CN104614417A - 一种用于糖蛋白检测的电化学方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公布了一种用于糖蛋白检测的电化学方法,属于化学领域。该方法包括制备苯硼酸-生物素-纳米金复合物、含待测物工作电极的制备,电化学测试。采用本发明所提供的方法检测糖蛋白灵敏性高,较传统的方法不需要采用价格昂贵、易变性的抗体,本发明的方法成本较低,稳定性好。
Description
技术领域
本发明涉及一种糖蛋白的检测方法,特别涉及一种用于糖蛋白检测的电化学方法,属于化学领域。
背景技术
糖蛋白是一类重要生理活性物质,参与很多生命活动过程及代谢调节,起着多种重要的作用。 一些蛋白表面糖基化的变化通常关联和预示着一些疾病的发生,例如一些与癌症有关的糖蛋白近年来就发现可能具有一定的关联性,通过分析和检测糖蛋白有助于生命科学的研究和发展。为此在业界也在积极寻找和开拓高效、低成本糖蛋白检测方法,近年来电化学传感器检测方法发展迅速,在糖蛋白检测方面“夹心式”传感器(如酶联免疫吸附法)是检测蛋白质的一种有效方法。在这种检测体系中,目标蛋白质可以被电极表面的抗体(一抗)捕获,然后再通过酶标记的抗体(二抗)对被捕获的蛋白质进行识别和信号输出。然而,抗体和酶标记抗体往往价格较高、制备较困难,且容易变性。电化学传感器具有使用方便、测量精度高、维护简单和成本低等优点,在生物分析中具有广大的应用前景。因此,开发研制一种用于糖蛋白的高灵敏和选择性检测的电化学传感器是十分必要的。
发明内容
本发明为提供一种用于糖蛋白检测的电化学方法。
一种用于糖蛋白检测的电化学方法,包括以下步骤:
(A)制备苯硼酸-生物素-纳米金复合物,包括以下子步骤:
A1: 纳米金粒子的合成,采用前驱体为HAuCl4,还原剂为柠檬酸钠,将HAuCl4溶液加热至沸腾,然后快速加入柠檬酸钠溶液,继续加热沸腾10-50分钟,然后将溶液冷却到室温,即得到柠檬酸稳定的纳米金粒子溶液;
A2:苯硼酸-生物素-纳米金复合物的合成:用移液枪取出上述纳米金粒子溶液,然后加入包含三(2-羧乙基)膦和多肽的PBS溶液,PBS溶液的pH 为7-8,室温搅拌1小时以上得到生物素修饰的纳米金,再向反应溶液中加入4-巯基苯硼酸溶液,继续搅拌0.5小时以上得到苯硼酸-生物素-纳米金复合物;
A3:苯硼酸-生物素-纳米金复合物的纯化:将A2得到的反应产物离心分离,弃除上层未反应的多肽和三(2-羧乙基)膦,将所得沉淀物用pH =7-8的PBS溶液洗涤,将得到的纯化后的苯硼酸-生物素-纳米金复合物用PBS溶液分散,低温保存备用;
(B)工作电极的制备,包括以下子步骤:
B1:在金电极表面组装巯基化的核酸适配体;
B2:采用6-巯基己醇和牛血清蛋白封闭未反应的金电极表面;
B3: 将含糖蛋白的待测物修饰到B2得到的电极表面;
B4:将步骤A制备得到的的苯硼酸-生物素-纳米金复合物修饰到B3得到的电极表面;
B5:将链霉亲和素-碱性磷酸酶复合物修饰到B4得到的电极表面;
B6:将B5得到的电极浸泡于p-APP溶液中,催化产生电活性物质对氨基酚;
(C)电化学测试:将步骤(B)制备得到的电极作为工作电极进行电性能测试。
进一步的,步骤A2和A3中所述的PBS溶液的pH值为7.4,进一步的,步骤B1中所述的核酸适配体为:5'-SH-(CH2)6-GATTGAAAGGTCTGTTTTTGGGGTTGGTTTGGGTCAATA,进一步的,步骤(C)中电化学测试采用三电极体系,制备的金电极作为工作电极,饱和的Ag/AgCl电极为参比电极,Pt电极为辅助电极,进一步的,步骤A3得到的苯硼酸-生物素-纳米金复合物低温保存备用,所述的保存温度为0℃-8 ℃,进一步的,步骤A3得到的苯硼酸-生物素-纳米金复合物低温保存备用,所述的保存温度为4 ℃。
本发明所提供的一种用于糖蛋白检测的电化学方法的有益技术效果为:糖蛋白富含糖基,而糖基可以和苯硼酸相互作用形成硼酸酯键,采用苯硼酸代替二抗来特异性地识别糖蛋白成本低、选择性高,且本发明对糖蛋白的识别准确性极高,本发明采用核酸适配体捕获糖蛋白,通过硼酸酯键作用,采用苯硼酸-生物素-纳米金复合物对糖蛋白进行衍生从而有利于通过生物素-亲和素之间的作用将多个链霉亲和素-碱性磷酸酶复合物分子固定于电极表面,本发明的方法灵敏性高,检测限低,选择性好,本发明无需采用价格昂贵、易变性的抗体,成本较低,稳定性好。
附图说明
图1是本发明糖蛋白重组人红细胞生成素为例的测试原理图。
图2是柠檬酸稳定的纳米金和苯硼酸-生物素-纳米金复合物的紫外-可见吸收光谱图。
图3为苯硼酸-生物素-纳米金复合物的透射电镜表征图。
图4是工作电极在经过和不经过rHuEPO修饰步骤的测试结果图。
图5是修饰不同浓度的rHuEPO时的测试结果图。
图6是峰电流与rHuEPO浓度的线性关系图。
图7是本发明的传感器的选择性测试图。
具体实施方式
为了更充分的解释本发明的实施,提供本发明的实施实例。这些实施仅仅是对该工艺的阐述,不限制本发明的范围,本发明中用以下实施例说明,但不限于下述实施例,任何变化实施都包含在本发明的技术范围内。本发明中各种缩写所代表的物质分别为:TCEP:三(2-羧乙基)膦 ,CALNNGK(biotin)G:多肽, PBS:磷酸盐缓冲液,MBA:4-巯基苯硼酸,rHuEPO:糖蛋白重组人红细胞生成素, BSA:牛血清蛋白,MCH:6-巯基己醇,p-APP:4-氨基苯磷酸盐,SA-ALP:链霉亲和素-碱性磷酸酶复合物;mM、μM、pM、为浓度单位,分别代表10-3mol/L、10-6mol/L、10-12mol/L,μL:微升,Tris:英文名称: Tris(hydroxymethyl)aminomethane,中文别名:三(羟甲基)氨基甲烷;氨丁三醇;缓血酸铵;三羟甲基氨基甲烷。以下实施例以糖蛋白重组人红细胞生成素作为待测糖蛋白进行具体阐述。图2中曲线a为柠檬酸稳定的纳米金的紫外-可见吸收曲线,曲线b为苯硼酸-生物素-纳米金复合物的紫外-可见吸收曲线。图3为苯硼酸-生物素-纳米金复合物的透射电镜表征图。图4中rHuEPO的浓度为10 pM,扫速为0.1 V/s,支持电解质为 50 mM Na2SO4,箭头所示为扫描方向。图5中脉冲高度为50 mV,脉冲宽度为50 ms,图6中rHuEPO的浓度依次为0.02, 0.2, 0.5, 1和2 pM。图7中是电极对辣根过氧化氢酶(1), ***特异抗原(2), 金属硫蛋白(3), 链霉亲和素(4),凝血酶(5),rHuEPO(6)及1~6混合物(7)的响应情况。rHuEPO的浓度为1 pM,1~5的浓度均为10 pM,本发明中的核酸适配体5'-SH-(CH2)6-GATTGAAAGGTCTGTTTTTGGGGTTGGTTTGGGTCAATA为已知物,具体的可见参考文献“Analyst,2010,135, 2924-2929”。
实施例1 :
(A):苯硼酸-生物素-纳米金复合物的合成:
A1:采用体积比为1:3的HNO3/HCl混合液将三颈烧瓶、球形冷凝管、量筒清洗干净,晾干。往三颈烧瓶中加入50 mL 1 mM的HAuCl4,加热至沸腾,然后快速加入5 mL 38.8 mM的柠檬酸钠溶液,继续加热沸腾30分钟,然后将该红色溶液冷却到室温;
A2:用移液枪取出上述纳米金溶液5 mL,然后加入5 mL 1 mM的包含50 μM TCEP 和 2 μM CALNNGK(biotin)G的PBS溶液(pH 7.4),室温搅拌2小时,再加入0.1 mL 50 μM的4-巯基苯硼酸溶液(MBA),继续搅拌2小时;
A3:将反应物于13000 rpm/min的转速下离心,弃除上层未反应的CALNNGK(biotin)G和MBA。将所得的苯硼酸-生物素-纳米金复合物用5 mL 1 mM的PBS溶液(pH 7.4)洗涤两次,最后将该复合物用5 mL PBS溶液分散,4 ℃保存于冰箱中备用。所合成的苯硼酸-生物素-纳米金复合物采用紫外-可见分光光度计和透射电镜表征,结果见图2、图3;
(B): 工作电极的制备;
B1:在金电极表面组装巯基化的核酸适配体5'-SH-(CH2)6-GATTGAAAGGTCTGTTTTTGGGGTTGGTTTGGGTCAATA,用于捕获rHuEPO,具体为将直径为2 mm的金电极在1 μM核酸适配体溶液中浸泡12小时,再用蒸馏水冲洗电极表面;
B2:采用6-巯基己醇(MCH)和牛血清蛋白(BSA)封闭B1得到的金电极未反应的表面,即将B1得到的电极在0.1 mM的MCH溶液中浸泡5 分钟,然后再于1 % 的BSA溶液中浸泡30分钟,最后用蒸馏水冲洗电极表面;
B3:将20 μL 100 pM 的rHuEPO溶液滴加到B2得到的电极表面,反应30分钟,然后用蒸馏水冲洗电极表面,除去未反应的rHuEPO;
B4:将20 μL步骤A制备的苯硼酸-生物素-纳米金复合物滴加到B3得到的电极表面,反应10分钟后用蒸馏水冲洗电极,除去未反应的复合物;
B5:将10 μL 1μM SA-ALP溶液滴加到B4得到的电极表面,反应10分钟后用蒸馏水冲洗电极,除去未反应的SA-ALP;
B6:将B5得到的电极表面浸泡于30 μL 0.5 mM的p-APP溶液中,反应20分钟后进行循环伏安测试。p-APP溶液包含0.5 mM的4-氨基苯磷酸盐、50 mM 的Na2SO4、10 mM的三羟甲基氨基甲烷(Tris),pH为7.4,使用前用氮气饱和,除去溶液中的氧气;
C:电化学测试:
电化学检测采用三电极体系,修饰的金电极作为工作电极,饱和的Ag/AgCl电极为参比电极,Pt电极为辅助电极进行电化学测试。
工作电极经过rHuEPO和不经过rHuEPO修饰的实施例及测试结果:
采用实施例1的全部步骤制备经过rHuEPO修饰的工作电极,采用实施例1中除步骤B3之外的其它步骤制备不经过rHuEPO修饰的工作电极,测试结果如图4所示,图4中曲线a1、a2组是工作电极经过rHuEPO修饰的的循环伏安测试结果,图4中曲线a1、a2上的一对氧化还原峰来源于对氨基酚的氧化还原,曲线b1、b2是工作电极未经过B3步骤的循环伏安测试的结果,比较曲线两组可得知:该方法可以用于糖蛋白的检测。
采用不同rHuEPO浓度的实施例:
采用其它步骤相同,将步骤B3中rHuEPO的浓度改变,步骤B6中的测试方法为示差脉冲伏安法,其它的步骤条件不改变,测试结果如图5、图6所示,图5中各曲线自上而下采用的rHuEPO浓度(pM)分别为0.02、0.2、0.5、1、2、3、10,从图5中可以看出,氧化电流随着rHuEPO浓度的增加而增加,说明对氨基酚的产生数量取决于糖蛋白的浓度,图6中各点采用的rHuEPO浓度(pM)分别为0.02、0.2、0.5、1、2,从图6中可以看出,电流强度随rHuEPO浓度(0.02~2 pM)的增加而呈线性增加,表明该方法可以用于糖蛋白的定量检测。
对其它蛋白质的响应对比实施例:
将步骤B3中rHuEPO换成以下1、2、3、4、5所述的蛋白质,6仍然采用rHuEPO,7采用的为1~6的混合物,其它步骤相同,制备得到各工作电极进行测试,步骤B6中的测试方法为示差脉冲伏安法,采用rHuEPO的浓度为1 pM,其它蛋白质的浓度均为10 pM,其它的步骤条件不改变,各试样对应的测试结果如图7所示。图中1、2、3、4、5采用的蛋白质为:1:辣根过氧化氢酶,2:***特异抗原,3:金属硫蛋白,4:链霉亲和素,5:凝血酶,6为rHuEPO, 7:1~6的混合物,rHuEPO的浓度为1 pM,1~5的浓度均为10 pM。从图7中可以看出,采用1~5蛋白质产生的电化学信号可以忽略不计,另外,比较图7中的6和7可得知,蛋白质1~5对糖蛋白的测定没有干扰,说明本发明的方法可以选择性检测糖蛋白。
在详细说明本发明的实施方式之后,熟悉该项技术的人士可清楚地了解,在不脱离上述申请专利范围与精神下可进行各种变化与修改,凡依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰,均属于本发明技术方案的范围,且本发明亦不受限于说明书中所举实例的实施方式。
Claims (6)
1.一种用于糖蛋白检测的电化学方法,其特征在于:包括以下步骤:
(A)制备苯硼酸-生物素-纳米金复合物,包括以下子步骤:
A1:纳米金粒子的合成,采用前驱体为HAuCl4,还原剂为柠檬酸钠,将HAuCl4溶液加热至沸腾,然后快速加入柠檬酸钠溶液,继续加热沸腾10-50分钟,然后将溶液冷却到室温,即得到柠檬酸稳定的纳米金粒子溶液;
A2:苯硼酸-生物素-纳米金复合物的合成:用移液枪取出上述纳米金粒子溶液,然后加入包含三(2-羧乙基)膦和多肽的PBS溶液,PBS溶液的pH 为7-8,室温搅拌1小时以上得到生物素修饰的纳米金,再向反应溶液中加入4-巯基苯硼酸溶液,继续搅拌0.5小时以上得到苯硼酸-生物素-纳米金复合物;
A3:苯硼酸-生物素-纳米金复合物的纯化:将A2得到的反应产物离心分离,弃除上层未反应的多肽和三(2-羧乙基)膦,将所得沉淀物用pH =7-8的PBS溶液洗涤,将得到的纯化后的硼酸-生物素-纳米金复合物用PBS溶液分散,低温保存备用;
(B)工作电极的制备,包括以下子步骤:
B1:在金电极表面组装巯基化的核酸适配体;
B2:采用6-巯基己醇和牛血清蛋白封闭未反应的金电极表面;
B3:将含糖蛋白的待测物修饰到B2得到的电极表面;
B4:将步骤A制备得到的苯硼酸-生物素-纳米金复合物修饰到B3得到的电极表面;
B5:将链霉亲和素-碱性磷酸酶复合物修饰到B4得到的电极表面;
B6:将B5得到的电极浸泡于p-APP溶液中,催化产生电活性物质对氨基酚;
(C)电化学测试:将步骤(B)制备得到的电极作为工作电极进行电性能测试。
2.根据权利要求1所述的一种用于糖蛋白检测的电化学方法,其特征在于:步骤A2和A3中所述的PBS溶液的PH值为7.4。
3.根据权利要求1所述的一种用于糖蛋白检测的电化学方法,其特征在于:步骤B1中所述的核酸适配体为:5'-SH-(CH2)6-GATTGAAAGGTCTGTTTTTGGGGTTGGTTTGGGTCAATA。
4.根据权利要求1所述的一种用于糖蛋白检测的电化学方法,其特征在于:步骤(C)中电化学测试采用三电极体系,制备的金电极作为工作电极,饱和的Ag/AgCl电极为参比电极,Pt电极为辅助电极。
5.根据权利要求1所述的一种用于糖蛋白检测的电化学方法,其特征在于:步骤A3得到的苯硼酸-生物素-纳米金复合物低温保存备用,所述的保存温度为0℃-8 ℃。
6. 根据权利要求1所述的一种用于糖蛋白检测的电化学方法,其特征在于:步骤A3得到的苯硼酸-生物素-纳米金复合物低温保存备用,所述的保存温度为4 ℃。
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