血细胞的存在会对检测准确性产生一定干扰，通过添加本发明的免疫磁珠，可有效降低检测时全血中血细胞的影响，使检测结果更准确。
下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明，但不能理解为是对本发明保护范围的限制，该领域的技术人员根据上述本发明的内容对本发明作出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
以下材料或试剂，如非特别说明，均为购买。
实施例1
一种用于分离红细胞的免疫磁珠的制备方法，具体包括以下步骤：
1.1.1磁珠的清洗：
磁珠的原始浓度为2.0wt％，加入10mM磷酸缓冲液(pH 6.0)，强磁离心，舍弃上清液，重复两次，得到磁珠沉淀。
1.1.2活化：
1)配制活化剂溶液：
活化剂选用重量比例为1:1的N-羟基琥珀酰亚胺和1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺，分别使用10mM(pH 6.0)的磷酸缓冲液配制成500mg/mL的溶液，备用；
2)磁珠的活化：
向清洗后的磁珠沉淀中加入10mM的磷酸缓冲液(pH 6.0)，超声混匀(40kHz，6min)得到100mg/mL的磁珠溶液，将之前步骤1)配制的500mg/ml的N-羟基琥珀酰亚胺与1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺混合溶液(磁珠、N-羟基琥珀酰亚胺与1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺三者的重量比例为1:2.5:2.5)加入其中并超声混匀(40kHz，6min)，所得的溶液中磁珠的浓度为10mg/mL，N-羟基琥珀酰亚胺的浓度为25mg/mL，1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺的浓度为25mg/mL；之后将该溶液放置于摇床上，37℃，100rpm下震荡反应24min。
3)活化磁珠离心：
活化结束的磁珠溶液使用10mM磷酸缓冲液(pH 6.0)进行强磁离心，舍弃上清液，重复两次。
1.1.3偶联：
向活化离心所得的磁珠沉淀中先加入10mM磷酸缓冲液(pH 6.0)，超声混匀(40kHz，6min)，使磁珠的最终浓度为10mg/mL；再加入抗红细胞抗体，其中磁珠与抗红细胞抗体的重量比例为100:1，超声混匀(40kHz，6min)，放置于摇床上，37℃，100rpm震荡反应4h。反应过程中每半小时超声混匀一次(40kHz，6min)，避免沉淀产生。
1.1.4封闭：
标记结束后向磁珠溶液中加入与其溶液等体积的50mM甘氨酸溶液(pH 7.4)，超声混匀(40kHz，6min)，放置于摇床上，37℃，100rpm震荡反应14min。反应结束后使用50mM甘氨酸溶液(pH 7.4)离心清洗，转速14000rpm，时间9min，舍弃上清液，重复两次。
1.1.5保存：
向封闭离心结束后所得的磁珠沉淀中加入储存液(50mM Tris，0.5wt％BSA，pH7.8)，使得最终磁珠浓度为5mg/ml，超声混匀(40kHz，6min)，4℃保存。
1.1.6真空干燥：
将该磁珠储存液超声混匀(40kHz，6min)，按0.2ml/瓶分装到5mL西林瓶中，用纱布封口，放进真空冷冻干燥器，在10Pa、-50℃进行真空冷冻干燥12h。该试剂可以在4℃保存两年。
实施例2
将实施例1得到的免疫磁珠用于分离血浆中的红细胞，使用时取0.5mL全血加入实施例4中的西林瓶中，摇匀，然后置于磁力架或者磁铁上，2min后即得上层血浆。
实施例3
对比磁珠分离法和静置法，用PCT试剂盒检测其结果差异。
分别取20份新鲜抗凝全血，均匀的分成两组，在其中一组加入实施例1得到的免疫磁珠，然后至于磁力架上，记为免疫磁珠组；另一组自然放置分离血浆，记为自然放置组。2min后，免疫磁珠组的血细胞基本沉降；而自然放置组基本上需要耗时20-30min才能得到血浆。
将两组得到的血浆同时用PCT试剂盒检测，对比两组检测结果，无明显差异，其检测结果如表1所列。
表1
编号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
磁珠组(ng/ml) 0.21 0.07 0.14 0.55 0.29 1.07 0.88 0.10 0.32 0.64
放置组(ng/ml) 0.20 0.07 0.15 0.57 0.30 1.09 0.86 0.11 0.30 0.66
由表1可看出，使用本发明得到的免疫磁珠进行磁性分离血细胞方法简单有效，可以快速的分离血细胞得到血浆，且无残留，对待检物质无影响。
实施例4
一种用于分离红细胞的免疫磁珠的制备方法，具体包括以下步骤：
4.1.1磁珠清洗：
磁珠的原始浓度为5.0wt％，使用10mM磷酸缓冲液(pH 7.0)强磁离心，舍弃上清液，重复两次，得到磁珠沉淀。
4.1.2活化：
1)配制活化剂溶液：
活化剂选1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺，分别使用10mM(pH7.0)的磷酸缓冲液配制成250mg/mL的溶液，备用；
2)磁珠活化：
向清洗后的磁珠沉淀中加入10mM的磷酸缓冲液(pH 7.0)，超声混匀(40kHz，6min)得到100mg/mL的磁珠溶液，将之前步骤1)配制的250mg/ml的1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺溶液(磁珠、1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺的重量比例为1:5)加入其中并超声混匀(40kHz，6min)，所得的溶液中磁珠的浓度为10mg/mL，1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺的浓度为50mg/mL；之后将该溶液放置于摇床上，37℃，100rpm下震荡反应24min。
3)活化磁珠离心：
活化结束的磁珠溶液使用10mM磷酸缓冲液(pH 7.0)进行强磁离心，舍弃上清液，重复两次。
4.1.3偶联：
向活化离心所得的磁珠沉淀中先加入10mM磷酸缓冲液(pH 7.0)，超声混匀(40kHz，6min)，使磁珠的最终浓度为10mg/mL；再加入抗红细胞抗体，其中磁珠与抗红细胞抗体的重量比例为200:1，超声混匀(40kHz，6min)，放置于摇床上，37℃，100rpm震荡反应2h。反应过程中每半小时超声混匀一次(40kHz，6min)，避免沉淀产生。
4.1.4封闭：
标记结束后向磁珠溶液中加入与其溶液等体积的50mM酪蛋白溶液(pH 7.4)，超声混匀(40kHz，6min)，放置于摇床上，37℃，100rpm震荡反应24min。反应结束后使用50mM酪蛋白溶液(pH 7.4)进行强磁分离，舍弃上清液，重复两次。
4.1.5保存：
向封闭离心结束后所得的磁珠沉淀中加入储存液(50mM Tris，0.5wt％BSA，pH7.8)，使得最终磁珠浓度为5mg/mL，超声混匀(40kHz，6min)，4℃保存。
4.1.6真空干燥：
将该磁珠储存液超声混匀(40kHz，6min)，按0.4ml/瓶分装到5mL西林瓶中，用纱布封口，放进真空冷冻干燥器在10Pa、-50℃进行真空冷冻干燥10h。该试剂可以在4℃保存两年。
实施例5
将实施例4得到的免疫磁珠用于分离血浆中的红细胞，使用时取0.5mL全血加入实施例4中的西林瓶中，摇匀，然后置于磁力架或者磁铁上，2min后即得上层血浆。
实施例6
对比磁珠分离法和静置法，用PCT试剂盒检测其结果差异。
分别取20份新鲜抗凝全血，均匀的分成两组，在其中一组加入实施例4得到的免疫磁珠，然后至于磁力架上，记为免疫磁珠组；另一组自然放置分离血浆，记为自然放置组。2min后，免疫磁珠组的血细胞基本沉降；而自然放置组基本上需要耗时20-30min才能得到血浆。
将两组得到的血浆同时用CPR试剂盒检测，对比两组检测结果，无明显差异，其检测结果如表2所列。
表2
编号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
磁珠组(ng/ml) 8.62 1.09 15.37 2.15 56.74 3.80 6.41 11.97 3.99 7.91
放置组(ng/ml) 8.23 1.26 15.00 2.28 55.23 3.85 6.09 12.33 4.05 7.98
由表2可看出，使用本发明得到的免疫磁珠进行磁性分离血细胞方法简单有效，可以快速的分离血细胞得到血浆，且无残留，对待检物质无影响。
在上述实施例中，对各个实施例的描述都各有侧重，某个实施例中没有详述的部分，可以参见其他实施例的相关描述。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明,任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内,当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (11)

1.一种用于分离红细胞的免疫磁珠的制备方法，其特征在于，包括：
步骤S1、用活化剂对磁珠进行活化，所述磁珠与活化剂的重量比例为1:0.1-5；所述活化的时间为5-30min；
步骤S2、将抗红细胞抗体加入步骤S1得到的活化产物中，进行超声处理；
步骤S3、将封闭剂加入步骤S2得到的产物中进行封闭，强磁分离，得到用于分离红细胞的免疫磁珠。
2.根据权利要求1所述的用于分离红细胞的免疫磁珠的制备方法，其特征在于，所述的磁珠为包覆有四氧化三铁或三氧化二铁的微球，其表面带有羧基、氨基或羟基。
3.根据权利要求2所述的用于分离红细胞的免疫磁珠的制备方法，其特征在于，所述的磁珠为包裹有四氧化三铁的聚苯乙烯微球。
4.根据权利要求1所述的用于分离红细胞的免疫磁珠的制备方法，其特征在于，所述的磁珠的粒径为1-5μm。
5.根据权利要求1所述的用于分离红细胞的免疫磁珠的制备方法，其特征在于，所述的活化剂包括1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺、戊二醛、过碘酸盐和氯胺-T中的至少一种。
6.根据权利要求1所述的用于分离红细胞的免疫磁珠的制备方法，其特征在于，步骤S2中，所述的抗红细胞抗体与磁珠的质量比为：1：10-1000。
7.根据权利要求1所述的用于分离红细胞的免疫磁珠的制备方法，其特征在于，步骤S3中，所述封闭剂选自1-5wt％牛血清白蛋白溶液、0.1-5wt％酪蛋白溶液和10-50mM甘氨酸中的至少一种。
8.根据权利要求1所述的用于分离红细胞的免疫磁珠的制备方法，其特征在于，所述步骤S3还包括：
将得到的用于分离红细胞的免疫磁珠进行清洗，加入保存液中，分散均匀后，按照所需的量分成小份，进行真空干燥，所述保存液为50mM的三羟甲基氨基甲烷和0.5wt％的牛血清白蛋白，所述保存液的pH值为7.8。
9.根据权利要求8所述的用于分离红细胞的免疫磁珠的制备方法，其特征在于，所述的真空干燥包括：将所述的免疫磁珠在压力为10-30Pa、温度低于-30℃下进行真空冷冻干燥处理。
10.一种用于分离红细胞的免疫磁珠，其特征在于，所述的免疫磁珠是由权利要求1-9中任一项所述的制备方法制备得到。
11.一种权利要求10所述的免疫磁珠在分离血浆中的红细胞的应用。
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