CN101614736A - 应用新型全血样品垫处理方法的免疫层析检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明应用新型全血样品垫处理方法的免疫层析检测试剂盒,涉及一种新型全血样品垫的处理方法和用此技术制备的免疫层析试剂盒及其检测方法。本发明所说全血样品垫可通过将非生物活性凝血激活剂与含磷脂类以及钙离子Ca2+溶液均匀分散在样品垫上实现,可广泛用于同时检测全血/血清/血浆样本的免疫检测试剂盒。该方法可使以全血为检测样本的免疫层析试剂制备生产工艺更加简便、有效,同时兼有成本低廉,样本用量小,检测速度快等优点。
Description
技术领域
本发明应用新型全血样品垫处理方法的免疫层析检测试剂盒涉及一种新型全血样品垫的处理方法和用此技术制备的免疫层析试剂盒及其检测方法,其成本低廉、操作简便、诊断快速、安全可靠,可广泛应用于同时检测全血/血清/血浆样本的免疫层析检测试剂盒。
技术背景
免疫快速检测试剂为适应同时检测人或动物全血和血清样本的要求,一般采用在样品垫上附着一定孔径的聚酯材料以实现血细胞、血清的分离和检测同时进行。其工作原理是当血细胞体积大于或等于聚酯材料孔径而被过滤,血清得以通过。该聚酯材料已有商品化产品,如:Gelman Sciences Inc.的水平红细胞分离材料、垂直红细胞分离材料和Whatman公司的全血滤膜。该方法应用于检测时全血样本使用量大,分离速度慢,价格昂贵。国内专利(CN1243251A)提供了另一种瞬间分离血细胞和血清的方法,即在全血中混入山羊抗红细胞血清,红细胞凝集成团被玻璃纤维垫完全阻挡,血清透过玻纤垫并通过反应膜的毛细作用沿反应膜向吸水垫端移动。此种方法具有样本用量小价格便宜等优点,但不同来源不同批次山羊抗红细胞血清质量差异大,易失效,生产工艺复杂不易掌握。因此开发一种简便、有效、样本用量小的快速分离血细胞和血清的方法对于免疫层析检测试剂盒的制备十分必要。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种新型的全血样品垫的处理方法,并利用该项技术制备适用于同时检测全血/血清/血浆的免疫层析检测试剂盒。
本发明所说一种新型全血样品垫的处理方法可通过以下技术方案实现:
1.非生物活性凝血激活剂与含磷脂类以及钙离子Ca2+溶液按照如下方法配制:
1~50g/L非生物活性凝血激活剂
0.5~4g/L磷脂
0.1~0.5mmol/L Ca2+
2.将上述制备所得溶液均匀分散在样品垫上,烘干,即得全血样品垫。
本发明所说非生物活性凝血激活剂包括:白陶土(又称高岭土、高锰粉)、鞣花酸、二氧化硅微粒中的一种或几种。
本发明所说磷脂包括:磷脂酰胆碱(PC,又称卵磷脂),磷脂醇(PA)、磷酯酰肌醇(PI)、磷脂酰甘油(PG),神经鞘磷脂(SPH),磷脂醇(PA),磷脂酰乙醇胺(PE,又称脑磷脂)中的一种或几种。
本发明所说样品垫材质为聚酯膜、玻璃纤维素膜、纤维素滤纸、无纺布中的一种或复合材质。
本发明所说一种应用新型全血样品垫处理方法的免疫层析检测试剂盒可通过以下技术方案实现:
1.用本发明所说技术方案制备全血样品垫;
2.制备免疫层析用标记物;
3.标记抗体或抗原的交联及固相化;
4.在免疫膜上固定捕捉抗体或抗原或质控线抗体;
5.将背板、全血样品垫、标记物垫、免疫膜和吸水滤纸按照附图所示装配成免疫层析试剂盒。
6.使用方法:将1~2滴全血样本滴于样品垫上同时加入等体积的样本稀释液。血液在样品垫上迅速凝集,被稀释的血清因毛细作用透过样品垫并向吸水纸端移动,可在30分钟内完成检测反应。
本发明所说免疫层析检测试剂盒由背板、全血样品垫、标记物垫、免疫膜和吸水滤纸组成,其中底衬可为聚氯乙烯材料;标记物垫可为聚酯或玻璃纤维素材料并载有抗原抗体标记物;免疫膜可为硝酸纤维素或醋酸纤维素材料。
本发明所说免疫层析用标记物可为胶体金颗粒、乳胶颗粒或荧光纳米颗粒等。
本方法所说抗原抗体标记方法和固定方法均为制备免疫层析试剂常规方法。
本发明所说样本稀释液为pH值在5~8范围内具备一定离子强度水溶液,可为生理盐水、Tris缓冲液、磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液和硼酸-硼砂缓冲液等。
本发明采用廉价、无生物活性的凝血激活剂与含磷脂类按照所需比例混合分散在样品垫上,即得全血样本垫,优越性在于生产工艺简单、成本低、使用无生物活性的物质降低了批间差,延长了样品垫的保存时间。大量实验数据表明,使用此种全血样品垫处理方法的免疫层析检测试剂盒,样本用量小、滤血速度快,可用于同时检测全血、血清和血浆样本,其检测卡(条)的特异性、灵敏度等符合临床检测要求。
附图说明
附图,免疫层析试剂盒组装示意图。
其中,1-背板、2-全血样品垫、3-标记物垫、4-免疫膜、5-吸水滤纸、6-检测线(T线)、7-质控线(C线)
具体实施方式
以下实施例描述了本发明的特殊实施例子,以便对本发明作进一步的说明,这些实施例只是说明而不表示本发明所有的可能性。本发明并不仅仅局限于这些实施例中提到的材料、反应条件或参数,任何在相关领域具备经验的人,都可以按照本专利的原理,利用其它类似材料或反应条件实现本发明所描述的免疫层析技术制备出检测试剂盒。这些并不脱离本发明描述的基本概念。因此,这些修改或者不同的应都在本发明的覆盖范围之内。
实施例一:应用白陶土-脑磷脂悬浊液处理全血样品垫制备乙型肝炎表面抗原胶体金免疫层析检测试剂盒
1.制备白陶土-脑磷脂悬浊液(含24g/l白陶土、2g/l脑磷脂、0.25mmol/l CaCl2);
2.将聚酯膜完全浸入悬浊液中充分浸泡,取出平摊烘干即得全血样品垫。
3.胶体金颗粒制备:取0.01%HAuCl4溶液50ml,加热煮沸,随即快速加入1%柠檬酸三钠溶液0.5ml;继续煮沸约5分钟后结束反应,溶液变成樱桃红色,制成胶体金溶液,冷却后保存。
4.标记抗体及固化:将胶体金溶液和鼠抗HBsAg单克隆抗体分别以0.1mol/l K2CO3调pH值至8.2,电磁搅拌胶体金溶液,加入鼠抗HBsAg单抗,继续搅拌10分钟,加入5%BSA使其终浓度为1%;再加入占1/10终体积的1%聚乙二醇溶液。先低速离心金标蛋白溶液,用1800×g,4℃离心20分钟,弃去凝聚的沉淀。然后将金标蛋白溶液用10000×g,4℃离心1小时;仔细吸出上清,将沉淀物用含1%BSA的PB液(含0.02%NaN3)重悬为原体积的1/10,喷涂至金标垫上,烘干保存,制成标记物垫。
5.制备免疫膜:将检测线蛋白羊抗HBsAg多抗及质控线蛋白羊抗鼠IgG分别用PBS溶液稀释至1mg/ml,用喷膜仪或划膜仪将蛋白溶液划在免疫膜上,烘干保存。
6.装配:将全血样品垫、喷涂有金标蛋白溶液的标记物垫、包被有检测线蛋白及质控线蛋白的免疫膜、吸水滤纸、背板等按照附图的形式粘贴组装。然后剪切成试纸条。
7.检测:将一滴或两滴全血滴加至试纸条的全血样品垫上,再滴加同等体积的0.01MPB(pH 7.4)。15-30分钟时观察免疫膜区域产生的条带数量及位置,观察试验结果。
8.结果评价:
使用此试纸条检测乙型肝炎表面抗原阳性全血/血清乙型肝炎表面抗原阴性全血/血清、临检中心质控血清。观察结果,与已获得上市资格产品进行比对,结果见表1。
表1应用白陶土-脑磷脂悬浊液处理全血样品垫
制备乙型肝炎表面抗原免疫层析检测试剂盒结果评价
用全血测试时,血液凝集及时,试纸条判读区背景清晰,无溶血及红细胞爬至免疫膜的现象。所有样本的实验结果与对比试剂结果相同。说明本全血样品垫完全能达到分离血液的效果。
实施例二:应用鞣花酸-脑磷脂悬浊液处理全血样品垫制备乙型肝炎表面抗原胶体金免疫层析检测试剂盒
1.制备溶液(含2g/L的鞣花酸、3g/L脑磷脂、0.25mmol/L CaCl2);
2.将玻璃纤维素膜完全浸入溶液中充分浸泡,取出平摊烘干制得全血样品垫。
3~7.同实施例一步骤3~7。
8.结果评价:
用此试纸条检测乙型肝炎表面抗原阳性全血/血清乙型肝炎表面抗原阴性全血/血清、临检中心质控血清。观察结果,与市面上产品进行比对,结果见表2。
表2应用鞣花酸-脑磷脂处理全血样品垫
制备乙型肝炎表面抗原免疫层析检测试剂盒结果评价
用全血测试时,血液凝集及时,试纸条判读区背景清晰,无溶血及红细胞爬至免疫膜的现象。所有样本的实验结果与对比试剂结果相同。说明本全血样品垫完全能达到分离血液的效果。
Claims (9)
1.一种应用新型全血样品垫处理方法其特征在于将非生物活性凝血激活剂与含磷脂类以及钙离子Ca2+溶液按照一定比例混合,均匀分散在样品垫上制备所得。
2.权力要求1所述非生物活性凝血激活剂包括:白陶土(又称高岭土、高锰粉)、鞣花酸、二氧化硅微粒中的一种或几种。
3.权力要求1所述磷脂包括:磷脂酰胆碱(PC,又称卵磷脂),磷脂醇(PA)、磷酯酰肌醇(PI)、磷脂酰甘油(PG),神经鞘磷脂(SPH),磷脂醇(PA),磷脂酰乙醇胺(PE,又称脑磷脂)中的一种或几种。
4.权力要求1所述样品垫材质包括:聚酯膜、玻璃纤维素膜、纤维素滤纸、无纺布中的一种或复合材质。
5.一种应用新型全血样品垫处理方法的免疫层析检测试剂盒其特征在于所用全血样品垫按照权利要求1所述处理方法制备所得。
6.根据权利要求5制备所得免疫层析检测试剂盒,其特征在于由背板、全血样品垫、标记物垫、免疫膜和吸水滤纸装配而成。
7.根据权利要求5制备所得免疫层析检测试剂盒,其特征在于可同时用于检测全血、血清和血浆样本。
8.根据权利要求5制备所得免疫层析检测试剂盒,其特征在于应用于检测全血样本时,将1~2滴全血样本滴于样品垫上同时加入等体积的样本稀释液。血液在样品垫上迅速凝集,被稀释的血清因毛细作用透过样品垫,可在30分钟内完成检测反应。
9.权力要求8所述样本稀释液,其特征在于为pH值在5~8范围内具有一定离子强度水溶液,可为生理盐水、Tris缓冲液、磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液和硼酸-硼砂缓冲液等。
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