CN113702362A - 一种使用化学发光方法定量检测IFN-γ浓度的方法及其检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种使用化学发光方法定量检测IFN‑γ浓度的方法，本方法以配体受体结合原理为基础，将包被蛋白、检测物IFN‑γ、检测抗体先后结合在固体介质上，然后加入显色底物进行检测；检测步骤如下：使固体介质固定住和IFN‑γ的特异性蛋白，该特异性蛋白即为包被蛋白，然后加入检测样品，特异地将样品中的IFN‑γ也固定在固体介质上，然后使用可以结合IFN‑γ的第二个抗体，即为检测抗体，将第二个抗体也固定在固定介质上，中间伴随着洗涤的过程，洗去非特异吸附的杂质；第二个抗体直接或者间接进行了特殊的标记，最后用标记物相适应的底物进行显色检测。本发明优点在于成本较低、灵敏度高、来源可控、可持续业务强。
Description
技术领域
本发明涉及生物分析检测领域，具体涉及通过双抗体夹心法，采用化学发光的检测方式检测人类基质中IFN-γ浓度的的检测方法及其试剂盒。
背景技术
干扰素(Interferon，IFN)，是由英国科学家Isaacs于1957年利用鸡胚绒毛***研究流感病毒干扰现象时首先发现的，是一种细胞因子，具有抑制细胞***、调节免疫、抗病毒、抗肿瘤等多种作用。其本质是蛋白质，类型可分为α、β、γ、ω等几种。IFN能诱导细胞对病毒感染产生抗性，它通过干扰病毒基因转录或病毒蛋白组分的翻译，从而阻止或限制病毒感染，是目前最主要的抗病毒感染和抗肿瘤生物制品。
参与免疫调节的为干扰素为IFN-γ，又称为免疫调节作用干扰素。免疫调节干扰素可对IgG的Fc受体表达，从而有利于巨噬细胞对抗原的吞噬，K、 NK细胞对靶细胞的杀伤以及T、B淋巴细胞的激活，增强机体免疫应答能力。 IFN-γ可使巨噬细胞表面MHCⅡ类分子的表达增加，增强其抗原递呈能力。此外还可以通过增强巨噬细胞表面表达Fc受体，促进巨噬细胞吞噬免疫复合物、抗体包被的病原体和肿瘤细胞。同时还可以刺激中性粒细胞，增强其吞噬能力，活化NK细胞，增强其细胞毒作用等作用来参与免疫调节。
干扰素是一个在防御肿瘤发展的先天的和适应的必需细胞因子，IFN-γ由特异性抗原刺激T淋巴细胞产生，其结构与I型干扰素不同，不耐酸，为机体主要的巨噬细胞刺激因子，对机体免疫反应有多方面的调节作用。能激活效应细胞，提高自然杀伤细胞、巨噬细胞和肿瘤浸润淋巴细胞的活性，促进单核细胞循环，增强免疫细胞表面抗原和抗体的表达，刺激IL-2、肿瘤坏死因子、干扰素-α等细胞因子的产生，抑制肿瘤细胞***，诱导基因全成抗病毒蛋白等。
血清和血浆中IFN-γ的浓度测定是病毒感染，免疫调结剂药物安全性评估的重要参考指标。目前用于IFN-γ浓度的生物分析方法以受体配体结合原理的ELISA检测方法，多以试剂盒的形式存在如ELISA方法R&D systems Cat. SIF50C或者电化学发光检测方法MSDCat.K151QOD等。
尽管IFN-γ的浓度测定方法市场上已有试剂盒可以提供，但是性能上仍然有没有满足的需求。根据MSD试剂盒的信息正常血清中INFγ的浓度范围在 0.64-14.4pg/mL，对方法的灵敏度要求比较严格。例如Abcam的试剂盒 (ab48490)的检测区间400-12.5pg/ml，灵敏度约为5pg/ml也达不到需求。电化学发光检测方法MSD试剂盒(K151QOD-2)检测区间0.20-938pg/m，能够满足需求，但是整个试剂盒成本非常高，且配套使用的仪器价格高昂，相对于ELISA试剂盒有多种选择，MSD电化学发光检测方法具有垄断地位，没有可替换的产品可供选择，一旦采购周期太长或者断货，不利于IFN-γ的浓度测定临床检测业务的持续进行。
发明内容
本发明的目的提供一种使用化学发光方法定量检测IFN-γ浓度的检测方法及其检测试剂盒，解决上述现有技术问题中的一个或者多个。
根据本发明所提供的一种使用化学发光方法定量检测IFN-γ浓度的方法，本方法以配体受体结合原理为基础，将包被蛋白、检测物IFN-γ、检测抗体先后结合在固体介质上，然后加入显色底物进行检测；其特征在于，检测步骤如下：使固体介质固定住和IFN-γ的特异性蛋白，该特异性蛋白即为包被蛋白，然后加入检测样品，特异地将样品中的IFN-γ也固定在固体介质上，然后使用可以结合IFN-γ的第二个抗体，即为检测抗体，将第二个抗体也固定在固定介质上，中间伴随着洗涤的过程，洗去非特异吸附的杂质；第二个抗体直接或者间接进行了特殊的标记，最后用标记物相适应的化学发光底物进行显色检测。
本发明所提的一种使用化学发光方法定量检测IFN-γ浓度的检测方法及其检测试剂盒，灵敏度高和来源可控，适用于人血液基质中IFN-γ的浓度检测试剂盒。
在一些实施方式中，所述检测抗体的标记物为HRP，使用HRP直接或者间接对于第二个抗体进行标记。
在一些实施方式中，具体操作步骤如下：
含包被蛋白的酶标板的制作：将包被抗体稀释到合适的浓度，100μL/ 孔加入96酶标板中，500rpm混匀10min后，置于4度过夜孵16-24h；
第二天，弃微孔板的溶液，用洗涤液洗三遍，拍干，加入300μL/孔的封闭液，室温500rpm孵育1小时；
检测物IFN-γ梯度设置：IFN-γ标准品使用样品分析液进行梯度稀释，稀释起始浓度为100pg/mL，然后两倍梯度稀释9个点，标准曲线的标准品浓度范围为100pg/mL，50pg/mL，25pg/mL，12.5pg/mL，6.25pg/mL，3.125 pg/mL，1.563pg/mL，0.781pg/mL，0.391pg/mL，0.195pg/mL样品分析液作为空白样品；
检测反应：取封闭好的96酶标板，弃微孔板的溶液，用洗涤液洗三遍，拍干，将稀释好的标准品梯度溶液以100μL/孔加入微孔板中，室温500rpm 孵育1小时；弃微孔板的溶液，用洗涤液洗三遍，拍干，使用方法分析液将检测抗体稀释100倍，以100μL/孔加入微孔板中，室温500rpm孵育1小时；
弃微孔板的溶液，用洗涤液洗三遍，拍干，使用方法分析液将HRP标记的链霉亲和素1：200进行稀释后，以100μL/孔加入微孔板中，室温500rpm孵育 1小时；
显色检测：提前半小时将化学发光检测试剂A液和B液平衡到室温，临用前进行1：1混合，以100μL/孔加入微孔板中室温500rpm孵育3分钟后，使用多功能酶标仪使用化学发光的检测程序进行读数。
一种使用化学发光方法定量检测IFN-γ浓度的检测试剂盒：所述试剂盒包括96孔板、包被蛋白、检测抗体、化学发光检测试剂，所述试剂盒是以96 孔板为固相载体。
在一些实施方式中，所述试剂盒的包被蛋白可以是重组受体蛋白或者重组抗体；所述试剂盒采用酶直接或者间接和检测抗体结合，使用酶特异性的化学发光底物进行化学发光的检测，该酶是但不限于HRP、luciferase，对应底物为该酶的化学发光底物。
发光是指分子或原子中的电子吸收能量后，由低能级的基态跃迁到高能级的激发态，高能级的激发态将会在短时间内返回到低能级的基态释放能量，该能量以光子的形式释放出来。根据分子或者原子形成激发态的能量来源不同发光可以分为光刺激发光、生物发光、电刺激发光、化学发光等。化学发光是指伴随化学反应过程所产生的光的发射现象。检测反应体系中的某些物质分子，如酶、底物等在进行化学反应的时候，由于吸收了反应时产生的化学能，使信号分子激发至激发态，受激分子由激发态回到基态时，便发出一定波长的光。化学发光检测方法主要是依据检测体系中待测物的浓度与化学发光强度在一定条件下呈线性相关的原理，利用仪器捕捉化学发光，将光信号转换成电信号，通过电信号的大小来确定待测物含量的一种痕量分析方法。现有的化学发光分析技术多用于蛋白免疫印迹领域，使用酶标记抗体进行反应，当加入化学发光底物(如鲁米诺，双氧水等)进行酶促化反应，产生光信号。信号可通过感光胶片或专用的成像设备来采集。使用化学发光分析技术可检测到低至飞克(10-15g)级别的痕量的蛋白，灵敏度极高。但是蛋白免疫印迹实验需要以膜为固体载体，一块膜上的上样量不高，不能满足医药工业界药物研发高通量的检测需求，复杂的操作过程导致结果的稳定性较差，不能满足临床检测的精密度，准确度和稳定性等方法性能的需求。
受体配体结合酶联免疫技术早在19世纪70，80年代就开发出来用于替代放射性同位素标记技术用于研究蛋白质间的相互作用(配体-受体，抗原- 抗体)和浓度测试，到如今已经接近50年的历史了。ELISA技术和MSD技术均脱胎于受体配体结合酶联免疫技术，ELISA技术和MSD技术以96孔板为固体载体，使用不同的显色底物进行检测，均有着高通量，方法的精密度，准确度和稳定性优异的特点。
本发明使用化学发光分析技术结合受体配体结合酶联免疫技术，以96 孔板为固体载体，发挥化学发光分析技术的高灵敏优势的同时，也具备ELISA 技术和MSD技术高通量，方法的精密度，准确度和稳定性优异的特点。化学发光方法定量检测IFN-γ浓度的生物分析方法灵敏度低至0.5pg/mL，且板间精密度和板内精密度<10％。
附图说明
图1为本发明的一种实施方式的化学发光方法IFN-γ的标准曲线。
具体实施方式
下面结合说明书附图，对本发明进行进一步详细的说明。
实施例1 ELISA方法建立IFN-γ标准曲线
将Abcam试剂盒Human Interferon gamma ELISA Set(without plates)货号：ab48490中的包被抗体IFN gamma Capture antibody用1×PBS稀释100倍， 100μL/孔加入96酶标板(ThermofisherTM439454)中，500rpm混匀10min后，置于4度过夜孵16-24h。
第二天，弃微孔板的溶液，用洗涤液(洗涤液成分1×PBS+0.1％Tween 20) 洗三遍，拍干，加入300μL/孔的封闭液(封闭液/方法分析液成分1×PBS+1％ BSA+0.1％Tween20)，室温500rpm孵育1小时；IFN-γ标准品(标准品来自Abcam 试剂盒Human Interferongamma ELISA Set(without plates)货号：ab48490) 使用样品分析液(样品稀释液成分为方法分析液中加入10％兔血清)进行梯度稀释，稀释起始浓度为400pg/mL，然后两倍梯度稀释8个点，标准曲线的标准品浓度范围为400pg/mL，200pg/mL，100pg/mL，50pg/mL，25pg/mL，12.5 pg/mL，6.25pg/mL，3.125pg/mL，样品分析液作为空白样品；取封闭好的 96酶标板，弃微孔板的溶液，用洗涤液(洗涤液成分1×PBS+0.1％Tween 20) 洗三遍，拍干，将稀释好的标准品梯度溶液以100μL/孔加入微孔板中，室温 500rpm孵育1小时；弃微孔板的溶液，用洗涤液(洗涤液成分1×PBS+0.1％ Tween 20)洗三遍，拍干，使用方法分析液(封闭液/方法分析液成分1×PBS +1％BSA+0.1％Tween 20)将Detection biotinylated anti-IFN gammaantibody(检测抗体来自Abcam试剂盒Human Interferon gamma ELISA Set (withoutplates)货号：ab48490)稀释100倍，以100μL/孔加入微孔板中，室温500rpm孵育1小时；弃微孔板的溶液，用洗涤液(洗涤液成分1×PBS+0.1％ Tween 20)洗三遍，拍干，使用方法分析液(封闭液/方法分析液成分1×PBS +1％BSA+0.1％Tween 20)将HRP标记的链霉亲和素(R&D货号DY998)1：200 进行稀释后，以100μL/孔加入微孔板中，室温500rpm孵育1小时；提前半小时将TMB显色液(Thermo，货号34028)A液和B液平衡到室温，临用前进行1：1 混合，以100μL/孔加入微孔板中，室温避光孵育15分钟后加入50μL/孔ELISA 终止液终止，使用酶标仪(Molecular Device型号SpectraMax plus 384)使用吸光度发以450nM为检测波长，650nM为参比波长，进行读数，读数结果使用SoftMax软件(Molecular Device)，采用4参数进行标准曲线拟合，权重因子选择1。
经过数据分析，ELISA方法IFN-γ标准曲线进行函数拟合后数据分析结果见下表1，相对于背景信号为0.013，最大检测信号为2.401，ELISA方法一般认为OD值>0.1时，会有较为稳定的检测结果，以此判断有ELISA方法 24倍的检测窗口，以标准曲线各浓度点的回测偏差Bias％在25％以内点计算， ELISA方法的检测范围12.5-400pg/mL。
表1 ELISA方法IFN-γ标准曲线进行函数拟合后数据分析结果
实施例2化学发光方法建立IFN-γ标准曲线
将Abcam试剂盒Human Interferon gamma ELISA Set(without plates)货号：ab48490中的包被抗体IFN gamma Capture antibody用1×PBS稀释100倍， 100μL/孔加入96酶标板(Thermo FisherTM436110)中，500rpm混匀10min 后，置于4度过夜孵16-24h。
第二天，弃微孔板的溶液，用洗涤液(洗涤液成分1×PBS+0.1％Tween 20) 洗三遍，拍干，加入300μL/孔的封闭液(封闭液/方法分析液成分1×PBS+1％ BSA+0.1％Tween20)，室温500rpm孵育1小时；IFN-γ标准品(标准品来自Abcam 试剂盒Human Interferongamma ELISA Set(without plates)货号：ab48490) 使用样品分析液(样品稀释液成分为方法分析液中加入10％兔血清)进行梯度稀释，稀释起始浓度为100pg/mL，然后两倍梯度稀释9个点，标准曲线的标准品浓度范围为100pg/mL，50pg/mL，25pg/mL，12.5pg/mL，6.25pg/mL， 3.125pg/mL，1.563pg/mL，0.781pg/mL，0.391pg/mL，0.195pg/mL样品分析液作为空白样品；取封闭好的96酶标板，弃微孔板的溶液，用洗涤液 (洗涤液成分1×PBS+0.1％Tween20)洗三遍，拍干，将稀释好的标准品梯度溶液以100μL/孔加入微孔板中，室温500rpm孵育1小时；弃微孔板的溶液，用洗涤液(洗涤液成分1×PBS+0.1％Tween 20)洗三遍，拍干，使用方法分析液(封闭液/方法分析液成分1×PBS+1％BSA+0.1％Tween 20)将Detectionbiotinylated anti-IFN gamma antibody(检测抗体来自Abcam试剂盒Human Interferongamma ELISA Set(without plates)货号：ab48490)稀释100 倍，以100μL/孔加入微孔板中，室温500rpm孵育1小时；弃微孔板的溶液，用洗涤液(洗涤液成分1×PBS+0.1％Tween20)洗三遍，拍干，使用方法分析液(封闭液/方法分析液成分1×PBS+1％BSA+0.1％Tween20)将HRP标记的链霉亲和素(R&D货号DY998)1：200进行稀释后，以100μL/孔加入微孔板中，室温500rpm孵育1小时。
提前半小时将化学发光检测试剂(Thermo货号37074)A液和B液平衡到室温，临用前进行1：1混合，以100μL/孔加入微孔板中室温500rpm孵育3分钟后，使用多功能酶标仪(Tecan型号Infinite F plex)使用化学发光的检测程序进行读数，读数结果使用SoftMax软件(Molecular Device)，采用4参数进行标准曲线拟合，权重因子选择1/Y^2。
经过数据分析，IFN-γ标准曲线图见图1。
标准曲线进行函数拟合后数据分析结果见下表2，相对于背景信号为 96551，最大检测信号为13159275，有136倍的检测窗口，标准曲线各浓度点的回测偏差Bias％在25％为标准，方法的检测范围扩展到0.195-100pg/mL，具有极佳的灵敏程度和回测准确度。
表2经函数拟合后标准曲线各浓度点参数
实验数据对比：经实施例1和实施例2的结果显示，ELISA方法的检测范围12.5-400pg/mL，化学发光方法的检测范围扩展到0.195-100pg/mL，对比结果表明化学发光方法相对于ELISA方法有更加灵敏，可以将最低检测限由12.5pg/mL降低至0.195pg/mL；ELISA的检测窗口为32倍，化学发光方法的检测窗口为512倍，化学发光方法相对于ELISA方法有更宽的检测窗口。
实施例3化学发光方法血清样品的平行性测试
按照实施例2组装的试剂盒，按照实施例2操作步骤进行实验，在标准品稀释准备这步，同时使用样品稀释液进行血清样品的准备，血清样品用分别进行1，2倍稀释。
利用实施例2相同的数据处理方式进行标准曲线拟合，血清样品测得的结果见下表3。
4个血清样品检测结果表明，每个样品在两个稀释度水平内都能够测得接近的浓度值，说明方法中的标准品IFN-γ和血清中的样品在此方法体系内有类似的剂量响应曲线，方法的平行性很好。
该试剂盒能够用于人血清基质样品中的IFN-γ检测。
| Sample | Value | Result | MeanResult | ％CV | Dilution | AdjResult | Bias％1 | ％CV |
| SM-09-1 | 387710 | 2.076 | 2.065 | 0.8 | 1 | 2.065 | -7.17 | 5.3 |
| 384506 | 2.054 | |||||||
| SM-09-2 | 229651 | 0.947 | 0.959 | 1.7 | 2 | 1.917 | ||
| 232801 | 0.97 | |||||||
| SM-18-1 | 295382 | 1.428 | 1.431 | 0.4 | 1 | 1.431 | -21.80 | 17.3 |
| 296439 | 1.435 | |||||||
| SM-18-2 | 175643 | 0.532 | 0.559 | 7 | 2 | 1.119 | ||
| 182696 | 0.587 | |||||||
| SM-26-1 | 465596 | 2.608 | 2.649 | 2.2 | 1 | 2.649 | -0.60 | 0.4 |
| 477786 | 2.69 | |||||||
| SM-26-2 | 282176 | 1.333 | 1.316 | 1.7 | 2 | 2.633 | ||
| 277687 | 1.3 | |||||||
| SM-30-1 | 396919 | 2.14 | 2.087 | 3.6 | 1 | 2.087 | 2.73 | 1.9 |
| 381663 | 2.035 | |||||||
| SM-30-2 | 246281 | 1.07 | 1.072 | 0.2 | 2 | 2.144 | ||
| 246749 | 1.074 |
表3血清样品平行性测定结果
实施例4化学发光方法的精密度和准确度测试
按照实施例2组装的试剂盒，按照实施例2操作步骤进行实验，以理论浓度为50pg/mL，6.25pg/mL和0.781pg/mL的标准品作为QC样品。
利用实施例2相同的数据处理方式进行QC样品的浓度计算。进行了3 次测试，三次的检测结果见下表4，三次测得的结果表明该化学发光方法定量检测IFN-γ浓度的生物分析方法的精密度在±5％以内，方法的准确度在± 5％以内，说明该方法有极佳的精密度和准确度。
| 理论浓度pg/ml | 第一次测定 | 第二次测定 | 第三次测定 | 准确度Bias％ | 精密度％CV |
| 50 | 47.81 | 51.49 | 49.61 | -0.73 | 3.7 |
| 6.25 | 6.41 | 6.04 | 6.15 | -0.80 | 3.1 |
| 0.781 | 0.81 | 0.79 | 0.82 | 3.29 | 1.9 |
表4精密度和准确度测试结果
本发明使用化学发光分析技术结合受体配体结合酶联免疫技术，以96孔板为固体载体，发挥化学发光分析技术的高灵敏优势的同时，也具备ELISA 技术和MSD技术高通量，方法的精密度，准确度和稳定性优异的特点。化学发光方法定量检测IFN-γ浓度的生物分析方法灵敏度低至0.195pg/mL，且板间精密度和板内精密度＜10％。
以上所述仅是本发明的优选方式，应当指出，对于本领域普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干相似的变形和改进，这些也视为发明保护之内。
Claims (6)
1.一种使用化学发光方法定量检测IFN-γ浓度的方法，本方法以配体受体结合原理为基础，将包被蛋白、检测物IFN-γ、检测抗体先后结合在固体介质上，然后加入显色底物进行检测；其特征在于，检测步骤如下：使固体介质固定住和IFN-γ的特异性蛋白，该特异性蛋白即为包被蛋白，然后加入检测样品，特异地将样品中的IFN-γ也固定在固体介质上，然后使用可以结合IFN-γ的第二个抗体，即为检测抗体，将第二个抗体也固定在固定介质上，中间伴随着洗涤的过程，洗去非特异吸附的杂质；第二个抗体直接或者间接进行了特殊的标记，最后用标记物相适应的化学发光底物进行显色检测。
2.根据权利要求1所述的一种使用化学发光方法定量检测IFN-γ浓度的方法，其特征在于，所述检测抗体的标记物为HRP，使用HRP直接或者间接对于第二个抗体进行标记。
3.根据权利要求1或2所述的一种使用化学发光方法定量检测IFN-γ浓度的方法，其特征在于，具体操作步骤如下：
含包被蛋白的酶标板的制作：将包被抗体稀释到合适的浓度，100μL/孔加入96酶标板中，500rpm混匀10min后，置于4度过夜孵16-24h；
第二天，弃微孔板的溶液，用洗涤液洗三遍，拍干，加入300μL/孔的封闭液，室温500rpm孵育1小时；
检测物IFN-γ梯度设置：IFN-γ标准品使用样品分析液进行梯度稀释，稀释起始浓度为100pg/mL，然后两倍梯度稀释9个点，标准曲线的标准品浓度范围为100pg/mL，50pg/mL，25pg/mL，12.5pg/mL，6.25pg/mL，3.125pg/mL，1.563pg/mL，0.781pg/mL，0.391pg/mL，0.195pg/mL样品分析液作为空白样品；
检测反应：取封闭好的96酶标板，弃微孔板的溶液，用洗涤液洗三遍，拍干，将稀释好的标准品梯度溶液以100μL/孔加入微孔板中，室温500rpm孵育1小时；弃微孔板的溶液，用洗涤液洗三遍，拍干，使用方法分析液将检测抗体稀释100倍,以100μL/孔加入微孔板中，室温500rpm孵育1小时；
弃微孔板的溶液，用洗涤液洗三遍，拍干，使用方法分析液将HRP标记的链霉亲和素1：200进行稀释后，以100μL/孔加入微孔板中，室温500rpm孵育1小时；
显色检测：提前半小时将化学发光检测试剂A液和B液平衡到室温，临用前进行1：1混合，以100μL/孔加入微孔板中室温500rpm孵育3分钟后，使用多功能酶标仪使用化学发光的检测程序进行读数。
4.一种使用化学发光方法定量检测IFN-γ浓度的检测试剂盒：其特征在于：所述试剂盒包括96孔板、包被蛋白、检测抗体、化学发光检测试剂，所述试剂盒是以96孔板为固相载体。
5.根据权利要求4所述的一种使用化学发光方法定量检测IFN-γ浓度的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的包被蛋白可以是重组受体蛋白或者重组抗体；所述试剂盒采用酶直接或者间接和检测抗体结合，使用酶特异性的化学发光底物进行化学发光的检测。
6.根据权利要求5所述的一种使用化学发光方法定量检测IFN-γ浓度的检测试剂盒，其特征在于，所述酶是但不限于HRP、luciferase，对应底物为该酶的化学发光底物。
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115839945A (zh) * | 2023-02-13 | 2023-03-24 | 上海索昕生物科技有限公司 | 用于光激化学发光检测的感光微球 |
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