ES2334745B1 - Dispositivo de lectura de microarrays de tipo electrico y reutilizable. - Google Patents
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Abstract
Dispositivo de lectura de microarrays de tipo
eléctrico y reutilizable.
El objeto principal de la presente invención es
un dispositivo de lectura eléctrica de microarrays que se puede
limpiar y volver a utilizar más de una vez. El dispositivo (1, 1',
1'') de lectura de microarrays (6) tiene las siguientes partes: una
base (2, 2', 2''), que tiene unos medios de apoyo (3, 3', 3'') para
situar la superficie de test (7) del microarray (6) en paralelo a
una superficie de lectura (4) de la base (2, 2', 2''); una matriz de
transductores (5, 5', 5''), dispuestos sobre la superficie de
lectura (4) de la base (2, 2', 2''), que traducen una variación de
una magnitud eléctrica o química en una variación de una magnitud
eléctrica; y unos medios de lectura (10), conectados a los
transductores (5, 5', 5''), que interpretan las señales eléctricas
de los transductores (5, 5', 5'').
Description
Dispositivo de lectura de microarrays de tipo
eléctrico y reutilizable.
El objeto principal de la presente invención es
un dispositivo de lectura eléctrica de microarrays que se puede
limpiar y volver a utilizar más de una vez.
Desde su aparición a finales de la década de
1980, los biochips o microarrays han permitido llevar a cabo
interpretaciones cuantitativas de muchos e importantes fenómenos
biológicos. Un microarray es un conjunto de spots o puntos de
ensayo de pequeñas dimensiones (desde pocos nm a pocos mm) sobre un
soporte plano que permite realizar muchos ensayos en paralelo,
aumentando enormemente la velocidad y la capacidad de análisis
respecto a sistemas de análisis en serie.
Estos elementos están diseñados para analizar el
contenido proteico, las interacciones
proteína-proteína, proteína-ADN,
proteína-ligando, la presencia de mutaciones del
ADN, patrones de expresión de genes, etc., de muestras biológicas
complejas. Los microarrays que utilizan anticuerpos como elemento
de reconocimiento se basan en diferentes tipos de ensayo:
- -
- Tipo sándwich, cuando el analito es capturado por un anticuerpo inmovilizado en el soporte y cuantificado mediante un segundo anticuerpo marcado.
- -
- Tipo competitivo cuando copias del analito se inmovilizan en los spots de la superficie del soporte y la cuantificación de dicho analito se realiza indirectamente a partir de los anticuerpos marcados que se unen a dichos spots en presencia de la muestra que se desea analizar.
- -
- Tipo fase inversa cuando la muestra se adsorbe directamente en la superficie del soporte y el analito es reconocido por anticuerpos marcados.
\vskip1.000000\baselineskip
En todos ellos la cuantificación se realiza por
medio de la detección de una marca, que está unida a un anticuerpo.
En el caso de chips de ADN la marca se une a los fragmentos de ADN
o ARN a analizar. Las marcas pueden ser de tipo óptico (molécula
fluorescente, punto quántico, enzima cuyo producto precipita),
radioactivo (radioisótopos), o electroquímico (enzima cuyo producto
es electroactivo o nanopartículas electroactivas). Este último tipo
de marcas tienen la ventaja de que permiten una instrumentación de
lectura puramente eléctrica, y por lo tanto más compacta, robusta y
barata que la de las más ampliamente utilizadas marcas
fluorescentes. Existen productos en el mercado que utilizan este
tipo de lectura, como por ejemplo el lector Electrasense de
COMBIMATRIX (WO2008051196). La empresa Nanoident Technologies,
anuncia también sistemas compactos con lectura eléctrica de
microarrays basados en una matriz de fotodiodos orgánicos impresos
en el mismo soporte donde se realiza el ensayo (WO2006026796).
Sin embargo, para que el uso de microarrays se
extienda de forma más amplia y se pueda utilizar en los lugares en
que se necesita (junto a la cama del paciente en un hospital o en
los centro de atención primaria), los equipos deben mejorar en
términos de coste, robustez, sencillez y tamaño. Estos equipos
analíticos constan básicamente de dos partes diferenciadas: los
microarrays sobre los que se realiza el ensayo y el dispositivo con
que se realiza la lectura del resultado de dicho ensayo. En algunos
casos también se incluyen otros complementos en el sistema, como un
brazo robótico para la deposición de componentes de reconocimiento
o muestras sobre los spots o puntos de medida del microarray
(spoter), o un equipo con componentes fluídicos y reactivos para
realizar el ensayo automáticamente.
Los dispositivos de lectura de tipo eléctrico
son los más robustos, sencillos y de menor tamaño. Sin embargo,
presentan el inconveniente de requerir una matriz de dispositivos
(electrodos o fotodiodos) formados sobre el propio soporte, lo cual
obliga a utilizar un soporte nuevo y desechar el usado cada vez que
se realiza el ensayo. El soporte, además, es un elemento complejo y
costoso, ya que debe incluir transductores eléctricos, etc., en
lugar de los soportes habitualmente utilizados en los sistemas
ópticos, que consisten simplemente en un trozo de vidrio o plástico
funcionalizado.
La presente invención describe un dispositivo de
lectura de microarrays de tipo eléctrico y reutilizable que está
basado en la medida electroquímica (amperométrica, potenciométrica
o impedimétrica) de la acumulación de productos de una reacción
enzimática al entrar en contacto una superficie marcada por marcas
enzimáticas y un sustrato químico. La novedad de este dispositivo
reside en que los transductores encargados de realizar la medida se
encuentran en una base diferente al soporte del microarray, de
manera que el dispositivo de lectura se puede reutilizar para
tantos análisis como se desee. Además el dispositivo de lectura
puede funcionar con los soportes de bajo coste utilizados por los
conocidos sistemas ópticos. El único requerimiento para el uso de
este dispositivo de lectura es que la marca enzimática utilizada,
al reaccionar con su substrato químico correspondiente, genere un
producto que pueda ser detectado por los transductores, es decir,
un producto que modifique alguna propiedad eléctrica o química del
medio en que se produce la reacción. Los transductores de la
invención, por tanto, transforman magnitudes eléctricas o químicas
de un medio en magnitudes eléctricas.
En el caso de transductores impedimétricos, será
necesario que el substrato químico sea una especie química con
carga neta diferente a la de la suma de las cargas netas de los
productos, de manera que al producirse la reacción enzimática
cambie la concentración de especies cargadas, y por lo tanto cambie
la conductividad del medio. Un ejemplo de ello es el enzima Ureasa,
que al reaccionar con la urea (especie neutra) produce amoniaco y
dióxido de carbono. El amoniaco se protona rápidamente dando lugar
al ion amonio (cargado positivamente), mientras que el dióxido de
carbono se convertirá parcialmente en bicarbonato (cargado
negativamente).
En el caso de transductores amperométricos, la
reacción enzimática debe producir especies electroactivas. Un
ejemplo es el enzima fosfatasa alcalina, que en presencia de
p-aminofenilfosfato produce
p-aminofenol. El p-aminofenol se
oxida a un potencial menor de 200 mV dando lugar a
p-quinonaimina. Este sistema de enzima/substrato
permite utilizar el redox cycling ya que la
p-quinonaimina puede ser reducida a su vez a un
potencial menor de -200 mV dando lugar nuevamente a
p-aminofenol.
En el caso de transductores potenciometricos, la
reacción enzimática debe producir iones que sean detectables en el
transductor. El caso más simple seria una enzima que produzca un
cambio de pH.
En el presente documento, diremos que un
microarray está formado por un soporte plano, en una de cuyas
superficies, que denominaremos "superficie de test", hay una
matriz de spots con una marca enzimática. El soporte plano puede
ser cualquiera de los soportes habitualmente utilizados con otros
tipos de equipos de lectura, por ejemplo ópticos, y puede ser de
materiales como vidrio o plástico, entre otros.
Por tanto, de acuerdo con un primer aspecto de
la invención, se describe un dispositivo de lectura de microarrays
de tipo eléctrico y reutilizable que comprende los siguientes
elementos:
1) Una base, que comprende unos medios de apoyo
para situar la superficie de test del microarray en paralelo a una
superficie de lectura de la base.
Los medios de apoyo de la base deben ser tales
que la superficie de test del microarray quede enfrentada en
paralelo a la superficie de lectura de la base. Además, la
distancia entre ambas superficies debe ser tal que permita que una
gota de un medio acuoso toque simultáneamente ambas superficies,
poniendo así en contacto el sustrato químico presente en el medio
acuoso y la marca enzimática de los spots del microarray, y
produciéndose así una reacción química que resulta en unos
productos que afectan a propiedades eléctricas o químicas del medio
acuoso.
2) Una matriz de transductores, dispuestos sobre
la superficie de lectura de la base, que traducen una variación de
una magnitud eléctrica o química en una variación de una magnitud
eléctrica.
Los transductores están fijados a la superficie
de lectura de la base formando una matriz, de tal modo que, cuando
el microarray se dispone sobre los medios de apoyo, cada
transductor queda enfrentado a un spot.
Para poder efectuar la lectura, se debe aplicar
una gota de medio acuoso que contenga el substrato químico
correspondiente entre cada transductor y el respectivo spot
enfrentado al mismo. Las gotas de medio acuoso pueden formarse de
cualquier modo, siempre que todas sean del mismo tamaño, y que no
se toquen unas con otras. Por ejemplo, se podría utilizar una
micropipeta o un equipo tipo "spoter", aunque en una
realización preferida de la invención, el dispositivo de lectura de
microarrays de la invención comprende un medio de aplicación de
gotas de medio acuoso.
Preferentemente, el medio de aplicación de gotas
de medio acuoso está integrado en el propio dispositivo de lectura
de microarrays, y comprende un depósito de medio acuoso acoplado a
la superficie de la base opuesta a la superficie de lectura, y una
matriz de microcanales practicados en la propia base del
dispositivo. Cada microcanal conecta el depósito de medio acuoso
con el punto en el que está situado cada transductor, de modo que
modificando la presión en el depósito se consigue una inyección
controlada de medio acuoso, formándose así gotas de volumen
uniforme encima de cada transductor. Además, el depósito de medio
acuoso comprende una entrada y una salida de medio acuoso, de
manera que se pueden inyectar con él diferentes líquidos.
En otra realización preferida, el medio de
aplicación de gotas de medio acuoso es un aplicador que comprende
un depósito de medio acuoso y una matriz de microcanales
practicados en una de sus paredes. Al igual que el medio de
aplicación de gotas de medio acuoso descrito en el párrafo anterior,
situando correctamente el aplicador sobre la superficie de lectura
de la base y modificando la presión en el depósito, se produce la
inyección de fluido sobre cada transductor hasta que se forma una
gota del volumen deseado. Esto se puede hacer formando directamente
una gota única o depositando una multitud de pequeñas gotas
expulsadas desde la boquilla del microcanal por algún mecanismo
similar al utilizado por las impresoras de inyección de tinta, y
que al irse uniendo sobre el transductor van formando la gota. Al
tratarse de un aplicador que no está integrado en la base, es
necesario posicionarlo de modo que cada microcanal quede enfrentado
a un transductor. Para ello, se pueden utilizar los mismos medios
de apoyo utilizados para colocar el microarray.
3) Unos medios de lectura, conectados a los
transductores, que interpretan las señales eléctricas de los
transductores.
Una vez las gotas están en contacto con los
spots del microarray marcados enzimáticamente, la reacción
enzimática empieza a tener lugar. En los spots donde exista mayor
concentración de la marca enzimática, el transductor medirá un
cambio mayor en la concentración de productos. Las gotas están
separadas entre si y por lo tanto los productos se acumulan en el
volumen de las mismas sin que se produzca interferencia entre
diferentes puntos de la matriz. Por tanto, la matriz de
transductores está conectada a unos circuitos electrónicos de
medida capaces de adquirir y procesar la señal generada por cada uno
de dichos transductores. La medida se puede realizar al final de un
tiempo determinado o durante todo el tiempo que las gotas están en
contacto con los spots. El segundo caso permite medir la dinámica de
la reacción enzimática, lo cual puede dar mayor información
analítica. Por ejemplo, puede permitir un mayor rango dinámico, ya
que se puede detectar la evolución de las concentraciones de
producto antes de que se llegue a un valor de saturación.
De acuerdo con un segundo aspecto de la
invención, se describe un procedimiento de lectura eléctrica de un
microarray utilizando el dispositivo de lectura descrito
anteriormente, que comprende las siguientes operaciones:
a) Poner en contacto los spots del microarray
con las gotas de medio acuoso, produciéndose en cada gota una
reacción química que modifica una propiedad eléctrica o química del
medio acuoso que forma la gota.
Esta operación se puede realizar de dos modos
diferentes. De acuerdo con una realización particular, se pueden
crear en primer lugar gotas de medio acuoso sobre los
transductores, y a continuación colocar el microarray, con ayuda de
unos medios de apoyo, en paralelo a la superficie de lectura de la
base, y a una distancia tal que cada spot quede enfrentado a un
transductor y la gota de medio acuoso los toque a ambos.
En otra realización particular, es posible
disponer en primer lugar el microarray sobre los medios de apoyo y,
a continuación, inyectar el medio acuoso sobre los transductores
hasta formar gotas de un tamaño suficiente como para que cada una
de ellas esté en contacto simultáneamente con el transductor y con
el spot enfrentado al mismo.
b) Leer, mediante unos medios de lectura, la
señal eléctrica generada por cada uno de los transductores en
respuesta a la modificación de una propiedad eléctrica o química
del medio acuoso que forma la gota.
Una vez una gota de medio acuoso entra en
contacto con un spot marcado enzimáticamente, comienza la reacción
química entre el sustrato químico incluido en el medio acuoso y la
marca enzimática del spot, formándose como resultado de la reacción
unos productos que modifican alguna propiedad eléctrica o química
del medio acuoso que forma la gota. La subsiguiente operación de
lectura se puede realizar, bien simultáneamente sobre todos los
transductores de la matriz, o bien secuencialmente por filas,
columnas o individualmente.
c) Lavar la superficie de lectura del
dispositivo y reutilizarlo para nuevas pruebas.
Es importante que, una vez realizada la lectura
y antes de realizar una nueva lectura, se limpien los transductores
y la superficie de lectura de la base del dispositivo para que no
queden restos de los productos de la reacción enzimática ni de
enzimas que se puedan haber desprendido del microarray. En este
sentido, la solución o soluciones de limpieza deben tener la
capacidad de disolver los productos de la reacción enzimática y
desnaturalizar los enzimas para que pierdan por completo su
actividad. La limpieza puede acabar con un enjuagado en agua
desionizada.
Esta limpieza se puede hacer de modo tradicional
o bien, de acuerdo con una realización particular de la invención,
succionando las gotas de medio acuoso generadas e inyectando a
continuación una solución de limpieza, mediante el medio de
aplicación de gotas de medio acuoso. Para llevar a cabo esta
operación del procedimiento, el medio de aplicación de gotas de
medio acuoso debe ser capaz de crear presiones negativas en el
depósito al que están conectados los microcanales y de sustituir el
medio acuoso del depósito por una solución de limpieza
adecuada.
Para complementar la descripción que se está
realizando y con objeto de ayudar a una mejor comprensión de las
características de la invención, de acuerdo con un ejemplo
preferente de realización práctica de la misma, se acompaña como
parte integrante de dicha descripción, un juego de dibujos en donde
con carácter ilustrativo y no limitativo, se ha representado lo
siguiente:
Figura 1.- Muestra un esquema de un microarray
de soporte plano, con las diferentes partes que lo componen.
Figuras 2.- Muestra un esquema de un dispositivo
de lectura eléctrica de microarrays de acuerdo con la
invención.
Figuras 3 y 4.- Muestran dos realizaciones
particulares de medios de aplicación de gotas de medio acuoso.
Figuras 5 y 6.- Muestra las primeras operaciones
del procedimiento de lectura eléctrica de microarrays de acuerdo
con una realización particular de la invención.
Figura 7.- Muestra una realización particular de
los medios de lectura de acuerdo con la presente invención.
La Figura 1 muestra un microarray (6) formado
por un soporte plano (9), sobre cuya superficie de test (7) se
dispone una matriz de puntos de medida o spots (8), que son
marcados con una marca enzimática.
La Figura 2 muestra de forma esquemática el
dispositivo (1) de lectura de microarrays de acuerdo con la
presente invención. Se observa que está formado por una base (2),
sobre cuya superficie de lectura (4) hay una matriz de
transductores (5) que reaccionan ante un cambio en una propiedad
eléctrica o química del medio acuoso.
El dispositivo (1) de lectura de microarrays de
tipo eléctrico y reutilizable del ejemplo comprende además, en los
laterales de la base (2), unos medios de apoyo (3), que sirven para
apoyar el microarray (6) de forma que cada spot (8) de la matriz
quede enfrentado a un transductor (5). En este ejemplo, los medios
de apoyo (3) comprenden básicamente un reborde que sirve de apoyo
al microarray (6) durante el proceso de lectura. Aunque no se
observa en las figuras, en la superficie opuesta a la superficie de
lectura (4) se encuentran los medios de lectura (10), que se han
representado en la Fig. 7.
La fabricación de la base (2) y la matriz de
transductores (5) se realiza a partir de obleas de vidrio tipo
pyrex de 100 mm de diámetro. El proceso empieza con la deposición
de una tricapa metálica de titanio, níquel y oro (el titanio se
deposita sobre el pyrex con un grosor de 20 nm, el níquel sobre el
titanio con un grosor de 50 nm y el oro sobre el níquel con un
grosor de 50 nm). Los tres metales se despositan por pulverización
catódica. A continuación se realiza un proceso de fotolitografía
estándar con una máscara que contiene los motivos para definir una
matriz de pares de electrodos interdigitados. Cada par de
electrodos interdigitados tiene 14 dedos (siete en cada electrodo)
de 20 pm de ancho, separados 20 pm y con una longitud de la zona
interdigitada de 500 pm. Con la misma máscara se definen las pistas
de conexión que van desde cada electrodo hasta el borde del chip,
donde se define una área para su conexión a un circuito impreso
mediante soldadura de hilo. Los transductores forman una matriz
rectangular de 4x9 elementos y están separados 6 mm entre ellos. En
una oblea de 100 mm caben dos matrices de transductores (5) como la
descrita. El ataque de los metales posterior a la fotolitografía se
realiza en diferentes soluciones de ataque. Para el oro se utiliza
una mezcla de 5700 ml de H_{2}O, 435 g de Kl y 250 g de I_{2}.
Para el níquel se utiliza una mezcla 1:4 de HNO_{3} al 70% :
H_{2}O. Para el titanio se utiliza una mezcla 1:10:33 de HF 49% :
H_{2}O : 1,2-Propanodiol.
Una vez definidos los electrodos la oblea se
pasa por una sierra mecánica para separar las dos matrices de
transductores (5). Las matrices se unen a un circuito impreso en el
que se han definido las áreas necesarias para la conexión mediante
soldadura por hilo y que tiene un conector para conectar
eléctricamente los electrodos a la instrumentación. Tras realizar la
soldadura con hilo de todos los electrodos se protegen los hilos
mediante un polímero termocurable (Epotek H77). El medio de apoyo
(3) se fabrica con Polidimetilsyloxano a partir de un molde, y se
suelda a la matriz de transductores mediante activación con plasma
de oxígeno.
Las Figuras 3 y 4, por su parte, muestran
respectivamente dos realizaciones preferidas de medios de
aplicación de medio acuoso. En la figura 3, éstos están integrados
en la base (2'), de modo que un depósito (11') de medio acuoso
formado en la superficie opuesta a la superficie de lectura (4)
inyecta el medio acuoso a través de una matriz de microcanales (12')
que atraviesan la base (2') hasta el lugar en el que está situado
cada transductor (5'). En este ejemplo, los transductores (5')
tienen un orificio central donde está la boquilla de cada
microcanal.
En la Figura 4, los medios de aplicación de
medio acuoso constituyen un aplicador formado por un depósito
(11'') de medio acuoso en una de cuyas paredes hay unos
microcanales (12''), a través de los cuales se inyecta el medio
acuoso sobre los transductores (5''). Para que cada microcanal quede
enfrentado a un tranductor (5''), los medios de apoyo (3'')
comprenden además un segundo reborde sobre el que se apoya el
aplicador de medio acuoso.
Las Figuras 5 y 6 muestran algunas operaciones
de una realización preferida del procedimiento de la invención. En
particular, la Figura 5 muestra el micrroarray (6) y el dispositivo
de lectura (1), donde previamente se ha llevado a cabo la operación
de inyectar una gota de medio acuoso sobre cada transductor (5). El
microarray (6) está ya preparado para ser apoyado en los medios de
apoyo (3), momento que se recoge en la Figura 6, en la que cada
gota de medio acuoso ya están en contacto con un spot (8), y por lo
tanto ha comenzado ya la reacción química entre la marca enzimática
y el sustrato.
Finalmente, la Figura 7 muestra la
instrumentación de medida en el caso de que el producto de la
reacción química entre la marca enzimática y el sustrato químico
provoque cambios en la impedancia del medio acuoso de la gota. La
instrumentación comprende fuentes de excitación de tensión alterna
(15) y circuitos de medida (16) de corriente alterna, que combinados
son capaces de medir la impedancia vista en terminales de los
electrodos (17) interdigitados. En la figura se observa conexión de
dichas fuentes (15) y circuitos medidores(16) con los
electrodos (17). Como se puede apreciar, los transductores
impedimétricos permiten un conexionado tipo
fila-columna. Esto hace que sea práctica la
realización de matrices de gran número de elementos. Por ejemplo,
para una matriz de 1024 elementos bastaría con 32 fuentes de
excitación alterna (15) y 32 circuitos de medida (16) de la
corriente. De hecho, con una multiplexación adecuada es suficiente
una sola fuente de excitación (15) y un solo circuito de medida
(16) de la corriente. En el caso de que el número de elementos de
la matriz sea muy elevado, el número de soldaduras por hilo que se
necesitarían también lo seria. Para solventar este problema se
puede utilizar una tecnología de fabricación con dos niveles de
metal y conectar los electrodos (17) a nivel de oblea por filas y
columnas como se muestra en la Figura 7. De esta manera, el número
de soldaduras por hilo que se necesitan para encapsular una matriz
de transductores de
(n x m) es tan solo de (n + m). En el ejemplo que aquí se describe, las fuentes de excitación son las salidas analógicas de una tarjeta NI USB-6259 de National Instruments. Los circuitos de medida (16) de corriente se han implementado en el ejemplo con amplificadores operacionales AD8674, con una resistencia de realimentación de precisión de
100 k\Omega. El registro de los valores de tensión a la salida de los amplificadores operacionales se ha realizado mediante las entradas analógicas de la misma tarjeta. Un programa en LabView sirve para controlar el proceso de adquisición, procesar las señales adquiridas y obtener los valores de impedancia que presentan los transductores (5) a lo largo del tiempo de lectura. El proceso de adquisición se desarrolla según la siguiente secuencia: Primero se excita una fila de transductores (5) con una tensión alterna de 50 mV de amplitud y 2 kHz de frecuencia durante 25 ms. El resto de fuentes (15) de excitación se mantiene a 0V. Durante este tiempo se adquiere la señal con las entradas analógicas conectadas a cada una de las columnas de transductores (5). A continuación se procedería de igual forma con la siguiente fila y así hasta que todas las filas de transductores hubieran sido leídas.
(n x m) es tan solo de (n + m). En el ejemplo que aquí se describe, las fuentes de excitación son las salidas analógicas de una tarjeta NI USB-6259 de National Instruments. Los circuitos de medida (16) de corriente se han implementado en el ejemplo con amplificadores operacionales AD8674, con una resistencia de realimentación de precisión de
100 k\Omega. El registro de los valores de tensión a la salida de los amplificadores operacionales se ha realizado mediante las entradas analógicas de la misma tarjeta. Un programa en LabView sirve para controlar el proceso de adquisición, procesar las señales adquiridas y obtener los valores de impedancia que presentan los transductores (5) a lo largo del tiempo de lectura. El proceso de adquisición se desarrolla según la siguiente secuencia: Primero se excita una fila de transductores (5) con una tensión alterna de 50 mV de amplitud y 2 kHz de frecuencia durante 25 ms. El resto de fuentes (15) de excitación se mantiene a 0V. Durante este tiempo se adquiere la señal con las entradas analógicas conectadas a cada una de las columnas de transductores (5). A continuación se procedería de igual forma con la siguiente fila y así hasta que todas las filas de transductores hubieran sido leídas.
Se describe a continuación un ejemplo de uso de
un dispositivo (1) de lectura de microarrays (6) de tipo eléctrico
y reutilizable basado en transductores (5) impedimétricos para
medir los resultados en un microarray (6) que utiliza la ureasa
como marca enzimática.
La Ureasa, en presencia de urea (neutra) produce
amoniaco y dióxido de carbono. El amoniaco se protona rápidamente
dando lugar al ion amonio (cargado positivamente), mientras que el
dióxido de carbono se convertirá parcialmente en bicarbonato
(cargado negativamente). Por lo tanto, la reacción enzimática hace
aumentar la conductividad del tampón original. El tampón original
está formado por una solución acuosa de urea 0.1 M y glicina 0.25 M,
con una conductividad aproximada de 16 \muS/cm. En este ejemplo,
las gotas de tampón, de 1 \mul de volumen se depositaron sobre
los transductores (5) manualmente utilizando una micropipeta. En la
preparación del microarray, se empleó como analito modelo a
detectar una inmunoglobulina G de conejo y se aplicó un ensayo de
tipo fase inversa. Este consistió en realizar diluciones sucesivas
de una solución madre de dicho analito modelo. Se depositaron
microgotas de 1 \muL de volumen, de cada una de las diluciones
preparadas en el soporte (9) del microarray (6) (portaobjetos de
vidrio previamente silanizado). Una vez inmovilizado el analito, el
microarray (6) se incubó con una disolución de un anticuerpo de
cabra, anti-inmunoglobulina G de conejo marcado con
ureasa durante una hora, tiempo durante el cual tuvo lugar la
interacción específica entre el analito y el anticuerpo marcado.
Tras lavar el microarray (6) con agua desionizada y secar en
corriente de nitrógeno, se procedió a la lectura del mismo con la
matriz de transductores (5) impedimétricos.
Claims (14)
1. Dispositivo (1, 1', 1'') de lectura de
microarrays (6) de tipo eléctrico y reutilizable,
caracterizado porque comprende:
una base (2, 2', 2''), sobre cuya superficie de
lectura (4) están dispuestos en una matriz unos transductores (5,
5', 5''), que traducen una variación de una magnitud eléctrica o
química en una variación de una magnitud eléctrica;
unos medios de apoyo (3, 3', 3'') comprendidos
en la base (2, 2', 2'') que sirven para situar la superficie de
test (7) de un microarray (6) que comprende una matriz de spots (8)
con una marca enzimática en paralelo a la superficie de lectura (4)
de la base (2, 2', 2'') a una distancia tal que permite que una gota
de un medio acuoso ponga en contacto un spot (8) de la superficie
de test (7) con un transductor (5, 5', 5'') de la superficie de
lectura (4); y
unos medios de lectura (10), conectados a los
transductores (5, 5', 5''), que interpretan las señales eléctricas
de los transductores (5, 5', 5'').
\vskip1.000000\baselineskip
2. Dispositivo (1, 1', 1'') de lectura eléctrica
de un microarray (6) de acuerdo con la reivindicación 1,
caracterizado porque la base (2, 2', 2'') y la matriz de
transductores (5, 5', 5'') están fabricados a partir de una oblea de
vidrio tipo pirex.
3. Dispositivo (1, 1', 1'') de lectura eléctrica
de un microarray (6) de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1-2, caracterizado porque
los transductores (5, 5', 5'') se eligen de la siguiente lista:
transductores impedimétricos, transductores amperométricos y
transductores potenciométricos.
4. Dispositivo (1, 1', 1'') de lectura
eléctrica de un microarray (6) de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1-3, caracterizado porque
los medios de lectura (10) comprenden circuitos electrónicos que
adquieren y procesan las señales eléctricas generadas por los
transductores (5, 5', 5'').
5. Dispositivo (1, 1', 1'') de lectura
eléctrica de un microarray (6) de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1-4, caracterizado porque
además comprende un medio de aplicación de gotas de medio acuoso
para formar una gota de medio acuoso sobre cada transductor (5, 5',
5'').
6. Dispositivo (1'') de lectura eléctrica de un
microarray (6) de acuerdo con la reivindicación 5,
caracterizado porque el medio de aplicación de gotas de
medio acuoso es un aplicador que comprende un depósito (11'') de
medio acuoso y una matriz de microcanales (12'') practicados en una
de sus paredes.
7. Dispositivo (1') de lectura eléctrica de un
microarray (6) de acuerdo con la reivindicación 5,
caracterizado porque el medio de aplicación de gotas de
medio acuoso comprende un depósito (11') de medio acuoso situado
junto a la superficie de la base (2') opuesta a la superficie de
lectura (4), y una matriz de microcanales (12') practicados en la
base (2').
8. Dispositivo (1') de lectura eléctrica de un
microarray (6) de acuerdo con la reivindicación 7,
caracterizado porque los microcanales (12') comprenden una
boquilla situada en un orificio central de los transductores
(5').
(5').
9. Procedimiento de lectura de un microarray
(6), donde el microarray (6) comprende un soporte (9) plano en cuya
superficie de test (7) hay una matriz de spots (8) con una marca
enzimática y donde el dispositivo (1, 1', 1'') de lectura comprende
una base (2, 2', 2'') sobre cuya superficie de lectura (4) se
dispone una matriz de transductores (5, 5', 5'') que transforman una
modificación de una propiedad eléctrica o química en una
modificación de una propiedad eléctrica, caracterizado porque
comprende las siguientes operaciones:
disponer en paralelo la superficie de lectura
(4) de la base (2, 2', 2'') y la superficie de test (8) del
microarray (6), de modo que cada spot (8) está enfrentado a un
transductor (5, 5', 5'') con una gota de un medio acuoso en
contacto con ambos;
leer, mediante unos medios de lectura (10), la
señal eléctrica generada por cada uno de los transductores (5, 5',
5'') en respuesta a la modificación de una propiedad eléctrica o
química del medio acuoso que forma la gota;
lavar la superficie de lectura (4) del
dispositivo (1) y reutilizarlo para nuevas lecturas.
\vskip1.000000\baselineskip
10. Procedimiento de lectura de un microarray
(6) de acuerdo con la reivindicación 9, caracterizado porque
la gota de medio acuoso se añade antes de acercar los spots (8) del
microarray (6) a los transductores (5, 5', 5'').
11. Procedimiento de lectura de un microarray
(6) de acuerdo con la reivindicación 9, caracterizado porque
la gota de medio acuoso se añade después de acercar los spots (8)
del microarray (6) a los transductores (5, 5', 5''').
\newpage
12. Procedimiento de lectura de un microarray
(6) de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones
9-11, caracterizado porque la operación de
lectura se realiza durante todo el tiempo que cada gota de medio
acuoso permanece en contacto con los spots (8) y transductores (5,
5', 5'').
13. Procedimiento de lectura de un microarray
(6) de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones
9-11, caracterizado porque la operación de
lectura se realiza solamente una vez un tiempo predeterminado
después de entrar las gotas de medio acuoso en contacto con los
spots.
14. Procedimiento de lectura de un microarray
(6) de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones
9-13, caracterizado porque la operación de
lavar el dispositivo (1, 1', 1'') de lectura se efectúa inyectando
una solución de limpieza mediante un medio de aplicación de gotas
de medio acuoso.
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| ES200802068A ES2334745B1 (es) | 2008-07-11 | 2008-07-11 | Dispositivo de lectura de microarrays de tipo electrico y reutilizable. |
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