CN101400800A - 利用酶检测电极微阵列上结合事件的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种检测电极微阵列上结合事件的方法。本发明提供了含有可寻址电极和电极对应位点上两种或多种不同类型的捕获复合物的微阵列。捕获复合物能捕获分析物。连接酶形成报道复合物。依次接触底物溶液，以制备可通过含有酶产物的电极和不含酶产物的电极上的电反应差异而可在电极上进行检测的酶产物。所述酶产物可能是固体沉积产物。通过将保持在恒定电压的各电极依次切换至接地、然后回到恒定电压，而阅读微阵列上电极的电学特性，以确定酶产物的存在。

Description

利用酶检测电极微阵列上结合事件的方法
关于联邦资助研究的声明
本发明的一部分得到国防部II期SBIR资助号DAAD13-00-C-0033和国防部合同号W911SR-04-C-0022的资助。
技术领域
本发明提供了电子检测带有电极的微阵列装置中已知位置上附连的探针与溶液中靶标之间的结合事件的方法。采用酶部分和能改变含有酶部分的电极的电学特性的底物溶液进行检测。
发明背景
在生物技术研究和开发领域，微阵列已成为重要的分析研究工具。通常，微阵列是通常是平面的固体表面上小型化的位置阵列。作为制备微阵列的一部分，位置中可能连接有预先合成的分子，包括生物分子，或者可能含有原位合成的分子，如DNA分子(一次合成一种单体)。附连位置通常成列和成行排列；然而，也可采用其它形式。最常见的是，微阵列(具体是寡核苷酸的微阵列)是基于硅的，最常见是载玻片。微阵列的主要优点是能够同时进行几百(即使不是几千)个实验。同时实验提高了研究分子结构和生物功能之间关系的效率，其中化学结构的细微改变可能对生物活性产生深远影响。顾名思义，微阵列上的附连点是微米级的，通常为1-100μm。
采用微阵列的研究主要专注于脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)相关领域，包括基因组学、细胞基因表达、单核苷酸多态性(SNP)、基因组DNA检测和验证、功能基因组学和蛋白质组学(Wilgenbus和Lichter，J.Mol.Med.77：761，1999；Ashfari等，Cancer Res.59：4759，1999；Kurian等，J.Pathol.187：267，1999；Hacia，Nature Genetics 21增刊：42，1999；Hacia等，Mol.Psychiatry3：483，1998；和Johnson，Curr.Biol.26：R171，1998)。此外，可将微阵列用于与肽(两个或多个连接的天然或合成氨基酸)、小分子(如药物化合物)、低聚物和聚合物有关的研究。有许多方法制备DNA相关分子的微阵列，所述DNA相关分子包括天然或克隆的DNA和合成DNA。合成的相对较短的单链DNA或RNA链通常称为寡核苷酸。
微阵列制备方法包括：(1)用打点机器人将溶液打点到制备的平坦表面上；(2)通过喷墨打印或其它打印技术、采用常规亚磷酰胺化学以打印试剂进行原位合成；(3)采用脱保护所用的电化学产生的酸以及常规亚磷酰胺化学进行原位平行合成；(4)采用常规亚磷酰胺化学，进行光生酸(PGA)控制的无掩模原位合成；(5)采用光切割光敏性保护基(PLPG)而进行掩膜指导的原位平行合成；(6)采用PLPG和数字光刻技术进行无掩膜原位平行合成；和(7)通过电场吸引/排斥沉积寡核苷酸。寡核苷酸微阵列合成的综述参见Gao等，Biopolymer73：579，2004。
用于原位寡核苷酸合成的光刻技术参见Fodor等，美国专利5,445,934和要求其作为优先权的其它专利。电场吸引/排斥微阵列的描述参见Hollis等，美国专利5,653,939和Heller等，美国专利5,929,208。蒙哥马利(Montgomery)，美国专利6,093,302、6,280,595和6,444,111(分别是蒙哥马利I、II和III)中描述了采用电化学解封法进行原位寡核苷酸合成的电极微阵列，将其纳入本文作参考。
蒙哥马利I、II和III所述的电化学合成微阵列基于含有成列或成行的多个微电极的半导体芯片。该芯片设计采用了互补型金属氧化物半导体(CMOS)技术，以产生能平行寻址以对微阵列内的单个微电极进行选择和控制的高密度微电极阵列。为了在各个电极上提供合适的反应性基团，用多孔性反应基质材料(层)包被微阵列。控制基质的厚度和多孔性。可以在多孔性基质上任何电极的位置上合成生物分子以及其它分子。
在某位置合成期间，通过施加电压或电流“打开”该电极，该电压或电流能产生电化学试剂(具体是酸性质子)，以改变电极附近和多孔性基质内限定的“虚拟瓶”小区域或体积中的pH。电化学方法产生的试剂能去除正在合成的分子上的保护基，以便继续合成DNA或者其它寡聚材料或聚合材料。只有电极附近的pH降低，因为酸性试剂迁移离开电极的能力仅限于天然扩散和缓冲。
合成或附连于微阵列的分子通常称为探针。微阵列上的各个位置可以含有不同探针。在采用微阵列进行的实验中，使溶液中的靶分子与微阵列相互作用。如果在实验条件下靶标具有足够的亲和力，那么它将结合于特定探针类型，或者可能结合于一种以上的探针类型。需要准确检测靶标与探针的结合事件，以捕获关于溶液中任何靶标与微阵列上探针之间相互作用的数据。
在微阵列中，通常采用基于光子的检测***来检测结合事件。最常见的是，微阵列检测方法使用靶标上的荧光标签转导结合事件；荧光量是结合量的衡量。或者，可采用可见染料或发光标记。例如，在DNA杂交中，将标签附连于靶DNA序列，以检测与附连于微阵列的寡核苷酸探针的杂交。根据标签产生的信号强度，可能得通过基于激光共聚焦显微镜的***读出构造成单层的这类微阵列(如通过高密度打点或光刻技术制备的微阵列)的数据，或通过视频型相机(如CCD相机)读出含有各点以高密度形式分布的三维基质的微阵列的数据。
替代荧光的方式为光学检测探针-靶标的结合。在＂扫描计量＂试验中，用催化金颗粒标记靶标。与探针结合后，将银盐加入溶液中，结合颗粒时沉积出金属银。检测类似于光学照相胶卷显影，并用数字扫描仪或照相技术记录。这种技术能缓解荧光检测的一些技术需求，但尚不清楚扫描计量技术在本领域微阵列目前状态归类(relegated)的打点尺寸到底有多么灵敏。
通常，基于光子的阅读器昂贵、体积大且笨重，依赖于复杂的数值算法，必须在使用前精确校准。因此，这类阅读器通常仅限于实验室使用。在由微阵列＂阅读＂信号的各种情况下，常常出现引起假读数或不准确读数的杂散光或其它噪声信号。而且，很难分辨灰色的阴影或几乎察觉不到的信号是真阳性还是假阳性。最后，荧光信号可能淬灭，信号也可能被结合靶标附近的其它标记自动吸收。与采用基于光子的阅读器有关的其它复杂性增加了变异性。因此，本领域需要改进用于分析微阵列上结合事件的检测方法。本发明满足了这种需求，改善了结合事件的检测，并提供了可为高密度微阵列***中各位置产生更客观的“是”或“否”答案的检测***。
发明概述
本发明提供了用酶检测电极微阵列上的结合事件的方法，所述方法包括：
(a)提供含有可电学寻址的多个电极并且在对应于电极的位点上连接有至少两种不同的捕获复合物的微阵列，其中第一捕获复合物类型与第一分析物类型具有亲和力，第二和后续的捕获复合物类型与后续的分析物类型具有亲和力；
(b)将至少一种类型的多种分析物施加到捕获复合物上，形成对应于捕获复合物捕获的各分析物类型的各类型结合复合物；
(c)将酶连接于结合复合物，形成报道复合物，其中报道复合物的类型对应于捕获复合物捕获的各分析物类型；
(d)使多种底物溶液依次接触微阵列，用电信号确定位点上是否存在酶产物，其中各底物溶液对应于报道复合物类型，其中存在电信号是结合事件的衡量。
优选地，捕获复合物由多种寡核苷酸探针组成，分析物由多种寡核苷酸靶标组成，寡核苷酸靶标与寡核苷酸探针的杂交形成结合复合物，通过附连法使酶结合于寡核苷酸靶标，其中附连法包括通过选自下组的分子基团连接酶：(a)抗体、抗-抗体和抗-独特型抗体组合，(b)生物素和链霉亲和素或亲和素组合，和(c)寡核苷酸和互补寡核苷酸组合，和它们的组合。优选通过原位电化学合成方法来合成寡核苷酸探针。
优选地，捕获复合物由杂交于含有抗体标签的寡核苷酸靶标的寡核苷酸探针组成，通过抗体标签捕获分析物，从而形成结合复合物，通过附连法使酶结合于分析物，其中所述附连法包括附连于分析物的报道抗体和通过选自下组的分子基团附连于报道抗体的酶：(a)抗体、抗-抗体和抗-独特型抗体组合，(b)生物素和链霉亲和素或亲和素组合，和(c)寡核苷酸和互补寡核苷酸组合，和它们的组合。
优选通过原位电化学合成方法合成寡核苷酸探针。捕获复合物优选通过选自下组的方法制备：原位电化学合成、打点、喷墨打印、电场沉积和原位光刻合成。捕获复合物优选由选自下组的分子组成：寡核苷酸、多肽、抗体、糖基化多肽、多糖、肽核酸和含有多个上述分子的单体的混合分子。
分析物优选由选自下组的分子组成：抗原、半抗原、病毒、细菌、细胞、蛋白质、多糖、生物聚合物分子、脂质、糖蛋白(α-1-酸糖蛋白)、蓖麻毒蛋白、M13噬菌体、球形芽孢杆菌(Bacillus globigii)(BG)芽孢、荧光素、兔IgG、山羊IgG、DNA、RNA、单链DNA、核糖体RNA、线粒体DNA、细胞受体、糖基化的膜结合蛋白、非糖基化的膜结合蛋白、多肽、糖基化多肽、抗体、细胞抗原决定簇、有机分子、金属离子、盐阴离子和阳离子以及有机金属和它们的组合。
酶优选选自：辣根过氧化物酶、漆酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、碱性磷酸酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、过氧化氢酶、乳酸氧化酶和过氧化物酶，以及它们的组合。底物溶液优选由含有缓冲液、盐和酶底物溶液的水溶液组成，其中酶底物溶液含有能与该酶发生反应的底物。酶产物优选包含可以通过电化学方式还原或氧化的分子。
电信号优选包括差异反应(difference response)，其中差异反应是产物反应与基础反应之间差异的衡量，其中在含有酶的位点上测得所述产物反应，在不含酶的位点上测得所述基础反应，其中产物反应和基础反应选自：电流、电压和电阻，其中差异反应是分析物与捕获复合物结合的衡量。
本发明还提供了用酶检测电极微阵列上的结合事件的方法，所述方法包括：
(a)提供含有多个电极并且在对应于电极的位点上连接有多种捕获复合物的微阵列，这些电极是可电学寻址的电极；
(b)将多种分析物施加到捕获复合物上，以形成结合复合物，其中捕获复合物对分析物具有亲和力；
(c)将酶连接于结合复合物，形成报道复合物；
(d)使底物溶液接触所述微阵列，所述底物溶液中含有能与酶反应的底物，其中固体酶产物沉积在含酶位点上；和
(e)用测定溶液和电信号测定该位点上是否存在固体酶产物，其中存在电信号是结合事件的衡量。
优选地，捕获复合物由多种寡核苷酸探针组成，分析物由多种寡核苷酸靶标组成，寡核苷酸靶标与寡核苷酸探针杂交形成结合复合物，通过附连法使酶结合于寡核苷酸靶标，其中附连法包括通过选自下组的分子基团连接酶：(a)抗体、抗-抗体和抗-独特型抗体组合，(b)生物素和链霉亲和素或亲和素组合，和(c)寡核苷酸和互补寡核苷酸组合，和它们的组合。优选通过原位电化学合成方法来合成寡核苷酸探针。
优选地，捕获复合物由杂交于含有抗体标签的寡核苷酸靶标的寡核苷酸探针组成，通过抗体标签捕获分析物，从而形成结合复合物，通过附连法使酶结合于分析物，其中所述附连法包括通过选自下组的分子基团连接酶：(a)抗体、抗-抗体和抗-独特型抗体组合，(b)生物素和链霉亲和素或亲和素组合，和(c)寡核苷酸和互补寡核苷酸组合，和它们的组合。
优选通过原位电化学合成方法合成寡核苷酸探针。捕获复合物优选通过选自下组的方法制备：原位电化学合成、打点、喷墨打印、电场沉积和原位光刻合成。捕获复合物优选由选自下组的分子组成：寡核苷酸、多肽、抗体、糖基化多肽、多糖和含有多个上述分子的单体的混合分子。
分析物优选由选自下组的分子组成：抗原、半抗原、病毒、细菌、细胞、蛋白质、多糖、生物聚合物分子、脂质、糖蛋白(α-1-酸糖蛋白)、蓖麻毒蛋白、M13噬菌体、球形芽孢杆菌(Bacillus globigii)(BG)芽孢、荧光素、兔IgG、山羊IgG、DNA、RNA、单链DNA、核糖体RNA、线粒体DNA、细胞受体、糖基化的膜结合蛋白、非糖基化的膜结合蛋白、多肽、糖基化多肽、抗体、细胞抗原决定簇、有机分子、金属离子、盐阴离子和阳离子以及有机金属和它们的组合。
酶优选选自：辣根过氧化物酶、漆酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、碱性磷酸酶或葡萄糖脱氢酶、或其组合。底物溶液优选由含有缓冲液、盐和酶底物溶液的水溶液组成，其中酶底物溶液含有能与该酶发生反应的底物。酶优选为辣根过氧化物酶，底物是过氧化氢和选自下组的化学物质：可氧化的芳香剂(aromatics)、二茂铁衍生物和可氧化的无机物，以及它们的组合。
优选地，固体酶产物为非反应性产物，测定溶液是含有电子介质的水溶液。电子介质优选为***亚铁和***铁的混合物，其混合比约为10∶90-90∶10，浓度约为0.1-1000毫摩尔。或者，可以还原或氧化固体酶产物，测定溶液是含有缓冲液和盐的水溶液。缓冲液优选为磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液，盐是氯化钠。
或者，固体酶产物是导电材料。导电材料优选为聚吡咯。电信号优选包括差异反应，其中差异反应是产物反应与基础反应之间差异的衡量，其中在含有酶的位点上测得所述产物反应，在不含酶的位点上测得所述基础反应，其中产物反应和基础反应选自：电流、电压、电导率或电阻，其中差异反应是分析物与捕获复合物结合的衡量。
本发明还提供了用酶检测电极微阵列上的结合事件的方法，所述方法包括：
(a)提供含有多个电极的微阵列，这些电极是可电学寻址的电极；
(b)向这些电极施加恒定的初始电压，而保持该电极为开路；和
(c)在测定时间内使各电极在约为接地或显著不同于恒定初始电压的电压下连续切换，记录测定时间内各电极的电流，使各电极返回恒定初始电压，然后将下一个电极设定为接地或显著不同于恒定初始电压的电压，从而测定各电极的电反应。
优选地，恒定初始电压的绝对值约为0.1毫伏至5伏。测定时间优选约为0.1毫秒至1秒。
附图简要说明
图1提供了辣根过氧化物酶(HRP)用作检测微阵列上结合事件的酶时本发明的化学反应方案。具体说，分析物(靶标)是α1-酸糖蛋白(AGP)，首先与生物素标记的第二抗体形成复合物，从而检测分析物与微阵列的结合。第二抗体是AGP表位特异性抗体。然后加入亲和素标记的HRP酶，使亲和素连接于生物素。用于检测分析物AGP的微阵列位点上含有作为探针的另一抗体，其结合于AGP的不同表位。第一抗体(标记的＂抗体1＂)通过标记的寡核苷酸探针自身组装成寡核苷酸微阵列。HRP催化产物是可还原的，因而可将结合有HRP的电极用作阴极，从而可在微阵列的电极上检测。
与图1的设计相比，图2提供了相似的夹心免疫实验设计，以检测微阵列已知位点上的AGP。区别是链霉亲和素连接于生物素标记的附连于AGP第二表位的第二抗体，然后生物素标记酶连接于链霉亲和素。此外，该酶是漆酶，而非HRP。
图3提供了β-半乳糖苷酶作为酶、X-Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷)作为底物时，酶反应的化学(情况)。该反应形成靛蓝，并产生电化学反应物。在pH约7.0的含有1毫摩尔Fe2+/Fe3+(作为***亚铁和***铁加入)的0.01摩尔磷酸盐缓冲盐水(PBS)中进行该反应。溶液中X-Gal的含量为饱和极限。铁(III)用作电子转移介质。
图4提供葡萄糖氧化酶用作酶、吩嗪硫酸二甲酯(5-甲基-吩嗪硫酸二甲酯)用作底物时，酶反应的化学情况。在pH约7.0的含有1毫摩尔Fe2+/Fe3+(作为***亚铁和***铁加入)的0.01摩尔磷酸盐缓冲盐水(PBS)中进行该反应。铁(III)用作电子转移介质。
图5提供HRP用作酶、邻苯二酚和过氧化氢用作底物时，酶反应的化学情况。酶反应产物是可还原的，并可通过将阴极电流施加于电极进行检测。
图6提供在电极微阵列的所选电极上测定的电流的三维图。所选电极含有酶扩增体系，采用β-半乳糖苷酶作为酶。用含有生物素的试剂以电化学方式修饰含有酶扩增体系的电极，所述含有生物素的试剂是含有生物素标签的亚磷酰胺。在泳道1-8代表的一部分微阵列中，没有生物素标签。泳道9-16显示了含有生物素标签的电极上的电流；采用棋盘图案，见图。为了连接该酶，使链霉亲和素结合于生物素标签，使生物素化的β-半乳糖苷酶结合于链霉亲和素，产生生物素-链霉亲和素-生物素复合物。按照图3所示的反应方案加入氧化还原试剂和底物。数据表明，在结合有β-半乳糖苷酶的电极上电流绝对值较高，如棋盘图案中的负电流值所示。
图7提供了来自图6的一部分数据。在含有电极的位点上，电极9、11、13和15含有结合的β-半乳糖苷酶。这些电极上的电流是负电流，表明在结合有酶的电极上存在还原性酶产物。
图8提供电极微阵列的所选电极上的电流图。此图中电极的符号(sign)有所改变。泳道1、3和5所示的电极表明，在这些电极上结合和检测到荧光素标记的β-半乳糖苷酶。荧光素用作附连于较大酶的低分子量抗原。将亲和标记的抗荧光素抗体放置在S2行的交替电极上，从而连接酶。数据表明，与含有荧光素标记的β-半乳糖苷酶的电极相关联的已知位置的电流较高。采用落射荧光显微术验证这些数据，以确认电化学结果。
图9提供了电极微阵列的所选电极上的电流图。所用酶是葡萄糖氧化酶。用生物素-链霉亲和素复合物使葡萄糖氧化酶结合于微阵列。电极特异性亲和标记物位于泳道2、4、6、8中。葡萄糖氧化酶体系的背景信号高于其它氧化/还原酶。
图10提供了HRP的电压电流图，它是罕见(即没有原位合成生物分子)电极微阵列上单个100微米直径电极检测的氧化还原曲线。恒电势测定结果表明是负电势，电流差异(有酶和无酶)显著。邻苯二酚和过氧化氢用作底物。
图11提供了电极微阵列的所选电极上电流对时间的图。各数据点是不同电极上的测定值。所用酶是HRP，底物是邻苯二酚和过氧化氢。约3秒后电流达到稳定值。
图12提供了电极阵列的所选电极的电流图。该微阵列在连有酶的夹心抗体中连接了不同的分析物。分析物包括蓖麻毒蛋白(RCA)、BG芽孢(球形芽孢杆菌)、噬菌体、AGP和FITC。在微阵列上利用电化学合成合成各分析物的不同单链DNA单位。各分析物的连有抗体的互补DNA链与微阵列杂交。分析物结合于各抗体，使第二抗体结合于各抗体。第二抗体上连有生物素。使HRP和链霉亲和素的复合物连接于生物素。检测底物是邻苯胺二胺(ODP)和过氧化氢。
图13提供了电极阵列的所选电极的电流图。山羊IgG通过寡核苷酸标记过程结合于电极S1(1、3和5)和S2(2、4和6)。通过与HRP偶联的小鼠抗山羊抗体复合物检测山羊IgG。ODP和过氧化氢用作底物。改变电流的符号，使其为正。
图14是电极阵列的所选电极的电流图。在微阵列上原位合成两种不同寡核苷酸序列。将棋盘合成图案用于各寡核苷酸。各寡核苷酸的电极的棋盘区域包括含有各寡核苷酸的电极和没有合成寡核苷酸的电极。生物素化寡核苷酸靶标样品获自欧普朗公司(Operon)。使生物素化寡核苷酸与微阵列上合成的寡核苷酸杂交。将与HRP偶联的链霉亲和素(获自西格玛公司(Sigma))加入微阵列中，结合于微阵列上杂交的生物素化寡核苷酸序列。测定各电极的电流。图中显示了各寡核苷酸(寡核苷酸-5和寡核苷酸-6)的棋盘图案的示意图。图中的三维柱图标示电极上的电流。兔序列探针无信号。HRP用作酶，检测底物是邻苯胺二胺(ODP)和过氧化氢。
图15显示了100pM浓度的Rab-生物素与银/氯化银参比电极的检测结果。检测的是电势而非电流。HRP用作酶，检测底物是邻苯胺二胺(ODP)和过氧化氢。
图16显示了检测AGP(上)和RCA(下)的校正曲线。对数曲线表明本发明的高灵敏度。
图17显示了电流对Rab-生物素寡核苷酸浓度的依赖性。在40℃培育2小时。
图18显示了在含有两种不同酶体系的电极微阵列上电极的电流反应，这两种酶体系用于检测对各分析物特异的不同电极上AGP和蓖麻毒蛋白的结合。显示了设计用于捕获AGP的电极上的反应。
图19显示了在含有两种不同酶体系的电极微阵列上电极的电流反应，这两种酶体系用于检测对各分析物特异的不同电极上AGP和蓖麻毒蛋白的结合。显示了设计用于捕获蓖麻毒蛋白的电极上的反应。
图20是具有结合有酶部分的电极和不含酶部分的电极的电极阵列的示意图。酶反应产生在含有酶部分的电极上沉积的产物。
图21是电极微阵列的示意图，它显示了含有和不含沉积物的电极上电阻的测量结果。显示了电流介质，作为获得电极的电化学读数的方法。介质为氰化亚铁/氰化铁，它们对不溶性沉积物的量很灵敏。
图22是所选电极上沉积有不溶性酶产物的电极微阵列的光学显微照片。互补寡核苷酸靶标的浓度是1皮摩尔至1纳摩尔。可以观察到捕获的含生物素互补寡核苷酸的浓度高和低时，不溶性物质的沉积差异。
图23是电极微阵列，它显示沉积30分钟后HRP-DAB-沉积物上-100mV电化学还原2毫摩尔K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]。
图24是电极微阵列图像，显示蓝色沉积产物为较暗的电极。深兰色区域表明高浓度的结合RNA和随后的HRP；相反，浅蓝色表明两者浓度都较低。
图25是电极微阵列图像，它显示了阅读微阵列的过程中各电极上的电流图。
图26是电极微阵列图像，它显示了通过电极氧化去除了所有沉积的酶产物后，读出微阵列的过程中各电极上的电流。以-0.1伏阅读该微阵列。由于在前一微阵列读数过程中所有氧化的TMB均被还原，所以观察到的电流只是由电极充电引起的。平均来看，这种电流为0.2-0.3纳安培。
图27是用于阅读整个微阵列上各电极的电学反应的方法。
图28是电极微阵列的图像，它显示了用图27的读数方案阅读微阵列的过程中，各电极上的电流。白色区域对应于含有探针DNA的电极，由于还原了沉积产物而产生法拉第电流。黑色区域代表不含沉积产物，因此电流最小。
图29是电流与溶液中结合有酶的互补性靶RNA的浓度的图。随着溶液中靶RNA的浓度的对应的线性增加，电流基本上呈指数型升高。
图30提供了酶底物的化学结构。
图31包括含有GDH和不含GDH的电极的电流差异的三维柱状图。图中显示了含有GDH的三个所选电极分组的电流差异的二维示意图。图中显示，寡核苷酸靶标浓度为1纳摩尔时(P1)相对于背景电流测定到显著的电流。不出所料，10皮摩尔(P6)和50皮摩尔(P5)时电流差异小于1纳摩尔时的电流差异，它们大约相等。施加电压为300毫伏。
图32包括含有GDH和不含GDH的电极的电流差异的三维柱状图。图中显示了含有GDH的三个所选电极分组的电流差异的二维示意图。图中显示，寡核苷酸靶标浓度为1纳摩尔时(P1)相对于背景电流测定到显著的电流。不出所料，10皮摩尔(P6)和50皮摩尔(P5)时电流差异小于1纳摩尔时的电流差异，它们大约相等。施加电压为500毫伏。
图33显示了含有GDH和HRP的电极微阵列上所选电极的平均电流的两幅示意图。该示意图显示，在一种酶的检测期间，不会检测到另一种酶，即没有串话。
图34包括两幅测定电流减去背景电流与两种不同分析物浓度的关系图，这两种分析物是RCA(A)和M13噬菌体(B)。所用培育时间为12分钟(曲线1)、30分钟(曲线2)和60分钟(曲线3)。
图35提供了在不同电极上通过的电流的二维图。该图是通过各电极的电流的灰度图，称为方块图。较高的电流对应于方块中较淡的图像。该图显示六种杂交的转录物(每种转录物一列)各自的三种探针，并且显示了各转录物在杂交转录物溶液中的浓度(最下面一行)。还有九种在溶液中没有杂交物质的阴性对照探针。
图36提供了各杂交转录物的电极上的电流数值。该值是各转录物浓度下三种不同探针的平均值。
图37提供了相对于由九种零浓度探针计算的平均背景值的增加量。该图显示，在最低浓度下电流增加1倍，在最高浓度下电流增加4.5倍。
发明详述
以下是本文所用术语的定义列表：
术语“电极微阵列”指固体基材上的电极微阵列。各电极可单独寻址，并可激活成阳极或阴极。固体基材通常是平面，具有含有电极的表面。通常，电极大小约为0.1-100μm。电极数目可以是少至一个，多至成千上万甚至几十万。通常，电极微阵列的大小不受限制，电极数目也不受限。术语＂芯片＂指电极微阵列。术语“微阵列”包括电极微阵列以及其它类型的微阵列。
术语“反应层”指电极上的涂层，该涂层有助于电化学合成或连接预先合成的物质。DNA、RNA和其它分子可以是在电极微阵列的电极上电化学原位合成的，或者连接于微阵列电极。对各电极而言，存在与其对应的“位点”或“位置”，这类位点在反应层的某部分上。任选地，电极的相对表面具有反应层，在此处进行合成或连接。所述相对表面接近电极表面，并通过电极和相对表面之间的溶液与电极电接触。
术语“寡核苷酸探针”指通常在电极微阵列上原位合成的单链DNA或RNA，但也可以打点在微阵列上。寡核苷酸探针可与溶液中的寡核苷酸靶标基本互补。可以是预先合成寡核苷酸探针，然后将其连接于电极微阵列。“DNA探针”特别指DNA链，“RNA探针”特别指RNA链。
术语“寡核苷酸靶标”指溶液中能够与寡核苷酸探针杂交的单链DNA或RNA。除了与寡核苷酸探针杂交以外，寡核苷酸靶标不连接于微阵列。“DNA靶标”特别指DNA链，“RNA靶标”特别指RNA链。寡核苷酸靶标的例子包括合成或天然的单链DNA或RNA，包括核糖体RNA和线粒体DNA。寡核苷酸靶标一般含有亲和标记物，以便连接报道复合物。
术语“捕获复合物”指能够捕获溶液中的“分析物”的化学物质。分析物是感兴趣的化学物质，通过捕获复合物捕获分析物称为“结合事件”。捕获通常指形成键，如氢键，但通常不意味着形成共价键。分析物不结合捕获复合物，除非分析物和捕获复合物互相具有亲和力。亲和力包括但不限于：抗体-抗原相互作用、链霉亲和素-生物素、亲和素-生物素和寡核苷酸的互补碱基配对。“结合复合物”指通过结合事件得到的物质。例如，捕获复合物可包含在电极微阵列上原位合成的寡核苷酸探针，生物素化寡核苷酸可以是分析物。存在足够的互补碱基配对且溶液条件允许进行杂交时，生物素化寡核苷酸(分析物)与寡核苷酸探针杂交(捕获复合物)。“报道复合物”可能连接生物素以检测结合事件。还例如，捕获复合物可包含抗体—与寡核苷酸探针杂交的寡核苷酸靶标化合物。分析物是溶液中能够特异性结合该抗体的化学物质(抗原)。“报道复合物”可连接于抗原，以检测结合事件(抗原与捕获复合物)。第一捕获复合物是特定类型的复合物。相似地，后续捕获复合物包括任何和所有其它捕获复合物。第一分析物的类型是对第一捕获复合物有亲和力的特定类型的分析物。相似地，后续捕获复合物包括对特定类型的捕获复合物有亲和力的任何和所有其它分析物。电极微阵列可能含有针对多种靶标(分析物)的多种类型的捕获复合物，即第一捕获复合物和一种或多种后续捕获复合物，其中各后续捕获复合物对后续靶标(分析物)有亲和力。
术语“报道复合物”指能够结合结合复合物且含有酶作为报道复合物一部分的化学复合物。报道复合物提供了检测结合事件的方法。可以通过依次加入互相结合并在加入最后一种化学物质时形成报道复合物的不同化学物质依次形成报道复合物。最后一种化学物质含有酶。例如，报道复合物可以是酶-链霉亲和素复合物，其中链霉亲和素能够结合与寡核苷酸探针杂交的寡核苷酸靶标上的生物素。还例如，报道复合物可包含“报道抗体”，其含有能结合某抗原的抗体，该抗原是通过连接于捕获复合物的第一抗体捕获的。报道抗体可含有结合于抗体的生物素、结合于生物素的链霉亲和素和结合于链霉亲和素的酶。该抗体能结合与第一抗体结合的分析物。该酶能够产生可以在电极位点上检测到的氧化还原产物。可通过先加入抗体-生物素复合物，然后加入链霉亲和素-酶复合物，而形成报道抗体。或者，可单独加入链霉亲和素，然后加入生物素-酶复合物。其它报道抗体的描述参见以下说明书。
术语“缓冲液”指能够控制pH或抵抗pH改变的任何水溶液。缓冲液包含单独的下述化合物或其组合：磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、柠檬酸盐、碳酸盐、碳酸氢盐、硼酸盐、乙酸盐、2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)、双(2-羟乙基)亚氨基三(羟甲基)甲烷(双Tris)、N-(2-乙酰胺基)-2-亚氨基二乙酸(ADA)、2-[(2-氨基-2-氧乙基)氨基]乙磺酸(ACES)、哌嗪-N，N′-双(2-乙磺酸(PIPES)、3-(N-吗啉代)-2-羟基丙磺酸(MOPSO)、1，3-双[三(羟甲基)甲基氨基]丙烷(双Tris丙烷)、N，N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸(BES)、3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)、N-(2-羟乙基)哌嗪-N′-(2-乙磺酸)(HEPES)、N-三(羟甲基)甲基-2-氨基乙磺酸(TES)、3-[N，N-双(2-羟乙基)氨基]-2-羟基丙磺酸(DIPSO)、3-[N-三(羟甲基氨基]-2-羟基丙磺酸(TAPSO)、三(羟甲基)氨基甲烷(TRIZMA)、N-(2-羟乙基)哌嗪-N′-(2-羟基丙磺酸)(HEPPSO)、哌嗪-N，N′-双(2-羟基丙磺酸)(POPSO)、N-(2-羟乙基)哌嗪-N′-(3-丙磺酸)(EPPS)、三乙醇胺(TEA)、N-三(羟甲基)甲基甘氨酸(Tricine)、N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸(Bicine)、N-三(羟甲基)甲基-3-氨基丙磺酸(TAPS)、3-[(1，1-二甲基-2-羟乙基)氨基]-2-羟基丙磺酸(AMPSO)、2-(N-环己基氨基)乙磺酸(CHES)、3-(环己基氨基)-2-羟基-1-丙磺酸(CAPSO)、2-氨基-2-甲基-1-丙醇(AMP)和3-(环己基氨基)-1-丙磺酸(CAPS)。
术语“酶底物溶液”指含有能与酶反应的底物分子的水溶液。下面列举了不同酶的底物的例子。此外，溶液中可以单独存在以下任何一种物质，或其组合：辅酶、表面活性剂、防腐剂、粘度调节剂、光稳定剂和促进剂。辅酶的例子包括烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)、黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)和过氧化氢。酶底物溶液的配方可能是供应商的专利。表面活性剂的例子包括吐温(R)、十二烷基硫酸钠和3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)。防腐剂的例子是乙二醇。
术语“可氧化的芳香剂”指能够与酶发生反应而产生可在电极上还原的产物的芳香基化学物质。可氧化的芳香剂包括单独的下述化合物和其组合：具有R1、R2、R3、R4、R5和R6的图30所示的化合物A，其中R1选自羟基、氨基、-OR7或-NR8R9，R2、R3、R4、R5和R6独立地选自：氢、烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、取代的烷基、取代的烯基、取代的炔基、取代的芳基、腈、卤素、羟基、氨基、-OR7、-NR8R9、酯、酰胺、羰基、氨基甲酸酯、脲、硫酯、硫酰胺、硫代羰基、硫代碳酸酯、醛、酮、亚胺、烯、多环***或取代的多环***，其中R7选自烷基、芳基、氢、杂芳基、取代的烷基、取代的芳基、酯、酮、醛、氨基甲酸酯、羰基、甲硅烷基醚，其中R8或R9独立地选自：烷基、芳基、氢、杂芳基、取代的烷基、取代的芳基、酰胺、酮、醛、脲、氨基甲酸酯、硫酯、硫酰胺、硫代羰基或硫代氨基甲酸酯。
术语“二茂铁衍生物”指能够与酶发生反应而产生可在电极上还原的产物的化学物质。通常，二茂铁化合物是具有高电子转移特性的有机金属试剂。二茂铁衍生物包括单独以下化合物及其组合：二茂铁、乙酰基二茂铁、苯甲酰二茂铁、正丁基二茂铁、二茂铁单羧酸、丁酰二茂铁、环己烯基二茂铁、环戊烯基二茂铁、二甲基氨基甲基二茂铁、乙基二茂铁、己酰基二茂铁、己基二茂铁、辛酰基二茂铁、戊酰基二茂铁、戊基二茂铁、丙酰二茂铁、丙基二茂铁、1，1′-二乙酰基二茂铁、1，1′-二丁基二茂铁、1，1′-二丁酰二茂铁、1，1′-二乙基二茂铁、1，1′-二己酰基二茂铁、1，1′-二己基二茂铁、1，1′-二丙基二茂铁、4-二茂铁酰基(ferrocenoyl)丁酸、4-二茂铁酰基丁酸酯、3-二茂铁酰基丙酸、3-二茂铁酰基丙酸酯、二茂铁基乙酸、二茂铁基乙腈、4-二茂铁基丁酸、4-二茂铁基丁酸酯、二茂铁基羧基醛(Ferrocenyl Carboxaldehyde)、二茂铁基羧酸、二茂铁基乙醇、二茂铁基甲醇、5-二茂铁基戊酸、5-二茂铁基戊酸酯、卡托辛(Catocene)(2，2-双(乙基二茂铁基)丙烷、氨基二茂铁、甲酰胺基二茂铁、异氰基二茂铁、异硫氰酸根合二茂铁和二膦1，1′双(二苯基膦基)二茂铁。其它有机金属的例子包括双(2，2′-联吡啶)-4，4′-二羧基联吡啶-钌和卟啉锌。
术语“可氧化的无机物”指能够与酶发生反应而产生可在电极上还原的产物的无机化学物质。可氧化的无机物包括单独的下述化合物和其组合：碘、莫尔盐(硫酸铵亚铁(II))和氰基铁酸(II)钾。
术语“烷基”指具有单自由基(single radical)且最多含有约20个碳原子，但较好的是含有最多10个碳原子的直链或支链烷基。烷基的例子包括但不限于：甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、新戊基、叔戊基、异己基、正己基、正庚基和正辛基。取代的烷基中有一个或多个氢原子被其它基团取代，或者一个或多个碳被二价或三价基团或原子替代。
术语“烯基”指具有单自由基、含有至少一个碳-碳双键且最多含有约20个碳原子，但较好的是含最多10个碳原子的直链或支链烷基。烯基的例子包括但不限于：乙烯基、1-丙烯基、2-丁烯基、1，3-丁二烯基、2-戊烯基、2，4-己二烯基、4-(乙基)-1，3-己二烯基和2-(甲基)-3-(丙基)-1，3-丁二烯基。取代的烯基中有一个或多个氢原子被其它基团取代，或者一个或多个碳被二价、三价或四价基团或原子替代。
术语“炔基”指具有单自由基、含有至少一个碳-碳三键且最多含有约20个碳原子，但较好的是含最多10个碳原子的直链或支链烷基。炔基的例子包括但不限于：乙炔基、1-丙炔基、2-丙炔基、1-丁炔基、2-丁炔基、3-丁炔基、4-戊炔基、5-己炔基、6-庚炔基、7-辛炔基、1-甲基-2-丁炔基、2-甲基-3-戊炔基、4-乙基-2-戊炔基和5，5-甲基-1，3-己炔基。取代的炔基中有一个或多个氢原子被其它基团取代，或者一个或多个碳被二价、三价或四价基团或原子替代。
术语“环烷基”指形成至少一个环的烷基，其中所述环具有约3-14个碳原子。环烷基的例子包括但不限于：环丙基、环丁基、环戊基和环己基。取代的环烷基中有一个或多个氢原子被其它基团取代，或者一个或多个碳被二价、三价或四价基团或原子替代。
术语“环烯基”指形成至少一个环并且该环中具有至少一个碳-碳双键的烯基，其中所述环具有约3-14个碳原子。环烯基的例子包括但不限于：环丙烯基、环丁烯基、环戊烯基、1，3-环戊二烯基和环己烯基。取代的环烯基中有一个或多个氢原子被其它基团取代，或者一个或多个碳被二价、三价或四价基团或原子替代。
术语“环炔基”指形成至少一个环并具有至少一个碳-碳三键的炔基，其中所述环含有最多约14个碳原子。形成具有至少一个三键和至少一个双键的环的基团是环炔基。环炔基的例子包括但不限于环辛炔基。取代的环炔基中有一个或多个氢原子被其它基团取代，或者一个或多个碳被二价、三价或四价基团或原子替代。
术语“芳基”指大多数原子为碳原子，含有单自由基，且具有约4-20个碳原子的芳环基。芳环结构可以包括有一个或两个杂原子的环。芳基的例子包括但不限于：苯基、萘基和蒽基。取代的芳基中有一个或多个氢原子被其它基团取代，或者一个或多个碳被二价或三价基团或原子替代。
术语“杂”在用于化学基团命名时，或“杂原子”是指除碳和氢以外的原子。杂原子的例子包括但不限于：氧、氮、磷、硫、硼、硅和硒。
术语“杂环”指一种环结构，所述环结构上具有至少一个环，该环上有至少一个形成该环一部分的杂原子，且具有约3-20个原子连接形成环结构。具有6个原子的杂环的例子是吡啶。杂环结构的其它例子包括但不限于以下芳族结构：吖啶、咔唑、苯并吡喃、咪唑、呋喃、吲哚、喹啉和磷啉(phosphinoline)。杂环结构的例子包括但不限于以下非芳族结构：氮丙啶、1，3-二硫戊环、1，3-二氮杂环丁烷和1，4，2-噁唑磷烷(oxazaphospholidine)。杂环结构的例子包括但不限于以下稠合芳族结构和非芳族结构：2H-呋喃并[3，2-b]吡喃、5H-吡啶并[2，3-d]-o-噁嗪、1H-吡唑并[4，3-d]噁唑、4H-咪唑并[4，5-d]噻唑、硒唑并[5，4-f]苯并噻唑和环戊二烯并[b]吡喃。
术语“多环基团”指具有一个以上的环的碳环结构，所述碳环结构具有约4-20个碳原子形成环结构。多环基团的例子包括但不限于：双环[1.1.0]丁烷、双环[5.2.0]壬烷和三环[5.3.1.1]十二烷。
术语“卤代”或“卤素”的含义包括：氟、氯、溴或碘。
术语“杂原子基团”指一个杂原子，或结合在一起并具有两个自由价的一个以上的杂原子，所述自由价在两个原子之间形成共价桥连。例如，氧自由基-O-可以在两个甲基之间形成桥，形成CH3-O-CH3(二甲基醚)，或可以在两个碳之间形成桥连，形成环氧化物，如顺或反2，3-环氧丁烷。与通常用法不同的是本文中所用术语杂原子基团表示烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基和环炔基中的基团取代，并不表示形成环状桥如环氧化物，除非术语环状桥与术语杂原子基团一起使用来表示通常用法中的含义。使用杂桥(如环氧桥)命名法的杂原子基团的例子包括但不限于：亚叠氮基(—N＝N—HN—)、偶氮(—N＝N—)、二亚氨基(—NH—NH—)、桥二氧(—O—O—)、桥二硫基(—S—S—)、桥硫基(—S—)、桥硫氧亚氨基(epithioximino)(—S—O—NH—)、桥氧基(—O—)、桥氧亚氨基(epoxyimino)(—O—NH—)、桥氧次氮基(—O—N＝)、桥氧硫基(epoxythio)(—O—S—)、桥氧硫氧基(epoxythioxy)(—O—S—O—)、呋喃基(furano)(—C4H2O—)、亚氨基(—NH—)和次氮基(—N＝)。使用形成环桥的命名法的杂原子基团的例子包括但不限于：桥氧基(—O—)、桥硫基(—S—)、桥硒基(episeleno)(—Se—)、桥二氧(—O—O—)、桥二硫(—S—S—)、λ4-磺烷基(sulfano)(—SH2—)、桥氧硫(—O—S—)、桥氧硫氧基(—O—S—O—)、桥氧亚氨基(—O—NH—)、桥亚氨基(—NH—)、二氮烷基(diazano)(—NH—NH—)、二氮烯基(diazeno)(—N＝N—)、三氮-1-烯基(triaz[1]eno)(—N＝N—NH—)、磷烷基(phosphano)(—PH—)、锡烷基(stannano)(—SnH2—)、桥氧亚甲基(epoxymethano)(—O—CH2—)、桥氧亚乙基(epoxyethano)(—O—CH2—CH2—)、桥氧丙烯-1-基(epoxyprop[1]eno)(-O-CH-CH-CH2-)。
术语“桥(bridge)”指环结构的一部分与该环结构的另一部分之间通过碳氢桥(hydrocarbon bridge)的连接。桥的例子包括但不限于：桥亚甲基(methano)、桥亚乙基(ethano)、亚乙烯基(etheno)、桥亚丙基(propano)、桥亚丁基(butano)、2-亚丁烯基(2-buteno)和桥亚苯基(benzeno)。
术语“杂桥”指环结构的一部分与该环结构的另一部分之间通过一个或多个杂原子基团的连接，或通过杂桥将线型结构的一部分与该线型结构的另一部分相连形成的环。
术语“氧基(oxy)”指二价基团-O-。
术语“氧代(oxo)”指二价基团＝O。
术语“羰基”指基团-C(O)-，其中的碳具有用于连接的两个自由基。
术语“酰胺”或“酰基氨基”指基团-NH-C(O)-R，其中氮具有一个用于连接的单自由基，R是氢或未取代的或取代的烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂环或多环基团。
术语“烷氧基”指基团-O-R，其中，氧具有单自由基，R是氢或未取代或取代的烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂环或多环基团。其中R是烷基的烷氧基的例子包括但不限于：甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、戊氧基、己氧基、庚氧基、辛氧基、1，1-二甲基乙氧基、1，1-二甲基丙氧基、1，1-二甲基丁氧基、1，1-二甲基戊氧基、1-乙基-1-甲基丁氧基、2，2-二甲基丙氧基、2，2-二甲基丁氧基、1-甲基-1-乙基丙氧基、1，1-二乙基丙氧基、1，1，2-三甲基丙氧基、1，1，2-三甲基丁氧基、1，1，2，2-四甲基丙氧基。R是烯基的烷氧基的例子包括但不限于：乙烯氧基、1-丙烯氧基、2-丙烯氧基、1-丁烯氧基、2-丁烯氧基、3-丁烯氧基、1-甲基-丙-2-烯氧基、1，1-二甲基-丙-2-烯氧基、1，1，2-三甲基-丙-2-烯氧基和1，1-二甲基-丁-2-烯氧基、2-乙基-1，3-二甲基-丁-1-烯氧基。R是炔基的烷氧基的例子包括但不限于：乙炔氧基、1-丙炔氧基、2-丙炔氧基、1-丁炔氧基、2-丁炔氧基、3-丁炔氧基、1-甲基-丙-2-炔氧基、1，1-二甲基-丙-2-炔氧基和1，1-二甲基-丁-2-炔氧基、3-乙基-3-甲基-丁-1-炔氧基。R是芳基的烷氧基的例子包括但不限于：苯氧基、2-萘氧基和1-蒽氧基。
术语“酰基”指基团-C(O)R，其中，碳具有单自由基，R是氢或未取代的或取代的烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂环或多环基团。酰基的例子包括但不限于：乙酰基、丙酰基、丁酰基、异丁酰基、戊酰基、异戊酰基、丙烯酰基、丙炔酰基(propioloyl)、甲基丙烯酰基、丁烯酰基、异丁烯酰基、苯甲酰基和萘甲酰基。
术语“酰氧基”指基团-O-C(O)R，其中氧具有单自由基，R是氢或未取代的或取代的烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂环或多环基团。酰氧基的例子包括但不限于：乙酰氧基、乙基甲酰氧基、2-丙烯基甲酰氧基、戊基甲酰氧基、1-己炔基甲酰氧基、苯甲酰氧基、环己基甲酰氧基、2-萘甲酰氧基、3-环癸烯基甲酰氧基。
术语“氧基羰基”指基团-C(O)-O-R，其中碳具有单自由基，R是氢或未取代的或取代的烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂环或多环基团。氧羰基的例子包括但不限于：甲氧基羰基、乙氧基羰基、异丙氧基羰基、苯氧基羰基和环己氧基羰基。
术语“烷氧基羰氧基”指基团-O-C(O)-O-R，其中氧具有单自由基，R是氢或未取代的或取代的烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂环或多环基团。
术语“羧基”指基团-C(O)OH，其中碳具有单自由基。
术语“氨基”指基团-NH2，其中氮具有单自由基。
术语“仲氨基”指基团-NH-R，其中氮具有单自由基，R是氢或未取代的或取代的烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂环或多环基团。
术语“叔氨基”指基团-NR2R1，其中氮原子具有单自由基，R1和R2独立地选自以下基团：未取代和取代的烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂环和多环基团。
术语“1，2-亚肼代”指基团-NH-NH-，其中氮具有与相同原子相连的单自由基。术语“1，2-亚肼基”指基团-NH-NH-，其中氮原子具有与不同原子相连的单自由基。
术语“肼基”指基团NH2-N*H-，其中氮(N*)具有单自由基。
术语“亚肼基”指基团NH2-N*＝，其中氮(N*)具有两个自由基。
术语“羟基亚氨基”指基团HO-N*＝，其中氮(N*)具有两个自由基。
术语“烷氧基亚氨基”指基团R-O-N*＝，其中氮(N*)具有两个自由基，R是未取代的或取代的烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂环或多环基团。
术语“叠氮基”指基团N3-，其中氮(N*)具有单自由基。
术语“氧化偶氮基”指基团-N*(O)-N*-，其中每个氮具有一个自由基。
术语“烷基氧化偶氮基(alkazoxy)”指基团R-N(O)-N*-，其中氮(N*)具有一个自由基，R是氢或未取代的或取代的烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂环或多环基团。氧化偶氮苯是一个示例化合物。
术语“氰基”指基团-CN。术语“异氰基”指基团-NC。术语“氰酸根”指基团-OCN。术语“异氰酸根”指基团-NCO。术语“雷酸根”指基团-ONC。术语“硫氰酸根”指基团-SCN。术语“异硫氰酸根”指基团-NCS。术语“硒氰酸根”指基团-SeCN。术语“异硒氰酸根”指基团-NCSe。
术语“羧酰氨基”或“酰氨基”指基团-NH-CO-R，其中，氮具有单自由基，R是氢或未取代的或取代的烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂环或多环基团。
术语“酰亚氨基”指基团＝N-C(O)-R，其中，氮具有两个自由基，R是氢或未取代的或取代的烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂环或多环基团。
术语“亚硝基”指基团O＝N-，其中，氮具有单自由基。
术语“氨氧基”指基团-O-NH2，其中，氧具有单自由基。
术语“亚胺酰基(carxoimidioy)”指基团-C(NH)-R，其中，碳具有单自由基，R是氢或未取代的或取代的烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂环或多环基团。
术语“亚肼基”指基团-C(NH-NH2)-R，其中，碳具有单自由基，R是氢或未取代的或取代的烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂环或多环基团。
术语“甲醛肟基(hydroximoyl)”或“肟(oxime)”指基团-C(NH-OH)-R，其中，碳具有单自由基，R是氢或未取代的或取代的烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂环或多环基团。
术语“肼基”指基团R-C(O)-NH-HN-，其中，每个氮具有单自由基，R是氢或未取代的或取代的烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂环或多环基团。
术语“脒基”指基团-C(NH)-NH2，其中，碳具有单自由基。
术语“硫化物”指基团-S-R，其中，硫具有单自由基，R是氢或未取代的或取代的烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂环或多环基团。
术语“硫醇”指基团-S-，其中，硫具有两个自由基，氢硫醇指-SH。
术语“硫代酰基”指基团-C(S)-R，其中，碳具有单自由基，R是氢或未取代的或取代的烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂环或多环基团。
术语“亚砜”指基团-S(O)-R，其中，硫具有单自由基，R是氢或未取代的或取代的烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂环或多环基团。术语“硫代亚砜”指硫取代亚砜中的氧；该术语包括在R基团的第一个碳被氧基取代时以及当亚砜与另一个基团上的硫原子相连时，对连接在硫和该R基团之间的氧的取代。
术语“砜”指基团-S(O)(O)-R，其中，硫具有单自由基，R是氢或未取代的或取代的烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂环或多环基团。术语“硫代砜”指硫取代在砜的一个或两个位置上的氧；该术语包括在R基团的第一个碳被氧基取代时以及当亚砜与另一个基团上的硫原子相连时，对连接在硫和该R基团之间的氧的取代。
术语“磷酸酯”指基团R1R2PO4-，其中，氧具有单自由基，R1选自：氢、未取代的和取代的烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂环和多环基团，R2选自：未取代的和取代的烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂环和多环基团。
术语“取代的”或“取代”在本文对化学物质的描述中独立地具有选自以下的含义：至少一个碳上的氢被单价基取代、至少一个碳上的两个氢被二价基取代、至少一个末端碳(甲基)上的三个氢被三价基取代、至少一个碳和相连的氢(如亚甲基)被二价、三价或四价基替代，以及它们的组合。要满足价数的要求限制了取代。取代发生在烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂环和多环基团上，提供取代的烷基、取代的烯基、取代的炔基、取代的环烷基、取代的环烯基、取代的环炔基、取代的芳基、取代的杂环和取代的多环基团。在烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂环和多环基团上的取代基团独立地选自：烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂环、多环基团、卤素、杂原子基团、氧基(oxy)、氧代、羰基、酰胺、烷氧基、酰基、酰氧基、氧羰基(oxycarbonyl)、烷氧基羰氧基、羧基、亚氨基、氨基、仲氨基、叔氨基、1，2-亚肼代、肼基、亚肼基、羟基亚氨基(hydroxyimino)、叠氮基、氧化偶氮基(azoxy)、烷基氧化叠氮基、氰基、异氰基、氰氧基，异氰酸根、氰硫基、雷酸根、异硫氰酸根、异硒代氰酸根、硒代氰酸根、羧酰氨基(carboxyamido)、酰基亚氨基、亚硝基、氨基氧代、羧亚氨基、腙酰基、肟、酰基肼基、脒基、硫化物、硫醇、亚砜、硫代亚砜(thiosulfoxide)、砜、硫代砜(thiosulfone)、硫代硫酸根、羟基、甲酰基、羟基过氧基、过氧羟基、过氧酸、氨基甲酰基、三甲基甲硅烷基、次氮基、硝基、酸式硝基、亚硝基、脲亚氨基、草氨酰基、五唑基、硒基、硫氧化(thiooxi)、氨磺酰基、氨亚磺酰基(sulfenamoyl)、次磺基(sulfeno)、氨亚硫酰基(sulfinamoyl)、亚磺基、亚硫酰基、磺基、磺氨基、磺酸根、磺酰基、磺酰二氧基(sulfonyldioxy)、氢硫醇、四唑基、硫代氨甲酰基、硫代缩二脲亚氨基(thiocarbazono)、硫代双偶氮酮基(thiocarbodiazono)、硫代碳酰肼基(thiocarbonohydyazido)、硫代羰基、硫代羧基、氰硫基、硫醛基、硫代酰基、氨基硫脲基(thiosemicarbazido)、硫代亚磺基、硫代磺基、硫脲基、硫代(thioxo)、三氮烷基、三氮烯基、三嗪基、三硫代(trithio)、三硫代磺基、亚磺基亚胺酸(sulfinimidic acid)、磺基亚胺酸(sulfonimidic acid)、亚磺基腙酸(sulfinohydrazonic acid)、磺基腙酸(sulfonohydrazonic acid)、亚磺基羟肟酸(sulfinohydroximic acid)、磺基羟肟酸(sulfonohydroximic acid)和磷酸酯，以及它们的组合。作为取代的例子，例如乙烷上的一个氢原子被羟基取代，得到乙醇；丙烷的中间碳上的两个氢被氧基取代，得到丙酮(二甲基甲酮)。作为取代的另一个例子，例如丙烷的中间碳(次甲基)被氧基(-O-)替代，得到二甲醚(CH3-O-CH3)。作为取代的又一个例子，例如苯上的一个氢原子被苯基取代，得到联苯。如上所述，杂原子基团可以替代烷基、烯基或炔基内的亚甲基(:CH2)，形成直链或支链的取代结构，而不是形成环，或者替代环烷基、环烯基或环炔基的环内的亚甲基，形成杂环。作为另一个例子，例如次氮基(-N＝)可以替代苯上的其中一个碳和相连的氢，得到吡啶，或用氧基替代，得到吡喃。
术语“未取代的”指在烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基或芳基上的碳和氢都没有被取代。
可寻址电极微阵列和结合事件
电极微阵列包括多个可寻址电极。可寻址电极是可电学控制该电极以在电极上产生电流或电压的电极。电极微阵列优选成列或成行排列，但也可采用其它形式。电极可以是圆形或其它合适的几何形状，包括部分成环状或适当断开的线条格子。也可采用其它几何形状，包括2005年4月15日提交的题为＂Neutralization and Containment of Redox Species Produced by CircumferentialElectrodes＂(圆形电极产生的氧化还原物质的中和和包含)的美国申请序列号11/108,078(纳入本文作参考)所述的几何形状。各电极占据了微阵列的表面区域。在含有电极的特定区域内，可原位合成分子。可以合成的分子类型包括小分子、低聚物和聚合物。还可合成生物分子如肽、DNA和RNA。在电极微阵列上合成的分子通常称为探针。
电极微阵列还常常含有连接于微阵列表面的多孔性反应基质(层)。多孔性反应基质连接有探针，并提供三维虚拟瓶用于约束电极的试剂。在圆形电极的情况下，可以认为该瓶是圆柱形。在优选实施方式中，多孔性反应基质选自蔗糖、单糖、二糖、三糖、聚乙二醇、聚乙二醇衍生物、N-羟基琥珀酰亚胺、琥珀酰亚胺衍生物和其组合。在优选实施方式中，可采用其它多孔性反应基质材料，包括2004年9月18日提交的题为＂Electrode Array device having an adsorbedporous reaction layer＂(吸附有多孔性反应层的电极阵列装置)的美国申请序列号10/992,252(纳入本文作参考)。在另一实施方式中，多孔性反应层是膜，膜材料选自聚乙烯醇、聚乙酸乙烯酯、三纤维素乙酸酯、聚氨酯、琼脂糖、含有PTFE树脂的控制多孔性玻璃和它们的组合。
最常见的是，微阵列含有多个探针分子。或者和罕见地，微阵列可含有一种探针分子类型。在最常见的微阵列形式中，探针是可结合于DNA或RNA的互补序列的寡核苷酸，其中所述DNA或RNA是寡核苷酸靶标。根据杂交条件，含有与探针几乎互补的区域的靶标可结合于探针。检测微阵列上的结合或杂交事件是获得有用和准确数据的主要挑战之一。大多数市售产品通常是通过将寡核苷酸打点或喷墨打印到平坦的非多孔性表面如载玻片上制备的。存在使样品寡核苷酸(靶标)变成用荧光染料标记的市售样品标记试剂盒。它常常是以商品名德克萨斯红或CY染料，包括CY3
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和CY5
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出售的荧光染料。最常见的是，通过具有显微镜放大或成像拼合功能的常见荧光计布置“阅读”微阵列。读数包括在打点或合成探针的已知位置上观察荧光。阅读微阵列荧光以检测结合事件是通用的检测方法。然而，存在着光学问题、难以用荧光染料标记、偶发性高背景问题，以及最重要的是，荧光显微设备成本极高。因此，需要用复杂程度低且变异性降低的较低成本的设备检测微阵列上的结合事件。
本发明方法采用电化学方法检测结合事件，以提供变异性较低的较低成本的方法。该方法包括将电压或电流施加于电极微阵列上的电极，以检测结合事件。用电压或电流检测酶反应的产物或酶反应产物的影响。可以在阳极氧化该产物，或在阴极还原该产物。微阵列上的电极可以用作阳极或阴极。仅限于在有源(active)电极，而非相邻(neighboring)电极检测局部电流或电压信号。不存在这类限制称为电极间的＂串话＂。本发明在结合事件检测期间电极之间串话很少或无串话。优选地，与未发生结合事件的电极相比，检测到电压或电流改变，则说明发生了结合事件。或者，可通过电阻率改变来检测结合事件。电极微阵列优选为康柏玛其克公司(CombiMatrix Corporation)的CUSTOMARRAY12KTM。(每平方厘米约12,000个电极)。或者，电极微阵列是康柏玛其克公司的CUSTOMARRAY902TM(每平方厘米约1,000个电极)。其它电极微阵列也适合用于实施本发明。通常，微阵列上任何密度的电极均适合实施本发明，只要各电极之间间隔足够距离。
电极微阵列上的免疫实验
根据抗体与少数分析物形成复合物的能力进行免疫实验，所述分析物通常是抗原或半抗原。抗体对特定分析物的选择性提供了高度特异且高度灵敏的实验。通常，免疫实验是基于一种或多种抗体与分析物的结合。分析物的例子包括抗原、半抗原、病毒、细菌、细胞、蛋白质、多糖、生物聚合物分子、脂质、糖蛋白(α-1-酸糖蛋白)、蓖麻毒蛋白、M13噬菌体、球形芽孢杆菌(Bacillusglobigii)(BG)芽孢、荧光素、兔IgG、山羊IgG、DNA、RNA、单链DNA、核糖体RNA、线粒体DNA、细胞受体、糖基化的膜结合蛋白、非糖基化的膜结合蛋白、多肽、糖基化多肽、抗体、细胞抗原决定簇、有机分子、金属离子、盐阴离子和阳离子以及有机金属，和它们的组合。与免疫实验有关的问题可能源于以下能力：(1)组装可检测结构的能力和(2)发生抗体结合时准确检测的能力。理想情况下，仅在含有合适探针的位置上发生抗体结合。可通过存在酶反应产物而间接测定抗体结合事件。
结合抗体后，需要一种检测结合抗体的方法。通常，最常见的检测方法包括使用标记，包括放射性标记、酶或荧光标记。最常见的方法是使用连接于结合于抗体的部分或直接连接于抗体的荧光标签。在这种方法中，用荧光成像***观察含有该抗体的微阵列上的位置。荧光图像和探针身份知识的组合提供了靶标的检测。最常见的使用酶标记的免疫实验是酶联免疫吸附实验(ELISA)。最普遍的酶免疫实验是夹心法和竞争性结合法。用96孔微量滴定板进行最传统的免疫实验；也可采用其它平板，如384孔板或更多孔板。通常，对常规免疫实验的限制包括：(1)难以进行多重测定；(2)分析时间相对较长；(3)整个过程分为多个阶段，使该方法较复杂并且需要经过充分培训的工作人员；(4)在实践中，无法使该装备小型化；(5)完成了自动化但困难重重；和(6)必须在实验室进行。因此，本领域需要一种复杂程度降低、分析时间缩短、能够小型化、自动化和能够在非实验室条件下进行的改进的免疫实验。
本发明方法利用了夹心免疫实验和连接于报道抗体的酶。在电极微阵列上进行的夹心免疫实验中，使第一结合抗体结合于微阵列的已知位置上。通常，第一结合抗体称为捕获抗体。第一结合抗体优选连接于与电极微阵列已知位置上原位合成的寡核苷酸互补的寡核苷酸。或者，将电极微阵列上的寡核苷酸打点到已知位置上。通过与微阵列上的互补链杂交使第一结合抗体连接于微阵列，从而按照互补链的位置提供第一抗体的位置图。这类杂交和作图称为自身组装微阵列。
使含有分析物的溶液接触微阵列，以便使分析物结合于抗体。感兴趣分析物通常只结合于特定抗体，从而提供高特异性。使含有第二抗体的溶液接触微阵列，以使第二抗体连接于结合的分析物。第二抗体用作报道抗体，就是说该抗体能报道连接有分析物的微阵列位置。
优选地，报道抗体与酶共价连接。或者，报道抗体可含有生物素分子。可将链霉亲和素-酶偶联物或亲和素-酶偶联物连接于此生物素分子。或者，可将链霉亲和素连接于生物素，然后将另一生物素连接于链霉亲和素，其中第二个生物素共价连接于酶。或者，可将连接有酶的抗-物种抗体连接于报道抗体。或者，报道抗体可结合有链霉亲和素或亲和素。然后，将生物素标记的酶连接于链霉亲和素或亲和素。或者，报道抗体可连接有寡核苷酸。连接有酶的互补寡核苷酸与连接于报道抗体的寡核苷酸杂交。该酶优选为氧化还原酶。或者，该酶是引起切割反应而产生氧化还原产物的酶，所述产物是可以在电极上氧化或还原的酶。或者，所述产物是在电极上沉积的固体；可通过电阻、电导率或氧化还原反应检测固体产物。
可与免疫实验一起构建和使用本发明方法，所述免疫实验包括夹心型免疫实验。构建和使用使该酶连接于抗体复合物。报道抗体结合于微阵列已知位置上连接的探针抗体结合的分析物时，形成该复合物。夹心实验形式能够使用若干形式，而不难提供(合成)基于分析物的单独的抗体-酶偶联物。图1和2显示了夹心形式的免疫实验的例子。也可采用以前所述的其它形式。
用于免疫实验的酶体系
本文介绍了不同酶体系。各自具有不同的活化电势。各自在独特的pH范围内起作用。一些酶体系可能需要氧化还原介质。各体系的底物可能不同。产物可能是可被直接氧化或还原的可溶性产物；产物可以是不溶的，并沉积在连接有酶部分的位点上。提供了各体系的反应方案。
辣根过氧化物酶
在一个实施方式中，辣根过氧化物酶(HRP)用作酶。该酶较小(约36千道尔顿)，并具有大周转率(底物饱和时酶催化反应的最大初始速率)。HRP是能催化还原过氧化氢的氧化酶，过氧化氢可能损坏某些聚合型多孔基质或膜。图5显示了用邻苯二酚和过氧化氢作底物，HRP催化的反应方案。HPR将催化其它底物与过氧化氢的反应。例如，其它底物包括：可氧化的芳香剂、二茂铁衍生物和可氧化的无机物。采用邻苯二酚和过氧化氢的HRP催化反应如下：
邻苯二酚+H2O2→醌+H2O。
检测(电流测量法检测)结合有酶复合物的电极(阴极)上的抗体结合事件的氧化还原反应如下：
醌+2e-+2H+→邻苯二酚。
优选地，以-0.3伏与铂丝进行该实验。实验溶液优选为0.05摩尔柠檬酸-磷酸钠缓冲液，其中含有0.2摩尔硫酸钠，pH为5.0。优选地，溶液中的过氧化氢浓度为1毫摩尔。溶液中的邻苯二酚浓度优选为1毫摩尔。
碘和过氧化氢是可与HRP一起使用的另一种底物对。采用碘和过氧化氢的HRP催化反应如下：
2I-+2H++H2O2→I2+2H2O。
用于以电流测量法检测结合有酶复合物的电极(极性设定为阴极)上的抗体结合事件的氧化还原反应如下：
I2+2e-→2I-。
邻苯二胺(OPD)和过氧化氢是另一与HRP一起使用的底物对。采用OPD和过氧化氢的HRP催化反应如下：
OPD+H2O2→ox-OPD+H2O。
用于以电流测量法检测结合有酶复合物的电极(阴极)上的抗体结合事件的氧化还原反应如下：
ox-OPD+2H++2e-→OPD。
优选地，以-0.1伏与铂丝进行采用OPD的实验。溶液优选为0.05摩尔柠檬酸-磷酸钠缓冲液，其中含有0.2摩尔硫酸钠，pH为5.0。优选地，溶液中的OPD和过氧化氢浓度均约为1毫摩尔。
漆酶
在另一实施方式中，漆酶用作酶。漆酶是类似于HRP的氧化酶，但用氧代替了过氧化氢。漆酶能催化其它底物与氧的反应。例如，其它底物包括：邻苯二胺(OPD)和可氧化的芳香剂。采用邻苯二酚和氧的漆酶催化反应如下：
邻苯二酚+O2→醌+H2O。
以电流测量法检测结合有酶复合物的电极(阴极)上的抗体结合事件的氧化还原反应如下：
醌+2e-+2H+→邻苯二酚。
优选地，以-0.3伏与铂丝进行该实验。实验溶液优选为0.05摩尔柠檬酸-磷酸钠缓冲液，其中含有0.2摩尔硫酸钠，pH为5.0。优选地，溶液中的邻苯二酚为1毫摩尔。
β-半乳糖苷酶
在另一实施方式中，β-半乳糖苷酶用作酶。β-半乳糖苷酶能催化切割寡糖和糖基衍生物上倒数第二个β-半乳糖残基的反应。β-半乳糖苷酶的反应方案见图3。优选地，底物是X-Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷)。X-Gal是β-半乳糖苷酶的非诱导性生色底物。β-半乳糖苷酶能水解X-Gal，形成蓝色沉淀。β-半乳糖苷酶的周转率低于其它酶，但该酶在中性pH下非常稳定。优选地，水溶液中X-Gal约为0.1毫摩尔。优选将X-Gal溶解于二甲基甲酰胺中，然后在剧烈搅拌的条件下加入约0.01摩尔的磷酸盐缓冲盐水中。
pH优选7.0。X-Gal不会与玻璃或金属电极发生作用。因此，需要电子介质使电子穿梭于电极表面。电子介质优选氰化铁/亚铁溶液，包括***亚铁和***铁。该溶液优选为50:50的铁:亚铁。用电流测量法检测时，氰化铁/亚铁溶液的铁浓度优选约为10毫摩尔。优选将溶液中总铁浓度调节得较低。用电势计检测是将所选电势施加于电极与参比电极，而不让电流通过连接电极的电路。参比电极的例子是银/氯化银。可以随着加入底物浓度的升高，按比例提高氰化铁/亚铁的浓度。优选地，电压设定为0伏(铂电极)和0.5V(电极微阵列)。
葡萄糖氧化酶
在另一实施方式中，葡萄糖氧化酶用作酶。葡萄糖氧化酶是氧化酶。反应方案见图4。优选地，反应在pH约为7.5的缓冲液中发生。缓冲液优选为浓度约为0.01摩尔的磷酸盐缓冲盐水。底物优选为葡萄糖，它高度可溶于水。优选用5-甲基-吩嗪硫酸甲酯(PMS)再生酶。PMS使用氰化亚铁/铁转变在电极上检测。优选地，将微阵列外铂电极的电势设定为0伏，将微阵列电极电势设定为0.5伏。
相对于β-半乳糖苷酶反应，葡萄糖氧化酶反应有一些优点和缺点。优点是，此反应的所有组分在水性缓冲液中极其易溶。然而，需要电子介质如PMS。PMS倾向于随时间被＂空气氧化＂，一定要新鲜制备或在适当的惰性条件下储存，否则会产生较高的背景信号。
葡萄糖脱氢酶
在另一实施方式中，葡萄糖脱氢酶用作酶。采用底物葡萄糖和2，6-二氯靛酚(DCPI)的葡萄糖脱氢酶反应方案如下：
葡萄糖+DCPI(ox)→葡糖酸+DCPI(红色)。
以电流测量法检测结合有酶复合物的电极(阳极)上的抗体结合事件的氧化还原反应如下：
DCPI(红色)→DCPI(ox)+2e-。
优选地，以-0.3伏与铂丝进行该实验。实验溶液优选含有约50毫摩尔哌嗪-N，N′-双(2-乙磺酸)(PIPES)缓冲液，pH6.8，其中含有约1纳摩尔吡咯并喹啉醌(PQQ)、约1微摩尔氯化钙、约64微摩尔DCIP和约120毫摩尔葡萄糖。
更优选地，在PBS溶液中用GDH进行电化学检测，所述PBS溶液中含有CaCl2、PQQ、2，6-二氯靛酚(DCIP)、吩嗪硫酸乙酯(phenazine ethosulfate，PES)和葡萄糖。在约+300-500毫伏与常见的ITO反电极(counter electrode)下进行检测。GDH催化葡萄糖氧化，该反应伴随着PES的还原。反应如下：
葡萄糖+PES(氧化)→葡糖酸+PES(还原)
这一反应后，还原的PES还原了DCIP：
DCIP(氧化)+PES(还原)→DCIP(还原)+PES(氧化)
通过向电极施加正电压氧化DCIP的还原形式。检测到按照以下等式的氧化反应产生的氧化电流：
DCIP(还原)-电子→DCIP(氧化)。
碱性磷酸酶
在另一实施方式中，碱性磷酸酶(AP)用作酶。AP能在水存在下催化氨基酚磷酸酯(底物)的去磷酸化反应。该反应能够形成氨基酚，它是检测到的产物。反应方案如下：
氨基酚磷酸酯+H2O→(AP)磷酸酯+氨基酚
通过连接有AP的电极上发生的电化学氧化，检测电极上的氨基酚。检测到的电流是阳极电流。电流大小与氨基酚形成量成正比。氨基酚形成量是酶反应的结果，因此与结合于电极的AP量成正比。
多重氧化还原酶放大的检测
在另一实施方式中，用不同的独特酶标记各分析物特异性抗体、靶标或附连于微阵列的第二抗体。在各个酶体系中，化学特征是独特的，因此在信号获取期间串话有限(或无串话)。为使用各种酶体系提供了一个例子。优选地，采用了至少两种不同酶，它们选自辣根过氧化物酶(HRP)、漆酶(Lac)、葡萄糖脱氢酶(GDH)、葡萄糖氧化酶(GO)或β-半乳糖苷酶(β-Gal)。为在常见电极微阵列上使用前三种提供了一个例子。然而，同一电极微阵列上可以使用若干种酶体系，以便在底物溶液(含有缓冲液和各种酶底物)改变时，特定酶仅在适合连接于微阵列的特定酶、而非其它酶的条件下产生信号。
HRP是过氧化氢氧化还原酶，它能还原过氧化氢，伴随着氧化许多有机物。漆酶(氧的氧化还原酶)能氧化类似于与HRP发生反应的化合物的化合物，但它能将氧还原成水。因为它们具有相似的酶特异性(均测定为阴极电流)，所以必须控制添加底物/缓冲液的顺序。采用葡萄糖脱氢酶体系时，将葡萄糖氧化成葡糖酸，而2，6-二氯靛酚(DCPI)被还原。在将还原的DCPI再氧化时测定阳极电流。葡萄糖脱氢酶体系与HRP或漆酶无重叠，因为测定的是阳极电流，而非阴极电流。此外，底物显著不同。
当漆酶和HRP用于同一免疫实验体系时，选择先引入哪一底物对进行合适的实验很重要。合并的漆酶和HRP体系不受各酶体系的化学性质影响，而是受检测步骤中电极的电化学性质的影响。这种检测的复杂情况是有机底物还原时在阴极产生痕量过氧化氢的结果。产生过氧化物使得检测复杂化，因为漆酶和HRP酶的底物相似。因此，在利用HRP的免疫实验体系中先运行漆酶实验总是产生痕量阳性反应，这必须予以考虑。然而，大量过氧化物抑制了漆酶的化学反应；因此，尝试测定采用HRP和漆酶时的酶化学性质时，应该先进行漆酶实验，以防止过氧化物引起的漆酶抑制。
在含有一种以上酶的酶放大体系的另一实施方式中，葡萄糖脱氢酶(GDH)和HRP用作酶。电极微阵列的所选电极上合成了探针。其它电极上合成了随机序列。采用互补靶标在微阵列上自身组装GDG和HRP。在一个实施方式中，吡咯并喹啉醌(PQQ)用作GDH体系的辅因子。GDH通过涉及电子受体底物的反应催化葡萄糖氧化，如下所述：
葡萄糖+电子受体→葡糖酸+还原的电子受体(电子供体)
可以在电极上检测因酶反应而形成的电子供体，如下所述：
电子供体-电子+电子受体
与HRP检测相反，在较高的电极电势(HRP＝-0.1伏，GDH＝+0.3伏)下进行GDH检测，与HRP的阴极电流相反，检测阳极电流，即，可分别由HRP和GDH反应产物测定电流而不互相干扰，因为电流的极性不同；一种是正性，一种是负性。因此，可以用这两种酶设计双酶***检测，类似于双色光学检测。优选地，在过氧化氢存在下TMB用作HRP底物。
通过不溶性沉积产物产生的电阻进行氧化还原酶放大检测
在本发明另一实施方式中，酶底物在连接有酶的微阵列电极上反应并形成沉积物。优选地，该酶是HRP。辣根过氧化物酶(HRP)的所选底物会通过酶反应形成不溶性产物。优选地，该底物是3，3′-二氨基联苯胺(DAB)，它在过氧化氢存在下由HRP酶氧化形成不溶性产物。其它底物如二茂铁衍生物也适合实施本发明。
不想局限于理论，随着酶反应进行，氧化产物形成沉积在微阵列表面层上的不溶性化合物。因此，微阵列位置上酶数量越多，结合有酶的位点的多孔性反应层上产生和发现的不溶性物质越多。这层不溶性物质在电极表面上形成＂绝缘层＂。与不含沉积物的电极相比，含有沉积物的电极的电阻改变。可通过电极的电化学读数监测这种改变的电阻。说明本发明两个电极的示意图见图20，它显示的一个电极含有酶和沉积物，另一个电极不含酶或沉积物。
优选地，电流介质实现了电极的电化学读数。优选地，该介质是氰化铁/亚铁对，它对不溶性沉积物的量很灵敏。不想局限于理论，不溶性沉积物将降低K3[Fe(CN)6](K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]体系)的电化学还原的电流。说明电流介质的两个电极的示意图见图21，它显示的一个电极含有酶和沉积物，另一个电极不含酶或沉积物，因此电流更高。
用酶反应产物作为沉积层进行电化学检测有许多优点。首先，该方法合并了酶放大和信号收集的原理，从而提高了灵敏度。因此，理论上的实验检测限是每点一个分子。在一个实施方式中，在非优化条件下能检测10尘摩尔15-聚体寡核苷酸。其次，虽然因为酶反应和检测方案的分开的导致该方法需要一个额外步骤，但由于这种分开，电化学检测不需要快速检测步骤。可以在几十分钟或更长时间内进行检测而电极微阵列的化学性质不会发生改变。最后，因为检测信号是测定沉积物质引起的电流降低，所以可施加高电流(阳极或阴极电流)。可通过改变氧化还原介质的浓度和/或施加的电压以及沉积时间来控制电流密度。因此，即便可能采用相当低的动态范围，也不需要低电流测定的设备。对于超低电流测定可能是限制参数的高密度/低电极尺寸微阵列而言，不需要低电流测定特别重要。
通过减少不溶性沉积产物进行氧化还原酶放大检测
在本发明另一实施方式中，用酶标记的靶标检测生物识别-结合事件，如DNA杂交或抗体-抗原相互作用。该酶能催化有电化学活性的不溶性物质的沉积。通过减少不溶性物质进行电化学检测。如同其它实施方式那样，这一实施方式是通过将结合转变为电化学信号而进行荧光检测的另选方式。采用随后接触底物并形成反应产物的酶标记的靶标实现这种转变，所述反应产物是表面结合的电活性分子、分子簇或聚合分子。可通过将电压或电流施加于含有探针-靶标-酶复合物的电极检测电活性产物。这种方案减轻了荧光技术中昂贵光学器件的需要，并增加了通过初始结合事件酶学放大信号的优点。
本发明的这一实施方式提供了测定结合事件的方法，该方法改进了荧光相关问题。在这个实施方式中，提供了酶放大法，藉由这种方法使酶产物为不溶性产物并沉积在含有探针-靶标-酶复合物的电极表面上。不溶性酶产物有电化学活性，可通过向表面施加电压并监测所产生的电流而转变成电信号。在监测期间还原该酶产物。
在优选实施方式中，酶是HRP，底物是过氧化氢和四甲基联苯胺(TMB)。HRP能在过氧化氢存在下氧化TMB，从而形成不溶性氧化分子或分子簇，沉积在结合有HRP的电极上。去除TMB并用缓冲液取代，以终止氧化反应。通过将电压施加于电极以还原氧化的酶产物，从而检测氧化的TMB。能够形成不溶性反应产物的其它酶底物组合也适合实施本实施方式，需要注意不溶性反应产物能够在检测期间被还原或氧化。
在优选实施方式中，氧化TMB的表面浓度与该位点上的酶量、溶液中过氧化物和TMB两者的浓度、以及总反应时间成正比。这种普通关系适用于酶和底物的任何组合。用这种方法可以控制所有变量。一旦不溶性沉淀物结合于电极表面后，施加还原电势会改变氧化状态，产生与该电极上氧化物质的量成正比的法拉第电流。检测这种电流，作为定量电极表面上的结合量(如)RNA-DNA结合量的基础。
文中所述的检测方案类似于停流实验，其中可控制酶反应条件，如时间和底物浓度。得到的电信号与表面上的酶产物量成正比，并且与底物浓度和反应时间有关联。由于可以采用这种方法控制这两种变量，所以可进行定量。
通过连续阅读进行氧化还原酶放大检测
在本发明另一实施方式中，提供了阅读含有可通过氧化还原反应检测的酶产物的电极微阵列的方法。为了阅读电极微阵列，将所有电极设定为略高于接地电势的低电势。该电势优选约为10毫伏。维持这种低电势状态，同时通过不提供任何通向低电阻接地的途径使所有电极处于开路中。由于施以开路，没有电流流动。缺少电流防止产物的氧化还原状态发生任何改变。将各电极依次设定为接地，然后在开路状态下回复至低电势。不同时将两个电极设定为接地，然后在开路状态下回复到低电势。
电极设定为接地时，电路是通路，使得电流由电极流向电极微阵列的其余部分(由于存在低正电势)。这种电流能还原各电极上的酶产物并氧化微阵列其它电极上的物质。这种连续方案有效地将整个微阵列用作反电极，将接地电极用作工作电极。优选地，将电极设定为接地后立即测定接地电极的电流。为了阅读整个微阵列，将各个电极依次转向接地、阅读，然后转回施加电势。测定的电流是充电和法拉第电流的线性组合。由于超电势很低(如10毫伏)，所以最大程度降低了充电电流，它被法拉第电流所遮蔽。或者，利用约-10毫伏的负电势在电极上氧化产物，从而阅读微阵列。
可以设定酶反应的时间，然后在预定终点立即终止该反应。此时，终止了动态过程；因此，对检测酶反应没有时间限制。按照本发明制备电极微阵列，在电极微阵列上终止酶反应，18小时后阅读微阵列。采用非常低的超电势；因此由充电引起的背景电流非常小。背景电流小能提高信噪比。只有一个电极用作工作电极。微阵列上其余电极是有效的反电极；因此，不需要采用单独的＂微阵列外＂电极实现这一目的。此外，由于在某一点上所有电极均被移交(relegate)用作反电极，所以所有电极均可用于实验目的。
实施例1
辣根过氧化物酶
在第一个免疫实验中，以电流测量法检测HRP催化反应的产物醌。以-0.3伏与铂丝在水溶液中进行该实验，所述溶液中含有0.05摩尔柠檬酸-磷酸钠缓冲液，pH5.0，同时含有0.2摩尔硫酸钠。邻苯二酚浓度为1毫摩尔，过氧化氢浓度为1毫摩尔。为了连接HRP，以棋盘图案在电极微阵列上原位合成探针DNA。采用标准的亚磷酰胺化学和用于去除保护基的电化学产生的酸。用生物素标记与探针DNA互补的靶DNA。用1纳摩尔靶DNA的2XPBST溶液在40摄氏度培育1小时，使靶DNA与探针DNA杂交。
加入含有链霉亲和素标签的HRP，以便用HRP-链霉亲和素复合物溶液连接生物素。该复合物包含偶联于链霉亲和素的80个HRP单元形成的专利聚合物。链霉亲和素-HRP复合物购自研究诊断公司(Research Diagnostics，Inc)。为了制备链霉亲和素-HRP溶液，用2XPBST将1微升链霉亲和素-HRP80复合物稀释至5000微升。接触时间为60分钟，溶液温度为25摄氏度。结果显示，电极微阵列上获得了预计的棋盘图案，如连接有酶的电极上电流增加所证明的那样，即没有HRP的位置上的阴极电流低于结合了HPR的位置的阴极电流。电流较高表明醌在电极上还原为邻苯二酚。此外，在预计位置上存在结合，而相邻电极位置之间不存在噪声或串话。
实施例2
漆酶
在第二个免疫实验中，通过电流测量法检测漆酶催化反应的产物醌。以-0.3伏与铂丝在水溶液中进行该实验，所述溶液中含有0.05摩尔柠檬酸-磷酸钠缓冲液，pH 5.0，同时含有0.2摩尔硫酸钠。邻苯二酚浓度为1毫摩尔，氧浓度未测定，但由溶液中天然存在的量决定。为了连接漆酶，以棋盘图案在电极微阵列上原位合成靶DNA。采用标准的亚磷酰胺化学和用于去除保护基的电化学产生的酸。用生物素标记与探针DNA互补的靶DNA。用1纳摩尔靶DNA的2XPBST溶液在40摄氏度培育1小时，使靶DNA与探针DNA杂交。用1微克/毫升链霉亲和素的2XPBST溶液在25摄氏度培育60分钟，从而加入链霉亲和素，，使其连接于生物素。用1微克/毫升漆酶-生物素复合物的2XPBST溶液在25摄氏度培育60分钟，从而加入含有生物素标签的漆酶，，使其连接于链霉亲和素。
结果显示，电极微阵列上获得了预计的棋盘图案，如结合有漆酶的电极上电流增加所证明的那样，即结合了漆酶的位置的阴极电流高于没有漆酶的位置的阴极电流。电流较高表明醌在电极上还原为邻苯二酚。此外，在预计位置上存在结合，而相邻电极位置之间不存在噪声或串话。
实施例3
β-半乳糖苷酶免疫实验
在电极微阵列上进行的免疫实验中，β-半乳糖苷酶用作酶，底物是X-Gal。采用生物素化β-半乳糖苷酶。在pH 7.0的磷酸盐缓冲盐水中进行反应。缓冲液浓度为0.01M。为了制备溶液，将所选量的X-Gal溶解于DMF，因为它在DMF中非常易溶，但在水中的溶解度低。将含有X-Gal的DMF加到水性缓冲液中。X-Gal的终浓度为约0.1毫摩尔，这接近饱和浓度。将含有X-Gal的DMF加入缓冲液的过程中，剧烈搅拌缓冲液，以防止由于X-Gal的水溶性有限所致的X-Gal沉淀。如果加入X-Gal的DMF溶液时不剧烈搅拌，X-Gal会沉淀下来。该溶液的不稳定性需要每天制备新鲜溶液。使用浓度约为10毫摩尔的氰化铁/亚铁溶液进行电流检测。将电极微阵列的电压设定为0伏(微阵列外的铂电极)和0.5伏。通过电化学合成法(标准亚磷酰胺化学和用以去除保护基的电化学产生的酸)原位合成电极微阵列(康柏玛其克公司)的所选电极上的探针DNA。修饰连接于探针DNA的最后一个DNA单位，使其含有生物素标签。将链霉亲和素加入微阵列中，以结合生物素。按照图3所示的反应方案加入氧化还原试剂和底物。
β-半乳糖苷酶免疫实验检测***的结果见图6。在泳道1-8代表的微阵列的一部分中，没有置入生物素标签。在泳道9-16中，生物素化β-半乳糖苷酶加到微阵列中，以结合链霉亲和素，从而形成生物素-链霉亲和素-生物素复合物。这些数据显示了微阵列两部分，即泳道1-8与含有β-半乳糖苷酶的泳道9-16之间的电流测量反应差异。图6所示所选电极的负电流值表明结合了β-半乳糖苷酶。在合成过程中相邻电极用作对应电极，相邻电极不含生物素标签。相似地，图7将这种微阵列概况表示为图6所示三维图形的切片图(slice)(行)。电极9、11、13和15含有β-半乳糖苷酶，不出所料，这些电极上电流的绝对值较高。
实施例4
采用荧光素的β-半乳糖苷酶免疫试验
在免疫化学检测试验中，捕获和检测含荧光素的β-半乳糖苷酶。采用标准亚磷酰胺化学和用以解封亚磷酰胺上保护基的电化学产生的酸在电极微阵列(康柏玛其克公司)上原位合成探针DNA。靶DNA与探针DNA互补，且连接有抗荧光素抗体。采用约85微摩尔溶液(每200微升缓冲液约2.5毫克靶DNA)、40摄氏度的温度和60分钟的时间使含有抗体的靶DNA杂交于探针DNA。使β-半乳糖苷酶标记的荧光素的溶液接触微阵列，以使荧光素结合于靶DNA上的抗体。溶液浓度为约1纳摩尔；温度为25℃；接触时间为60分钟。将用作低分子量抗原的荧光素连接于较大酶。
所用底物是0.1毫摩尔的X-Gal的水溶液。为了制备底物溶液，使X-Gal溶解于二甲基甲酰胺，然后在剧烈搅拌的情况下加入约0.01摩尔磷酸盐缓冲盐水。pH为7.0。氰化铁/亚铁溶液用作电子介质。氰化物溶液包含铁/亚铁比例为50∶50的***亚铁和***铁。氰化铁/亚铁溶液的铁浓度为10毫摩尔。电压设定为0伏(铂电极)和0.5伏(电极微阵列)。
电流测量的结果见图8。探针DNA位于电极微阵列的第2排(S2)，泳道1、3和5。按照图3的反应方案，含有荧光素-β-半乳糖苷酶的电极位点的电流值提高。用落射荧光显微镜确证和验证F-β-半乳糖苷酶与覆盖电极的多孔性反应层的结合。落射荧光数据准确跟踪了用本发明方法获得的检测电极电流的结果。
实施例5
葡萄糖-氧化酶电化学检测
在本实施例中，用附连有生物素的葡萄糖氧化酶进行试验。采用标准亚磷酰胺化学和用以解封亚磷酰胺上保护基的电化学产生的酸在电极微阵列(康柏玛其克公司)上原位合成探针DNA。靶DNA与探针DNA互补，且连接有抗荧光素标签。采用约15纳摩尔(每200微升缓冲液约2.5纳克靶DNA)、40摄氏度的温度和60分钟的时间使靶DNA杂交于探针DNA。链霉亲和素溶液接触微阵列，以使链霉亲和素结合于靶DNA上的生物素。溶液浓度为10纳摩尔链霉亲和素的2XPBST溶液；温度为25摄氏度；时间为60分钟。
采用浓度为10纳摩尔的酶溶液、25摄氏度的温度和60分钟的时间将含有生物素标签的酶连接于链霉亲和素。为了检测该酶，采用含有0.01摩尔缓冲液(pH7.5)、40毫摩尔β-D-葡萄糖、0.3毫摩尔PMS和比例为50:50的氰化亚铁/铁的底物溶液。总铁浓度为10毫摩尔。以***亚铁和***铁的形式加入氰化亚铁/铁。图9显示了所选电极上电流的三维图的切片图。葡萄糖氧化酶位于泳道2、4、6和8。如图所示，按照图4所示的反应方案，结合有葡萄糖氧化酶的电极上电流的绝对值增加。
实施例6
用邻苯二酚进行辣根过氧化物酶检测
在本实施例中，HRP是酶，邻苯二酚和过氧化氢是底物。通过含电极很少(即，无多孔性膜或其上合成的探针)微阵列装置(康柏玛其克公司)上一个100微米直径的电极监测过氧化物酶反应的氧化还原曲线。将微阵列浸没在溶液中，用其上的电极监测溶液氧化还原化学。结果见图10。图10中各曲线的各数据点代表同一电极上的测定结果。结果表明，在负电势下，有和无HRP酶的电流测量差异是显著的。结果的图案有些类似循环伏安曲线。在一段时间上进行电流实验。结果见图11。如图11所示，在一段时间后电流变平。因此，开始测定的最佳时间是约3秒后，即开始变平时。图11中各数据点是不同电极上的测定结果。
实施例7
五种分析物的HRP免疫试验
在本实施例中，在电极微阵列上电化学检测HRP产物。检测五种分析物，包括α-1-酸糖蛋白(AGP)、植物凝集素蓖麻毒蛋白(RCA)、M13噬菌体、球形芽孢杆菌(BG)芽孢和荧光素。微阵列是每平方厘米上含有1170个电极的康柏玛其克公司的98001CMOS芯片。电极的直径为约90微米。
兔的多克隆抗-人α-1-酸糖蛋白(AGP)、单克隆抗-FITC抗体、人AGP、多克隆抗-蓖麻毒蛋白(RCA)抗体(兔血清中)、RCA和共价连接有蓖麻毒蛋白的琼脂糖珠获自密苏里州圣路易斯的西格玛化学药品公司(Sigma ChemicalCompany，St.Louis，Mo.)。单克隆抗噬菌体(M13)抗体和单克隆抗噬菌体抗体的HRP偶联物购自新泽西州皮斯卡塔韦的安玛西亚-法玛西亚生物科技公司(Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，N.J.)。M13噬菌体(初始包装)是威斯康星州麦迪逊的普洛麦格公司(Promega)的产品。此外，SBCCOM(阿伯丁试验场(Aberdeen Proving Grounds))为此实施例提供了球形芽孢杆菌芽孢以及多克隆抗-BG芽孢抗体(来自山羊)。
4-[N-马来酰亚胺基甲基]环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺基酯(SMCC)交联试剂、生物素-LC-LCNHS和活化的琼脂糖珠获自伊利诺斯州罗克福德的皮尔斯化学品公司(Pierce Chemical Company，Rockford，Ill)。P-6和P-30离心柱获自加州里士满的伯乐公司(Biorad，Richmond，Calif)。由欧普朗公司(Operon)(加州阿拉米达的凯杰公司(Qiagen，Alameda，Calif.))制备用于修饰蛋白质的寡核苷酸。用作荧光素类似物的3′FITC标记的15聚体互补物也获自欧普朗公司(Operon)。
用琼脂糖-AGP偶联柱亲和纯化多克隆抗-AGP抗体，所述偶联柱是用购自威斯康星州密尔沃基的皮尔斯化学制品公司(Pierce Chemical Company，Milwaukee，Wis.)的试剂盒制备的。将该抗体的PBS(pH7.5)溶液加载到标记柱上，用甘氨酸缓冲液，pH2.8洗脱。在A280下监测洗脱溶液，将合适组分收集到微量滴定板中，用lox PBS，pH7.4中和；然后用1xPBS，pH7.4将样品透析过夜。以类似方式，采用与蓖麻毒蛋白偶联的琼脂糖亲和纯化兔抗-蓖麻毒蛋白抗体。
生物素-LC-LC-NHS(1mg/ml的二甲基甲酰胺溶液)与蛋白质在pH7.4的水相中发生反应，使抗体生物素化。标记反应中生物素与抗体的摩尔比为10:1(生物素的最终最终浓度为70微摩尔)。使该反应进行1小时，然后使该溶液通过伯乐公司的P-6离心柱。收集洗脱液，储存于4摄氏度待用。
通过以下方法用含有微阵列上直接合成的探针寡核苷酸的互补序列的寡核苷酸标记抗体：(1)先用Cleland试剂还原含有保护巯基的寡核苷酸，在伯乐的P-6离心柱上分离；(2)然后抗体单独与SMCC发生反应，标记蛋白质上的反应性胺，然后用P-6柱纯化；(3)然后，将SMCC标记抗体与含巯基的寡核苷酸混合，以使该寡核苷酸共价连接于该抗体；和(4)用伯乐(Biorad)P-30离心柱去除过量寡核苷酸。
用以下方法使抗体在芯片表面上自身组装。于40℃将抗体-寡核苷酸样品的2XPBST(含有0.05％吐温20的磷酸盐缓冲液)溶液与芯片培育1小时。该溶液含有五种不同的抗体-寡核苷酸偶联物(不同的抗体特异性)。各抗体-寡核苷酸偶联物在含有合成的寡核苷酸互补物的预定电极上自身组装。换言之，各抗体附连有独特的寡核苷酸，以便通过互补探针DNA的位置确定抗体在微阵列上的位置。采用标准亚磷酰胺化学和用以去除保护基的电化学产生的酸在微阵列上原位合成DNA探针。用2xPBST缓冲液洗涤微阵列两次，在与探针DNA杂交后干燥。将含有分析物的溶液与活化芯片一起培育1小时。用2xPBST缓冲液洗涤该微阵列，然后在含有生物素化抗分析物抗体(或者在噬菌体的情况下，HRP-Ab偶联物)的溶液中浸没1小时。用2xPBST缓冲液洗涤该微阵列，然后放入含有链霉亲和素-HRP偶联物的溶液中(0.5小时；仅用于AGP和蓖麻毒蛋白分析物)。最后，用2xPBST缓冲液洗涤该微阵列，保持在2xPBST中直到开始测定。通过用合成kras序列(癌基因15-聚体序列)修饰的亚区域确定阴性对照。处理此亚区域的方法类似于所有其它电极(接触分析物、生物素化抗体、SA-HRP和酶底物)。测定各电极上的电流，如果平均信号比背景高三倍标准差则认为结合有酶。
当BG芽孢是分析物时，将上述方法改变成通过结合抗体捕获这些芽孢的方案。这些芽孢本身容易从悬浮它们的水溶液中沉淀出来。这可能是由于聚集或其它因素。将含有芽孢的悬浮液加到微阵列表面上，使其沉淀，但不时地混合该溶液。然后在后续洗涤步骤中洗掉未通过特异性抗体结合于所选电极的芽孢。
酶缓冲液条件和HRP催化反应底物如下：反电极上的电势设定为0.3伏，芯片电极上的电势设定为0伏。因此，随着HRP将底物转变为酶产物，电子由芯片流向反应介质。反应缓冲液含有柠檬酸盐/磷酸盐(50毫摩尔)，其中含有0.2M NaCl，pH为5.0。该溶液含有0.003％过氧化氢和1毫摩尔邻苯二胺(OPD)。
经统计学和最大信号测定，60分钟是检测低浓度分析物的最佳培育时间。然而，当分析物浓度较高时，可采用较短的培育时间(12分钟或更短)更快地获得结果。图34显示了实验反应与分析物浓度和培育时间的关系，(A)中分析物为蓖麻毒蛋白，(B)中分析物为M13噬菌体。所用的培育时间为12分钟(曲线1)、30分钟(曲线2)和60分钟(曲线3)。
图12显示了由五种分析物的多重免疫实验输出的电流。
分析物培育时间为1小时。各分析物特异性抗体在棋盘图案中以4x10阵列排列(使用交替的电极)。分析物浓度如下：RCA(1ng/ml)、AGP(2.75微克/ml)、BG芽孢(2 x 105个芽孢/ml)和噬菌体(1010pfu/ml)。为了检测FITC分析物，在芯片上培育1微克FITC寡核苷酸(与芯片上的序列互补)。接下来与生物素化抗-FITC抗体培育该芯片。含有存在的每种分析物的所有生物素化抗体的混合物中存在此抗体。因为采用了不同浓度，所以所有分析物的强度不相同。阴性对照是15-聚体kras序列，见第25-27行。其它(kras修饰的)对照电极也位于分析物特异性区域之间的各行(第5、10、15、20行)中。各分析物的试验性能因各抗体-分析物对的亲和常数而不同。
实施例8
HRP免疫试验
在本实施例中，辣根过氧化物酶是酶，邻苯二酚和过氧化氢是底物。兔IgG和山羊IgG是亲和标记的，并分别结合于电极微阵列的上半部分和下半部分。通过加入HRP标记的抗山羊抗体和抗-兔抗体完成结合。可能采用HRP标记的山羊抗兔抗体和HRP标记的小鼠单克隆抗山羊抗体进行检测。这些实验的结果见图13。具体说，图13显示了检测结合于电极微阵列上所选电极的兔IgG的电流。微阵列是获自康柏玛其克公司(Combimatrix Corporation)的电极微阵列。用HRP标记的山羊抗-Rb抗体进行电化学检测。样品在S4(1、3、5)和S5(2、4)中。改变电流标识符以展示这些数据。另外，图13显示了结合于所选电极的山羊IgG的检测。用HRP标记的抗山羊抗体和抗兔抗体进行电化学检测。样品在S1(1、3、5)和S2(2、4、6)中。这些数据与根据采用荧光标记抗体和标准荧光检测的早期工作的预期结果一致。
实施例9
两种靶标的HRP和OPD试验
在这个实施例中，寡核苷酸靶标(两个)是生物素标签附连于3′末端的15-聚体单链DNA单元，它购自欧普朗公司。第一靶标构型为5′-15聚体A-生物素3′，第二靶标的构型为5′-15聚体B-生物素-3′。在含有约1000个电极的引脚格栅微阵列(pin grid microarray)(PGA)形式的电极微阵列上原位合成与寡核苷酸靶标互补的寡核苷酸探针，该微阵列购自康柏玛其克公司。以棋盘图案在电极微阵列的两个不同区域上合成探针。合成寡核苷酸探针后，寡核苷酸靶标与PGA上的互补寡核苷酸探针杂交。杂交条件包括40摄氏度1小时、寡核苷酸靶标浓度为1nM。
杂交溶液包含寡核苷酸的2x磷酸盐缓冲盐水0.05％吐温(R)(PBST)。用2xPBST洗涤PGA。含有辣根过氧化物酶标签的链霉亲和素的溶液与杂交的PGA微阵列一起培育。培育使得链霉亲和素-HRP复合物结合于生物素化的杂交靶探针。培育时间为45分钟，温度为25摄氏度。该复合物包含偶联于链霉亲和素的80个HRP单元形成的专利聚合物。链霉亲和素-HRP复合物购自研究诊断公司(Research Diagnostics，Inc)。为了制备链霉亲和素-HRP溶液，用2xPBST将1微升链霉亲和素-HRP80复合物稀释至5000微升。用2xPBST洗涤PGA。使含有1毫摩尔邻苯胺二胺(OPD)和1毫摩尔过氧化氢的底物溶液接触PGA。相对于反电极，将-0.3伏电势施加于工作电极，并测定电流。如图14所示，结合有HRP的电极的电流值较高，因为氧化的OPD产物被还原。通过三维柱状图和右上角二维插图中的黑色方块描述了较高电流。
实施例10
电势测定
图15显示了寡核苷酸杂交电化学检测的三维图。具体说，在电极微阵列(康柏玛其克公司)上原位合成Rab和Kras寡核苷酸序列。Kras序列构型为5′-15-聚体C-3′。所用的Rab序列为5′-15聚体D-3′。通过原位电化学技术合成的寡核苷酸探针Kras位置的序列为5′15-聚体C′-3′，Rab位置的序列为5′-15聚体D′-3′，其中15-聚体C′与15-聚体C序列互补，15-聚体D′与15聚体D序列互补。
采用铂丝为反电极。DNA靶标是购自欧普朗生物技术公司(OperonBiotechnologies，Inc.)的生物素化Rab样品。将生物素化Rab靶标加到微阵列中，以便与微阵列上的探针DNA杂交(1纳摩尔，40摄氏度，1小时)。将链霉亲和素偶联的HRP加到微阵列中，以便与生物素化Rab序列复合。测定各电极的电极电势与Ag/AgCl参比电极。这些数据见图15(三维图形)。发现Rab寡核苷酸探针为正信号。不出所料，没有发现Kras探针的信号。
实施例11
校正曲线
在本实施例中，将三种分析物混合成一种溶液，并加到制备的电极微阵列中。微阵列装置在不同已知位置上合成许多不同寡核苷酸探针的能力使得能够在一片芯片上检测多种分析物。在各种情况下，用标准偶联方法以酶标记准备研究的样品。合并多种样品，以便使所有待研究靶标来自单一合并样品。合并AGP样品、蓖麻毒蛋白和兔Rab寡核苷酸样品，用HRP作为酶在一个微阵列(康柏玛其克公司)上进行研究。即使靶标组是蛋白质或核酸，只有含有合适探针的位置能检测到靶标。根据多个微阵列研究，发现对AGP而言检测限度是每毫升5皮克，对蓖麻毒蛋白而言是每毫升300皮克；此浓度转换为2.5尘摩尔。动态检测范围跨越四个对数。图16显示了就AGP和蓖麻毒蛋白而言电流与分析物浓度的关系。
图17提供了温度40摄氏度、杂交时间为2小时时Rab-生物素寡核苷酸靶标的负电流与浓度对数的图。图17中的各数据点代表了不同电极微阵列的平均负电流，其中使各微阵列接触不同浓度的寡核苷酸靶标。
实施例12
采用HRP和漆酶的多种酶免疫试验
在本实施例中，在同一电极微阵列上使用漆酶和HRP，以进行AGP和蓖麻毒蛋白混合物的免疫试验。作为第一个步骤，制备试验试剂。通过抗体上的伯胺将15聚体寡核苷酸附连于第一抗体。就漆酶而言抗体是抗AGP，就HRP而言抗体是抗RCA。用二硫键修饰3′末端上的寡核苷酸，其5′末端上含有18个单位的PEG。因此，寡核苷酸的结构如下：PEG(18)-15-聚体DNA-S-S-R。R基团为甲基，但可以是另一个基团。采用两种不同的15聚体寡核苷酸；一种用于漆酶，一种用于HRP。
为了制备硫修饰的寡核苷酸，将含有二硫键的寡核苷酸(10微升1毫摩尔母液)与30微升10xPBS和5微升二硫苏糖醇(DTT)溶液(1毫克/毫升的水溶液)混合。然后在室温下培育该混合物4小时，分两次施加到用1x磷酸盐缓冲盐水(PBS)预平衡的P6柱上。得到的硫修饰的寡核苷酸具有以下结构：PEG(18)-15-聚体-S-H。
为了制备抗体，加入交联接头。将琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)溶解于二甲基甲酰胺(DMF)，以获得毫克/毫升的浓度。将SMCC溶液(1.2微升)加入50微升1xPBS配制的所需抗体溶液(1毫克/毫升)中。然后在室温下培育该混合物2小时，分两次施加到用1xPBS预平衡的P6柱上。
如下所述，将修饰寡核苷酸连接于修饰抗体。合并修饰的寡核苷酸和抗体溶液，室温培育2小时。然后，分两次将该混合物施加到用1xPBS预平衡的P30柱上。得到的结构如下：15-聚体-PEG(18)-抗体。然后，收集、冷冻和储存连接寡核苷酸的抗体。
通过在电极上合成互补性寡核苷酸制备含有约1000个电极的电极微阵列(康柏玛其克公司)。合成两种不同类型的互补寡核苷酸(标准的亚磷酰胺化学和电化学解封)，一种用于漆酶，一种用于HRP。控制各互补寡核苷酸的位置。
使附连有寡核苷酸的第一抗体接触微阵列，以便进行自身组装。将标记到所选寡核苷酸的两种抗体悬浮于含有0.05％吐温20的2xPBS(2xPBST)中，浓度约为1-5微克/毫升。将电极微阵列与寡核苷酸标记抗体一起于40摄氏度培育1小时。然后用0.5毫升2xPBST洗涤微阵列三次。
使分析物蓖麻毒蛋白(HRP)和AGP(漆酶)接触微阵列，以便连接于各自的抗体。将不同浓度的分析物悬浮于2xPBST。将含分析物的溶液(30微升)施加于微阵列。在室温下将微阵列与含分析物的溶液一起培育1小时。然后用0.5毫升2xPBST洗涤该微阵列3次。
然后，将第二抗体连接于微阵列以形成夹心结构。在不同阶段连接漆酶和HRP的各第二抗体，即各抗体的不同溶液。在HRP阶段，使2xPBST配制的生物素化第二抗体(0.2毫克/毫升)接触该微阵列。室温下培育该微阵列1小时。然后用0.5毫升2xPBST洗涤该微阵列3次。
然后将HRP-链霉亲和素偶联物(1微克/毫升)的2xPBST溶液加入微阵列中。在室温下将该微阵列与HRP-链霉亲和素偶联物溶液一起培育1小时。然后用0.5毫升2xPBST洗涤该微阵列3次。加入游离生物素、然后洗涤，从而封闭链霉亲和素上的其余位点。
在漆酶阶段，使生物素化第二抗体(0.2毫克/毫升)的2xPBST溶液接触该微阵列。在室温下培育该微阵列1小时。然后用0.5毫升2xPBST洗涤该微阵列3次。然后，使链霉亲和素接触该微阵列，以便将生物素结合到漆酶夹心结构的第二抗体上。使生物素化漆酶接触该微阵列，以便结合于连接于漆酶夹心结构第二抗体上生物素的链霉亲和素。首先，电化学检测漆酶夹心结构，然后电化学检测HRP夹心结构。
在邻苯二酚和空气氧存在下，采用漆酶标记抗体进行的AGP免疫试验产生正信号，如图18所示。试验溶液为含有0.2摩尔硫酸钠的0.05摩尔柠檬酸-磷酸钠缓冲液(pH5.0)。溶液中的过氧化氢浓度为1毫摩尔。溶液中的邻苯二酚浓度为1毫摩尔。温度为室温。施加电压为-0.3伏。
不出所料，采用HRP标签进行的蓖麻毒蛋白免疫试验没有信号，如图18右侧所示。洗涤微阵列并将其放入含有OPD和过氧化氢的底物溶液中时，采用HRP标签时观察到蓖麻毒蛋白的正信号，如图19的右侧所示。用-0.1伏与铂丝进行采用OPD的试验。该溶液为0.05摩尔柠檬酸-磷酸钠缓冲液，其中含有0.2摩尔硫酸钠，pH为5.0。OPD和过氧化氢的浓度均为1毫摩尔。温度为环境温度。还可观察到与检测AGP有关的漆酶标记抗体的低强度反应。
如本实施例所述使用夹心结构时，必须按照本实施例所述的顺序进行试验。换言之，一定要在HRP检测之前进行漆酶检测。否则，可能发生酶串话。串话很明显，因为酶来自相关家族，从而通过还原氧或过氧化氢氧化同一有机物。使用两种不同氧化还原酶时多重酶***变得更有效。可以采用的许多其它酶***之一是葡萄糖脱氢酶与漆酶或HRP。
实施例13
采用HRP和葡萄糖脱氢酶的多种酶免疫试验
在本实施例中，在同一电极微阵列上使用HRP和葡萄糖脱氢酶(GDH)，以证明在多种酶免疫试验中使用这些酶的可行性。微阵列为康柏玛其克公司CUSTOMARRAY 12KTM。分别和依次在微阵列上检测GDH和HRP。通过寡核苷酸与微阵列上合成探针的杂交使GDH和HRP连接于微阵列。将GDH和HRP连接于同一微阵列之前，将GDH本身连接于微阵列，以显示GDH的用途。通过杂交三种所选生物素化寡核苷酸完成连接。
采用几个步骤来制备含有GDH的微阵列。按照标准的皮尔斯生物素化方案使GDH生物素化。为了将GDH连接于微阵列，用电化学合成法在微阵列上原位合成与三种不同的生物素化寡核苷酸互补的三种探针。探针包括含有序列15-聚体E′的aP1、含有序列15-聚体F′的aP2和含有序列15-聚体G′的aP3。靶标长度是15-聚体，且与探针互补。不含探针的电极上合成了随机15-聚体序列。通过将该微阵列接触寡核苷酸溶液使生物素化寡核苷酸杂交于各互补探针，这些寡核苷酸称为P1、P5和P6。生物素连接于3′末端。溶液中P1、P5和P6的浓度分别为1纳摩尔、50皮摩尔和10皮摩尔。杂交时间为60分钟，温度为40摄氏度。使浓度为1微克/毫升的链霉亲和素溶液接触微阵列，以便将链霉亲和素连接于各寡核苷酸上的生物素。然后，将含有1毫摩尔CaCl2和10微摩尔PQQ的PBS中的生物素化GDH与微阵列于25摄氏度培育15分钟，形成具有以下结构的复合物：杂交寡核苷酸-生物素-链霉亲和素-生物素-GDH。
在含有100微摩尔CaCl2、0.1微摩尔PQQ、1毫摩尔2，6-二氯靛酚(DCIP)、600微摩尔吩嗪硫酸乙酯(PES)和100微摩尔葡萄糖的PBS溶液中进行GDH的电化学检测。以+300毫伏、然后+500毫伏进行检测，用普通ITO反电极进行检测。GDH能催化葡萄糖氧化，该反应伴随着PES被还原。该反应如下：葡萄糖+PES(氧化)→葡糖酸+PES(还原)
按照这一反应，还原的PES然后还原DCIP：
DCIP(氧化)+PES(还原)→DCIP(还原)+PES(氧化)
向电极施加正电压能氧化DCIP的还原形式。按照以下等式，氧化反应产生可检测的氧化电流：DCIP(还原)-电子→DCIP(氧化)
以300毫伏进行检测的结果见图31，它提供了含有P1、P5或P6的电极组电流差异的三维图和平均电流差异的二维示意图。深色方框表示该组中电极的平均电流较高。图31显示，当靶标寡核苷酸浓度为1纳摩尔(P1)时，相对于背景电流测定到显著电流。不出所料，10皮摩尔(P6)和50皮摩尔(P5)的电流差异小于1纳摩尔，它们大约相等。如图32所示，在电势约500毫伏下测定时重复了电流差异的图案(pattern)。图31和32中的二维示意图并未显示实际照片中的瑕疵。
为了获得同时含有连接HRP的寡核苷酸和连接GDH的寡核苷酸的微阵列，P1用于GDH，P6用于HRP。在微阵列(康柏玛其克公司)上原位合成互补探针(采用电化学解封的标准亚磷酰胺化学)。将该微阵列与P6生物素化寡核苷酸一起培育(0.1纳摩尔，40℃，1小时)。洗涤该微阵列，然后用HRP-链霉亲和素偶联物培育，以便将HRP连接于微阵列。偶联物包含偶联于链霉亲和素的80个HRP单位形成的专利聚合物。链霉亲和素-HRP复合物购自研究诊断公司(Research Diagnostics，Inc)。为了制备链霉亲和素-HRP溶液，用2xPBST将1微升链霉亲和素-HRP80复合物稀释至5000微升。接触时间为60分钟，溶液温度为25摄氏度。得到的连接是杂交的P6-生物素-链霉亲和素-HRP。然后在同一微阵列上对GDH重复该方法，以获得杂交的P1-生物素-链霉亲和素-GDH。在标准HRP检测条件下，以TMB为底物，在过氧化氢存在下进行HRP检测。电压为-0.2伏。该溶液是10倍稀释的市售TMB溶液。温度为室温。用不同溶液依次检测GDH和HRP。用本实施例以前描述的溶液检测GDH。
图33显示了平均电流减去背景电流的二维示意图。该示意图不捕获原始照片中的瑕疵，原始照片中，由于盖玻片的污染，其P1位置上显示出一些阴影。上方的示意图将GDH检测结果表示为较浅的小方块。下方的示意图将HRP检测结果表示为较浅的小方块。在GDH检测期间，含HRP电极的电流并未显著高于背景电流。相似地，在HRP检测期间，含有GDH的电极未见显著高于背景电流的电流。因此，可以在同一电极微阵列上检测各酶，而不干扰其它酶。可利用这种没有串话的情况构建用一种以上类型的酶检测多种分析物的微阵列。
实施例14
通过沉积产物进行的氧化还原酶放大检测
在这个实施例中，用HRP作为酶，在电极微阵列上形成不溶性沉积产物，以检测结合事件。将康柏玛其克公司CUSTOMARRAY 12KTM电极微阵列用作微阵列。不溶性沉积产物能提高电极的电阻，从而可测定结合事件。选择四个子区域，在各区域上合成四种不同寡核苷酸，例如各区域含有四种寡核苷酸之一。各区域包含16个电极(4x4)。芯片子区域含有以下寡核苷酸：寡核苷酸1，5′-20-聚体H-3′；寡核苷酸2，5′-20-聚体I-3′；寡核苷酸3，5′-20-聚体J-3′；和寡核苷酸4，5′-20-聚体K-3′。用标准的亚磷酰胺化学和电化学解封技术在各子区域内四个电极上原位合成各寡核苷酸。在其余电极上，合成了许多随机寡核苷酸。将该微阵列与含有生物素的寡核苷酸1-4的互补寡核苷酸一起37摄氏度培育过夜。采用各种浓度的互补寡核苷酸。充分洗涤微阵列，在室温下用HRP-链霉亲和素偶联物培育。该偶联物包含偶联于链霉亲和素的80个HRP单元形成的专利聚合物。链霉亲和素-HRP复合物购自研究诊断公司。为了制备链霉亲和素-HRP溶液，用2xPBST将1微升链霉亲和素-HRP 80复合物稀释至5000微升。接触时间为60分钟，溶液温度为25摄氏度。然后再用2xPBST洗涤，用DAB-过氧化氢溶液培育30分钟，以便在微阵列上形成沉积层。DAB的浓度为1毫摩尔。过氧化氢浓度为1毫摩尔。沉积层为棕色，不难在升高的沉积物上观察到该沉积层。最后，用不同浓度的K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]溶液和不同施加电压进行电化学检测。
图22是电极微阵列的光学显微照片的黑白示意图。可在各4x4电极组上观察到沉积在微阵列子区域上的不溶性产物。互补寡核苷酸浓度为1皮摩尔至1纳摩尔。可观察到在高和低浓度的捕获的含生物素互补寡核苷酸存在下形成的不溶性物质沉积的差异。与产生随机序列寡聚物的位点(背景电极)上获得的电流相比，在含有互补寡核苷酸的电极上电化学还原K4[Fe(CN)6]的电流显著降低。对高浓度的氧化还原介质而言，这种电流差异可高达几十纳安培。
图23显示一电极微阵列的二维图，该电极微阵列显示30分钟的沉积时间后在HRP-DAB-沉积物上以-100mV对2毫摩尔K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]进行的电化学还原。在低至10尘摩尔的互补寡核苷酸浓度下观察到电流降低。在10皮摩尔以上，发生信号饱和；然而，如果缩短沉积时间，则可由这些电极获得数据。
实施例15
还原性沉积产物进行的氧化还原酶放大检测
本实施例中，用HRP作为酶，使不溶性产物沉积在电极微阵列上，从而将一个结合事件转化为有限量的氧化还原活性材料。用康柏玛其克公司CUSTOMARRAY 12K电极微阵列作为微阵列。向反电极施加电压，以还原不溶性沉积产物，从而检测微阵列上的结合。
将微阵列制备为用于复杂基因表达实验的DNA微阵列。45摄氏度时，靶RNA与微阵列上的互补探针杂交18小时。用生物素标记靶RNA。然后利用聚HRP链霉亲和素偶联物标记杂交序列。洗涤电极微阵列后，使其接触含0.003％过氧化氢的四甲基联苯胺(TMB)5分钟。不溶性物质，即氧化的TMB与HRP标记的靶RNA配合(registration)沉积。去除TMB试剂并用加了200毫摩尔的NaCl的磷酸柠檬酸盐缓冲液终止氧化反应。氧化的TMB为蓝色，不难观察到此种物质的沉积。缓冲液无氧化还原活性；因此，该检测步骤中观察的电流由电极上的氧化还原活性分子引起。
电极微阵列含有无沉积、淡蓝色沉积和深蓝色沉积区域。图24为代表电极微阵列彩图的黑白图，显示了蓝色沉积产物。深蓝色区域代表结合RNA和随后HRP的高浓度；相反地，浅蓝色代表它们的低浓度。微阵列上含有未合成探针DNA的电极。不出所料，这些电极无沉积。微阵列上蓝色较深的区域含有高浓度的与溶液中靶标互补的DNA序列。
起先，以-0.1伏的电压与铟-锡氧化(ITO)反电极对微阵列上的一小部分进行电化学阅读。图25是电极微阵列的黑白转换图，显示了微阵列阅读期间每一电极的电流。白色区域对应含有探针DNA的电极，因此，由沉积产物还原引起法拉第电流。黑色区域代表无沉积产物的电极，因此电流最小。最下面一排电极不含合成的DNA；因此，无HRP附着也无沉积产物形成。无DNA电极上的电流约为0.2纳安(均值)，在图25中这类电极表示为黑色。
图25中其余电极含有能与溶液中RNA杂交的合成探针序列。溶液中RNA的浓度为0.375-12pM。每一电极上观察到的电流为法拉第电流和充电电流的线性组合。为了辨别有酶的电极和无酶附连的电极，充电电流必须是总电流中可忽略不计的部分。特异性结合事件以及后续氧化的TMS的沉积产生了范围为0.5-12纳安的电流，而阴性对照探针上的非特异性相互作用小于0.4纳安。该技术可在非特异性干扰物存在下探测DNA-RNA的特异性相互作用。
当获取如图26所见信号后，在-0.1伏再次阅读微阵列。由于所有氧化TMB在前次阅读中已还原，观察到的电流仅由电极充电所致。该电流的平均值为0.2-0.3纳安，如图26所示。在某些情况下观察到充电电流比所选电极的法拉第电流小10倍以上。这是有利的，因为图25中观察到的大多数电流是由感应过程和极少的充电干扰所致。独立调整图25和26的灰度以在图像内显示最大对比度；然而，图中的黑白示意图的灰度发生改变(loose)。
为了阅读整个微阵列，如图27所示实施该方法。在阅读循环0中，将所有电极设定为10毫伏。这一状态与开路状态的所有电极同时发生，因为不存在接地的低电阻路径。各单独电极依次接地(阅读循环1-3)，而将微阵列上的其余电极保持在10毫伏。为了检测电流，通过电流测定电子器件使低电阻通路开始接地，从而使一个电极接地，以闭合该电流。在这段时间中，监测和记录电流。由于所施加的电势，在一个方向上例如从接地单独电极到微阵列其余电极的方向上电流被调正。电流还原了接地电极上的物质并氧化微阵列其余电极上的任何物质。此方案将整个微阵列有效用作反电极，将接地电极用作工作电极。为了阅读整个微阵列，使各个单独电极依次接地，记录电流，然后接回施加电势，如图27所示。通过单独阅读各电极，依次阅读微阵列。
更详细说，使各电极连接于多路开关。最初将该开关接入电压源(约10mV)。然后，在阅读该电流之前的很短时间，将电极真实接地一段时间(时间可变)。这段时间可以是0-10毫秒，然后将该电极接到放大器输入端。将该放大器的输入端保持在接近地电势的水平(1mV以内)，但并不真实接地。在大多数情况下，调整放大器输入端，以尽量接近接地电势，但也能够调整到不等于接地电势。可用此方法(例如)消除背景电流。在实践中，使电压维持尽可能接近接地电势。可采用不同的放大器，包括：积分放大器(这是所用的类型)、互阻抗放大器和电压放大器。
图28是描述用上述方法阅读微阵列时电极微阵列上各电极的电流的黑白转换图。白色区域对应于含有探针DNA的电极，由于沉积产物被还原而产生法拉第电流。黑色区域代表没有沉积产物，因此电流很小。在24秒内阅读整个CUSTOMARRAY 12K芯片，对未合成DNA的电极和含有阴性对照序列的电极而言平均背景充电电流为0.2纳安。由不同浓度的标记RNA靶标产生的电流见图29。电流显著增加与对应溶液中RNA浓度线性提高基本呈指数关系。这一试验说明，此方法能够区分不同浓度的RNA溶液，而受充电电流或非特异性RNA-DNA相互作用引起的其它电流的干扰。
数据表明可通过电化学还原在过氧化氢存在下制备的固定的HRP/TMB反应产物而观察DNA/RNA杂交。这一阅读方法能够终止酶反应，并在随后的时间阅读微阵列。采用低过电势，以便最大程度减小充电引起的背景电流，从而提高信噪比。这种阅读方法不一定需要分离的微阵列外电极。所有电极均用作反电极，所有电极均可用于试验目的。此外，发现溶液中的靶标浓度与电流成正比，而充电电流的干扰可忽略不计。
实施例16
通过固体沉积产物的电导率进行氧化还原酶放大检测
在本实施例中，用HRP作为酶、吡咯和过氧化氢作为底物，电化学检测寡核苷酸杂交结合事件。将HRP附连于寡核苷酸靶标，并催化聚合吡咯(氧化)，以形成聚吡咯，聚吡咯沉积在附连有HRP的电极上。聚吡咯是导电性聚合物，因此提高沉积有聚吡咯的电极的电导率。在沉积后测定是否存在聚吡咯。在恒定电压下测定时，与含聚吡咯的电极相比，不含聚吡咯的电极的电流较低。
在本实施例中，通过测定发生杂交的电极上电导率的增加，检测生物素化扩增RNA(aRNA)转录物的杂交。电导测定为在PBS溶液中设定为-300mV时通过电极的电流量增量。通过导电性聚合物聚吡咯的HRP酶学沉积增加电极上的电导。杂交aRNA转录物后，使链霉亲和素-HRP结合于生物素化aRNA。然后，HRP氧化底物吡咯，形成聚吡咯，发生杂交时它沉积在单个电极上。聚吡咯形成量与HRP量成正比，HRP量与杂交于电极位点的生物素化aRNA的量成正比。而且，在设定为-300mV的电极上检测的电流量与电极上沉积的聚吡咯量成正比。
用PCR由λDNA构建含有T7启动子的六种不同的1000碱基对(bp)DNA序列。这六种序列称为sp-12、sp-09、sp-08、sp-06、sp-05和sp-03。通过T7扩增产生这些转录物的扩增RNA，在此扩增过程中通过掺入生物素化UTP进行标记。用由mRNA线性扩增反义aRNA所用的埃伯温法(Eberwine method)(Phillips J，Eberwine J H.(1996)反义RNA扩增：由单个活细胞分析mRNA群体的线性扩增方法(Antisense RNA Amplification：A Linear AmplificationMethod for Analyzing the mRNA Population from Single Living Cells)，Methods.10(3):283-288)由K562(人CML细胞系)mRNA产生非特异性aRNA群体，并通过与六种转录物相同的方式用许可试剂标记上生物素。用镁2+诱导的金属水解使所有aRNA片段化成50-200bp长度。
在含有0.1％吐温TM和25％甲酰胺的6xSSPE溶液中，使六种转录物sp-12、sp-09、sp-08、sp-06、sp-05和sp-03以及5微克片段化K562aRNA于45摄氏度杂交于康柏玛其克公司CUSTOMARRAYTM12k DNA电极微阵列16小时。该微阵列含有K562特异性基因的探针以及对六种转录物中每一种特异的三种不同探针。所有探针的长度均为35-40bp。六种转录物sp-12、sp-09、sp-08、sp-06、sp-05和sp-03分别以下述浓度杂交：3000、1000、300、100、10和1皮摩尔。
杂交后，洗涤微阵列，用链霉亲和素-HRP培育15分钟。洗涤该微阵列，在含有0.1％吡咯和0.03％过氧化氢的50毫摩尔磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液(pH5)(西格玛(Sigma)#P-4809)中培育1小时。用1xPBS洗涤该微阵列3次。将微阵列保留在1xPBS中，电化学检测聚吡咯。为了测定电流，读数电极设定为接地，而微阵列外电极设定为300毫伏。电流测定值取作传入地的电流量(I)。
电流通过量与聚吡咯存在量成正比。在图35中，提供了不同电极上电流通过量的二维图。该图是各电极中通过电流的灰度图(表示为方块)。较高电流对应于方块中较亮的图像。此图显示了六种杂交转录物各自的三种探针(每种转录物一列)以及溶液中杂交转录物的浓度(最下面一行)。也有在溶液中没有杂交物的九种阴性对照探针。在图36中，提供了各杂交转录物在电极上的电流数值。该值是各转录物浓度下三种不同探针的平均值。在图37中，通过九种零浓度探针计算得到相对于平均背景的增量。该图显示，最低浓度下电流增加1倍，至最高浓度下电流增加4.5倍。

Claims (33)

1.一种用酶检测电极微阵列上的结合事件的方法，所述方法包括：
(a)提供一微阵列，该微阵列含有多个电极和多种捕获复合物，所述捕获复合物至少有两种不同类型，且连接在对应于所述电极的位点上，其中第一捕获复合物类型与第一分析物类型具有亲和力，后续的捕获复合物类型与后续的分析物类型具有亲和力，其中所述电极是可电学寻址的电极；
(b)将至少一种类型的多种分析物施加到捕获复合物上，形成对应于捕获复合物捕获的各分析物类型的结合类型复合物；
(c)将酶连接于结合复合物，形成报道复合物，其中报道复合物的类型对应于捕获复合物捕获的各分析物类型；
(d)使多种底物溶液依次接触微阵列，用电信号确定位点上是否存在酶产物，其中各底物溶液对应于报道复合物类型，其中存在电信号是结合事件的衡量。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述捕获复合物由多种寡核苷酸探针组成，所述分析物由多种寡核苷酸靶标组成，所述寡核苷酸靶标与寡核苷酸探针的杂交形成结合复合物，通过附连法使酶结合于寡核苷酸靶标，其中附连法包括通过选自下组的分子基团连接酶：(a)抗体、抗-抗体和抗-独特型抗体组合，(b)生物素和链霉亲和素或亲和素组合，和(c)寡核苷酸和互补寡核苷酸组合，和它们的组合。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，通过原位电化学合成方法合成所述寡核苷酸探针。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述捕获复合物由杂交于含有抗体标签的寡核苷酸靶标的寡核苷酸探针组成，通过抗体标签捕获分析物，从而形成结合复合物，通过附连法使酶结合于分析物，其中所述附连法包括附连于分析物的报道抗体和通过选自下组的分子基团附连于报道抗体的酶：(a)抗体、抗-抗体和抗-独特型抗体组合，(b)生物素和链霉亲和素或亲和素组合，和(c)寡核苷酸和互补寡核苷酸组合，和它们的组合。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，通过原位电化学合成方法合成所述寡核苷酸探针。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述捕获复合物通过选自下组的方法制备：原位电化学合成、打点、喷墨打印、电场沉积和原位光刻合成。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述捕获复合物由选自下组的分子组成：寡核苷酸、多肽、抗体、糖基化多肽、多糖、肽核酸和含有多个上述分子单体的混合分子。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述分析物由选自下组的分子组成：抗原、半抗原、病毒、细菌、细胞、蛋白质、多糖、生物聚合物分子、脂质、糖蛋白(α-1-酸糖蛋白)、蓖麻毒蛋白、M13噬菌体、球形芽孢杆菌(BG)芽孢、荧光素、兔IgG、山羊IgG、DNA、RNA、单链DNA、核糖体RNA、线粒体DNA、细胞受体、糖基化的膜结合蛋白、非糖基化的膜结合蛋白、多肽、糖基化多肽、抗体、细胞抗原决定簇、有机分子、金属离子、盐阴离子和阳离子以及有机金属和它们的组合。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酶选自：辣根过氧化物酶、漆酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、碱性磷酸酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、过氧化氢酶、乳酸氧化酶和过氧化物酶，以及它们的组合。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述底物溶液由含有缓冲液、盐和酶底物溶液的水溶液组成，其中所述酶底物溶液含有能与该酶发生反应的底物。
11.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酶产物包含可以通过电化学方式还原或氧化的分子。
12.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述电信号包括差异反应，其中差异反应是产物反应与基础反应之间差异的衡量，其中在含有酶的位点上测得所述产物反应，在不含酶的位点上测得所述基础反应，其中产物反应和基础反应选自：电流、电压和电阻，其中差异反应是分析物与捕获复合物结合的衡量。
13.一种用酶检测电极微阵列上的结合事件的方法，所述方法包括：
(a)提供含有多个电极和连接于所述电极对应位点上的多种捕获复合物的微阵列，其中所述电极是可电学寻址的电极；
(b)将多种分析物施加到捕获复合物上，以形成结合复合物，其中捕获复合物与分析物具有亲和力；
(c)将酶连接于所述结合复合物，形成报道复合物；
(d)使底物溶液接触所述微阵列，所述底物溶液中含有能与酶反应的底物，其中固体酶产物沉积在含酶位点上；和
(e)用测定溶液和电信号测定该位点上是否存在固体酶产物，其中存在电信号是结合事件的衡量。
14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述捕获复合物由多种寡核苷酸探针组成，所述分析物由多种寡核苷酸靶标组成，所述核苷酸靶标与寡核苷酸探针杂交形成结合复合物，通过附连法使所述酶结合于寡核苷酸靶标，其中附连法包括通过选自下组的分子基团连接酶：(a)抗体、抗-抗体和抗-独特型抗体组合，(b)生物素和链霉亲和素或亲和素组合，和(c)寡核苷酸和互补寡核苷酸组合，和它们的组合。
15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，通过原位电化学合成方法合成所述寡核苷酸探针。
16.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述捕获复合物由杂交于含有抗体标签的寡核苷酸靶标的寡核苷酸探针组成，通过抗体标签捕获分析物，从而形成结合复合物，通过附连法使所述酶结合于分析物，其中所述附连法包括通过选自下组的分子基团连接酶：(a)抗体、抗-抗体和抗-独特型抗体组合，(b)生物素和链霉亲和素或亲和素组合，和(c)寡核苷酸和互补寡核苷酸组合，和它们的组合。
17.如权利要求16所述的方法，其特征在于，通过原位电化学合成方法合成所述寡核苷酸探针。
18.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述捕获复合物通过选自下组的方法制备：原位电化学合成、打点、喷墨打印、电场沉积和原位光刻合成。
19.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述捕获复合物由选自下组的分子组成：寡核苷酸、多肽、抗体、糖基化多肽、多糖和含有多个上述分子单体的混合分子。
20.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述分析物由选自下组的分子组成：抗原、半抗原、病毒、细菌、细胞、蛋白质、多糖、生物聚合物分子、脂质、糖蛋白(α-1-酸糖蛋白)、蓖麻毒蛋白、M13噬菌体、球形芽孢杆菌(Bacillus globigii)(BG)芽孢、荧光素、兔IgG、山羊IgG、DNA、RNA、单链DNA、核糖体RNA、线粒体DNA、细胞受体、糖基化的膜结合蛋白、非糖基化的膜结合蛋白、多肽、糖基化多肽、抗体、细胞抗原决定簇、有机分子、金属离子、盐阴离子和阳离子以及有机金属和它们的组合。
21.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述酶选自：辣根过氧化物酶，漆酶，β-半乳糖苷酶，葡萄糖氧化酶，碱性磷酸酶或葡萄糖脱氢酶，或其组合。
22.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述底物溶液由含有缓冲液、盐和酶底物溶液的水溶液组成，其中酶底物溶液含有能与该酶发生反应的底物。
23.如权利要求22所述的方法，其特征在于，所述酶是辣根过氧化物酶，所述底物是过氧化氢和和选自下组的化学物质：可氧化的芳香剂、二茂铁衍生物和可氧化的无机物，以及它们的组合。
24.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述固体酶产物是为非反应性产物，所述测定溶液是含有电子介质的水溶液。
25.如权利要求24所述的方法，其特征在于，所述电子介质为***亚铁和***铁的混合物，其混合比约为10:90-90:10，浓度为约0.1-1000毫摩尔。
26.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述固体酶产物是可还原或可氧化的，所述测定溶液是含有缓冲液和盐的水溶液。
27.如权利要求26所述的方法，其特征在于，所述缓冲液是磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液，所述盐是氯化钠。
28.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述固体酶产物是导电物质。
29.如权利要求28所述的方法，其特征在于，所述导电物质是聚吡咯。
30.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述电信号包括差异反应，其中差异反应是产物反应与基础反应之间差异的衡量，其中在含有酶的位点上测得所述产物反应，在不含酶的位点上测得所述基础反应，其中产物反应和基础反应选自：电流、电压、电导率或电阻，其中差异反应是分析物与捕获复合物结合的衡量。
31.一种用酶检测电极微阵列上的结合事件的方法，所述方法包括：
(a)提供含有多个电极的微阵列，其中所述电极是可电学寻址的电极；
(b)向所述电极施加恒定起始电压，同时保持该电极为开路；和
(c)在测定时间内使各电极在约为接地电压或显著不同于恒定初始电压的电压下依次切换，记录测定时间内各电极的电流，使各电极返回恒定初始电压，然后将下一个电极设定为接地电压或显著不同于恒定初始电压的电压，从而测定各电极的电反应。
32.如权利要求31所述的方法，其特征在于，所述恒定起始电压的绝对值为约0.1毫伏到5伏。
33.如权利要求31所述的方法，其特征在于，所述测定时间为约0.1毫秒到1秒。
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