CN102998465A - 血管紧张素ⅰ磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种血管紧张素Ⅰ磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒，所述试剂盒包括：Ang Ⅰ校准品；偶联有链霉亲和素的磁微粒悬浮液；生物素标记的Ang Ⅰ抗体；Ang Ⅰ酶结合物，所用的酶为辣根过氧化物酶，辣根过氧化物酶纯度RZ≥3.0，活性≥250U/mL；Ang Ⅰ质控品；化学发光液A液和B液；20倍浓缩洗液；反应管。另外本发明还公开了本发明试剂盒的制备方法。本发明试剂盒与现有试剂盒相比操作简便，安全无环境污染。此外，本发明还具有检测样品的浓度范围宽、成本低、稳定性好等优点。

Description

血管紧张素Ⅰ磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒及其制备方法

技术领域

本发明涉及免疫分析医学领域，具体的，本发明提供了一种血管紧张素Ⅰ（AngⅠ）磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒及其制备方法。

背景技术

血管紧张素Ⅰ是由肾素作用于血管紧张素原转变而来，因此可反映肾素活性。肾素-血管紧张素-醛固酮***对维持血压、水和电解质平衡、内环境稳定起重要作用。

血管紧张素Ⅰ能刺激肾上腺髓质分泌肾上腺素，它直接收缩血管的作用不明显；可促进肾上腺皮质分泌醛固酮，醛固酮作用于肾小管，起保钠、保水、排钾作用，从而引起血量增多，血压升高，临床上血管紧张素Ⅰ对高血压的诊断与分型，以及评估冠心病、心力衰竭等疾病的严重程度和预后都有重要意义。

目前，测定血管紧张素Ⅰ的方法有放射性免疫法、酶联免疫法、化学发光免疫分析等，例如RIA存在放射性污染、标记物半衰期短、对操作者具有放射性损伤，且操作繁琐，时间长等缺点；而ELISA灵敏度低，检测范围窄；化学发光免疫分析（CLIA）是当今最为敏感的微量免疫测定法，本试剂盒将化学发光免疫分析和磁微粒技术结合，与以微孔板为固相载体的Ang Ⅰ化学发光试剂盒相比，具有以下优势：（1）以磁微粒为固相载体，大大增加了抗体的有效包被量，节约了抗体的用量，从而节约了成本；（2）以磁微粒为固相载体包被抗体，增加了抗原-抗体的接触面积，及发光面积，提高了反应的灵敏度；（3）反应在液相中进行，且利用旋转磁场使磁微粒其搅拌作用，大大缩短了反应时间；（4）在反应过程中引入了生物素-亲和素***（biotin-avidin system，BAS），它是70年代末发展起来的一种新型反应放大***，由于具有与标记试剂高亲和力的牢固结合、多级放大效应，使其具有灵敏度高、特异性好、稳定性高的特点，目前已成为广泛用于微量抗原、抗体定性、定量检测及定位观察研究的新技术。现有国外化学发光免疫分析试剂盒为封闭式全自动化学发光测量***，需要昂贵的全自动化学发光测量仪，从而限制了推广使用，无法广泛地应用于临床诊断和科研工作。尤其是还没有关于血管紧张素Ⅰ磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒广泛用于医疗领域。

发明内容

本发明要解决的问题是提供Ang Ⅰ的磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒及其制备方法，避免了放射性免疫分析的试剂有效期短、存在放射性污染、操作繁琐等缺点，且解决了灵敏度低，检测范围窄，成本高的缺陷。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：血管紧张素Ⅰ磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒，包括：Ang Ⅰ校准品，Ang Ⅰ校准品的梯度农素分别为0，0.8，2，10，20，50ng/mL，稀释液是50%牛血清；偶联有链霉亲和素的磁微粒悬浮液；生物素标记的Ang Ⅰ抗体；Ang Ⅰ酶结合物，所用的酶为辣根过氧化物酶，辣根过氧化物酶纯度RZ≥3.0，活性≥250U/mL；Ang Ⅰ质控品；化学发光液A液和B液；20倍浓缩洗液；反应管。

进一步，所述的发光液A液的主要成分为鲁米诺，B液的主要成分是过氧化脲。A液为0.7g/L鲁米诺，0.165g/L对碘酚，缓冲液为pH8.6的5mmol/L Tris·HCl，避光保存；B液为0.675g/L过氧化脲，用工艺用水配制。

进一步，所述的磁微粒是表面包裹带有氨基或羧基活性基团的四氧化三铁，粒径1-2um。

进一步，所述的Ang Ⅰ质控品包括低值质控品和高值质控品，低值质控品和高值质控品的允许范围分别为4.16～6.24ng/mL和11.6～17.4ng/mL。

进一步，所述的反应管的材料是透明聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯或玻璃。

试剂盒的制备方法，包括以下步骤：

（1）Ang Ⅰ校准品的配制：

将Ang Ⅰ纯品用50%牛血清稀释成系列梯度，浓度分别为0，0.8，2，10，20，50ng/mL；

（2）Ang Ⅰ质控品的配制：

将Ang Ⅰ抗原用含有50%牛血清配制低值质控品和高值质控品，其允许范围分别为4.16～6.24ng/mL和11.6～17.4ng/mL；

（3）磁性颗粒-链霉亲和素悬浮液的制备：

取100mL0.1mol/L 2-吗啉乙磺酸溶液（MES溶液），依次加入10mg磁性颗粒和3mg链酶亲和素（SA），搅拌30min，然后加入10mg/mL碳二亚胺盐酸盐溶液（1-乙基-(3-二甲基氨基丙基，EDC)3.5uL，反应1h后，使用磁力架吸附，静止10min，移去液体，加入10mL 0.01mol/L PBS，重复上述过程，共洗涤3次，最后用0.01mol/L PBS定溶至1L即可。

（4）生物素标记的Ang Ⅰ抗体的制备

取0.5mg Ang Ⅰ抗体，用硼酸盐缓冲液在2～8℃下透析1～3h；将透析后的抗体加入25ug生物素，同时加入二甲基亚砜，最终浓度为10%，避光反应3h，缓慢振荡；在上述溶液中加入250uL1mol/L氯化铵溶液，常温避光反应30～60min；用0.01mol/L PBS溶液在2～8℃下透析2天，期间换液3～5次；

（5）Ang Ⅰ酶结合物的制备

采用高碘酸钠氧化法将Ang Ⅰ与辣根过氧化物酶进行偶联后，用酶稀释液将其稀释至工作浓度1:8000，并加入5-20%酶稳定剂，储存于2~8℃；酶稳定剂是一种可以保持蛋白质在冻干或溶液下保持天然折叠构想的试剂，有利于抗原或抗体的保存，避免外界因素如温度、pH、盐、金属离子及其他污染物影响其稳定性。

（6）20倍浓缩洗液的配制

20浓缩洗液包括58g/L磷酸氢二钠，5.92g/L磷酸二氢钠，180g/L NaCl，10mL/LTween-20和1‰Proclin300；

（7）化学发光液A液和B液的配制

A液为0.7g/L鲁米诺，0.165g/L对碘酚，缓冲液为5mmol/L Tris·HCl（pH8.6）；B液为0.675g/L过氧化脲，用工艺用水配制。

（8）组装：将上述试剂组装成盒，储存于2~8℃。

（9）对采用该方法制备的试剂盒的进行物理检查，准确度、剂量-反应曲线的线性、精密度、特异性、灵敏度、质控品的测定值和稳定性进行测定。

本发明的原理是，本试剂盒采用竞争法原理测定血清或血浆中的Ang Ⅰ，在亲和素-磁微粒悬浮液中加入生物素-Ang Ⅰ抗体结合物，通过亲和素和生物素的亲和反应，形成磁微粒-亲和素-生物素-Ang Ⅰ抗体复合物，加入样本和酶结合物后，酶结合物与样本中的Ang Ⅰ竞争结合磁微粒表面的Ang Ⅰ抗体，形成磁微粒-亲和素-生物素-Ang Ⅰ抗体-Ang Ⅰ-Ang Ⅰ抗体-HRP复合物，用磁场将复合物吸附在试管底部，清洗掉游离的成分，加入底物工作液，在氧化剂作用下，HRP催化鲁米诺生成处于激发态的氨基邻苯二甲酸离子，其恢复到基态时，释放出425nm的光子，于第5分钟测定各加样孔的发光值（RLU）。样本的发光值与样本中Ang Ⅰ浓度呈负相关。样本中的Ang Ⅰ浓度依据由校准品Ang Ⅰ浓度和对应的RLU建立的Log（X）-Logit（Y）数学模型进行定量，从而检测人血清、血浆中的Ang Ⅰ含量。

本专利发明的血管紧张素Ⅰ（Ang Ⅰ）磁微粒化学发光免疫定量测定试剂盒，具有以下优点：（1）反应快速，可在40分钟内判断检测结果；操作简便，无污染。（2）灵敏度高，本试剂盒的分析灵敏度不高于0.05ng/mL。（3）特异性强，本产品对血管紧张素Ⅱ、血管紧张素1-7的交叉特异性均小于0.1%。（4）精密度良好，精密度不高于10%。（5）稳定性良好，本产品在37℃可存放7天以上，在2～8℃可存放1年。（6）成本低，与市场上同类产品比较，本试剂盒性能良好，成本低，具有临床应用价值。（7）本试剂盒与管式化学发光仪配套使用，在样本测定过程中灵活性更好。

附图说明

图1是本发明的博奥赛斯化学发光试剂盒测定Ang Ⅰ与放免试剂盒测定Ang Ⅰ的测定结果比较图，其中纵坐标为博奥赛斯测得的Ang Ⅰ值，横坐标为放免试剂盒测定AngⅠ值，两种方法相关系数（r）=0.9891，直线方程y=0.9993x+0.0053

具体实施方式

实施例1：制备血管紧张素Ⅰ（Ang Ⅰ）磁微粒化学发光免疫定量测定试剂盒Ⅰ

（1）Ang Ⅰ校准品的配制：

将Ang Ⅰ纯品用50%牛血清稀释成系列梯度，浓度分别为0，0.8，2，10，20，50ng/mL；

（2）Ang Ⅰ质控品的配制：

将Ang Ⅰ抗原用含有50%牛血清配制低值质控品和高值质控品，其浓度分别为4.16ng/mL和17.4ng/mL；

（3）磁性颗粒-链霉亲和素悬浮液的制备：

取100mL0.1mol/L 2-吗啉乙磺酸溶液（MES溶液），依次加入10mg磁性颗粒和3mg链酶亲和素（SA），搅拌30min，然后加入10mg/mL碳二亚胺盐酸盐溶液（1-乙基-(3-二甲基氨基丙基，EDC)3.5uL，反应1h后，使用磁力架吸附，静止10min，移去液体，加入10mL 0.01mol/L PBS，重复上述过程，共洗涤3次，最后用0.01mol/L PBS定溶至1L即可。

（4）生物素标记的Ang Ⅰ抗体的制备

取0.5mg Ang Ⅰ抗体，用硼酸盐缓冲液在2～8℃下透析3h；将透析后的抗体加入25ug生物素，同时加入二甲基亚砜，最终浓度为10%，避光反应3h，缓慢振荡；在上述溶液中加入250uL1mol/L氯化铵溶液，常温避光反应30min；用0.01mol/L PBS溶液在2～8℃下透析2天，期间换液3次；

（5）Ang Ⅰ酶结合物的制备

采用高碘酸钠氧化法将Ang Ⅰ与辣根过氧化物酶进行偶联后，用酶稀释液将其稀释至工作浓度1:8000，并加入5%酶稳定剂，储存于2~8℃；酶稳定剂使用SurModics In VitroTechnologies的蛋白稳定剂产品。

（6）20倍浓缩洗液的配制

20浓缩洗液包括58g/L磷酸氢二钠，5.92g/L磷酸二氢钠，180g/L NaCl，10mL/LTween-20和1‰Proclin300；

（7）化学发光液A液和B液的配制

A液为0.7g/L鲁米诺，0.165g/L对碘酚，缓冲液为pH8.6的5mmol/L Tris·HCl，避光保存；B液为0.675g/L过氧化脲，用工艺用水配制；A液和B液在使用前5min混合；

（8）组装：将上述试剂组装成盒，储存于2~8℃；

（9）对采用该方法制的的试剂盒的进行物理检查，准确度、剂量-反应曲线的线性、精密度、特异性、灵敏度、质控品的测定值和稳定性进行测定。

说明：

1）物理检查：液体组分应澄清，无沉淀或絮状物；其他组分应无包装破损。

2）准确性：试剂盒校准品与企业标准品系列同时进行分析测定，用双对数数学模型拟合，要求两条剂量-反应曲线不明显偏离平行（t检验，|t|<2.447）；以Ang Ⅰ企业标准品为对照品，用双对数数学模型拟合，试剂盒校准品的实测值与标示值比值的平均值应在0.90~1.10范围内。

3）剂量-反应曲线的线性：用双读数数学模型拟合，剂量-反应曲线在0-50ng/mL浓度范围内相关系数r绝对值不低于0.9900。

4）分析灵敏度：试剂盒分析灵敏度不高于0.05ng/mL。

5）精密度：精密度（CV%）应不高于10%。

6）质控品的测定值：平行测定10孔高值和低值的质控品，用Log(X)-Logit(Y)数学模型拟合，质控品测值应在允许范围内，QcL和QcH的允许范围分别为4.16～6.24ng/mL和11.6～17.4ng/mL。

7）特异性：

交叉反应符合下表要求：

（8）稳定性：37℃放置7天，测定值应符合上述各项要求。

实施例2：制备血管紧张素Ⅰ（Ang Ⅰ）磁微粒化学发光免疫定量测定试剂盒Ⅱ

（1）Ang Ⅰ校准品的配制：

将Ang Ⅰ纯品用50%牛血清稀释成系列梯度，浓度分别为0，0.8，2，10，20，50ng/mL；

（2）Ang Ⅰ质控品的配制：

将Ang Ⅰ抗原用含有50%牛血清配制低值质控品和高值质控品，其浓度分别为6.24ng/mL和11.6ng/mL；

（3）磁性颗粒-链霉亲和素悬浮液的制备：

取100mL0.1mol/L 2-吗啉乙磺酸溶液（MES溶液），依次加入10mg磁性颗粒和3mg链酶亲和素（SA），搅拌30min，然后加入10mg/mL碳二亚胺盐酸盐溶液（1-乙基-(3-二甲基氨基丙基，EDC)3.5uL，反应1h后，使用磁力架吸附，静止10min，移去液体，加入10mL 0.01mol/L PBS，重复上述过程，共洗涤3次，最后用0.01mol/L PBS定溶至1L即可。

（4）生物素标记的Ang Ⅰ抗体的制备

取0.5mg Ang Ⅰ抗体，用硼酸盐缓冲液在2～8℃下透析1h；将透析后的抗体加入25ug生物素，同时加入二甲基亚砜，最终浓度为10%，避光反应3h，缓慢振荡；在上述溶液中加入250uL1mol/L氯化铵溶液，常温避光反应60min；用0.01mol/L PBS溶液在2～8℃下透析2天，期间换液5次；

（5）Ang Ⅰ酶结合物的制备

采用高碘酸钠氧化法将Ang Ⅰ与辣根过氧化物酶进行偶联后，用酶稀释液将其稀释至工作浓度1:8000，并加入20%酶稳定剂，储存于2~8℃；酶稳定剂使用SurModics In VitroTechnologies的蛋白稳定剂产品。

（6）20倍浓缩洗液的配制

20浓缩洗液包括58g/L磷酸氢二钠，5.92g/L磷酸二氢钠，180g/L NaCl，10mL/LTween-20和1‰Proclin300；

（7）化学发光液A液和B液的配制

A液为0.7g/L鲁米诺，0.165g/L对碘酚，缓冲液为pH8.6的5mmol/L Tris·HCl，避光保存；B液为0.675g/L过氧化脲，用工艺用水配制；A液和B液在使用前5min混合；

（8）组装：将上述试剂组装成盒，储存于2~8℃；

（9）对采用该方法制的的试剂盒的进行物理检查，准确度、剂量-反应曲线的线性、精密度、特异性、灵敏度、质控品的测定值和稳定性进行测定。

实施例3：制备血管紧张素Ⅰ（Ang Ⅰ）磁微粒化学发光免疫定量测定试剂盒Ⅲ

（1）Ang Ⅰ校准品的配制：

将Ang Ⅰ纯品用50%牛血清稀释成系列梯度，浓度分别为0，0.8，2，10，20，50ng/mL；

（2）Ang Ⅰ质控品的配制：

将Ang Ⅰ抗原用含有50%牛血清配制低值质控品和高值质控品，其浓度分别为5.2ng/mL和13.8ng/mL；

（3）磁性颗粒-链霉亲和素悬浮液的制备：

取100mL0.1mol/L 2-吗啉乙磺酸溶液（MES溶液），依次加入10mg磁性颗粒和3mg链酶亲和素（SA），搅拌30min，然后加入10mg/mL碳二亚胺盐酸盐溶液（1-乙基-(3-二甲基氨基丙基，EDC)3.5uL，反应1h后，使用磁力架吸附，静止10min，移去液体，加入10mL 0.01mol/L PBS，重复上述过程，共洗涤3次，最后用0.01mol/L PBS定溶至1L即可。

（4）生物素标记的Ang Ⅰ抗体的制备

取0.5mg Ang Ⅰ抗体，用硼酸盐缓冲液在2～8℃下透析23h；将透析后的抗体加入25ug生物素，同时加入二甲基亚砜，最终浓度为10%，避光反应3h，缓慢振荡；在上述溶液中加入250uL1mol/L氯化铵溶液，常温避光反应50min；用0.01mol/L PBS溶液在2～8℃下透析2天，期间换液4次；

（5）Ang Ⅰ酶结合物的制备

采用高碘酸钠氧化法将Ang Ⅰ与辣根过氧化物酶进行偶联后，用酶稀释液将其稀释至工作浓度1:8000，并加入15%酶稳定剂，储存于2~8℃；酶稳定剂使用SurModics In VitroTechnologies的蛋白稳定剂产品。

（6）20倍浓缩洗液的配制

20浓缩洗液包括58g/L磷酸氢二钠，5.92g/L磷酸二氢钠，180g/L NaCl，10mL/LTween-20和1‰Proclin300；

（7）化学发光液A液和B液的配制

A液为0.7g/L鲁米诺，0.165g/L对碘酚，缓冲液为pH8.6的5mmol/L Tris·HCl，避光保存；B液为0.675g/L过氧化脲，用工艺用水配制；A液和B液在使用前5min混合；

（8）组装：将上述试剂组装成盒，储存于2~8℃；

（9）对采用该方法制的的试剂盒的进行物理检查，准确度、剂量-反应曲线的线性、精密度、特异性、灵敏度、质控品的测定值和稳定性进行测定。

实施例4：本发明试剂盒的使用方法

（1）将待检试剂盒在室温（18~25℃）下平衡30分钟。

（2）配制洗液：用蒸馏水将浓缩洗液按1:20稀释（1mL洗液加19mL蒸馏水）。若浓缩洗液有结晶，可将浓缩洗液置于室温或37℃待结晶溶解后再进行稀释。

（3）配制发光液：使用前5分钟取适量发光液A与发光液B等体积混合。

（4）将反应管编号，向试管中依次加入10-50uL校准品或血清标本、100uL磁性颗粒-链霉亲和素悬浮液、100uL生物素-Ang Ⅰ抗体结合物、100uLAng Ⅰ酶结合物，37℃下振荡反应10-30min，将试管架置于磁分离器上分离5min，然后倒出上清液，加入500uL洗液，充分混匀后，于磁分离器上分离，倒出洗液，重复3次，在各管中加入化学发光底物液200-400uL，充分混匀，暗置5min，在管式化学发光仪上测定各管的发光值（RLU），以校准品浓度的Log值为横坐标，以发光值的Logit为纵坐标，绘制标准曲线，根据血清标本的发光值即可计算出Ang Ⅰ的浓度。

实施例5本试剂盒的方法学评价结果

实施例6本试剂盒的临床对比实验

本专利发明的试剂盒已进行了临床考核，本次临床试验的样本总数110例，先以AngⅠ放射性免疫试剂盒测试后，再用本专利发明的试剂盒（化学发光）进行测定，结果表明，直线方程为y=0.9993x+0.0053，相关系数为R=0.9533。可见本方法制备的试剂盒与医院测值有较好的一致性。以SPSS13.0统计分析软件对两种方法的Ang Ⅰ测值进行t检验（检验水准α=0.05），t=0.059，P=0.953，P>0.05，差别无统计学意义，可见两种方法测定的Ang Ⅰ值密切相关。灵敏度（真阳性率）为96.00%、特异性（真阴性率）为97.93%，都较高；而假阳性率（误诊率）为2.07%、假阴性率（漏诊率）为4.00%，都较低，可见本试剂盒的测量值与实际值（原测值）的符合程度良好。粗一致性反映试剂盒诊断病人与非病人的能力，本试剂盒的粗一致性为97.27%，接近于1，说明试剂盒的诊断能力较强。

为了确定本试剂盒的临床参考值，对589份正常人血清、血浆样本采用本试剂盒进行了检测，结果表明本试剂盒的参考值（参考范围）为0.3~5.1ng/mL。

Claims (6)

1.血管紧张素Ⅰ磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：

1）Ang Ⅰ校准品，Ang Ⅰ校准品梯度浓度分别为0，0.8，2，10，20，50ng/mL，校准品稀释液是50%牛血清；

2）偶联有链霉亲和素的磁微粒悬浮液；

3）生物素标记的Ang Ⅰ抗体；

4）Ang Ⅰ抗体酶结合物，所用的酶为辣根过氧化物酶，辣根过氧化物酶纯度RZ≥3.0，活性≥250U/mL；

5）Ang Ⅰ质控品；

7）20倍浓缩洗液；

8）反应管。

2.根据权利要求1所述的血管紧张素Ⅰ磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒，其特征在于，所述的发光液A液的主要成分为鲁米诺，B液的主要成分是过氧化脲。

3.根据权利要求1所述的血管紧张素Ⅰ磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒，其特征在于，所述的磁微粒是表面包裹带有氨基或羧基活性基团的四氧化三铁，粒径1-2um。

4.根据权利要求1所述的血管紧张素Ⅰ磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒，其特征在于，所述的Ang Ⅰ质控品包括低值质控品和高值质控品，低值质控品和高值质控品的允许范围分别为4.16～6.24ng/mL和11.6～17.4ng/mL。

5.根据权利要求1所述的血管紧张素Ⅰ磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒，其特征在于，所述的反应管的材料是透明聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯或玻璃。

6.一种制备所述权利要求1的试剂盒的方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）Ang Ⅰ校准品的配制：

将Ang Ⅰ纯品用50%牛血清稀释成系列梯度，浓度分别为0，0.8，2，10，20，50ng/mL；

（2）Ang Ⅰ质控品的配制：

将Ang Ⅰ抗原用含有50%牛血清配制低值质控品和高值质控品，低值质控品和高值质控品允许范围分别为4.16～6.24ng/mL和11.6～17.4ng/mL；

（3）磁性颗粒-链霉亲和素悬浮液的制备：

取100mL0.1mol/L 2-吗啉乙磺酸溶液，依次加入10mg磁性颗粒和3mg链酶亲和素，搅拌30min，然后加入10mg/mL碳二亚胺盐酸盐溶液3.5uL，反应1h后，使用磁力架吸附，静止10min，移去液体，加入10mL 0.01mol/L PBS，重复上述过程，共洗涤3次，最后用0.01mol/L PBS定溶至1L即可；

（4）生物素标记的Ang Ⅰ抗体的制备

取0.5mg Ang Ⅰ抗体，用硼酸盐缓冲液在2～8℃下透析1～3h；将透析后的抗体加入25ug生物素，同时加入二甲基亚砜，最终浓度为10%，避光反应3h，缓慢振荡；在上述溶液中加入250uL1mol/L氯化铵溶液，常温避光反应30～60min；用0.01mol/L PBS溶液在2～8℃下透析2天，期间换液3～5次；

（5）Ang Ⅰ酶结合物的制备

采用高碘酸钠氧化法将Ang Ⅰ与辣根过氧化物酶进行偶联后，用酶稀释液将其稀释至工作浓度1:8000，并加入5-20%酶稳定剂，储存于2~8℃；

（6）20倍浓缩洗液的配制

20浓缩洗液包括58g/L磷酸氢二钠，5.92g/L磷酸二氢钠，180g/L NaCl，10mL/LTween-20和1‰Proclin300；

（7）化学发光液A液和B液的配制

A液为0.7g/L鲁米诺，0.165g/L对碘酚，缓冲液为pH8.6的5mmol/L Tris·HCl，避光保存；B液为0.675g/L过氧化脲，用工艺用水配制；A液和B液在使用前5min混合；

（8）组装：将上述试剂组装成盒，储存于2~8℃；

（9）对采用该方法制的的试剂盒的进行物理检查，准确度、剂量-反应曲线的线性、精密度、特异性、灵敏度、质控品的测定值和稳定性进行测定。

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