CN112020645A - 基于多孔电极的生物传感器 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种基于多孔电极的生物传感器，其可以通过使用安培法与使用阻抗测量方法的现有的生物传感器相比更小型化，通过结合免疫测定方法，表现出约fg/ml的灵敏度，从而可以有效地检测血液中非常少量的目标蛋白。此外，通过在多个孔中包括不同的探针，可以通过单次过程同时检测各种目标蛋白。

Description

基于多孔电极的生物传感器
技术领域
本发明涉及基于多孔电极的生物传感器，其在检测非常少量的目标物质方面具有提高的灵敏度。
背景技术
近来，在使用显微样品开发新药的筛选过程和疾病诊断领域中，生物传感器引起了关注，并且研究和开发也在积极地进行。特别是，正在进行许多小型生物传感器的开发，以快速且准确地测量样品溶液(血液，尿液和唾液等)中存在的少量目标物质的存在或浓度，其示例包括生物特异性结合、免疫传感器或DNA传感器。
为了测量蛋白质，常规上主要使用ELISA(酶联免疫吸附测定)方法，该方法如下：通过将抗体固定在支持物上并使混合有抗原蛋白质的样品溶液在固定有上述抗体的表面上反应一定时间之后，在与上述抗原蛋白结合的表面上结合与抗原蛋白选择性结合的检测抗体，然后通过将酶与所述检测抗体结合以通过添加能够使酶显色或发荧光的反应物质来引起显色或发荧光反应来定量微量的抗原蛋白。尽管直到现在，ELISA方法仍被用作有效测量微量抗原蛋白的方法，但是存在如下缺点：抗原蛋白的分析范围小，一次只能分析一种蛋白，因此需要大量样品(200ul)，并且pg/ml水平的浓度下难以进行准确的测量。
因此，近来，已经开发了利用ELISA原理通过应用于生物传感器和生物芯片的过程来容易地测量抗原浓度的方法。例如，有一些用表面等离子体共振(SPR)、微晶尺和电化学传感器测量的研究结果。这种方法的优点在于能够容易地检测样品中存在的非常少量的目标物质，并且能够同时检测各种抗原。然而，上述方法表现出与ELISA方法相比灵敏度没有显着提高的结果，因此需要研究和开发具有提高的灵敏度的生物传感器以检测非常少量的目标物质。
另外，通常测量诸如TNF-α，TGF-β和IFN-γ等的细胞因子，以便测量由吸入有害物质引起的肺损伤和由此引起的心血管损伤，但是由于其以10至400pg/ml的极低浓度存在于血液中，因此存在难以感测的问题，因此需要研究和开发具有改善的灵敏度的生物传感器。
发明内容
技术问题
本发明的一个目的是提供一种多孔生物传感器。
本发明的另一个目的是提供一种使用生物传感器检测样品中的目标物质的方法。
本发明的又一个目的是提供一种制造根据本发明的生物传感器的方法。
然而，本发明要解决的技术问题不限于上述问题，并且本领域普通技术人员将从以下描述中清楚地理解未提及的其他问题。
技术方案
提供了一种电化学生物传感器，其特征在于，所述电化学生物传感器包括：形成有用于容纳样品的一个或多个孔的电极；在所述电极上的第一探针和与所述第一探针特异性结合的衔接蛋白；与目标物质特异性结合的第二探针，所述目标物质与所述第一探针结合；以及与第二探针特异性结合的信号中介分子。
此外，在本发明中，所述电化学生物传感器可以通过安培法测量样品内目标物质的浓度。
此外，在本发明中，与所述电极结合的衔接蛋白可以与电极结合以存在于所述孔中。
此外，在本发明中，所述第一探针可以与固定在暴露于孔底部的电极上的衔接蛋白特异性结合。
此外，在本发明中，所述电极可以用自组装单层对表面进行改性。
此外，在本发明中，所述第二探针可以与标记蛋白结合，并且所述信号中介分子可以与过氧化物酶结合。
此外，在本发明中，所述信号中介分子可以与第二探针的标记蛋白结合。
此外，在本发明中，所述标记蛋白可以是选自生物素、钙调蛋白、FLAG、His、Myc以及链霉亲和素结合蛋白中的至少一种。
此外，在本发明中，所述目标物质可以是蛋白质或肽。
本发明的另一实施例提供一种使用电化学生物传感器检测样品内目标物质的方法，
所述电化学生物传感器包括：形成有用于容纳样品的一个或多个纳米孔的电极；设置在所述孔的底部的第一探针；以及与所述第一探针特异性结合的衔接蛋白，
所述方法包括以下步骤：
a)将从个体分离的生物样品放入所述电化学生物传感器并进行反应；
b)通过在所述孔中提供靶向目标物质的第二探针来进行反应；
c)在所述纳米孔中使靶向标记第二探针的物质的信号中介分子反应；以及
d)在所述步骤c)中的第二探针与信号中介分子之间的反应测量在电解质存在的状态下由氧化还原反应产生的电流。
此外，在本发明中，在所述步骤d)中的电解质可以包含3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)、增强化学发光剂以及对苯二酚中的至少一种。
发明效果
与通过阻抗测量法的常规生物传感器相比，根据本发明的生物传感器可以通过使用安培法(amperometry)来小型化，并且，并且通过并入免疫分析法而可以表现出约fg/ml的灵敏度，并且可以非常有效地检测血液中非常少量的目标蛋白质。
另外，通过在多个孔中包括不同的探针，从而可以通过单次过程同时检测各种目标蛋白质。
此外，由于采用了氧化还原法通过施加特定电压来测量电流，因此分析时间在5秒钟之内非常短。
附图说明
图1是根据本发明实施例的生物传感器的具有纳米尺寸的孔的示意图。
图2是根据本发明实施例的生物传感器的示意图。
图3是根据本发明实施例的生物传感器的示意图。
图4是示出根据本发明实施例的制造和检测生物传感器的过程的图。
图5示出根据本发明实施例的使用生物传感器和ELISA的MCP-1蛋白的测量曲线图。
图6示出根据本发明的实施例的使用纳米孔生物传感器和平面电极测量TGF-β的量的曲线图。
图7示出根据本发明的实施例的使用纳米孔生物传感器(TGF-β)测量每1ng/ml的各种蛋白质产生的电流的图。
图8是示出根据本发明的实施例的使用纳米孔生物传感器(IL-6)测量每1ng/ml的各种蛋白质产生的电流的图。
图9是显示根据本发明的实施例的使用纳米孔生物传感器(MCP-1)测量每1ng/ml的各种蛋白质产生的电流的图。
图10示出通过使用总免疫球蛋白E(IgE)作为标志物在PBS缓冲液中按浓度进行计时电流法的图。
图11示出了通过根据总IgE浓度计算电流值而创建的、表示pg至ng范围内的指数曲线的校准曲线。
图12示出了使用本发明的生物传感器来对对照(未治疗组)小鼠随时间测量IgE水平的结果。
图13示出了在实验组中使用本发明的生物传感器以两天的间隔测量细胞因子IL-4变化的结果，在该实验组中，OVA(卵清蛋白)被致敏并吸入以诱发哮喘和气道炎症。
图14示出了在实验组中使用本发明的生物传感器以两天的间隔测量细胞因子IgE变化的结果，在该实验组中，OVA被致敏并吸入以诱发哮喘和气道炎症。
图15示出了具有纳米孔阵列电极的生物传感器的制造过程。
具体实施方式
在下文中，将参考附图描述本发明的优选实施例。然而，本发明的实施例可以以各种其他形式修改，并且本发明的范围不限于以下描述的实施例。另外，提供本发明的实施例以向本领域普通技术人员更完整地说明本发明。
本发明人试图开发出一种在常规的ELISA方法中检测样品中非常少量的目标物质时具有更高灵敏度的生物传感器，结果发现，当具有在形成有与微米或纳米尺寸的圆柱形对应的孔的电极的生物传感器包括结合有标记蛋白的第二探针和能够与第二探针特异性结合的信号中介分子时，可以显着提高样品内目标物质的测量灵敏度，由此完成了本发明。
在本发明中，作为一个实施例，生物传感器可以是具有通过图15的制造过程获得的纳米孔阵列电极的生物传感器。作为示例，纳米孔可以采用当前已知的各种形成纳米孔的方法，并且例如，可以应用基于硅晶片对纳米孔结构进行图案化的技术等。
本发明涉及一种电化学生物传感器，其特征在于，所述电化学生物传感器包括：形成有用于容纳样品的一个或多个孔的电极；在所述电极上提供的第一探针和与所述第一探针特异性结合的衔接蛋白；与目标物质特异性结合的第二探针，所述目标物质与所述第一探针结合；以及与第二探针特异性结合的信号中介分子。在下文中，将参照附图详细描述根据本发明的生物传感器的每种配置。
包括用于容纳样品的一个或多个孔的电极100：
作为电极布线，其对应于检测样品中产生的电子以检测目标物质的配置。
在本发明中，电极可以是Cu、Ni、Fe、Pt和Au中的一种或多种，优选为Au，但是不限于此。
如图2所示，在本发明中，电极的表面可以是改性的表面200，以促进第一探针和衔接蛋白的结合。具体地，可以利用自组装单层(Self-assembled monolayer；SAM)来进行表面的改性。当用自组装单层对电极的表面进行改性时，可以通过稳定地诱导第一探针400和衔接蛋白300之间的共价键来显着提高稳定性、可重复性和灵敏度。
另外，如图1所示，在本发明中，一个或多个孔可以是直径为微米或纳米的孔结构，并且可以是圆柱形孔。如上所述，在具有微米或纳米尺寸的直径的情况下，实现了过滤除了从目标个体分离的或通过其他方法获得的生物样品内包含的目标物质以外的大分子蛋白质(例如白蛋白)等的效果。此外，可以证明，在具有圆柱形孔的形状的情况下，与没有圆柱形孔的情况相比，根据下面的等式1，电子传递的扩散被最大化，从而可以有效地检测非常少量的样品。
[式1]
Figure BDA0002730850850000061
优选地，孔的尺寸可以是50至500nm的直径，200至500nm的直径，例如300至400nm的直径，但不限于此。当圆柱孔的直径小于50nm时，难以将抗体固定在孔中，而当直径小于200nm时，无法最大化用于内部测量的电子传递的扩散，并且当直径超过500nm时，可能无法充分滤除目标物质以外的不必要蛋白质。
第一探针和衔接蛋白：
衔接蛋白对应于促进电极与第一探针400之间结合的构成，该第一探针400最初捕获存在于目标样品中的目标物质500。
在本发明中，第一探针400可以包括能够与样品中存在的目标物质特异性结合的所有分子，具体地，可以是与目标物质特异性结合的抗体、蛋白质或其他生物分子等，但不限于此。
另外，在本发明中，可以包含衔接蛋白300，只要其能够固定诸如抗体或蛋白等的第一探针即可，具体地，衔接蛋白300可以是蛋白A、蛋白G或链霉亲和素，但不限于此。如上所述，当第一探针不直接结合至电极而是结合至衔接蛋白时，可以显着提高第一探针与电极之间的固定效率，并且可以减少非特异性反应。
然而，在本发明中，“目标物质500”可以是包含在从目标个体分离的生物样品中的用于测量的肽或蛋白质。
在本发明中，“肽”包括多肽，并且术语肽、多肽和蛋白质是指氨基酸残基的聚合物。当天然存在的氨基酸是人工合成的类似物时，除了天然存在的氨基酸(例如一个或多个氨基酸残基)之外，天然存在的氨基酸的聚合物也包括在本发明的范围内。
为了本发明的目的，目标物质可以是细胞因子蛋白，其是样品中非常少量包含的蛋白，并且优选地，细胞因子蛋白可以是白细胞介素、TGF-α、TGF-β、白介素-4、白介素-6、MCP-1、白介素-1-β、白介素-17和IFN-γ等。
如图3所示，本发明的一实施例涉及一种生物传感器，该生物传感器还包括与由第一探针捕获的目标物质特异性结合的第二探针和与第二探针特异性结合的信号中介分子。
第二探针：
对应于与由第一探针捕获的目标物质特异性结合的构成。
在本发明中，第二探针601可以包括能够与目标物质500特异性结合的所有分子，并且具体地可以是蛋白质、抗体等，但不限于此。另外，在本发明中，第二探针可以与标记蛋白602结合。
在本发明中，标记蛋白可以选自生物素、钙调蛋白、FLAG、His、Myc和链霉亲和素结合蛋白(SBP：streptavidin binding protein)中的一种或多种，优选为生物素，但不限于此。
信号中介分子：
与第二探针特异性结合，通过引起氧化还原反应而产生电流，从而确认是否存在目标物质。
在本发明中，信号中介分子700可以将结合有能够通过氧化还原反应产生电流的物质的所有物质702包括在蛋白质701中，该蛋白质701直接与第二探针结合或者与第二探针的标记蛋白特异性结合。优选地，当标记蛋白是生物素时，其可以是将辣根过氧化物酶结合到能够将一个分子与一个分子的生物素结合的链霉亲和素的物质。以这种方式，在包含可以与生物素1：1结合的链霉亲和素以及过氧化物酶结合的信号中介分子的情况下，可以通过与结合到目标物质的第二探针特异性结合来显着提高在目标物质的定量测量中的灵敏度和准确性。
在本发明的另一实施例中，
提供一种使用电化学生物传感器检测样品内目标物质的方法，所述电化学生物传感器包括：在基板上形成有用于容纳样品的一个或多个纳米孔的电极；设置在所述纳米孔的底部的第一探针；以及与所述第一探针特异性结合的衔接蛋白，所述方法包括以下步骤：
a)将从个体分离的生物样品放入所述电化学生物传感器并进行反应；b)通过在所述纳米孔中提供靶向目标物质的第二探针来进行反应；c)在所述纳米孔中使靶向与第二探针结合的标记物质的信号中介分子反应；以及d)在所述步骤c)中的第二探针与信号中介分子之间的反应测量在电解质存在的状态下由氧化还原反应产生的电流。
在本发明中，“目标物质”可以是从目标个体分离的生物样品中包含的用于测量的蛋白质或肽。为了本发明的目的，目标物质可以是细胞因子蛋白，其是样品中非常少量包含的蛋白，并且优选地，细胞因子蛋白可以是白细胞介素、TGF-α、TGF-β、白介素-4、白介素-6、MCP-1、白介素-1-β、白介素-17和IFN-γ等。
本发明的“目标个体”是指用于测量样品内目标物质的存在或定量值的个体。另外，从本发明的个体获得的“生物样品”是指存在与本发明的目标物质相对应的基因、蛋白质和/或微小RNA等的组织、组织裂解物(lysate)、支气管肺泡洗液、细胞、血液、血清、血浆、唾液、痰、脑脊液、粪便或尿液样品等样品，但包括任何含有待测目标物质的样品。
在本发明的一个实施例中，在步骤c)中，第二探针与信号中介分子之间的反应可以测量在电解质存在的情况下由氧化还原反应产生的电流。优选地，电解质可包含3,3',5,5'-四甲基联苯胺，增强化学发光剂(ECL)和氢醌中的一种或多种，更优选地可以是TMB，但不限于此。以这种方式，当第二探针与信号中介分子之间的反应测量在电解质存在的情况下通过氧化还原反应产生的电子所产生的电流时，与常规使用的阻抗测量方法相比，不需要额外的交流静压装置，因此可以简化传感器，并且由于显着提高了测量极限和灵敏度，因此可以检测与fg/ml相对应的目标物质。
另外，在本发明中，孔中包括的第一探针可以针对每个孔包括不同的探针，并且同时，可以通过单次过程检测各种目标物质。
在另一方面，在本发明的另一实施例提供了一种制造生物传感器的方法，所述方法包括以下步骤：对电极的表面进行改性；在所述电极上形成一个或多个孔；以及将衔接蛋白和第一探针结合到改性的电极。
在本发明的生物传感器的制造方法中，关于电极、第一探针、衔接蛋白和第二探针的内容如以上在生物传感器中所述，因此以下省略其详细说明。
实施例
在下文中，将通过具体实施例更详细地描述本发明。以下实施例仅是帮助理解本发明的实施例，本发明的范围不限于此。
[制造例]生物传感器的制造
参照生物技术杂志(Journal of Biotechnology)168，584-588，2013中描述的纳米孔形成方法，使用激光在金电极表面上以阵列形式形成直径为300至400nm的多个纳米孔(图1)。。
具体而言，该电极通过等离子化学气相沉积法在2×4mm硅晶片上形成氧化硅膜(10nm)，是导电性良好的物质，并且通过电子束气相沉积将Au层(生物友好金属)形成为50nm的厚度。为了在由此产生的金层上形成微纳米孔，应用了作为半导体工艺的光刻方法。为此，首先以1μm涂敷第一光致抗蚀剂层(PR，光致抗蚀剂)来形成。如果涂层的厚度太薄，则难以形成精细的图案，如果涂层的厚度太厚，则该过程结束后无法被完全去除，因此，考虑到蚀刻选择性，形成为100nm的厚度。在以这种方式形成PR层之后，使用电子束光刻工艺形成直径为200nm的圆形结构的精细图案。此时，可以根据电子束功率的大小将圆形结构的直径从纳米调整为微米。将为了去除在完成光刻工艺之后剩余的PR(日本至强公司(JapanXeon Corporation))和绝缘层而形成的电极浸入丙酮中，然后使用超声波来去除。将由此制得的电极分别真空包装以防止氧化，将其存储在恒温恒湿器中，并在使用前立即用去离子水洗涤。
此后，如图4所示，为了使在金电极上形成的孔的内部表面亲水化并诱导与蛋白质的共价键，自组装单层；为了增加安全性、可重复性和灵敏度，使用11-巯基烷酸)反应1小时以对SAM进行改性。然后，通过与1M乙醇胺反应10分钟，除去没有发生反应的自组装单层物质。将对应于衔接蛋白的蛋白A结合至具有由此获得的多个改性的孔的金电极以固定抗体。此后，使作为特异性结合至待测目标物质的抗体的第一探针与蛋白质A反应1小时以诱导结合从而形成电极。
另外，通过生物素化并制备与目标物质直接结合的第二探针，并且与结合到第二探针的生物素结合的信号中介分子在制备了将马匹过氧化物酶(HRP：Horse peroxidase)结合到链霉亲和素的物质之后，用于使用生物传感器进行的测量。
[实验例1和比较例1]使用生物传感器的目标物质的测定以及与ELISA方法的比较
将使用对MCP-1具有特异性的抗体制造的生物传感器(由R&D Systems公司购买)用作第一探针和第二探针。
每个第一探针分别与每个纳米孔结合，然后以1mg/ml的BSA反应30分钟，以防止非特异性结合。此后，将作为对应于每个第一探针的抗体的抗原的每种MCP-1蛋白放入孔中，并使其反应30分钟。此后，与生物素化的第二探针反应45分钟，并与HRP结合于链霉亲和素的信号中介分子反应15分钟。之后，加入对应于电解质的TMB溶液并测量随时间变化的电流，其值如图5所示。但是，ELISA方法是使用MCP-1抗原及其特异性抗体通过公知的常规方法测定的。
如图5所示，当用根据本发明的生物传感器测量时，测量极限值对应于10-17g/ml，并且可以测量在10-17至10-11的宽范围内的浓度，而在ELISA方法的情况下，测量极限值对应于10-12g/ml，并且在10-9g/ml的相对短的范围内测量。
从以上结果可以看出，根据本发明的生物传感器不仅具有能够检测非常少量的蛋白质(样品消耗量小于5ul)的效果，而且还具有能够测量对应于宽范围的浓度的效果。
[比较例2]纳米孔电极与普通电极生物传感器的灵敏度比较
在根据本发明的孔中，特别是具有纳米直径的孔的电极和没有这种孔的电极中，比较灵敏度。
使用根据本发明的具有纳米尺寸的直径的制备例1的生物传感器和用于通过将探针固定到不包含通常可以使用的孔的平面电极上进行测量的传感器，如实施例1和比较例1中那样对TGF-β进行测量，其结果示于图6中。
如图6所示，在具有纳米尺寸的直径的制备例1的生物传感器的情况下，电流的差随着TGF-β的蛋白质量的增加而成比例地增加，而在平面电极的情况下，电流差在10-15和10-13g/ml之间没有变化。
从以上结果可以看出，与具有平坦电极时相比，根据本发明的生物传感器具有显着更高的灵敏度以辨别较低的浓度。
[比较例3]目标物质之间的灵敏度(特异性)测定比较
使用根据本发明的生物传感器，确认了仅特异性探测选择性抗原的信号。
在制备实施例1的生物传感器中，将对TGF-β具有特异性的抗体(由R&D Systems公司购买)用作第一探针，并将MCP-1、IL-4、IL-1β、IL-6、IL-17、INF-γ、瘦蛋白(Leptin)、BSA和缓冲液作为对照而处理每种1ng/ml浓度后，测量产生的电流，如图7所示。
如图7所示，当其他抗原表现出约10uA的电流强度时，TGF-β在1ng/ml的情况下表现出65uA的电流强度。
另外，可以确认即使在电极上被其他特异性抗体包被的情况下，也只有与该抗体特异性结合的蛋白质表现出大的电流强度变化。如图8所示，通过使用对IL-6具有特异性的抗体(由R&D Systems公司购买)，使用MCP-1、TGF-β和缓冲液以1ng/ml处理相应蛋白质的结果，可以确认只有相应的蛋白质(即，IL-6)表现出特定的大电流强度变化。
如图9所示，使用对MCP-1特异的抗体(由R&D Systems公司购买)，使用IL-6、TGF-β和缓冲液以1ng/ml处理的结果，可以确认只有相应的蛋白质(即，MCP-1)表现出特定的大电流强度变化。
[实验例2]校正曲线的创建
用于创建校准曲线的标记是总免疫球蛋白E(IgE)，而IgE是一种其水平在炎性损伤模型中会迅速增加的蛋白质。首先，为了定量IgE，对PBS缓冲液中的每种浓度进行计时电流法(图10)，并且相应地，根据每种浓度计算电流值以完成校准曲线。结果，确认可以用pg至ng范围内的指数曲线进行拟合(图11)。
[比较例4]对照组(未治疗组)和OVA(卵清蛋白)给药组的IgE或IL-4的测定比较
基于实验例2中完成的校准曲线的定量，在实际的小鼠模型中测量了总IgE水平。在现有的ELISA方法的情况下，需要大约100至200μl的大量样品(例如，血液)，因此不可避免地牺牲动物(小鼠)并且不可能连续监测，而本发明的生物传感器中，通过实现约fg/ml的灵敏度，可以在不牺牲动物的情况下有效地从非常少量的样品中检测出目标蛋白质，因此也可以进行连续监测。
首先，作为使用本发明的生物传感器和检测方法对未进行任何处理的对照小鼠进行IgE水平的测定的结果，通过连续监测确认了随时间的IgE浓度没有差异(图12)。同时，在实验组的情况下，用滴管使OVA(卵清蛋白)致敏并吸入以诱发哮喘和气道炎症，并且每两天确认作为相应增加的代表细胞因子的IL-4和IgE的变化。结果，本发明的生物传感器可以准确地确定IL-4和IgE的浓度随时间变化的水平和过程(图13和14)，结果表明，这与现有的ELISA方法不同，可以进行根据增加的灵敏度的连续监测。
尽管上面已经详细描述了本发明的实施例，但是本发明的范围不限于此，并且在不脱离权利要求中描述的本发明的技术精神的情况下，对于本领域普通技术人员而言，可以进行各种修改和变型将是显而易见的。
[附图标记说明]
100：电极
200：改性层
300：衔接蛋白
400：第一探针
500：目标蛋白
600：与标记蛋白结合的第二探针
601：第二探针
602：标记蛋白
700：结合有过氧化物酶的信号中介分子
701：与标记蛋白特异性结合的蛋白
702：能够通过氧化还原反应产生电流的物质(例如，过氧化物酶)。

Claims (9)

1.一种电化学生物传感器，其特征在于，所述电化学生物传感器包括：
形成有用于容纳样品的一个或多个孔的电极；
在所述电极上提供的第一探针和与所述第一探针特异性结合的衔接蛋白；
与目标物质特异性结合的第二探针，所述目标物质与所述第一探针结合；以及
与第二探针特异性结合的信号中介分子。
2.根据权利要求1所述的电化学生物传感器，其特征在于，所述电化学生物传感器通过安培法测量样品内目标物质的浓度。
3.根据权利要求1所述的电化学生物传感器，其特征在于，所述第一探针与固定在暴露于孔底部的电极上的衔接蛋白特异性结合。
4.根据权利要求3所述的电化学生物传感器，其特征在于，所述电极用自组装单层对表面进行改性。
5.根据权利要求1所述的化学生物传感器，其特征在于，所述第二探针与标记蛋白结合，并且所述信号中介分子与特异性结合于所述标记蛋白的蛋白质和过氧化物酶结合。
6.根据权利要求5所述的化学生物传感器，其特征在于，所述标记蛋白是选自生物素、钙调蛋白、FLAG、His、Myc以及链霉亲和素结合蛋白中的至少一种。
7.根据权利要求1所述的化学生物传感器，其特征在于，所述目标物质是蛋白质或肽。
8.一种使用电化学生物传感器检测样品内目标物质的方法，所述电化学生物传感器包括：形成有用于容纳样品的一个或多个纳米孔的电极；设置在所述纳米孔的底部的第一探针；以及与所述第一探针特异性结合的衔接蛋白，所述方法包括以下步骤：
a)将生物样品放入所述电化学生物传感器并进行反应；
b)通过在所述纳米孔中提供靶向目标物质的第二探针来进行反应；
c)在所述纳米孔中使靶向与第二探针结合的标记物质的信号中介分子反应；以及
d)在所述步骤c)中的第二探针与信号中介分子之间的反应测量在电解质存在的状态下由氧化还原反应产生的电流。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述电解质包含3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)、增强化学发光剂以及对苯二酚中的至少一种。
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