CN111308070A - 一种用于从全血中分离红细胞的试剂盒及其从全血中分离红细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了用于从全血中分离红细胞的试剂盒及其从全血中分离红细胞的方法。包括化学偶联的抗RBC抗体的磁珠，植物凝集素和/或抗RBC抗体。再用试剂盒中的该得到的化学偶联抗RBC抗体的磁珠，配合植物凝集素和/或游离的抗RBC抗体，从全血中分离红细胞。该分离方法快速，分离效果好。
Description
技术领域
本发明涉及细胞分离领域，尤其涉及一种用于从全血中分离红细胞的试剂盒及其从全血中分离红细胞的方法。
背景技术
目前用于红细胞分离的方式，主要为离心方法，离心方法很难实现红细胞分离的自动化，不利于检测设备的小型化，而红细胞的存在对现有的血液标志物检测带来很大的干扰。中国专利申请号200710305363.6从全血中分离红细胞的方法公开了采用加入标记好植物凝集素或抗红细胞抗体的微球达到分离红细胞的目的。但是分离需要10min以上，时间较长。专利申请号200810244503.8利用冻干制剂快速分离人全血或悬浮红细胞上清的方法公开的是采用植物凝集素或抗红细胞抗体包被微球，再制备成冻干制剂后与全血混匀后达到分离红细胞的目的。但是该技术方案分离需要2-3min，试剂为冻干。这两个技术方案均尝试使用磁珠进行红细胞分离，但植物凝集素或抗RBC抗体与磁珠偶联均使用的是物理吸附，分离全血样本要求较多，比如中国专利申请200710305363.6，样本不加任何凝集素或其他试剂，对样本的检测时间提出了要求，临床上通常会集中一部分患者样本，同时进行上机检测，同时在检测时间上对全血样本有所限制；中国专利申请200810244503.8，其分离时间相对较长，需要2-3min。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于从全血中分离红细胞的试剂盒，使用该试剂盒进行全血分离红细胞，该方法快速，分离效果好。
为实现上述目的，本发明提供一种用于从全血中分离红细胞的试剂盒，其特征在于，包括化学偶联的抗RBC抗体的磁珠，植物凝集素和/或抗RBC抗体。
进一步，所述化学偶联的抗RBC抗体的磁珠的制备方法为，
磁珠活化：往经过MEST溶液洗涤后的羧基磁珠中加入新配制的EDC溶液，混匀使磁珠充分悬浮后活化，活化过程中使磁珠保持悬浮状态；
加入抗体进行偶联：将上述活化后的磁珠磁性分离去除上清液后得到磁珠悬液，再加入抗RBC抗体后轻柔混匀，抗RBC抗体存在于pH8.0 PBS，内含0.05％Tween20的溶液中；进行偶联，偶联期间保持磁珠的悬浮状态；
洗涤：磁性分离去除上清液，加入PBST溶液重悬磁珠，反应，封闭磁珠表面未反应的活化羧基基团，期间保持磁珠的悬浮状态；磁性分离去除上清液，用pH7.2的PBS溶液洗涤2-4次后，重新悬浮于保存液中即得到化学偶联的抗RBC抗体的磁珠。
进一步，所述磁珠活化步骤中，经过MEST溶液洗涤后的羧基磁珠为往磁珠中；优选的，磁珠的粒径为1-4μm；加入MEST溶液后，磁性分离洗涤1-3次，优选2次，然后移除上清液；洗涤时，使用2倍于磁珠体积的MEST溶液进行洗涤。
任选的，所述活化为20-30℃20-40min；优选的，活化为25℃30min；
进一步，所述加入抗体进行偶联步骤中，抗体的加入量为,100μL 10mg/mL的磁珠悬液加入50-200μg抗RBC抗体；优选的，加入200μg抗RBC抗体。
任选的，所述偶联为23-27℃1.5-2.5h；优选的，为25℃2h。
进一步，所述洗涤步骤中，所述反应为23-27℃反应0.5-1.5h；优选的，为25℃反应1h。
任选的，所述所述MEST溶液为100mM MES，pH 5.0，0.05％Tween20；EDC溶液为将10mg/mL的EDC分散于所述MEST中所得溶液；所述PBST溶液为pH7.2，0.05％Tween20，1％BSA的PBS溶液；
所述保存液为30-50mM pH5.0-8.5的PBS或MEST或HEPES或Tris-HCl或CBS缓冲液。
进一步，所述化学偶联的抗RBC抗体的磁珠的制备方法为，
磁珠活化：取100μL 10mg/mL羧基磁珠到1mL离心管中，磁性分离去除上清液，用200μL MEST溶液进行磁性分离洗涤2次，然后移除上清液；再加入新配制的200μL EDC溶液，混匀使磁珠充分悬浮后活化，25℃活化30min，该期间使用摇床晃动混匀，使磁珠保持悬浮状态；经过上述步骤，磁珠表面羧基已经活化，可与抗RBC抗体进行共价偶联；
加入抗体进行偶联：将上述活化后的磁珠磁性分离去除上清液，加入200μg的抗RBC抗体后轻柔混匀，抗体存在于pH8.0 PBS，内含0.05％Tween20的溶液中；25℃偶联2h，偶联期间保持磁珠的悬浮状态；
洗涤：磁性分离去除上清液，加入200μL PBST溶液重悬磁珠，25℃反应1h，封闭磁珠表面未反应的活化羧基基团，期间保持磁珠的悬浮状态；磁性分离去除上清液，用200μLpH7.2的PBS溶液洗涤2-4次后，重新悬浮于保存液中即得到化学偶联的抗RBC抗体的磁珠。
本发明还提供一种从全血中分离红细胞的方法，其特征在于，使用了所述用于从全血中分离红细胞的试剂盒。
进一步，包括如下步骤，
取所述用于从全血中分离红细胞的试剂盒中的化学偶联的抗RBC抗体的磁珠，磁性分离去上清，加入植物凝集素和/或抗RBC抗体，轻轻吹打混匀，再加入全血，轻轻吹打混匀，进行磁性吸附，吸取上清即可；
所述全血为EDTA-2Na或枸橼酸钠或肝素钠的抗凝全血或未加抗凝剂的全血。
进一步，所述植物凝集素的用量为终浓度为50-500μg/mL；
任选的，所述抗RBC抗体的用量为终浓度0.5-5μg/mL。
本发明公开了一项用于常规全血中，红细胞的快速分离方法，所述方法简单，易实现自动化，有利于快速检测设备及试剂的开发。
本发明使用化学偶联方式将抗RBC直接或间接连接到磁珠上，配合含有游离抗RBC和/或植物凝集素的分离体系，可在液体状态下，快速分离红细胞(2min内，最优的分离时间可控制在10-20秒)，且对全血样本无特殊要求，含常见的EDTA、枸橼酸钠、肝素钠等抗凝全血样本及不添加抗凝剂的全血样本均可使用。
将抗红细胞抗体(抗RBC抗体)与磁性颗粒偶联进行标记，标记后的磁性颗粒可以通过红细胞抗体特异性结合在红细胞表面，然后通过磁性吸附，使得结合了磁性颗粒的红细胞向磁铁方向快速富集，最终达到分离的目的。另外，在红细胞中加入游离的部分抗RBC、植物凝集素等，有利于红细胞的富集，达到快速分离血浆/血清的目的。在整个方法反应过程中，主要关键组成除了直接或间接化学偶联的磁珠；还需要有游离的植物凝集素和/或抗RBC。
本发明从全血中分离红细胞的方法的原理为磁珠与抗RBC抗体进行化学偶联，偶联后的磁珠通过抗RBC抗体特异性结合红细胞表面抗原并相互聚集，同时游离的抗RBC和植物凝集素也可以和红细胞特异性或非特异性结合并相互聚集，最后通过磁铁吸附，使结合磁珠的红细胞向磁铁方向快速聚集，达到分离的目的，见图1和图2。图1是红细胞聚集原理图，包含偶联抗RBC抗体的磁珠与红细胞聚集原理，游离抗RBC抗体与红细胞聚集原理，游离植物凝集素与红细胞聚集原理以及上述三种聚集物通过暴露表位继续相互聚集的原理图示。图2是全血分离红细胞原理图，包含磁珠-抗RBC抗体-红细胞，抗RBC抗体-红细胞，植物凝集素-红细胞以上三种单独的聚集体或他们彼此结合的聚集体被磁铁吸附，完成红细胞分离的原理图示。其中图1的图一表示磁珠与抗RBC抗体进行化学偶联，偶联后的磁珠通过抗RBC抗体特异性结合红细胞表面抗原并相互聚集，图二表示游离的抗RBC抗体与红细胞特异性结合并相互聚集，图三表示游离的植物凝集素与红细胞非特异性结合并相互聚集，图四表示磁珠-抗RBC抗体、游离抗RBC抗体、游离植物凝集素共同存在时，与红细胞通过特异性/非特异性结合，并通过暴露的表位相互聚集。图2表示通过磁铁吸附，使直接或间接结合了磁珠的红细胞向磁铁方向快速聚集，达到分离的目的。
附图说明
图1是红细胞聚集原理图。
图2是全血分离红细胞原理图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1：抗RBC与羧基磁珠偶联(1)
1、取羧基磁珠(如购自苏州为度公司)1mg到1mL离心管中，磁珠粒径为1μm，用200μLMEST溶液(100mMMES，pH5.0，0.05％Tween20)洗涤2次，磁性分离去除上清液；
2、迅速加入新配制的200μLEDC溶液(10mg/mL，用上述MEST做分散剂)到装有磁珠的离心管中，涡旋混匀使磁珠充分悬浮，25℃活化30min，该期间使用摇床晃动混匀，使磁珠保持悬浮状态；经过上述步骤，磁珠表面羧基已经活化，可与抗RBC抗体进行共价偶联。
3、磁性分离去除上清液，加入200μg的抗RBC抗体，抗体保持液为pH8.0 PBS，内含0.05％Tween20，同时避免缓冲体系中存在除抗RBC抗体以外含有伯氨基的试剂，轻柔混匀；
4、25℃偶联2h，偶联期间保持磁珠的悬浮状态；
5、磁性分离去除上清液，加入200μLPBST溶液(pH7.2，0.05％Tween20，1％BSA)重悬磁珠，25℃反应1h，封闭磁珠表面未反应的活化羧基基团，期间保持磁珠的悬浮状态；
6、离心管磁性分离去除上清液，用200μL PBS溶液(pH7.2)洗涤3次后，重新悬浮于10mM pH 7.2PBS中，4℃保存。长期保存加入防腐剂与0.2％BSA，放置于4℃冰箱中，记为(1)磁珠。
实施例2：抗RBC-链霉亲和素磁珠偶联(2)
1、取链霉亲和素磁珠(如购自苏州为度公司)1mg到1mL离心管中，磁珠粒径1μm；
2、加入1mL Buffer(40mM PBS，pH7.4，含0.05％Tween20，0.01％-0.1％BSA)到离心管中，充分振荡重悬磁珠，磁性分离去上清液；
3、重复步骤2两次；
4、加入1mL用该Buffer稀释的生物素化抗RBC，则磁珠浓度为1mg/mL，充分混匀后，于摇床上，室温旋转混合60min；
5、磁性分离去上清液，将上清液转移至新的离心管中；
6、按步骤2洗涤磁珠5次，加入200ulBuffer缓冲液，至此，结合生物素化抗体完成，记为(2)磁珠。
实施例3：抗RBC-葡聚糖-羧基磁珠偶联(3)
1、取羧基磁珠(如购自苏州为度公司)1mg到1mL离心管中，磁珠粒径为1μm，用200μLMEST溶液(100mMMES，pH5.0，0.05％Tween20)洗涤2次，磁性分离去除上清液；
2、迅速加入新配制的200μLEDC溶液(10mg/mL，用上述MEST做分散剂)到装有磁珠的离心管中，涡旋混匀使磁珠充分悬浮，25℃活化30min，该期间使用摇床晃动混匀，使磁珠保持悬浮状态；
3、加入氨基葡聚糖2.8μg，轻柔混匀，放摇床上过夜偶联；
4、磁性分离上清液，加入200μL封闭液溶液(pH7.2PBST，0.05％Tween20，1％BSA)重悬磁珠，放摇床上封闭反应1h,磁分离去上清，加入112μL新配的1mg/mL NaIO4溶液，悬浮混合30分钟；
5、磁性分离去上清，加入224μg抗RBC抗体，用PH9.5 0.02M的CB(0.2mol/L碳酸盐缓冲液pH9.5无水碳酸钠0.32g+碳酸氢钠0.586g+50mL蒸馏水或去离子水)补加到500μL，室温轻轻悬浮混合2小时；
6、加500μL乙醇胺溶液(1％，水稀释)，混匀，室温悬浮混合2小时；
7、磁性分离上清液，PBS洗涤3次，置换到200μL保存液中(保存液：10mM pH7.2Tris、0.5％Casein-Na、0.2％Tween 20、0.8％BSA、1％PEG20000、1‰proclin300)，记为(3)磁珠。
实施例4：
分别取振荡均匀的(1)、(2)、(3)磁珠各100μL，各自加入100μL EDTA-2Na、枸橼酸钠、肝素钠的抗凝全血和未加抗凝剂的全血，轻轻吹打混匀，进行磁性吸附，吸附时间1min,吸取上层血浆/血清结果见表1。
表1磁珠直接吸附分离全血实验的结果表
实施例5：
分别取振荡均匀的偶联磁珠(1)、(2)、(3)磁珠100μL，均加入1μL 10mg/mL植物凝集素，轻轻吹打混匀，再各自加入100μL EDTA-2Na、枸橼酸钠、肝素钠的抗凝全血和未加抗凝剂的全血，轻轻吹打混匀，进行磁性吸附。吸附时间1min,吸取上层血浆/血清。结果见表2。
表2添加游离植物凝集素分离全血实验的结果表
实施例6：
分别取振荡均匀的(1)、(2)、(3)磁珠100μL，均加入5μL 0.1mg/mL抗RBC抗体，轻轻吹打混匀，再各自加入100μLEDTA-2Na、枸橼酸钠、肝素钠的抗凝全血和未加抗凝剂的全血，轻轻吹打混匀，进行磁性吸附。吸附时间1min,吸取上层血浆/血清。结果见表3。
表3添加游离抗RBC抗体分离全血实验的结果表
实施例7
分别取振荡均匀的(1)、(2)、(3)磁珠100μL，均加入1μL 10mg/mL植物凝集素，再加入5μL 0.1mg/mL抗RBC抗体，轻轻吹打混匀，再各自加入100μL EDTA-2Na、枸橼酸钠、肝素钠的抗凝全血和未加抗凝剂的全血，轻轻吹打混匀，进行磁性吸附。吸附时间1min,吸取上层血浆/血清。结果见表4。
表4添加游离植物凝集素与抗RBC抗体分离全血实验的结果表
从表1-表4的结果可以看出，
经过植物凝集素处理，磁珠吸附后，分离所得血浆/血清体积较与未添加任何物质相比，平均有9.2μL的增加量，并且，经过植物凝集素的凝集作用，红细胞聚集颗粒变大，分离所得血浆/血清中游离红细胞数量较不加任何物质有明显的降低；
经过抗RBC抗体处理，磁珠吸附后，分离所得血浆/血清体积较与未添加任何物质相比，平均有62μL的增加量，并且，经过抗RBC抗体的凝集作用，红细胞聚集更快，颗粒更密集，分离所得血浆/血清中游离红细胞数量较不加任何物质有明显的降低；
经过植物凝集素和抗RBC抗体双处理，磁珠吸附后，分离所得血浆/血清体积较与未添加任何物质相比，平均有90μL的增加量，并且，经过植物凝集素和抗RBC抗体的凝集作用，红细胞聚集颗粒变大，聚集更快，分离所得血浆/血清中游离红细胞数量较只添加凝集素或抗RBC抗体有进一步的的降低。
实施例8：
分别取粒径为350nm、1μm、3μm、5μm羧基磁珠(如购自苏州为度公司)各1mg，按照以下操作进行标记，得出标记后的磁珠分别记为(4)磁珠、(5)磁珠、(6)磁珠、(7)磁珠。
1、混匀磁珠后，取1mg羧基磁珠(到1mL离心管中，磁性分离去除上清液，用200μLMEST溶液(100mM MES，pH5.0，0.05％Tween 20)进行磁性分离洗涤2次，然后移除上清液；
2、迅速加入新配制的200μL EDC溶液(10mg/mL，用上述MEST做分散剂)到装有磁珠的离心管中，涡旋混匀使磁珠充分悬浮，25℃活化30min，该期间使用摇床晃动混匀，使磁珠保持悬浮状态；经过上述步骤，磁珠表面羧基已经活化，可与抗RBC进行共价偶联。
3、磁性分离去除上清液，加入200μg的抗RBC抗体，抗体保持液以pH8.0 PBS，内含0.05％Tween 20，避免缓冲体系中存在除抗RBC以外含伯氨基的试剂，轻柔混匀；
4、25℃偶联2h，偶联期间保持磁珠的悬浮状态；
5、离心管磁性分离去除上清液，加入200μL PBST溶液(pH7.2，0.05％Tween20，1％BSA)重悬磁珠，25℃反应1h，封闭磁珠表面未反应的活化羧基基团，期间保持磁珠的悬浮状态；
6、离心管磁性分离去除上清液，用200μL PBS溶液(pH7.2)洗涤3次后，重新悬浮于pH7.2,10mM PBS中，4℃保存，长期保存加入防腐剂与0.2％BSA，置于4℃冰箱。
实施例9：
使用(4)磁珠、(5)磁珠、(6)磁珠、(7)磁珠分别进行全血分离，各取100μL磁珠，加入1μL 10mg/mL植物凝集素，再加入5μL 0.1mg/mL抗RBC抗体，再分别加入100μL EDTA-2Na、枸橼酸钠、肝素钠的抗凝全血和未加抗凝剂的全血，轻轻吹打混匀，进行磁性吸附。吸附时间1min,吸取上层血浆/血清。
表5不同粒径羧基磁珠(含植物凝集素和游离抗RBC抗体)分离全血效果对比实验的结果表
从表5的结果可以看出，经过植物凝集素和抗RBC抗体的双重处理后，(4)(5)(6)(7)吸附全血所得血浆/血清体积均值分别为44μL，119μL，95μL和94μL，分离所得的血浆/血清中游离红细胞数量没有明显区别。可以看出，相同实验条件下，粒径为1-5μm的磁珠，特别是1μm的磁珠，吸附全血效果好。
实施例10：
使用(1)磁珠100μL，进行植物凝集素使用量进行确认，加入0.1μL、0.5μL、1μL、5μL、10μL、20μL的10mg/mL植物凝集素，轻轻吹打混匀，再加入100μLEDTA-2Na、枸橼酸钠、肝素钠的抗凝全血和未加抗凝剂的全血，轻轻吹打混匀，进行磁性吸附，吸附时间1min,吸取上层血浆/血清，结果见表6。
表6游离植物凝集素添加量确定实验的结果表
由表6可以得出：200μL反应体系中，10mg/mL植物凝集素加入量为1μL-10μL好，即体系终浓度为50-500μg/mL植物凝集素的用量最佳，分离所得血浆/血清体积最多，分离红细胞最彻底。
实施例11：
使用(1)磁珠100μL，进行游离抗RBC使用量进行确认，加入0.1μL、0.5μL、1μL、5μL、10μL、20μL 0.1mg/mL抗RBC抗体，轻轻吹打混匀，再加入100μLEDTA-2Na、枸橼酸钠、肝素钠的抗凝全血和未加抗凝剂的全血，轻轻吹打混匀，进行磁性吸附，吸附时间1min,吸取上层血浆/血清，结果见表7。
表7游离抗RBC抗体添加量确定实验的结果表
由表7可以得出：200μL反应体系中，0.1mg/mL抗RBC加入量为1μL-10μL最好，即体系终浓度为0.5-5μg/mL抗RBC抗体的用量最佳，分离所得血浆/血清体积最多，分离最彻底。
实施例12：
使用(1)磁珠，进行磁珠保存液确认，将磁珠保护液分别替换为50mM pH6.0 MEST缓冲液，40mM pH7.0 HEPES缓冲液，30mM pH7.2 Tris-HCl缓冲液，50mM pH7.2 CBS缓冲液，取上述保存液及40mM pH7.2 PBS保存液的磁珠各100μL，加入1μL10mg/mL植物凝集素及5μL0.1mg/mL抗RBC抗体，再加入100μLEDTA-2Na、枸橼酸钠、肝素钠的抗凝全血和未加抗凝剂的全血，轻轻吹打混匀，进行磁性吸附，吸附时间0.5-1min,吸取上层血浆/血清。结果见表8。
表8磁珠保存液确认实验的结果表
| 抗凝剂 | 分离比例 | PBS | MEST | HEPES | Tris | CBS |
| EDTA-2Na的抗凝全血 | 血浆 | 125μL | 121μL | 123μL | 122μL | 121μL |
| 枸橼酸钠的抗凝全血 | 血浆 | 126μL | 123μL | 121μL | 124μL | 126μL |
| 肝素钠的抗凝全血 | 血浆 | 123μL | 122μL | 120μL | 123μL | 123μL |
| 未加抗凝剂的全血 | 血清 | 100μL | 97μL | 104μL | 101μL | 96μL |
注：PBS：即为40mM pH7.2的PBS；MEST：即为50mM pH6.0 MEST；HEPES：即为40mMpH7.0HEPES；Tris：即为30mM pH7.2 Tris-HCl；CBS：即为50mM pH7.2 CBS。
由表8的结果可以看出，本实验使用的几种保存液体系均能做到很好的分离效果。
实施例13：
使用(1)磁珠，进行磁珠保存液确认，将磁珠保护液分别替换为40mM pH5.0PBS缓冲液，40mM pH7.0 PBS缓冲液，40mM pH8.5 PBS缓冲液，取上述保存液的磁珠各100μL，加入1μL10mg/mL植物凝集素及5μL0.1mg/mL抗RBC抗体，再加入100μLEDTA-2Na、枸橼酸钠、肝素钠的抗凝全血和未加抗凝剂的全血，轻轻吹打混匀，进行磁性吸附，吸附时间0.5-1min,吸取上层血浆/血清。结果见表9。
表9不同pH值磁珠保存液对分离全血红细胞的影响的结果表
| 抗凝剂 | 分离比例 | Ph＝5.0 | Ph＝7.0 | Ph＝8.5 |
| EDTA-2Na的抗凝全血 | 血浆 | 125μL | 121μL | 123μL |
| 枸橼酸钠的抗凝全血 | 血浆 | 126μL | 123μL | 121μL |
| 肝素钠的抗凝全血 | 血浆 | 123μL | 122μL | 120μL |
| 未加抗凝剂的全血 | 血清 | 100μL | 97μL | 104μL |
由表9的结果可以看出，保存液的pH在5.0-8.5之间，分离效果没有明显区别。
实施例14：
使用(1)磁珠，进行磁珠保存液确认，将磁珠保护液分别替换为10mM pH7.0 PBS缓冲液，20mM pH7.0 PBS缓冲液，30mM pH7.0 PBS缓冲液，40mM pH7.0 PBS缓冲液，50mMpH7.0PBS缓冲液，60mM pH7.0 PBS缓冲液，取上述保存液的磁珠各100μL，加入1μL10mg/mL植物凝集素及5μL0.1mg/mL抗RBC抗体，再加入100μLEDTA-2Na、枸橼酸钠、肝素钠的抗凝全血和未加抗凝剂的全血，轻轻吹打混匀，进行磁性吸附，吸附时间0.5-1min,吸取上层血浆/血清。结果见表10。
表10不同盐离子浓度保存液对分离全血红细胞的影响的结果表
| 抗凝剂 | 分离比例 | 10mM | 20mM | 30mM | 40mM | 50mM | 60mM |
| EDTA-2Na的抗凝全血 | 血浆(上清) | 65μL | 72μL | 122μL | 124μL | 124μL | 71μL |
| 枸橼酸钠的抗凝全血 | 血浆(上清) | 62μL | 75μL | 123μL | 122μL | 124μL | 59μL |
| 肝素钠的抗凝全血 | 血浆(上清) | 63μL | 77μL | 121μL | 123μL | 123μL | 63μL |
| 未加抗凝剂的全血 | 血清(上清) | 60μL | 67μL | 114μL | 111μL | 109μL | 57μL |
由表10的结果可以看出，分离效果最好的PBS浓度为：30-50mM。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (9)
1.一种用于从全血中分离红细胞的试剂盒，其特征在于，包括化学偶联的抗RBC抗体的磁珠，植物凝集素和/或抗RBC抗体。
2.如权利要求1所述用于从全血中分离红细胞的试剂盒，其特征在于，所述化学偶联的抗RBC抗体的磁珠的制备方法为，
磁珠活化：往经过MEST溶液洗涤后的羧基磁珠中加入新配制的EDC溶液，混匀使磁珠充分悬浮后活化，活化过程中使磁珠保持悬浮状态；
加入抗体进行偶联：将上述活化后的磁珠磁性分离去除上清液后得到磁珠悬液，再加入抗RBC抗体后轻柔混匀，抗RBC抗体存在于pH8.0 PBS，内含0.05％Tween20的溶液中；进行偶联，偶联期间保持磁珠的悬浮状态；
洗涤：磁性分离去除上清液，加入PBST溶液重悬磁珠，反应，封闭磁珠表面未反应的活化羧基基团，期间保持磁珠的悬浮状态；磁性分离去除上清液，用pH7.2的PBS溶液洗涤2-4次后，重新悬浮于保存液中即得到化学偶联的抗RBC抗体的磁珠。
3.如权利要求2所述用于从全血中分离红细胞的试剂盒，其特征在于，所述磁珠活化步骤中，经过MEST溶液洗涤后的羧基磁珠为往磁珠中；优选的，磁珠的粒径为1-4μm；加入MEST溶液后，磁性分离洗涤1-3次，优选2次，然后移除上清液；洗涤时，使用2倍于磁珠体积的MEST溶液进行洗涤；
任选的，所述活化为20-30℃ 20-40min；优选的，活化为25℃ 30min。
4.如权利要求2所述用于从全血中分离红细胞的试剂盒，其特征在于，所述加入抗体进行偶联步骤中，抗体的加入量为,100μL 10mg/mL的磁珠悬液加入50-200μg抗RBC抗体；优选的，加入200μg抗RBC抗体；
任选的，所述偶联为23-27℃ 1.5-2.5h；优选的，为25℃ 2h。
5.如权利要求2所述用于从全血中分离红细胞的试剂盒，其特征在于，所述洗涤步骤中，所述反应为23-27℃反应0.5-1.5h；优选的，为25℃反应1h；
任选的，所述所述MEST溶液为100mM MES，pH 5.0，0.05％Tween20；EDC溶液为将10mg/mL的EDC分散于所述MEST中所得溶液；所述PBST溶液为pH7.2，0.05％Tween20，1％BSA的PBS溶液；
所述保存液为30-50mM pH5.0-8.5的PBS或MEST或HEPES或Tris-HCl或CBS缓冲液。
6.如权利要求1或2所述用于从全血中分离红细胞的试剂盒，其特征在于，所述化学偶联的抗RBC抗体的磁珠的制备方法为，
磁珠活化：取100μL 10mg/mL羧基磁珠到1mL离心管中，磁性分离去除上清液，用200μLMEST溶液进行磁性分离洗涤2次，然后移除上清液；再加入新配制的200μL EDC溶液，混匀使磁珠充分悬浮后活化，25℃活化30min，该期间使用摇床晃动混匀，使磁珠保持悬浮状态；经过上述步骤，磁珠表面羧基已经活化，可与抗RBC抗体进行共价偶联；
加入抗体进行偶联：将上述活化后的磁珠磁性分离去除上清液，加入200μg的抗RBC抗体后轻柔混匀，抗体存在于pH8.0 PBS，内含0.05％Tween20的溶液中；25℃偶联2h，偶联期间保持磁珠的悬浮状态；
洗涤：磁性分离去除上清液，加入200μL PBST溶液重悬磁珠，25℃反应1h，封闭磁珠表面未反应的活化羧基基团，期间保持磁珠的悬浮状态；磁性分离去除上清液，用200μLpH7.2的PBS溶液洗涤2-4次后，重新悬浮于保存液中即得到化学偶联的抗RBC抗体的磁珠。
7.一种从全血中分离红细胞的方法，其特征在于，使用了权利要求1-6任一所述用于从全血中分离红细胞的试剂盒。
8.如权利要求7从全血中分离红细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤，
取权利要求1-6任一所述用于从全血中分离红细胞的试剂盒中的化学偶联的抗RBC抗体的磁珠，磁性分离去上清，加入植物凝集素和/或抗RBC抗体，轻轻吹打混匀，再加入全血，轻轻吹打混匀，进行磁性吸附，吸取上清即可；
所述全血为EDTA-2Na或枸橼酸钠或肝素钠的抗凝全血或未加抗凝剂的全血。
9.如权利要求8从全血中分离红细胞的方法，其特征在于，所述植物凝集素的用量为终浓度为50-500μg/mL；
任选的，所述抗RBC抗体的用量为终浓度0.5-5μg/mL。
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