附图简要说明
图1显示人ER的氨基酸序列。图1(a)显示人ER-α66的氨基酸序列。图1(b)显示人ER-α46的氨基酸序列。
图2显示纯化的SNGmB1抗体的质量控制(QC)结果。使用带有重组ER-α36蛋白作为免疫原的杂交瘤技术生成了SNGmB1(mlgG2b)的单克隆抗体。所述的杂交瘤在其基因克隆之前亚克隆了三次。
图3显示SNGmB1的结合特异性。“Fc-LBD”表示Fc和包括C-末端27个氨基酸的ER-α36配体结合域的融合蛋白;“Fc-LBD-D27”表示删除C-末端27个氨基酸的Fc-LBD。“Fc-ER66”表示Fc和ER-α66配体结合域的融合蛋白。“多肽”表示源自ER-α36的F域C-末端的27个氨基酸。“人lgG”表示对照人lgG蛋白,净浓度=10μg/ml。
图4通过免疫印迹法显示SNGmB1的结合特异性。使用以下裂解物:1)亲本HEK293细胞(“P”);2)用pcDNA3.1_ER-α36带有Myc-标签(“E”)全长蛋白转染的HEK293细胞;3)MDA-MB-231(“231”);4)MCF-7;5)Hec-1A;6)K562。
图5显示如流式细胞分析(FACS)检测到的SNGmB1与表达在K562(图5A)细胞表面、MCF7(图5B)细胞表面、SKBR3(图5C)细胞表面、MHCC97H(图5D)细胞表面、3T3诱导的细胞系(图5E)细胞表面的ER-α36的结合。在FACS的分析,SNGmB1抗体表现出了与K-562的结合呈剂量依赖性。鼠IgG2b用于同型对照。
图6显示SNGmB1结合MCF7衍生的成球细胞及其对MCF7成球细胞形成的免疫荧光分析。图6A显示SNGmB1能够检测MCF7上的膜结合ER-α36,如荧光信号所示。图6B显示图6A的量化荧光强度。图6C显示SNGmB1抗体能够抑制MCF7成球细胞的形成和生长。图6D显示SNGmB1抗体能够以不同的浓度抑制MCF7成球细胞的形成和增长。
图7显示SNGmB1在K-562细胞内的时间依赖内化。%内化=(Qn-Qo)/(Nn-Qo);Qn=淬火后,样品在特定时间点的MFI(平均荧光强度);Nn=未经淬火,在特定时间点取样的MFI;Qo=淬火后,样品仅在冰上培养0小时的MFI。
图8显示生物大分子相互作用分析(biacoreassay)模式。芯片表面覆盖捕获受检抗体的抗鼠FCIgG,并且GV27多肽(即:SEQIDNO:2)注入其表面使受检抗体竞争结合。覆盖有IgG而没有受检抗体的芯片作为对照。
图9显示通过丙氨酸扫描的表位图谱。检测了SNGmB1与包括C-末端27个氨基酸的ER-α36衍生的一系列突变肽的结合。
图10显示抗-ERa-36抗体与ER-α36的结合。图10A显示人源化的抗体SNGHZD(C1L+C6H)与ER-α36的结合,并且图10B显示人源化的抗体SNGHZD(C2L+C5H)的结合。“Fc-LBD”、“Fc-LBD-D27”、“Fc-ER66”、“肽”和“人lgG”表示如说明书对图3定义的相同制剂。图10C到图10D显示如酶联免疫吸附法(ELISA)检测的杂交瘤衍生的鼠SNGmB1(C)抗体、嵌合SNGhB1(D)和人源化SNGHZD分别与SNGmB1抗体竞争结合ER-α36。平板分别覆盖SNGmB1、SNGhB1和SNGHZD,接着添加生物素化的GV27肽和竞争抗体(即,抗体104c3F8,其是结合不同表位的抗-ERα-36的抗体、抗体SNGmB1或者对照IgG)。图10F显示SNGmB1不同的人源化变异体,与SNGmB1抗体竞争结合ER-α36。HZD-B1表示SNGmB1的人源化变异体,HBD-F8表示人源化的104c3F8,HBD-B1表示产生SNGmB1的杂交瘤,鼠lgG表示阴性对照抗体。
图11显示通过使用免疫组织化学方法用SNGmB1抗体检测的人组织样品中在浸润前沿(A)和***转移(B)中的ER-α36的表达。
图12显示SNGmB1在BCAP37异种移植小鼠模型体内以剂量依赖方式抑制肿瘤细胞的增长。
图13显示如式(VII)所示的Ab-mc-vc-PAB-MMAE和SNGmB1的疏水作用色谱-高效液相(HIC-HPLC)色谱图。
图14a显示SNGmB1的分子筛-高效液相(SEC-HPLC)色谱图。
图14b显示如式(VII)所示的Ab-mc-vc-PAB-MMAE的SEC-HPLC色谱图。
图15显示如式(VII)所示的Ab-mc-MMAF和SNGmB1的HIC-HPLC色谱图。
图16显示如式(VII)所示Ab-mc-MMAF的SEC-HPLC色谱图。
图17显示如式(IX)所示的Ab-SMCC-DM1和SNGmB1的HIC-HPLC色谱图。
图18显示如式(IX)所示的Ab-SMCC-DM1和SNGmB1的SEC-HPLC色谱图。
图19显示如式(X)所示的Ab-SPDB-DM4和SNGmB1的HIC-HPLC色谱图。
图20显示如式(X)所示的Ab-SPDB-DM4的SEC-HPLC色谱图。
图21显示如式(XI)所示的MB-vc-倍癌霉素(duocarmycin)和SNGmB1的HIC-HPLC色谱图。
图22显示如式(XI)所示的MB-vc-倍癌霉素(duocarmycin)和SNGmB1的SEC-HPLC色谱图。
图23显示分别用不同浓度的不同ADC治疗的癌症细胞系PLC的活力检测结果。
图24显示分别用不同浓度不同ADC治疗的癌症细胞系SUM159的活力检测结果。
图25显示通过赋形剂、对照lgG和SNGmB1给药的肺肿瘤细胞的转移。
图26a显示在对照lgG治疗后,向荷瘤裸鼠施予它莫昔芬的肺转移灶的ALDH1免疫组化图。
图26b显示在SNGmB1治疗后,向荷瘤裸鼠施予它莫昔芬的肺转移灶的ALDH1的免疫组化图。
发明详述
本发明以下描述仅仅用于说明本发明的各种实施方式。例如,所讨论的特定的修改不能解释为对本发明范围的限制。对本领域技术人员而言显而易见的是,可以做出的多种等同、变化和修改而不偏离本发明的保护范围,并且可以理解这些等同的实施方式将包括于本文之中。本文引用的所有参考文献,包括公开文件、专利和专利申请都以全部参考的方式引入本文。
本文所用的术语“抗体”包括任意单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体、结合特异抗原的双特异性抗体(二价)抗体。完整的抗体包括两条重链和两条轻链,每条重链包括可变区和第一、第二和第三恒定区,而每条轻链包括可变区和恒定区。哺乳动物重链分类为α、δ、ε、γ和μ,并且哺乳动物轻链分类为λ或κ。所述的抗体具有"Y"形状,Y的茎部由通过二硫键结合到一起的两条重链的第二和第三恒定区构成。Y的每个臂部包括单条重链的可变区和第一恒定区,其与单条轻链的可变区和恒定区相结合。所述的轻链和重链的可变区负责与抗体相结合。两条链的可变区通常包括称为互补决定区(CDR)的三个高变环区(轻(L)链CDR包括LCDR1、LCDR2和LCDR3,重(H)链CDR包括HCDR1、HCDR2、HCDR3)。本文公开的抗体和抗原结合片段的CDR界限可以通过Kabat,Chothia或者Al-Lazikani公约(Al-Lazikani1997;Chothia1985;Chothia1987;Chothia1989;Kabat1987;Kabat1991)定义或者确定。三个CDR通过侧翼向的已知骨架区(FR)截断,骨架区比CDR更保守并且形成了支持高变环区的支架。重链和轻链的恒定区不参与抗原结合,而是呈现了多种效应功能。抗体基于它们重链保守区氨基酸的序列进行分类。五种主要的类别或同型抗体是IgA、IgD、IgE、IgG和IgM,其特征在于分别存在α、δ、ε、γ和μ重链。几种主要抗体类别分配于亚类中,如IgG1(γ1重链)、IgG2(γ2重链)、IgG3(γ3重链)、IgG4(γ4重链)、IgA1(α1重链)或者IgA2(α2重链)。
“二价”抗体或其抗原结合片段包括两个抗原结合位置。所述的两个抗原结合位置可以结合相同的抗原,或者它们各自可以结合到不同抗原,其中所述的抗体或其抗原结合片段描述为“双特异性”。
本文使用的术语“抗原结合片段”指的是例如双价抗体的抗体片段、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段、二硫键稳定的Fv片段(dsFv)、(dsFv)2、双特异性dsFv(dsFv-dsFv')、二硫键稳定的双价抗体(dsdiabody)、单链抗体分子(scFv)、scFv二聚体(二价双价抗体)、通过包括一个或多个CDR的抗体部分形成多特异性抗体、骆驼源化的单域抗体、纳米抗体、域抗体、二价域抗体或能结合抗原但并不包括完整抗体结构的其他抗体片段。抗原结合片段能够结合到与母抗体或母抗体片段(如,母scFV)结合的相同抗原。在一些实施方式中,抗原结合片段可以包括源自特定人抗体的一种或多种CDR移植到来自于一种或多种不同人抗体的骨架区。
关于抗体的“Fab”指的是由通过二硫键结合到单条重链可变区和第一恒定区的单条轻链(可变区和恒定区)构成的抗体部分。
“Fabˊ”指的是包括铰链区部分的Fab片段。
“F(abˊ)2”指的是Fab’的二聚体。
关于抗体“Fc”指的是由通过二硫键结合到第二重链第二和第三恒定区的第一重链第二和第三恒定区构成的抗体部分。抗体的Fc部分承担了多种效应功能,例如ADCC和CDC,而不起到与抗原结合的功能。
关于抗体“Fv”指的是承担完整抗原结合位置的抗体最小片段。Fv片段由与单条重链可变区相结合的单条轻链可变区构成。
“单链Fv抗体”或“scFv”指的是由相互直接相连或者通过肽连接子序列相连的轻链可变区和重链可变区构成的基因工程抗体。(Houston1988)
“单链Fv-Fc抗体”或“scFv-Fc”指的是由连接到抗体Fc区的scFv构成的基因工程抗体。
“骆驼源化单域抗体”、“重链抗体”或“HCAb”指的是包括两个VH域且并不包括轻链的抗体(Riechmann1999;Muyldermans2001;WO94/04678;WO94/25591;美国专利号6,005,079)。重链抗体最初源自骆驼科(骆驼、单峰骆驼和美洲驼)。虽然缺少轻链,骆驼源化抗体有真正的抗原-结合完整功能(Hamers-Casterman1993;Nguyen2002;Nguyen2003)。重链抗体可变域(VHH域)表示通过适应性免疫应答产生的最小的已知抗原结合单位。(Koch-Nolte2007)
“纳米抗体”指的是由源自重链抗体的VHH和两个恒定区CH2和CH3构成的抗体片段。
“双价抗体”包括具有两个抗原结合位置的小抗体片段,其中所述的片段包括连接到相同肽链(VH-VL或VH-VL)VL域的VH域(参见,如Holliger1993;EP404097;WO93/11161)。通过使用太短难以在相同链的两个域之间进行配对的连接子,所述的域被迫与另一链的互补域相配对,因此创造两个抗原结合位置,所述的抗原结合位置可以靶向不同抗原(或表位)的相同位置。
“域抗体”指的是仅包括重链的可变区或轻链的可变区的抗体片段。在一些实施方式中,两个或更多的VH域共价地与肽连接子相结合从而形成二价或多价域抗体。所述的二价域抗体的二VH域可以靶向相同或不同的抗原。
在一些实施方式中,"(dsFv)2"包括三个肽链:两个VH部分通过肽连接子相连并且通过二硫键桥接到两个VL分子。
在一些实施方式中,“双特异性抗体”和“双价抗体”包括VH1-VL2(通过肽连接子相连)通过在VH1和VL1之间的二硫键接结合到VL1-VH2(也通过肽连接子相连)。
在一些实施方式中,“双特异性dsFv”或“dsFv-dsFv”包括三个肽链:VH1-VH2部分,其中重链通过肽连接子连接(如,长的柔性连接子)并通过二硫键分别结合到VL1和VL2部分,其中每个二硫键配对的重链和轻链有不同的抗原特异性。
在一些实施方式中,“scFv二聚体”是二价双价抗体或包括VH-VL(通过肽连接子相连)与另一VH-VL部分形成二聚体的二价ScFv(BsFv),从而一个部分的VH'与另一个部分的VL'相配合并形成能够靶向相同抗原(或表位)或不同抗原(或表位)的两个结合位置。在另一实施方式中,“scFv二聚体”是包括VH1-VL2(通过肽连接子连接)与VL1-VH2(也通过肽连接子连接)相连的双特异性双价抗体,从而VH1和VL1相配合并且VH2和VL2相配合,并且每个配对具有不同的抗原特异性。
本文使用的术语“表位”指的是与抗体相结合的抗原上特定的原子组或氨基酸组。如果两个抗体对抗原呈现竞争性,它们可以结合抗原上的相同的表位。例如,如本文公开的抗体或其抗原结合片段与SNGmB1对ER-α36的结合产生竞争性,所述的抗体可以而不是必然地认为结合如SNGmB1相同的表位。
本文使用的"ER"指的是几种已知的***受体中的一种,ER-α66、ER-α46或者ER-α36。人ER-α全长确定为具有595氨基酸的66kDa蛋白被称为hER-α66(图1(a))。hER-α66由三个独立的并不影响的功能域构成:N-末端A/B域、C或DNA-结合域和D/E/F或者配体结合域(参见美国申请号10/591,199,其引入本文作为参考)。所述ER-α66的N-末端域编码配体-独立激活功能(AF-1),编码参于与共激活因子作用和靶基因的转录活动区。所述的DNA-结合域或C域包括两个锌指状结构,其在与受体二聚化并且结合特定的DNA序列起着重要的作用。所述D/E/F域的C末端是调节配体结合、受体二聚化、核转运和配体依赖转录激活功能(AF-2)的配体结合域。AF-1和AF-2在转录控制发挥的相关贡献随着细胞-特异性和DNA启动子-特异性方面进行变化。(Berry等,EMBOJ.,9:2811(1990)和Tzukerman等,Mol.Endocrin.,8:21(1994))。人ER-α46(hER-α46,图1(b)是hER-α66的剪接变异体,具有分子量46KDa包括412氨基酸,并且缺少hER-α66的N-末端AF-1域。人ER-α36(如SEQIDNO:1列出的hER-α36)是缺少hER-α66的N-末端AF-1域和C-末端AF-2域的36kDa的hER-α变异体。(Wang等.,《生物化学与生物物理研究通讯(Biochem.Biophys.Res.Commun.)336,1023-1027(2005)》,美国申请号10/591,199,WO2005/087811)。然而,hER-α36相较于hER-α66或hER-α46具有其C末端独特添加的27个氨基酸残基。所述的27个氨基酸残基是SEQIDNO.1的从284到310位的氨基酸残基或SEQIDNO.2的从1到27位的氨基酸残基。
本文使用的"ER活性"包括通过ER(例如:hER-α36)诱导的细胞内事件,例如受体磷酸化(如酪氨酸磷酸化),细胞内信号分子与受体或者其他细胞内信号分子结合,启动信号级联和/或启动生物学应答(例如:诱导具有ER细胞(如,hER-α36)的基因表达和生理学的改变或发展(如,增殖))。
本文使用的“癌症”或者“癌症病况”指的是通过肿瘤或者恶性细胞生长、增殖或转移调节的任何医学病况并且包括实体癌和非实体癌,例如白血病。本文使用的“肿瘤”指的是癌症和/或恶性细胞的固体肿块。
本文使用的病况的“进行治疗”或“治疗”,包括预防或缓解病况,降低病况的发生或发展率,减少病况的发展风险,预防或推迟与病况相关的症状发展,降低或结束与病况相关的症状,产生病况完全或部分衰退,治愈一个病况或其多个病况的组合。关于癌症,“进行治疗”或“治疗”包括根除全部或部分肿瘤,抑制或降低肿瘤生长和转移、预防或推迟肿瘤的发展及其结合。
本文使用的术语“特异性结合”指的是两分子之间的非任意结合反应,例如在抗体和抗原之间。在一些实施方式中,特异性结合抗原的抗体或抗原结合片段以亲和力(KD)≤10-6M(例如,≤5x10-7M、≤2x10-7M、≤10-7M、≤5x10-8M、≤2x10-8M、≤10-8M、≤5x10-9M、≤2x10-9M、≤10-9M、10-10M)结合抗原。本文使用的KD指的是离解率和结合率的比率(koff/kon),可以使用本领域已知的方法确定。(例如,使用生物大分子相互作用分析(Biacore)或者高感度测量技术(Kinexa)技术)
“分离”物质已经用人类手工从天然状态进行了改变。如果“分离”的组合物或者物质在自然界发生,它已经从其原始环境中进行了改变和/或去除。例如,天然存在于活体动物的多核苷酸或多肽不是“分离”的,然而如果相同的多核苷酸或多肽已经从其天然状态中的共存物质中得到了充分的分离,从而以实质上纯粹的状态存在,那么它是“分离”的。
本文使用的术语“载体”指的是多核苷酸编码的蛋白可操作***的媒介,从而引起蛋白的表达。载体可以用来转换、转导或者转染宿主细胞从而引起宿主细胞内遗传因素的表达。载体的实例包括质粒、噬粒、粘粒、例如酵母人工染色体(YAC)的人工染色体、细菌人工染色体(BAC)或者P1衍生的人工染色体(PAC),λ噬菌体或者M13噬菌体的细菌噬菌体和动物病毒。用于载体的动物病毒类型包括逆转录病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(例如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、***瘤病毒和***多瘤空泡病毒(例如SV40)。载体可以包括多种用来控制表达的因素,包括启动子序列、转录起始序列、增强子序列、可选择因素和报告基因。另外,载体可以包括复制源。载体也可以包括辅助进入细胞的材料,包括不限于病毒颗粒、脂质体或者蛋白涂层。
本文使用的短语“宿主细胞”指的是引入外源多核苷酸和/或载体的细胞。可以从多种细胞类型选择宿主细胞,包括例如E.coli或者B.subtilis细胞的细菌细胞、如酵母菌细胞或者曲霉细胞的真菌细胞、如DrosophilaS2或者SpodopteraSf9细胞的昆虫细胞、或者如成纤维细胞、CHO细胞、COS细胞、NSO细胞、HeLa细胞、BHK细胞、EK293细胞的动物细胞或人细胞。
本文使用的“与ER或者ER-α36相关或者相联系的疾病”指的是由ER活性(例如:ER-α36)增加或者降低引起的、加重的或者与之相关联的任何病况。这些病况包括通过依赖于ER(如:ER-α36)细胞调解生长、增殖或转移的癌症,骨疾病例如:骨流失、骨折或骨质疏松,以及例如类风湿性关节炎、银屑病、硬皮病、慢性阻塞性肺病或者哮喘的炎性病症。
本文使用的“阻止结合”或者“竞争结合”能力指的是抗体或者抗原结合片段抑制两分子结合相互作用的能力到可以检测程度。在一些实施方式中,阻断两分子之间结合的抗体或抗原结合片段抑制了两分子间结合的相互作用至少50%。在一些实施方式中,这个抑制可以超过60%,在一些实施方式中超过70%,在一些实施方式中超过80%,并且在一些实施方式中超过90%。在一些实施方式中,受到抑制的结合相互作用可以是SNGmB1与hER-α36的结合。
本文使用的术语“治疗有效量”或者“有效剂量”指的是用于治疗与hER-α36相关的疾病或病况的药物有效剂量或浓度。例如,关于本文公开的治疗癌症的抗体或者抗原结合片段的用途,治疗有效量是能够根除全部或者部分肿瘤、抑制或者降低肿瘤增长、抑制调解癌症病况细胞的生长或者增殖、抑制肿瘤细胞转移、减轻任何与肿瘤或者癌症病况相关的任何症状或标志、阻止或者推迟肿瘤或癌症病况发展或者以上结合的抗体或抗原结合片段的剂量或浓度。
术语“药学上可接受”指的是通常化学和/或物理学上与包括制剂和其它成分配伍并与其受体生理上相容的指定载体、赋形剂、稀释剂、辅料和/或盐。
抗hER-α36抗体
一方面,本发明提供了特异性结合SEQIDNO:1的284-310个氨基酸残基,即如SEQIDNO:2所示27个氨基酸片段的抗-hER-α36的抗体和其抗原结合片段。
SEQIDNO:1和SEQIDNO:2的氨基酸序列如下列出。
SEQIDNO:1的氨基酸序列:
MetAlaMetGluSerAlaLysGluThrArgTyrCysAlaValCysAsn
AspTyrAlaSerGlyTyrHisTyrGlyValTrpSerCysGluGlyCys
LysAlaPhePheLysArgSerIleGlnGlyHisAsnAspTyrMetCys
ProAlaThrAsnGlnCysThrIleAspLysAsnArgArgLysSerCys
GlnAlaCysArgLeuArgLysCysTyrGluValGlyMetMetLysGly
GlyIleArgLysAspArgArgGlyGlyArgMetLeuLysHisLysArg
GlnArgAspAspGlyGluGlyArgGlyGluValGlySerAlaGlyAsp
MetArgAlaAlaAsnLeuTrpProSerProLeuMetIleLysArgSer
LysLysAsnSerLeuAlaLeuSerLeuThrAlaAspGlnMetValSer
AlaLeuLeuAspAlaGluProProIleLeuTyrSerGluTyrAspPro
ThrArgProPheSerGluAlaSerMetMetGlyLeuLeuThrAsnLeu
AlaAspArgGluLeuValHisMetIleAsnTrpAlaLysArgValPro
GlyPheValAspLeuThrLeuHisAspGlnValHisLeuLeuGluCys
AlaTrpLeuGluIleLeuMetIleGlyLeuValTrpArgSerMetGlu
HisProGlyLysLeuLeuPheAlaProAsnLeuLeuLeuAspArgAsn
GlnGlyLysCysValGluGlyMetValGluIlePheAspMetLeuLeu
AlaThrSerSerArgPheArgMetMetAsnLeuGlnGlyGluGluPhe
ValCysLeuLysSerIleLeuLeuLeuAsnSerGlyIleSerHisVal
GluAlaLysLysArgIleLeuAsnLeuHisProLysIlePheGlyAsn
LysTrpPheProArgVal
SEQIDNO:2的氨基酸序列
GlyIleSerHisValGluAlaLysLysArgIleLeuAsnLeuHisPro
LysIlePheGlyAsnLysTrpPheProArgVal
本文使用的“抗-hER-α36”抗体指的是阻断hER-α36受体与其配体相结合或者与配体竞争结合hER-α36受体的抗体。
在一些实施方式中,抗-hER-α36抗体和其抗原结合片段特异性结合hER-α36(即:SEQIDNO:1)或包括SEQIDNO:2的hER-α36片段,具有结合亲和力(KD)≤10-6M(如.≤5x10-7M、≤2x10-7M、≤10-7M、≤5x10-8M、≤2x10-8M、≤10-8M、≤5x10-9M、≤2x10-9M、≤10-9M、≤5x10-10M、≤2x10-10M、≤5x10-11M、≤5x10-11M或者≤10-11M)。在一些实施方式中,结合亲和力的范围从10-11M到10-8M、从10-11M到10-9M、从10-11M到10-8M、从10-11M到10-7M、从10-11M到10-6M、从10-10M到10-8M、从10-10M到10-9M、从10-10M到10-8M、从10-10M到10-7M或者从10-10M到10-6M。
所述的结合亲和力可以通过KD值表示,当抗原和抗体分子达到平衡时,该值通过离解率与结合率的比率(koff/kon)计算出来。当难以得到kon测定值时,例如:由于抗原聚集,也可以使用结合平衡时测定离解率(koff)。所述的抗原-结合亲和力(例如:KD或koff)可以使用本领域已知的适合方法适当确定出,包括例如生物大分子相互作用分析(Biacore)(参见,例如,Murphy,M.等,蛋白质科学当前手册(Currentprotocolsinproteinscience),19卷19.14单元,2006)和高感度测量技术(Kinexatechniques)(参见,例如Darling,R.J.,等,药物检测发展技术(AssayDrugDev.Technol.,2(6):647-657(2004))。
在一些实施方式中,本文提供的抗体或其片段拮抗一种或多种hER-α36的ER活性。这种抗体及其片段与hERα36相结合时,不促进一种或多种ER活性,和/或它们能够与ER配体或激动剂竞争受体结合,从而通过ER配体或激动剂促进的ER活性可以得到抑制或拮抗。所述的抗体及其片段对ER的活性可以使用本领域已知的检测测定,例如,通过检测受体磷酸化、检测ER配体或激动剂结合的抑制、检测hER-α36受体的一种或多种生物学效应。实例方法或检测在WO05/087811描述,其全部引入本文。
在一些实施方式中,所述的抗-hER-α36抗体及其抗原结合片段可以被表达hER-α36的细胞内化。抗体的内化可以通过例如在一定时间孵化表达标记抗-hER-α36抗体的hER-α36的细胞,并检测细胞内标记抗体存在进行测定。(例如,通过荧光显微镜,或流式细胞分析(FACS))
在一些实施方式中,所述的抗-hER-α36抗体及其抗原结合片段拥有体外和/或体内的抗肿瘤活性。所述的抗体及其片段能够抑制肿瘤细胞的增长和/或诱导肿瘤细胞凋亡。所述的抗肿瘤活性通过使用体外肿瘤细胞培养或者体内动物模型得以检测。
源自SNGmB1的抗体
本文提供的抗-hER-α36抗体及其抗原结合片段,包括SNGmB1抗体的至少一个(例如,至少2、3、4、5或所有6个)CDR。
本文使用的“SNGmB1抗体”指的是包括具有SEQIDNO:16氨基酸序列的轻链和具有SEQIDNO:18氨基酸序列的重链的鼠单克隆抗体。如下提供了编码SNGmB1抗体轻链和重链的核苷酸序列,SEQIDNO:17和SEQIDNO:19。轻链和重链的氨基酸序列如下列出,其中CDR区是黑体并且下划线标记,并且恒定区是黑体和斜体标记。
所述的SNGmB1的轻链氨基酸序列(SEQIDNO:16):
ETTVTQSPASLSMTIGEKVTIRCWYRKKPGQPPKLLIS
LCDR1
GVPSRFSSSGYGTDFVFTIENMLSEDVADYYCFGAGTKLELK
LCDR2LCDR3
SNGmB1(SEQIDNO:18)重链的氨基酸序列:
QAYLQQSGAELVRPGASVKMSCKASGYTFTWIKQTPRQGLEWIG
HCDR1
KATLTVDKSSSTAYLQLSSLTSEESAVYFCARWGQGTTLTVSS
HCDR2HCDR3
编码鼠抗SNGmB1轻链的核苷酸序列(SEQIDNO:17):
5‘-GAGACCACAGTGACCCAGAGCCCCGCCAGCCTCAGCATGACAATCGGCGAGAAGGTGACCATCAGGTGCATCACATCCACCGACATCGACGACGACATGAACTGGTACAGGAAGAAGCCCGGCCAACCCCCCAAACTCCTCATCAGCGAGGGCAACACACTCAGGCCTGGCGTCCCCTCCAGATTCTCCAGCAGCGGCTACGGCACCGACTTCGTCTTCACCATCGAGAACATGCTGTCCGAGGACGTGGCCGACTACTACTGCCTGCAGTCCGATAACCTGCCCCTGACATTCGGCGCCGGCACCAAGCTCGAGCTGAAAAGGGCCGACGCCGCCCCTACCGTCAGCATTTTCCCCCCTTCCAGCGAGCAACTGACAAGCGGAGGCGCCAGCGTGGTGTGCTTCCTCAACAACTTCTACCCCAAGGACATCAACGTGAAGTGGAAGATCGACGGCAGCGAGAGACAAAACGGAGTGCTGAACAGCTGGACCGATCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCATGAGCTCCACCCTCACACTGACCAAGGACGAATACGAGAGGCACAACTCCTACACCTGCGAGGCCACACACAAGACAAGCACCTCCCCCATCGTCAAGAGCTTCAACAGGAACGAGTGCTGA-3’
编码鼠抗SNGmB1重链的核苷酸序列(SEQIDNO:19):
5’-CAGGCCTACCTGCAACAAAGCGGCGCTGAGCTCGTCAGGCCTGGAGCTAGCGTGAAGATGTCCTGTAAGGCCAGCGGCTACACCTTTACCAGCCACAACATGCACTGGATCAAGCAGACCCCTAGGCAGGGACTGGAATGGATCGGAGCCATTCACCCCGTGAACGGAGATACCGCTTATAACCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCTACCCTGACCGTCGACAAGTCCTCCTCCACAGCCTATCTGCAGCTCAGCTCCCTGACCAGCGAAGAGAGCGCCGTCTACTTTTGCGCCAGAGAAGGCTACGGCAGCGTGGATTACTGGGGCCAGGGAACCACCCTCACCGTGAGCTCGGCCAAGACCACCCCTCCTAGCGTCTACCCTCTGGCTCCCGGCTGTGGAGACACCACCGGAAGCTCCGTCACCCTGGGATGTCTGGTCAAGGGCTACTTCCCTGAGTCCGTGACCGTGACCTGGAACTCCGGCTCCCTGAGCAGCTCCGTGCACACCTTCCCCGCTCTGCTGCAGTCCGGCCTGTACACCATGAGCTCCAGCGTCACAGTGCCCTCCAGCACCTGGCCTTCCCAGACAGTGACCTGCAGCGTGGCCCACCCTGCTTCCAGCACCACAGTCGACAAAAAGCTGGAGCCTAGCGGCCCTATTTCCACCATCAACCCCTGCCCCCCCTGCAAGGAGTGCCATAAGTGTCCTGCCCCTAATCTCGAGGGCGGACCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAACATCAAAGACGTCCTGATGATCTCCCTGACACCCAAGGTGACATGCGTCGTCGTCGACGTGAGCGAAGACGACCCCGACGTGCAAATCTCCTGGTTCGTGAACAACGTGGAGGTGCACACAGCCCAGACCCAAACCCACAGAGAGGACTACAACAGCACCATTAGGGTGGTCAGCACACTCCCCATCCAACACCAGGACTGGATGTCCGGCAAGGAGTTTAAGTGCAAGGTCAACAACAAGGACCTGCCCAGCCCCATCGAGAGGACCATCTCCAAGATTAAGGGCCTGGTGAGGGCTCCTCAGGTGTATATCCTCCCCCCCCCTGCTGAACAGCTGTCCAGAAAAGACGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCGTCGGATTCAATCCCGGAGACATCTCCGTCGAATGGACCAGCAACGGACACACAGAGGAGAACTACAAGGACACAGCCCCTGTCCTGGACTCCGACGGCTCCTACTTCATCTACTCCAAGCTGAATATGAAGACCAGCAAGTGGGAGAAGACCGACTCCTTCAGCTGTAACGTGAGGCACGAGGGCCTCAAGAACTACTATCTGAAGAAGACAATCTCCAGGAGCCCCGGCAAGTGA-3’
SNGmB1抗体CDR序列如下表1列出
表1
CDR |
序列 |
序列号 |
LCDR1 |
ITSTDIDDDMN |
SEQ ID NO:3 |
LCDR2 |
EGNTLRP |
SEQ ID NO:4 |
LCDR3 |
LQSDNLPLT |
SEQ ID NO:5 |
HCDR1 |
SHNMH |
SEQ ID NO:6 |
HCDR2 |
AIHPVNGDTAYNQKFKG |
SEQ ID NO:7 |
HCDR3 |
EGYGSVDY |
SEQ ID NO:8 |
在一些实施方式中,本文提供的抗-hER-α36抗体和抗原结合片段包括选自SEQIDNO:3-8的至少一个CDR(或至少两个、三个、四个、五个或六个)。已知的CDR用于与抗原结合。然而,已经发现不是所有的6个CDR对于抗原结合都是不可或缺的。换言之,可能替换SNGmB1抗体的一个或多个CDR而实质保持着与hER-α36的亲和力。
在一些实施方式中,本文提供的抗-hER-α36抗体和抗原结合片段包括SEQIDNO:8(即:SNGmB1抗体重链CDR3序列)。重链CDR3区位于抗原结合位置的中心,并且因此据信与抗原进行最大接触并且提供了抗原抗体亲和力的最大自由能。据信,就长度、氨基酸组成和多元化机制的构造而言(TonegawaS.抗体多样体细胞的生成(Somaticgenerationofantibodydiversity)自然.302:575-81),重链CDR3是抗原结合位置最多样的CDR。重链CDR3多样化足以提供最多的抗体特异性(XuJL,DavisMM.V(H)CDR3区多样化足以提供最多的抗体特异性《免疫学(Immunity)》13:37-45)和想要的抗原结合亲和力。(SchierR,等.通过抗体结合区中心互补决定区分子的进化分离皮摩尔亲和力抗-c-erbB-2单链,分子生物杂志(JMolBiol.)263:551-67)。
在一些实施方式,本文提供的抗-hER-α36抗体和抗原结合片段包括含有SNGmB1抗体的3个HCDR中任意一个,即:包括SEQIDNO:6-8中任意一个的重链可变区,和/或包括含有SNGmB1抗体3个LCDR中任意一个,即:包括SEQIDNO:3-5中任意一个的轻链可变区。
在一些实施方式中,本文提供的抗-hER-α36的抗体和抗原结合片段包括含有SEQIDNO:6、7和8的重链可变区;和/或含有SEQIDNO:3、4和5的轻链可变区。
在一些实施方式中,本文提供的抗-hER-α36的抗体和抗原结合片段包括SNGmB1抗体的重链可变区,即,SEQIDNO:10;和/或包括SNGmB1抗体的轻链可变区,即SEQIDNO:9。在一些实施方式中,所述的抗-hER-α36的抗体是SNGmB1抗体,包括SEQIDNO:16的轻链和SEQIDNO:18的重链。
CDR区、SNGmB1抗体的轻链可变区和重链可变区可以按照本领域已知的方法移植到其他框架区或者恒定区从而产生骆驼源化的单域抗体、双价抗体、BsFv、scFv二聚体、dsFv、(dsFv)2、dsFv-dsFv'、Fv片段、Fab、Fab'、F(ab')2、ds双价抗体、纳米抗体、域抗体、二价域抗体或全抗体。本文公开的抗体可以是单克隆抗体、重组抗体、双特异性抗体、人源化抗体、嵌合抗体、标记抗体、二价抗体、抗独特型抗体或全人抗体。
嵌合和/或人源化抗体
在一些实施方式中,所述的抗-hER-α36的抗体和抗原结合片段是嵌合的。本文使用的“嵌合”指的是包括源自不同物种的至少两部分的一个分子。例如,嵌合抗体可以具有至少一个非人序列和一个人序列。在一些实施方式中,所述的嵌合抗体及其抗原结合片段包括源自鼠的至少一个CDR,以及源自非鼠物种(例如人)的至少一个恒定区和/或框架区。
所述的嵌合抗体和抗原结合片段保持着对hER-α36的结合特异性,并且优选地,保持着与hER-α36的结合亲和力(例如,不少于SNGmB1抗体亲和力的60%、70%、80%、90%或95%)和/或保持着hER-α36上的生物活性(例如,拮抗活性)。
在一些实施方式中,所述的嵌合抗体及其抗原-结合片段包括SEQIDNO:3-8中至少一个和人源抗体骨架。在一些实施方式中,所述的嵌合抗体及其抗原结合片段包括移植于人源抗体骨架的含有SEQIDNO:6-8全部序列的重链可变区和/或含有SEQIDNO:3-5全部序列的轻链可变区。
在一些实施方式中,所述的嵌合抗体合其抗原结合片段包括移植于人源抗体骨架的SEQIDNO:10的重链可变区和/或SEQIDNO:9轻链可变区。
在一些实施方式中,所述的嵌合抗体包括具有SEQIDNO:20氨基酸序列的轻链和具有SEQIDNO:22氨基酸序列的重链。在一些实施方式中,所述的嵌合抗体包括通过SEQIDNO:21多核苷酸序列编码的轻链和通过SEQIDNO:23多核苷酸序列编码的重链。
嵌合抗体和抗原结合片段可以使用重组方法进行制备,例如如Morrison等在美国专利5,807,715、Cabilly等在美国专利4,816,567;Boss等在美国专利4,816,397;Morrison,《科学(Science)》229(4719):1202-1207(1985);Morrison,《美国科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)》81:6851-6855(1984)中的描述,以上全部引入本文作为参考。通常,编码一个物种可变区的DNA分子是与编码其他物种恒定区的另一DNA分子框架相连,并且导致了DNA编码的嵌合抗体链转染进入细胞使其表达,并且轻链和重链任意地***细胞产生嵌合抗体或其抗原结合片段。
嵌合抗-hER-α36抗体和其抗原结合片段可以进行人源化。通过“人源化”意味着改造非人抗体以增加相对于人抗体的同源序列,从而保留抗原结合性质然而减少对于人的免疫原性。
在一些实施方式中,所述的人源化抗体及其抗原结合片段包括移植于人源性抗体骨架的源自SNGmB1抗体的一种或多种抗原结合序列。本文使用的“人源性”指的是抗体骨架是全人的,或者除了少量的突变或者修饰相当多地源自人,例如引入这些突变或者修饰以提供提高结合亲和力,提供结合位置,形成额外的二硫键或者为了其他适当的目的。在一些实施方式中,人源化抗体骨架已经减少相对于非人源抗体,例如鼠抗体的免疫源性或者在人体无免疫源性。
SNGmB1的一个或多个CDR和/或可变区可以移植于人源抗体或其片段。例如:SNGmB1抗体的CDR可以移植于人源抗体的人骨架区,从而SNGmB1的CDR置于替换人源抗体相应的CDR。另外的实施例,SNGmB1抗体的可变区可以移植于人源抗体相应的恒定区。
在一些实施方式中,SNGmB1抗体的CDR移植于人骨架区,人骨架区特定的氨基酸残基可以用SNGmB1抗体相应的残基取代,从而人源化抗体的抗原结合区更接近于鼠抗体结构。这种氨基酸残基的实例包括而不限于人源化抗体可变区轻链的V4、P44、L46、S49和/或S64,以及重链的T28、L81。(见表2)
在一些实施方式中,人源化嵌合抗体及其抗原结合片段包括移植到人源恒定区的选自SEQIDNO:14和15的重链可变区和/或包括选自SEQIDNO:11、12和13的轻链可变区。下表2提供了人源化的可变区序列,其中人骨架区的取代氨基酸残基以较大的字符表示。
在一些实施方式中,人源化嵌合抗体包括具有选自SEQIDNO:24、26和28氨基酸序列的轻链,和具有选自SEQIDNO:30和32氨基酸序列的重链。在一些实施方式中,嵌合抗体包括通过选自SEQIDNO:25、27和29的核苷酸序列编码的轻链和通过选自SEQIDNO:31和33核苷选序列编码的重链。
表2人源化抗体可变区
可以使用本领域已知的多种方法用于非人抗体的人源化。例如,描述于Lo.B,《AntibodyEngineering(抗体工程)》的方法:Springer,2004,135-159页公开的方法和实验报告;Padlan《分子免疫学(Mol.Immunol.)》28:489-498(1991);Sato等.《分子免疫学(Mol.Immunol.)》31(5):371-381(1994);Kettleborough等,《蛋白质工程(ProteinEng)》.4(7):773-783(1991);和Presta,L.,《先进药物传递评论(AdvancedDrugDeliveryReviews)》,58(2006)640-656。
亲和变异体
本发明还提供了具有提高性质的抗体和抗原-结合片段(例如,提高亲和性、提高半衰期、提高偶联相容性等),其包括在SNGmB1抗体的一个或多个CDR序列或者重链或轻链可变区、或在重链或者轻链恒定区取代、增加或减少一个或多个氨基酸。
在一些实施方式中,具有这种氨基酸取代的抗体或其抗原结合片段保持着与hER-α36的结合特异性和结合亲和力,并且优选地,提高了对hER-α36的结合亲和力。这可以通过氨基酸序列随机或靶向的突变和随后的结合以及功能检测实现。以这种方式生成的抗体和抗原结合片段可以通过结合ER-α36进行筛选,从而确定与ER-α36结合性质的抗体。具有良好结合性质的抗体可以通过一种或多种功能检测以确定它们例如:抑制体外癌细胞生长或增殖或者体内肿瘤生长的能力。
NNAA变异体
在一些实施方式中,抗-hER-α36的抗体和抗原结合片段因此包括一种或多种非天然氨基酸(NNAA)取代。本文使用的“非天然氨基酸”或“NNAA”指的是任意氨基酸,包括修饰的氨基酸和/或不是二十种标准氨基酸(即:甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、苏氨酸、蛋氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、组氨酸、赖氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺)中一种的氨基酸类似物。
NNAA可以包括多种官能基团或者活性基团,这能提供额外的功能和/或者活性。例如,适于并入抗体和抗原结合片段的NNAA可以是光固化的(photocaged)和/或光敏异构化氨基酸(例如p-苯偶氮基-苯丙氨酸)、糖基化氨基酸(例如:N-乙酰-L-葡萄糖氨基-L-丝氨酸)、同位素标记氨基酸、含酮氨基酸(例如:吡咯赖氨酸)、含醛氨基酸,例如:甲酰甘氨酸(伍特生物科学(RedwoodBioscience’s)的SMARTAGTM),重原子取代的氨基酸(例如:p-碘代苯丙氨酸)。化学裂解和/或光裂解氨基酸、氧化还原-活性氨基酸(3-氨基-L-酪氨酸),或光激活氨基酸(例如:p-叠氮-L-苯丙氨酸和p-苯甲酰-L-苯丙氨酸)。NNAA的总述可见如Xie,J.等《化学生物学研究的现状(CurrentOpinioninChemicalBiology)》2005,9:548–554;Hohsaka,T.等,《化学生物学研究的现状(CurrentOpinioninChemicalBiology)》2002,6:809–815,它们均全部引入本文。
NNAA可以提供多种优点,例如,抗体偶联、标记、糖基化、光交联等等。
在一些实施方式中,本文提供的抗体和抗原结合片段包括能够偶联的NNAA。具有官能团的偶联分子能够与NNAA相应的活性基团反应,从而在抗体的NNAA和偶联物之间能够形成稳定的连接,由此将偶联物连接到抗体。例如,包括酮基或醛或β-二酮分子的NNAA可以与含有酰肼-或O-烷基羟胺-或羟胺-制剂反应从而形成腙或O-烷基化肟连接。对于其他实例,NNAA含有能够与炔烃衍生物反应的叠氮基团从而通过铜(I)催化[3+2]的环加成形成稳定的***连接(并且反之亦然)。对于其他实例,含有叠氮基团的NNAA能够与适合的水溶性含膦-制剂相配合通过施陶丁格连接(Staudingerligatio)形成酰胺键。此外,NNAA的硫酯基团可以与含胺制剂反应从而形成酰胺键。引入NNAA的抗体和抗原结合片段可以通过环加成反应与制剂相偶联。例如,二烯烃和二烯亲和物之间的(4+2)环加成反应(狄尔斯-阿尔德反应(Diels-Alderreaction)),通过1,3-偶极胡伊斯根环加成(Huisgencycloaddition)的(3+2)环加成反应,和通过硝酮-烯烃环加成的(3+2)环加成反应。适于抗体偶联的环加成方法已经在例如WO05003294、US20120004183、WO06009901、WO07130453和美国专利6,737,236中进行了描述。这些方法在抗体和多种偶联物例如:荧光团、亲和分子(例如生物素)、糖类似物、聚合物(如,PEGs)以及化学化合物(例如:细胞毒素和抗肿瘤制剂)偶联时都非常有用。
在一些实施方式中,抗体和引入NNAA的抗原结合片段包括叠氮基或炔基。这种NNAA能够通过铜催化的“点击”化学偶联,例如,具有叠氮的NNAA能够与带有末端炔烃的偶联物在铜离子(I)存在下反应,从而形成***连接。带有炔基的NNAA也可以与带有叠氮基团的制剂通过铜催化进行“点击”化学反应。该反应的更多细节已经描述在例如:美国专利7,009,059、WO2004055160,美国专利7,375,234和美国专利7,763,736内。
可以使用任何本领域已知的适合的NNAA,包括不限于在PCT公开的WO05038002、WO04035743、WO04035605、WO06001832、WO06068802和WO06110182以及美国专利申请US20130030160,US20130028906和US20120301490。在一些实施方式中,NNAA是任何20种标准氨基酸的类似物。实例的NNAA包括而不限定于:
赖氨酸类似物如吡咯赖氨酸;
苯丙氨酸类似物如p-硝基苯丙氨酸、p-氨基苯丙氨酸、p-(2-氨基-3-羟基乙基)苯丙氨酸、p-苯甲酰苯丙氨酸、p-苯基偶氮苯丙氨酸、p-叠氮苯丙氨酸、p-碘代苯丙氨酸、p-乙酰苯丙氨酸、p-甲氧苯丙氨酸、p-(3-氧丁酰)-L-苯丙氨酸、p-异丙基硫羰基-苯丙氨酸、p-乙基硫羰基苯丙氨酸和p-炔丙氧基苯丙氨酸、p-羧甲基苯丙氨酸、3,4-二羟基-L-苯丙氨酸;
丙氨酸类似物例如L-3-(2-萘基)丙氨酸;
酪氨酸类似物如O-甲基-酪氨酸、O-(2硝基苄基)酪氨酸、O-(三甲基氨烷基)酪氨酸、3-碘代酪氨酸、3-氨基-酪氨酸;
半胱氨酸类似物例如S-(2-硝基苄基)-半胱氨酸、硒代半胱氨酸;
苯丙氨酸类似物例如p-苯甲酰-L-苯丙氨酸);
色氨酸类似物例如5-羟基色氨酸;
甘氨酸类似物例如7-羟基香豆素-甘氨酸和丹磺酰基-甘氨酸;
丝氨酸类似物例如β-GlcNAc-丝氨酸、N-乙酰-L-葡萄糖胺基-L-丝氨酸、N-乙酰-L-氨基半乳糖基-L-丝氨酸、N-乙酰-L-葡萄糖胺基-L-苏氨酸、N-乙酰-L-葡萄糖胺基-L-天冬酰胺酸和O-甘露糖胺基-L-丝氨酸;
苏氨酸类似物例如α-GalNAc-苏氨酸;和
谷氨酰胺类似物例如L-人谷氨酰胺。
NNAA能够通过引入编码抗体或其抗原结合片段的核苷酸中所希望的位点的指定遗传密码进行编码。NNAA可以通过不同于任何编码20个标准氨基酸天然密码的独特遗传密码进行编码。用于NNAA的遗传密码可以是终止密码子(例如琥珀密码子(UAG)、赭石密码子(UAA)和蛋白石密码子(UGA)密码子),四联密码子(例如:AGGA、AGGU、CGGU、CGCU、CGAU、CCCU、CUCU、CUAU和GGGU),五联密码字、六联密码子等等。
NNAA可以通过包括正交tRNA-氨酰基-tRNA合成酶对翻译***引入抗体及其抗原结合片段。通常,包括用于NNAA密码子的抗体编码的核苷酸序列可以引入翻译***,其中NNAA的密码子可以特异性得到识别并且通过tRNA和tRNA氨酰基合成酶的正交对翻译为NNAA,从而将核苷酸翻译为引入NNAA的抗体和抗原结合片段。
正交对之内的合成酶特异地将带有NNAA的tRNA氨基酰化,并且tRNA能特异性识别NNAA的遗传密码子。该对可以人工引入***(即:tRNA和合成酶的外源对)或者天然存在于***(即tRNA的天然对和微生物的合成酶的原生对)。用于制备这类翻译***的方法是本领域公知的。例如,参见PCT公开的WO02085923、WO02086075、WO03033521、WO04094593、WO05007624、WO05007870和WO05019415。
保守变异体
在一些实施方式中,抗-hER36抗体及其抗原结合片段因此包括来自SNGmB1抗体的保守替换。本文使用的“保守替换”指的是一个氨基酸残基用另一个侧链与被替换的残基有类似理化性质(例如:侧链的疏水性和分子体积)的氨基酸残基替换。例如,保守替换可以在具有疏水侧链氨基酸之间(例如:Met、Ala、Val、Leu和Ile),在具有中性疏水侧链氨基酸之间(例如Cys、Ser、Thr、Asn和Gln),在具有酸性侧链(例如Asp、Glu)氨基酸,在具有碱性侧链(His、Lys和Arg)的氨基酸或者具有芳香侧链(例如Trp,Tyr和Phe)的氨基酸之间完成。如本领域公知的保守替换并不引起蛋白构想结构的重要变化,并且因此不降低或损害蛋白的生物活性。在一些实施方式中,保守替换可以引入SNGmB1抗体可变区的一个或多个位置,例如对于抗原结合不重要的位置。
pH依赖变异体
在一些实施方式中,抗体或抗原结合片段包括给予依赖pH结合到ER-α36的一个或多个氨基酸替代。在一些实施方式中,相对中性pH条件,这种抗体和抗原结合片段在酸性pH条件下与ER-α36的结合已经减少。结合到受体表面的抗体可以内化为细胞溶质并且接着当pH酸性时在溶酶体内降解。这是考虑到酸性pH下,降低的亲和力能够将抗体从溶酶体内的受体离解,并且使得抗体逃脱而免于降解,并回收到细胞表面用于继续与其他受体分子结合。
具有pH依赖性的与ER-α36结合的抗体和抗原结合片段可以使用本领域已知的方法进行基因改变。例如IgawaT.等《自然生物技术(Naturebiotechnology)》,28(11):2010;美国专利申请20110076275,美国专利申请20110111406。例如,抗体或其抗原片段的表面残基可以使用组氨酸扫描得以突变,并且最终的突变可以通过在酸性pH和中性pH与受体的结合亲和性得以筛选。已经公开了在可变区适合组氨酸突变的特定残基,例如美国专利申请20110076275和美国专利申请20110111406。
在一些实施方式中,所述的抗体或者抗原结合片段包括一种或多种提高与Fc受体(FcRn)pH依赖性结合的氨基酸替代。已知IgG在酸性pH下结合FcRn并且在中性pH下离解。内化lgG能在内体与FcRn相复合,并且当内体转胞吞作用向细胞基底外侧时,可以从细胞释放出。这种与FcRn的结合使得lgG逃脱免于在溶酶体内降解,并且因此能够延长抗体的药代动力半衰期。改变抗体和其抗原结合片段的基因工程方法从而提高与FcRn的结合亲和力是本领域公知的。参见,例如:Vaughn,D.等,《结构(Structure)》,6(1):63-73,1998;Kontermann,R.等,《抗体工程(AntibodyEngineering)》,卷1,第27章:改变Fc区基因工程以提高PK(EngineeringoftheFcregionforimprovedPK),Springer公开,2010;Yeung,Y.等,《癌症研究(CancerResearch)》,70:3269-3277(2010);和Hinton,P.等,《免疫学(Immunology)》,176:346-356(2006)。可以筛选出突变的抗体从而确认具有改善FcRn结合亲和力的候选物。
具有改变ADCC活性的变异体
在一些实施方式中,所述的抗体和抗原结合片段可以通过基因工程方法改变Fc区从而改变抗体依赖的细胞毒效应(ADCC)。Fc区在效应细胞例如:天然杀伤细胞和巨噬细胞表面上结合Fc受体,并且引导这些效应细胞到如ER-α36表达细胞的靶向细胞。在一些实施方式中,所述的抗体或抗原结合片段包括提高ADCC活性的修饰或者突变。可以提供在Fc区的CH2域特定的氨基酸残基的取代从而提高ADCC活性。任选地或额外地,可以改变抗体上的碳水化合物结构以改善ADCC活性。通过抗体基因工程提高ADCC活性的方法已经在本领域进行了描述,参见例如ShieldsRL.等.,《生物化学杂志(JBiolChem.)》2001.276(9):6591-604;IdusogieEE.等,《免疫学(JImmunol)》.2000.164(8):4178-84;SteurerW.等,《免疫学(JImmunol)》.1995,155(3):1165-74;IdusogieEE.等《免疫学(JImmunol)》.2001,166(4):2571-5;LazarGA.等《美国科学院院报(PNAS)》,2006,103(11):4005–4010;RyanMC.等《癌症分子治疗(Mol.CancerTher.)》2007,6:3009–3018;RichardsJO,.等《癌症分子治疗(Mol.CancerTher.)》2008,7(8):2517-27;ShieldsR.L.等《生物化学杂志(JBiolChem.)》,2002,277:26733-26740;ShinkawaT.etal,,《生物化学杂志(JBiolChem.)》2003,278:3466-3473。
表位
本发明还提供了与SNGmB1抗体特异性结合的表位基本相同的表位相结合的抗体及其抗原结合片段。
用于识别抗体表位的方法是本领域公知的,例如,通过丙氨酸扫描。通常,引入单个的丙氨酸突变到感兴趣的残基从而产生突变的抗原,并检测突变抗原和抗体的结合亲和力,例如,使用竞争ELISA或者放射性配体免疫结合检测。如果通过这种丙氨酸取代抗体结合活性显著降低或者削弱,组成表位的残基将得到识别,如通过Cunningham等描述,《科学(Science)》244(4908):1081-1085(1989)。在例如Westwood,O.等,表位图谱可以得到更多的方法:《实用方法(apracticalapproach)》,牛津大学出版社2001年公开。
在一些实施方式中,本申请所述的抗体可以结合包括选自SEQIDNO:2的S3、K8、R10、P16、K17、G20、N21、K22、W23的一个或多个。在一些实施方式中,所述的表位包括选自SEQIDNO:2的G20、N21、K22、W23和/或F24的一个或多个。
在一些实施方式中,所述的表位包括SEQIDNO:2的G20、N21、K22、W23和/或F24的残基。在一些实施方式中,所述的表位包括SEQIDNO:2的S3、K8、R10、P16、K17、G20、N21、K22、W23的残基。
在一些实施方式中,所述的表位包括SEQIDNO:2的G20、N21、K22、W23和/或F24的残基,在一些实施方式中,所述的表位包括SEQIDNO:2的S3、K8、R10、P16、K17、G20、N21、K22、W23。
结合相同表位的抗体倾向于相互竞争结合,或者阻止其他抗体与抗原的结合。因此,也可以使用竞争结合分析识别与SNGmB1特异性结合相同表位的抗体。
使用抗体和抗原结合片段的方法
已经发现本文提供的所述的抗体和抗原结合片段抑制体内肿瘤生长。因此,可以使用抗体和抗原结合片段治疗与ER-α36相关的多种状况或疾病。
在一些实施方式中,预防和/或治疗受试者与ER-α36相关疾病的方法包括向受试者施予治疗有效量的包括本文提供的抗体或抗原结合片段的药物组合物。与ER-α36相关的疾病实例包括不限于骨流失、骨折、骨质疏松、转移性骨疾病、佩吉特氏病(Paget'sdisease)、牙周组织疾病、软骨退变、子宫内膜异位症、子宫肌瘤病、潮热、LDL胆固醇水平的增加、心血管疾病、认知功能损伤、大脑退行性疾病、(心瓣手术后)再狭窄、男子乳腺发育症、血管平滑肌细胞增殖、肥胖症、大小便失禁、焦虑症、源自***缺乏的抑郁症、围绝经期抑郁症、产后抑郁症、经前期综合症、躁郁症、焦虑症、痴呆、强迫行为、注意力缺乏症、睡眠障碍、易怒、冲动、免疫缺陷、自身免疫疾病、情绪管理、多发性硬化和帕金森疾病、炎症、炎性病症、炎症性肠病、呼吸***疾病、性功能障碍、高血压、视网膜变性、哮喘和癌症。优选地,与ER-α36相关-的疾病包括骨流失、骨折、骨质疏松、绝经、经前综合症、子宫内膜异位症、子宫疾病、阳痿、性功能障碍、LDL胆固醇水平的增加、心血管疾病、血管平滑肌细胞增殖、源自***缺乏的抑郁症、围绝经期抑郁症、产后抑郁症、免疫缺陷、自身免疫疾病、炎症、炎性病症、哮喘和癌症。更优选地,与ER-α36相关的疾病包括骨流失、骨质疏松、阳痿、心血管疾病、动脉粥样硬化、免疫缺陷、炎症、炎性病症、哮喘和癌症。本文使用的炎性病症包括类风湿性关节炎、银屑病、硬皮病、慢性阻塞性肺病和哮喘。受试者可以是哺乳动物例如狗、猫、牛、羊、马或者人,优选人。该方法要求的治疗有效量将根据特异性疾病变化并且对于知晓当前公开技术的本领域普通技术人员来说是容易确定的。
在一些实施方式中,预防和/或治疗个体中癌症病况的方法包括向个体施予包括本文提供的抗体或者抗原片段的药物组合物。使用本文公开的抗体或者抗原片段可以治疗的癌症状况和肿瘤类型包括而不限于癌、母细胞瘤、肉瘤、生殖细胞瘤或血液或淋巴恶性肿瘤,例如白血病、淋巴瘤或多发性骨髓瘤。更优选地,使用本文公开的抗体可以治疗的癌症状况和肿瘤类型包括而不限制于鳞状细胞癌、肺癌(例如:小细胞肺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、肺腺癌或者肺鳞状细胞癌),腹膜癌、肝癌(例如,肝细胞癌/肝癌)、胃或腹部癌(例如消化道癌)、胰腺癌、脑肿瘤(例如:胶质母细胞瘤/多形性胶质母细胞瘤(GBM)、非恶性胶质瘤或者脑膜瘤)、神经胶质瘤(例如,室管膜瘤、星形细胞瘤、间变性星形细胞瘤、少突神经胶质瘤或混合性胶质瘤如少突星形细胞瘤)、***、卵巢癌、肝癌(例如,肝母细胞瘤、肝细胞癌/肝细胞瘤或者肝癌)、膀胱癌(例如,尿路上皮癌)、乳腺癌、结肠癌、结肠直肠癌、直肠癌、子宫内膜癌、子宫癌、唾液腺癌、肾或肾癌(例如:肾脏的横纹肌样肉瘤)、***癌、外阴癌、***癌、***癌(例如***鳞状细胞癌)、甲状腺癌、头颈癌(例如:鼻咽癌)、皮肤癌(例如,黑色素瘤或鳞状细胞癌)、骨肉瘤、尤文氏肉瘤、软骨肉瘤、软组织肉瘤(例如:横纹肌肉瘤,纤维肉瘤,卡波济肉瘤(Kaposi'ssarcoma))、类癌肿瘤、眼癌(例如,视网膜母细胞瘤)、间皮瘤、淋巴细胞/淋巴细胞白血病(例如:T细胞系和前体B细胞谱系的急性淋巴细胞白血病(ALL),慢性淋巴细胞/淋巴细胞白血病(CLL)、急性粒细胞/粒细胞白血病(AML)包括肥大细胞白血病、慢性粒细胞/粒细胞/粒细胞白血病(CML)、毛细胞白血病(HCL)、霍奇金病,非霍奇金淋巴瘤、慢性粒单核细胞白血病(CMML)、滤泡性淋巴瘤(FL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLCL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、伯基特淋巴瘤(BL)、蕈样肉芽肿、色杂瑞综合症(Sezarysyndrome)、皮肤T细胞淋巴瘤、肥大细胞肿瘤、髓母细胞瘤、肾母细胞瘤、孤立性浆细胞瘤、骨髓增生异常综合征、慢性与非慢性骨髓增殖性疾病、中枢神经***肿瘤,垂体瘤、听神经瘤、原始神经外胚层肿瘤,室管膜瘤,脉络丛***状瘤,真性红细胞增多症、原发性血小板增多症、特发性骨髓纤维变性和儿科肿瘤例如:小儿肉瘤、横纹肌肉瘤和骨肉瘤)。另外,肿瘤可以是恶性的(例如:癌症)或者良性的(例如:增生、囊肿、假性囊肿、错构瘤和良性肿瘤)。
在一些实施方式中,在受试体中抑制与ER-α36相关的肿瘤转移的方法,该方法包括向受试者施予治疗有效剂量的包括本文提供的抗体或抗原片段的药物组合物。
在一些实施方式中,本文提供的抗体和抗原结合片段是ER-α36的调节剂并且用于调节体内和体外细胞ER-α36的活性。在一些实施方式中,本文公开的抗体和抗原结合片段可以引起细胞死亡和/或者抑制细胞增殖。
在一些实施方式中,调节细胞内ER-α36的方法包括将表达ER-α36的细胞暴露于本文公开的抗体和抗原结合片段。所述的细胞可以内源性表达ER-α36或者通过基因工程外源性表达ER-α36。在一个实施方式中,所述的细胞内源性表达ER-α36。在优选的实施方式中,所述的细胞是外源性表达ER-α36的癌症细胞。表达ER-α36癌症细胞的实例是乳腺癌细胞、白血病细胞、肺癌细胞、骨髓瘤细胞、***癌细胞、卵巢癌细胞、结肠癌细胞和胃癌细胞。在另外优选的实施方式中,表达ER-α36的细胞是内源性表达ER-α36的乳腺癌细胞。表达ER-α36乳腺癌细胞的实例是MCF7和MDA-MB-231细胞。内源性ER-α36的表达可以通过一种或多种制剂治疗得到增加或减少。这些制剂的实例是血清、E2β(17β-***)、它莫昔芬和ICI182,780。
在其他实施例中,细胞通过基因工程得到改变以表达外源ER-α36。表达外源ER-α36的细胞可以通过本领域普通技术人员已知的基因工程方法制备(参见Sambrook等,《分子克隆(MolecularCloning)》,《实验室手册(ALaboratoryManual)》(2dEd.1989)冷泉港实验室(ColdSpringHarborLaboratory)。简而言之,制备外源ER-α36基因并且***表达载体转染进入宿主细胞,宿主细胞接着在适合表达外源ER-α36的培养溶液中培养。人ER-α36的基因序列的实例由王等(Wangetal)在《生化、生物物理学研究通讯(Biochem.Biophys.Res.Commun.)》336,1023-1027(2005)中进行了公开,基因银行登陆号(GenBankAccessionNo.BX640939)。表达外源ER-α36的细胞可以或者不可以表达外源ER-α36。细胞内的内源或外源ER-α36的表达水平可以通过一种或多种制剂治疗得到增加或降低。这种制剂的实例是血清、E2β(17β-***)、它莫昔芬和ICI182,780。表达ER-α36的细胞可以或者不可以表达其他***受体例如ER-α66、ER-α46和ER-β。
本文公开的抗体或抗原结合片段可以单独或者与一种或多种额外的治疗方法或者制剂联合施用。例如,本文公开的抗体或者抗原结合片段可以与化疗、放疗、癌症治疗手术(例如:肿瘤切除术)、化疗引发并发症的一种或多种止吐剂或其他治疗、或者其它用于治疗由ER-α36调节的癌症或者任何内科疾病的治疗制剂共同施用。在这些一些实施方式中,本文公开的抗体或抗原结合片段与一种或多种额外治疗制剂联合施用,可以同时与一种或多种额外的治疗制剂施用,并且在这些一些实施方式中,所述的抗体或抗原结合片段和额外的治疗制剂可以作为同一药物组合物的一部份进行施用。然而,抗体或者抗原结合片段与其它治疗制剂“联合”施用,不必要同时或者作为相同组合物内的制剂进行施用。在其他制剂之前或者之后施用的抗体或者抗原结合片段认为如本文使用的短语所述,与制剂“联合”进行施用,即便所述的抗体或抗原结合片段和第二种制剂通过不同的途径进行施用。其中可能的是,与本文公开的抗体或者抗原结合片段联合施用的额外治疗制剂是按照额外治疗制剂产品信息单的列出的进度表进行施用,或者按照内科医生案头参考资料(Physicians'DeskReference)2003(内科医生案头参考资料,(Physicians'DeskReference)第57版;医疗经济公司(MedicalEconomicsCompany);ISBN:1563634457;第57th版(2002年11月)或者本领域公知的方案进行施用。治疗制剂的实施例包括而不限制于阿可拉定、它莫昔芬、17β-***、ICI182,780,在2007年10月23日提交的美国专利申请11/877,575公开的化合物,其引入本文作为参考。在2008年4月8日提交的美国专利申请60/046,255公开的引入本文作为参考的化合物,细胞因子、抗-VEGF抗体(例如,贝伐单抗或阿瓦斯汀)、抗-HER2抗体(例如赫赛汀或曲妥单抗)、抗EGFR抗体(尼妥珠单抗或爱必妥)和细胞因子受体抑制剂例如格帕替尼(Gapatinib)和拉帕替尼(Lapatinib)。
细胞因子的实例包括不限于淋巴因子、单核因子、人生长激素、牛生长激素、甲状旁腺激素、甲状腺素、胰岛素、胰岛素原、松弛肽、原松弛肽、促卵胞成熟激素、促甲状腺激素、促黄体激素、肝细胞生长因子、成纤维细胞生长因子、泌乳***、胎盘催乳激素、肿瘤坏死因子、副中肾管抑制物质、鼠***相关肽、抑制素、激活素、整联蛋白、促血小板生成素、神经生长因子类如NGF-β、血小板生长因子、转化生长因子如TGF-α和TGF-β、***I和II、***、骨诱导因子、干扰素类如干扰素-α、-β和–γ,集落刺激因子如巨噬细胞-CSF、粒细胞巨噬细胞CSF和粒细胞-CSF,白细胞介素如IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11和IL-12,肿瘤坏死因子类如TNF-α和TNF-β,以及其他多肽类因子。
在一些实施方式中,本文公开的抗体或抗原结合片段通过连接、偶联或者联合一种或多种化疗制剂使用。化疗制剂的实例包括而不限定于氨柔比星、阿曲生坦、巴特布林(batabulin)、骨化三醇、西仑吉肽、达沙替尼、迪卡它尼(decatanib)、艾朵特卡莱(edotecarin)、恩杂朵瑞(enzastaurin)、厄洛替尼、依维莫司、吉美特卡(gimatecan)、棉籽酚易普利姆玛、洛那法尼、硫蒽酮、努阿迪布(neuradiab)、诺拉曲塞、奥布里森(oblimersen)、奥法木单抗(ofatumumab)、奥瑞构单抗(oregovomab)、帕尼单抗、帕唑帕布卡(pazopanibrubitecan)、他仑帕奈、西罗莫司、替米利芬、汉防己甲素、替斯利姆单抗(ticilimumab)、曲贝替定、凡德他尼、维特斯盘(vitespan)、赞利姆单抗(zanolimumab)、***二膦酸盐(zolendronate)、组氨瑞林(histrelin)、阿扎胞苷、右丙亚胺、阿仑单抗(alemtuzumab)、来那度胺、吉姆单抗、酮康唑、氮芥、替伊莫单抗、地西他滨、六甲三聚氰胺、贝沙罗汀、托西莫单抗、三氧化二砷、艾迪托特(editronate)、环孢霉素、艾德温那-天门冬酰胺酶和锶89。
多种偶联物可以连接到本文提供的抗体或者抗原片段,这是可以预计的(参见,例如,“偶联疫苗(ConjugateVaccines)”微生物学和免疫学贡献(ContributionstoMicrobiologyandImmunology)J.M.Cruse和R.E.Lewis,Jr.(eds.),卡格出版社(CargerPress),纽约(1989)。这些偶联物可以通过其它方法中的共价结合、亲和结合、嵌入、配位结合、络合、联合、共混或者加成的方法连接到抗体或者抗原结合片段。如果需要的话,在表位结合区外的特定位置可以改变基因结构,从而提供用于偶联位置。例如,所述的抗体或其抗原结合片段的基因结构可以改变为包括一个或多个活性氨基酸残基,例如半胱氨酸、组氨酸、赖氨酸、谷氨酸或蛋氨酸残基或如上描述的NNAA以促进与偶联物的共价结合。
在一些实施方式中,所述的抗体可以间接连接到偶联物,或者通过其它偶联物或者通过连接子。例如,所述的抗体或抗原结合片段可以结合于生物素、然后间接连接于结合到抗生物素蛋白的第二个偶联物。可以使用多种连接子将偶联物连接到抗体的残基上,例如,用于连接到半胱氨酸的(6-马来酰亚胺己酰基)腙连接子、用于连接到赖氨酸的4-(4′-乙酰苯氧基)丁酸、用于连接到赖氨酸的4-巯基戊酸和连接到半胱氨酸的缬氨酸-瓜氨酸连接子。(参见,例如,Ducry,L等,生物偶联物化学,第21卷NO.1,2010)为了制备半胱氨酸连接子抗体药物偶联物,所述的抗体或其片段可以通过例如二硫苏糖醇(DTT)、三(2-羧乙基)磷化氢(TCEP)或者氨基乙硫醇的还原剂部分还原以提供自由的硫醇基,该硫醇接着通过连接到连接子的偶联物烷基化,例如缬氨酸-瓜氨酸连接单乙基阿里他汀E(MMAE)。然而,在任选的实施例中,抗体或抗原结合片段可以不经过还原使用从而得到缬氨酸-连接子抗体偶联物,例如,在抗体或者抗原结合片段序列***游离的半胱氨酸,或者***游离的S-甲基化的半胱氨酸接着对***的S-甲基化的半胱氨酸脱甲基化。类似地,蛋氨酸脱甲基化提供能与其他分子例如连接子或者小分子(例如药物)进一步偶联的巯基或者硫氢基(-SH)。制备而成的抗体偶联物可以进一步得到纯化和检测。
在一些实施方式中,偶联物和连接到本文公开的抗体或抗原结合片段的连接子可以包括一种或多种制剂或者官能团用来改变一种或多种药物代谢动力学(PK)性质(例如:增加半衰期)或者减少抗体或抗原结合片段的免疫原性。这种制剂或者基团可以包括而不限于例如:聚乙二醇(PEG)、葡萄糖醛酸或者其他糖基连接子,极性的、能够提高琥珀酰亚胺环水解率的阳性或者阴性电荷基团和减少或者弱化迈克尔逆反应速率,因此减少或者弱化药物和从抗体或抗原结合片段到其他含巯基蛋白的连接子和小分子的损失率。
在一些实施方式中,本发明提供了抗体药物偶联物。所述的抗体药物偶联物包括共价结合到一种或多种药物分子的本发明的抗体或者抗原结合片段。在一些实施方式中,所述的抗体药物偶联物具有分子式Ab(-L-D)n,其中所述的Ab是本发明的抗体或者抗原结合片段,D是药物,L是将药物结合到抗体或者抗原结合片段的连接子。并且所述的连接子在靶细胞或组织存在下是可断裂的或者不可断裂的。n是1-60之间的一个整数。
可以使用任何类型的连接子。适合连接子的实例包括而不限定于马来酰亚胺基己酰(MC)、马来酰亚胺基己酰-缬氨酸-瓜氨酸-p-氨基苄基氨甲酰基(mc-vc-PAB)、SMCC、SPDB和MB-vc。在一些实施方式中,所述的连接子选自包括马来酰亚胺基己酰(参见,例如式(II))、马来酰亚胺基己酰-缬氨酸-瓜氨酸-p-氨基苄基氨甲酰基(参见,例如式(III))、N-琥珀酰亚胺-4-(马来酰亚胺甲基)环己烷羧酸酯(参见,例如式(V))、N-琥珀酰亚胺-4-(2-吡啶二硫代)丁酸(参见例如式(VI)和MB-vc(参见,例如式(Ⅳ))。这些实例连接子的结构如下所示:
本文使用的术语“药物”指的是治疗制剂或者优选地细胞毒素剂、药物的实例包括但不限定于单甲基阿里他汀E(MMAE)、单甲基阿里他汀F(MMAF)、倍癌霉素和例如N2’-去乙酰-N2’-(3-巯基-1-氧代丙基)-美登素(DM1)和N2’-去乙酰基-N2’-(4-巯基-4-甲基-1-氧代戊基)美登素(DM4)。
本文还提供了优选抗体偶联物的结构,例如:如式(VII)所示的Ab-mc-vc-PAB-MMAE,其中“s”是从1到20变化的整数;如式(VIII)所示的Ab-mc-MMAF,其中“t”是从1-20变化的整数;如式(IX)所示的Ab-SMCC-DM1,其中“v”是从1-60变化的整数;如式(X)所示的Ab-SPDB-DM4,其中“u”是从1-60变化的整数。式(XI)所示的Ab-MB-vc-倍癌霉素,其中“y”是从1-20变化的整数。
Ab-mc-vc-PAB-MMAE
Ab-mc-MMAF
Ab-SMCC-DM1
Ab-SPDB-DM4(X)
Ab-MB-VC-倍癌霉素(XI)
其中,“s”是从1-20变化的一个整数,“t”是从1-20变化的一个整数,“u”是从1-60变化的一个整数,“v”是从1-60变化的一个整数,“y”是从1-20变化的一个整数并且“Ab”是本发明的抗体或抗原结合片段。
在抗体药物偶联物中,特别地,具有式Ab(-L-D)n的抗体药物偶联物,所述的连接子可以在一端与抗体或抗原结合片段的活性基团反应,并且还能够在另一端与药物部分的其他反应基团反应,因此,将抗体和药物相连,形成抗体药物偶联物。
在一些实施方式中,所述的连接子能够与抗体或其抗原结合片段半胱氨酸巯基反应。可以使用任何适当的抗体或者抗原结合片段的半胱氨酸残基用于连接子反应。在一些实施方式中,所述的抗体或抗原结合片段具有有限数量的半胱氨酸巯基(例如,1、2、3、4、5、6、7、8、9、10等)适合与连接子反应。例如,在抗体或者抗原结合片段的一些存在的二硫键可以使用例如二硫苏糖醇(DTT)得到还原,从而释放一个或多个用于连接子反应的巯基。适用于与抗体中巯基反应的连接子可以包括而不限定于mc-vc-PAB、mc和MB-vc。连接子与半胱氨酸巯基反应抗体-药物偶联物的实例是Ab-mc-vc-PAB-MMAE和Ab-mc-MMAF和Ab-MB-vc-倍癌霉素。
在一些实施方式中,所述的连接子能够抗体或其抗原结合片段赖氨酸残基上的氨基酸反应,在一个实施例中,所述的连接子将抗体或抗原结合片段通过抗体赖氨酸残基和也含有硫醚分子或二硫键的活性酯之间形成的共价氨键连接到例如美登素的药物。优选的美登素是DM1和DM4,DM1和DM4的结构分别如式(XI)和式(XII)所表示:
在一些实施方式中,抗体或其抗原结合片段分子可以与超过一分子药物部分偶联。例如,所述的抗体或抗原结合片段可以包括超过一个用于连接子反应的活性基团。因此,导致了超过一个连接子或药物分子偶联。在这种情况下,所述的抗体药物偶联物可以是在特定分布范围的带有变化数目的偶联连接子或药物分子的偶联物的混合物。每个抗体的药物分子平均值可以按照重量均值计算得出。∑i*(Ab-(LD)i%),其中i是抗体或抗原结合片段药物分子的数值,这如Ab-(LD)i所示,并且能够从0到60变化。每个特定种类Ab-(LD)i的百分率如(Ab-(LD)i)%所示。ADC混合物的负载率(药物/抗体比例,或者DAR)可以以不同的方式进行控制,包括以下的一种或所有:(i)限定药物连接子中间体或者连接子制剂相对于抗体的摩尔过量,(ii)限定偶联反应时间或者温度,(iii)半胱氨酸巯基修饰的部分或者限定还原条件和控制游离半胱氨酸的数目,引入抗体或抗原结合片段的重链和/或轻链的蛋氨酸或NNAA数目。
在优选的实施例中,所述的连接子包括聚乙二醇部分,例如Ab-MB-vc-倍癌霉素。连接子的PEG部分可以在1到50单位长度,在优选的实施例中,所述的PEG部分具有1-12个重复单位,更优选地,2-6个重复单位。所述的PEG部分降低了药物偶联到抗体时可能发生的聚合度。
在另外优选地实施例中,所述的连接子包括肽序列。具有肽连接子的抗体药物偶联物的实例包括而不限定于,mc-vc-PAB-MMAE和MB-vc-倍癌霉素。在一些实施方式中,可以基于多肽序列的氨基酸对酶裂解适应情况进行选择。例如:与蛋白酶相关的肿瘤,在优选的实施例中,肽连接子包括两个氨基酸连接子val-cit。然而,具有两个或超过两个氨基酸残基的其他氨基酸组合物可以类似方式工作,这也是公知的。
在一个实施方式中,偶联物的连接子包括非裂解连接子和可裂解的连接子。非裂解的连接子是以稳定、共价情况下,能够将药物连接到抗体或抗原结合片段的化学分子。连接连接子上的药物通过抗体序列的断裂释放出来,并且连接到连接子上的氨基酸(例如赖氨酸或半胱氨酸)游离而出。非裂解连接子基本上耐受酸引发的裂解、光引发的裂解、肽酶引发的裂解、酯酶引发的裂解和二硫键裂解。非裂解连接子的实例包括涉及氨键和硫醚的连接子,例如:SMCC和mc。可裂解的连接子能够通过蛋白酶、肽酶、酯酶、光、酸或二硫键断裂例如裂解,马来酰亚胺基己酰基-缬氨酸-瓜氨酸-p-氨基苄氧羰基和MB-vc进行裂解。从抗体的可裂解的连接子释放药物并保持抗体完整性,这是可能的。
在一些实施方式中,连接到本文公开的抗体或抗原结合片段的偶联物可以包括一种或多种可检测的标记物。这些标记物包括但不限定于放射性同位素例如:123I、124I、125I、131I、35S、3H、111In、112In、14C、64Cu、67Cu、86Y、88Y、90Y、177Lu、211At、186Re、188Re、153Sm、212Bi和32P。其他镧系元素、发光标记物、例如荧光素、罗丹明、丹酰、藻红蛋白或德克萨斯红和例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或β-D-半乳糖苷酶的酶底物标记物。
在一些实施方式中,连接到本文公开的抗体或抗原结合片段的偶联物可以包括一种或多种毒素。该毒素可以相同或不同。不同的毒素表示具有相同或不同行为机制的(MOA)的不同分子负载在相同单抗或单抗片段。这些毒素可以靶向表达ER-α36的细胞并且因此在靶向细胞上发挥细胞毒性。适合的毒素包括而不限定于通过例如vc或mc连接子的例如MMAE和MMAF的阿里他汀(西雅图基因)、例如DM1、DM3和DM4(免疫基因)的美登素、卡奇霉素(辉瑞)、倍癌霉素(欣欣(Synthon))、PBD二聚体(斯毕瑞根(Spirogen),西雅图基因和罗氏,参见US8426402)和作为RNA聚合酶抑制剂(海德堡制药(HeidelbergPharma))的毒伞毒素(例如阿玛尼汀(Amanitin))。
本文还提供了连接到偶联物的抗体及其抗原结合片段使用的方法。在特定的实施方式,偶联的抗体和抗原结合片段可以以治疗有效剂量施予受试体,从而治疗、预防或缓解与ER-α36相关的疾病,抑制ER-α36表达细胞的增殖,减少ER-α36表达细胞,和/或杀死ER-α36表达细胞。所述的抗体和抗原结合片段特异性靶向ER-α36表达细胞,因此使得偶联物(例如,毒素、化疗药物)特异性靶向所述的偶联物可以发挥治疗效果的ER-α36表达细胞。通过偶联制剂的这种靶向给药,偶联物的功效可以得到明显提高,并且由非特异性活性引起的毒性可以得到极大地降低。在一些实施方式中,当作为偶联抗体或抗原结合片段给药时,偶联物的治疗有效摩尔量可以比没有偶联到本文提供的抗体或抗原结合片段时要求的有所降低(例如:至少10%、20%、30%、40%、50%或更高)。
在一些实施方式中,本文提供的抗体或抗原结合片段可以作为包括一种或多种药学上可接受载体的药物组合物的一部分进行给药。本文公开的在药物组合物中使用的药学上可接受的载体可以包括例如药学上可接受的液体、凝胶或固体载体、水性载体、非水载体、抗菌制剂、等渗剂、缓冲剂、抗氧化剂、麻醉剂、悬浮剂/分散剂、螯合剂或络合剂、稀释剂、佐剂、辅料或非毒性辅料,本领域已知的其他成分或其多种组合。
适合的成分可以包括例如抗氧化剂、填充剂、粘合剂、崩解剂、缓冲剂、防腐剂、润滑剂、调味剂、增稠剂、染色剂、乳化剂或例如糖和环胡精的稳定剂。适当的抗氧化剂可以包括例如:蛋氨酸、抗坏血酸、EDTA、硫代硫酸钠、铂、抗氧化酶、柠檬酸、半胱氨酸、硫代甘油、硫代乙醇酸、硫代山梨醇糖、丁基茴香醚、丁基苯甲醇和/或没食子酸丙酯。如本文公开,一种或多种抗氧化剂包括例如在含有抗体或抗原结合片段和本文提供的偶联物的组合物中的蛋氨酸降低了所述抗体或抗原结合片段的氧化。该氧化还原阻止或减少了结合亲合力的损失,因此提高了抗体稳定性并且延长了保存期。因此,在一些实施方式中,所提供的组合物包括本文公开的一种或多种抗体或抗原结合片段以及如蛋氨酸的一种或多种抗氧化剂。还提供了用于阻止本文提供的抗体或抗原结合片段氧化、延长本文提供的抗体或抗原结合片段保护期和/或提高本文提供的抗体或抗原结合片段的效力的方法,通过将所述的抗体或抗原结合片段与一种或多种例如蛋氨酸的抗氧化剂混合。
为了进一步说明,药学上可接受的载体可以包括例如氯化钠注射剂的含水载体,林格液注射液、等渗葡萄糖注射液、无菌水注射液、或葡萄糖和乳酸格林注射液、无水载体例如植物来源的不挥发性油、棉籽油、玉米油、芝麻油或花生油,以抗菌或抑菌浓度的的抗菌剂,如氯化钠或葡萄糖的等渗制剂、如磷酸盐或柠檬酸缓冲液的缓冲液,例如硫酸氢钠的抗氧化剂、例如盐酸普鲁卡因的局部麻醉剂、例如羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素或聚乙烯吡咯烷酮的悬浮剂和分散剂,例如聚山梨醇酯80的乳化剂(吐温-80)、例如EDTA(乙二胺四乙酸)或EGTA(乙二醇四乙酸)、乙醇、聚乙二醇、丙二醇、氢氧化钠、盐酸、柠檬酸或乳酸的螯合剂或络合剂。作为载体使用的抗菌剂可以添加到包括苯酚或甲酚、汞、苯甲醇、氯丁醇、甲基和丙基P-羟基苯甲酸酯、硫柳汞、苯扎氯铵和苄索氯铵的多剂量包装的药物组合物中。适当的辅料可以包括例如水、盐溶液、葡萄糖、乙二醇或乙醇。适当的非毒性辅助物质可以包括例如:润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂、稳定剂、增溶剂或例如醋酸钠、失水山梨醇单月桂酸酯、油酸三乙胺或环糊精的制剂。
本文提供抗体或其抗原结合片段的治疗有效剂量将依赖本领域公知的多种因素,例如体重、年龄、既往病史、当前药物、受试体的健康状况和关于交叉反应、过敏、敏感性和副作用以及给药途径和肿瘤发展程度的潜在可能性。剂量可以由本领域普通技术人员(例如,医师或兽医)通过这些或者其他情况或要求的指示按比例地减少或增加。
在一些实施方式中,本文提供的抗体或抗原结合片段可以以大约0.01mg/kg到大约100mg/kg(例如,大约0.01mg/kg、大约0.5mg/kg、大约1mg/kg、大约2mg/kg、大约5mg/kg、大约10mg/kg、大约15mg/kg、大约20mg/kg、大约25mg/kg、大约30mg/kg、大约35mg/kg、大约40mg/kg、大约45mg/kg、大约50mg/kg、大约55mg/kg、大约60mg/kg、大约65mg/kg、大约70mg/kg、大约75mg/kg、大约80mg/kg、大约85mg/kg、大约90mg/kg、大约95mg/kg或大约100mg/kg)的治疗有效剂量进行施用。在这些一些实施方式中,所述的抗体或抗原结合片段以大约50mg/kg或更少的剂量给药,并且在这些一些实施方式中,所述的剂量是10mg/kg或更少、5mg/kg或更少、1mg/kg或更少、0.5mg/kg或更少、或0.1mg/kg或更少。在一些实施方式中,所述的给药剂量可以在整个治疗过程中变化。例如,在一些实施方式中,起始的给药剂量可以高于接下来的给药剂量,在一些实施方式中,所述的给药剂量在治疗过程中依赖受试体的反应进行改变。
可以调整剂量方案从而提供最好的想要的反应(例如,治疗反应)。例如,可以随着时间单一剂量或者分剂量给药。
本文公开的抗体和抗原结合片段可以通过本领域已知的路径给药,例如胃肠外(例如,皮下、腹腔、静脉注射包括静脉输液、肌内或皮内注射)或非注射(例如口服、鼻内、眼内、舌下、直肠或局部)路径。在所述的抗体或抗原结合片段通过注射给药的实施例中,可注射的药物组合物可以以任何常规的形式制备,例如液体溶液、悬浮液、乳化液或适合生成液体溶液、悬浮液或乳化液的固体形式。注射液的制备可以包括准备注射的无菌和/或非引起发热的溶液。无菌干燥的可溶性产品,例如冻干粉,在使用前准备与溶剂相结合,包括皮下注射片,准备注射的无菌悬浮液,使用前准备与载体相结合的无菌干燥不可溶产品和无菌和/或非引起发热的乳化剂。所述的溶液可以是含水的或者不含水。
在一些实施方式中,单位剂量的胃肠外制剂以安瓿、小瓶或带针头的注射器形式包装。胃肠外给药的所有制剂应该是无菌的和非引起发热的,正如本领域公知和公用的一样。
在特定的实施中,无菌、冻干粉通过将本文公开的抗体或抗原结合片段溶解于适合的溶剂中制备而成。所述的溶液可以包括提高稳定性的赋形剂,或者粉末或由粉末制成的重组溶液中的药理成分。可以使用的赋形剂包括而不限定于水、右旋糖、山梨糖醇、果糖、玉米糖浆、木糖醇、甘油、葡萄糖、蔗糖或其他可溶制剂。所述的溶剂可以包括缓冲剂,例如柠檬酸、磷酸钠或磷酸钾,或者本领域人员公知的其他这类缓冲剂。在一个实施例中,大约中性pH。溶液随后灭菌过滤,接下来在本领域技术人员已知标准条件下冷冻干燥提供了想要的剂型。在一个实施例中,最终的溶液将分配到小瓶中用于冷冻干燥。每个小瓶能够容纳单一剂量或多剂量的抗-hER抗体或其抗原结合片段或者其组合物。少量超过需要的一个剂量或一组剂量(例如,大约10%)的过量瓶是可接受的从而便于准确的样品取出和准确的剂量。所述的冻干粉末可以在适当的条件下储藏,例如大约4℃到室温。
用水复建用来注射的冻干粉提供了一种用于胃肠外给药的剂型。在一个实施例中,用于复建无菌和/或非引起发热的水或其他液体可溶性载体添加到冻干粉末。精确量依赖于给定的选定的治疗并且能够凭经验决定。
本文提供的抗体和抗原结合片段可以以多种非治疗用途使用。在一些实施方式中,所述的抗体或抗原结合片段可以作为亲和纯化制剂使用以纯化ER-α36或其片段。在这些实施方式中,所述的抗体或抗原结合片段可以使用本领域已知方法固定于例如树脂或滤纸的固定相。可以使用所述的抗体或抗原结合片段从溶液中沉淀ER-α36及其片段。在其他非治疗性实施方式中,可以在多种体外或体内诊断或检测应用中使用所述的抗体或抗原结合片段。在这些一些实施方式中,所述的抗体或抗原结合片段可以结合到检测标记物。所述的抗体或抗原结合片段可以结合到检测标记物。在其他实施例中,所述的抗体或抗原结合片段不能结合到检测标记物,却可以使用结合到抗体的标记第二抗体得以检测。在一些实施方式中,可以使用本文公开的抗体或抗原结合片段以检测ER-α36的表达。在这些一些实施方式中,可以使用所述的抗体或抗原结合片段诊断与ER-α36表达相关的升高或降低状况。例如,所述的抗体或抗原结合片段可以与来自受检者的生物样品相接触,从而诊断受检者ER-α36表达升高或降低相关的状况。特别地,与ER-α36相关的进展或衰退状况。类似地,所述的抗体或抗原结合片段可以直接施用于受检者,使用本领域公知的方法通过与受检的ER-α36相结合。
在一些实施方式中,提供了编码本文抗体或抗原结合片段的分离的核苷酸,包括核苷酸的载体和宿主细胞以及用于制备抗体的重组技术。
对于抗体的重组制备,编码它的核苷酸可以得到分离并且***到可复制的载体用于进一步的克隆(DNA的扩大)或者表达。在其他实施例中,所述的抗体可以通过本领域的已知的同源重组制备,DNA编码的单克隆抗体使用常规程序容易分离和测序。(例如,通过使用能够特异性结合到编码抗体重链和轻链基因的寡核苷酸探针)很多载体是可以得到的。所述的载体成分通常包括但不限定于以下列举的一种或多种:信号序列、复制源、标记基因的一种或多种、增强子元件、启动子和转录终止序列。
用于克隆或在本文的载体中表达DNA的合适的宿主细胞是如上描述的原核生物细胞、酵母菌或高等真核细胞。用于该目的的适当原核生物细胞包括真细菌,例如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体,例如大肠杆菌、肠杆菌、欧文氏菌、克雷伯氏菌、变形杆菌的肠杆菌科;沙门氏菌如鼠伤寒沙门氏菌;沙雷氏菌例如粘质沙雷氏菌和志贺菌;以及杆菌,例如枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌;假单胞菌,例如铜绿假单胞菌和链霉菌。
除了原核生物,真核微生物例如丝状真菌或酵母菌适合作为克隆或作为抗-ER抗体编码载体的表达宿主。酿酒酵母或普通面包酵母是在低等真核宿主微生物中最广泛使用的。然而,通常可以得到并使用本文的大量其他属、种和品系,例如粟酒裂殖酵母;克鲁维酵母宿主例如乳酸克鲁维酵母、脆壁克鲁维酵母(ATCC12,424)、保加利亚克鲁维酵母(ATCC16,045)、威克克鲁维酵母(ATCC24,178)、克鲁雄酵母(ATCC56,500)、果蝇克鲁维酵母(ATCC36,906)、耐热克鲁维酵母(K.thermotolerants)和马克斯克鲁维酵母(K.marxianus)、耶罗维亚酵母(yarrowia)(EP402,226)、毕赤酵母(Pichiapastoris)(EP183,070)、念珠菌、里氏木霉(EP244,234)、链孢霉;例如许旺酵母菌(Schwanniomycesoccidentalis)的许旺酵母菌属(Schwanniomyces)和例如脉孢霉(Neurospora)、青霉菌、真菌和黄曲霉(Aspergillushosts)例如构巢曲霉(A.nidulans)和黑曲霉(A.niger)的丝状真菌。
用于表达提供的糖基化抗体和抗原结合片段的适当的宿主细胞衍生于多细胞生物。无脊椎动物的细胞的实例包括植物和昆虫细胞。许多病毒株和变异体以及来源寄主相应允许的昆虫宿主细胞,例如:草地夜蛾(毛虫)、埃及伊蚊(蚊子)、白纹伊蚊(蚊子)、黑腹果蝇(果蝇)和桑蚕已经得到了证实。用来转染的多种病毒株是公众可以得到的,例如苜蓿银纹夜蛾NPV的L-1变异体和家蚕NPV的Bm-5菌株,并且这种病毒可以按照本发明,特别用于草地夜蛾细胞的转染。棉花、玉米、马铃薯、大豆、矮牵牛、番茄和烟草的植物细胞培养物也可以作为宿主使用。
然而,对无脊椎动物细胞的兴趣已经很大,并且培养(组织培养)中的无脊椎动物细胞的繁殖已经变成常规的程序。有用的哺乳动物宿主细胞系的实例是由SV40(COS-7,ATCCCRL1651)转变的猴肾CV1细胞;人胚肾(在悬浮培养中生长的293细胞或亚克隆的293细胞Graham等,《普通病毒学(J.GenVirol.)》36:59(1977)),幼仓鼠肾细胞(BHK,ATCCCCL10);中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO,Urlaub等,《美国科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.)》美国77:4216(1980)小鼠睾丸支持细胞(TM4,Mather,《生殖生物学(Biol.Reprod.)》23:243-251(1980));猴肾细胞(CV1ATCCCCL70);非洲绿猴肾细胞(VERO-76,ATCCCRL-1587);人***细胞(HELA,ATCCCCL2);犬肾细胞(MDCK,ATCCCCL34);布法罗大鼠肝细胞(BRL3A,ATCCCRL1442);人肺细胞(W138,ATCCCCL75);人肝细胞(HepG2,HB8065);小鼠乳腺肿瘤(MMT060562,ATCCCCL51);TRI细胞(Mather等,《纽约科学年报(AnnalsN.Y.Acad.Sci.)》383:44-68(1982));MRC5细胞;;FS4细胞;和人肝肿瘤细胞株(HepG2)。
宿主细胞用以上描述的表达或者用于抗-ER抗体制备的克隆载体进行转化,并且宿主细胞在按照适合诱导启动子、选择转化子或扩增编码想要序列基因改良的传统的营养培养基中进行培养。
制备本文提供的抗体或抗原结合片段使用的宿主细胞可以在多种培养基中培养。商业上可以获得的培养基例如汉斯(Ham's)F10(西格玛)、最小必要培养基(MEM)(西格玛)、RPMI-1640(西格玛)和达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco'sModifiedEagle'sMedium)((DMEM),西格玛)是适合于培养宿主细胞的。另外,在Ham等,Meth.Enz.58:44(1979),Barnes等,《生物化学年报(Anal.Biochem.)102:255(1980),美国专利号4,767,704;4,657,866;4,927,762;4,560,655或5,122,469;WO90/03430;WO87/00195;或者美国专利参见30,985可以用于宿主细胞的培养基。这些培养基中的任何一种在需要时可以补充激素和/或其他生长因子(例如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐(例如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲液(例如羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、核苷酸(例如腺苷和胸苷)、抗生素(例如GENTAMYCIN.TM药)、微量元素(如无机化合物定义通常以最终浓度为微摩尔范围出现)以及葡萄糖或者等效能量源。也可以以本领域人员公知合适的浓度包括任何其他必要的补充物。所述的培养条件例如温度、pH等是那些以前和选择用于表达的宿主细胞一起使用的,并且对于普通技术人员而言是显而易见的。
当使用重组技术时,所述的抗体能在细胞内、壁膜间隙制备或直接分泌于培养基内。如果所述的抗体在细胞内制备,第一步,去除颗粒物或者宿主细胞或裂解碎片,例如,通过离心或者超滤。Carter等,生物/技术10:163-167(1992)描述了一种分离分泌到大肠杆菌壁膜间隙的抗体的程序。简言之,细胞体在醋酸钠(pH3.5)、EDTA和苯甲基磺酰氟存在下解冻大约30分钟。细胞碎片能够通过离心去除。当抗体分泌到培养基上,这种表达体系的上清液通常首先使用商业上可得到的蛋白离心过滤器例如,超滤或微孔超滤单元进行离心。例如PMSF的蛋白酶抑制剂可以包括于前述的任何一种步骤以抑制蛋白水解并且可以增加抗生素以阻止外来污染物的生长。
通过细胞制备的抗体可以使用例如羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析和亲和层析进行纯化,亲和层析是优选的纯化技术。蛋白A作为亲和配体的适合性依赖于抗体存在的任何免疫球蛋白Fc域的种类和同种型。蛋白A可以用于纯化基于人的抗体重链的γ1、γ2、γ3或γ4(Lindmark等,《免疫方法杂志(J.Immunol.Meth.)》62:1-13(1983)。蛋白G是用于所有鼠同种型和是人的γ3的重组(Guss等,EMBOJ.5:15671575(1986))。亲和配体结合的基质最普遍的是琼脂糖,然而也可以使用其他基质。物理上稳定的基质例如受控的孔度玻璃或聚(苯乙烯-二乙烯)苯能比琼脂糖达到更快的流速和更短的操作时间。其中在所述的抗体包括C.亚.H3域,BakerbondABX.TM.树脂(J.T.Baker,Phillipsburg,N.J.)可用于纯化。其他用于蛋白纯化的技术,例如在离子交换柱上分离、乙醇沉淀、反相HPLC、硅胶色谱层析、在肝素SEPHAROSE.TM色谱层析、阴阳离子交换树脂(例如聚天门冬氨酸色谱柱)色谱层析、聚焦层析、十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和硫酸铵沉淀也可以根据待回收的抗体进行使用。
在任何最初的纯化步骤之后,包括感兴趣的抗体和污染物的混合物可以经过使用pH在大约2.5-4.5之间的洗脱液,优选在低盐浓度(例如从大约0-0.25M盐)下用低pH疏水作用色谱进行处理。
在一些实施方式中,本文提供的抗体或抗原结合片段可以提供在试剂盒中,即,预先确定量的制剂和实施诊断检测说明书的包装组合。其中所述的抗体用酶进行标记,试剂盒将包括底物和酶要求的辅酶因子(例如,提供检测生色团或荧光团的底物前体)。另外,可以包括其他添加物例如稳定剂、缓冲剂(例如封闭缓冲或裂解缓冲)等等。多种制剂的相对量可以大范围变化以提供制剂的溶液浓度,基本上优化了检测的敏感度。特别地,可以以干燥粉末形式提供制剂,通常为冻干,还包括赋形剂,从而在溶解时将提供制剂溶液具有适当浓度的赋形剂。
在一些实施方式中,提供了包括用于治疗以上描述状况材料的制品。该制片包括容器和标签。适合的容器包括例如,瓶子、小瓶、注射器和试管。所述的容器可以由例如玻璃或塑料的多种材料制成。该容器容纳本文提供的对所述状况有效的药学组合物(包括本文公开的抗体或抗原结合片段)并且可以有消毒入口(例如,该容器可以是静脉溶液袋或可以通过皮下注射针可刺破的带塞子小瓶)。容器上或与容器相关的标签表明组合物用来治疗供选择的状况。所述制品还可以包括含有药物可接受缓冲液的第二个容器,例如磷酸盐缓冲液、林格液溶液和葡萄糖溶液。它还包括其他从商业和用户观点想要的材料,包括其他缓冲液、稀释液、过滤器、针、注射器和指导使用的包装说明书。
提供以下的实施例更好地说明要求的发明而不应解释为限制发明的范围。所有以下的描述的特定组合物、材料和方法,在总体上或部分落入本发明的范围内。特定的组合物、材料和方法不用来限制本发明,而是仅仅解释落入本发明范围的一些实施方式。本领域技术人员无需创造能力并且不偏离本发明范围即可开发等同的组合物、材料和方法。可以理解在本文公开的流程进行多种改变同时依然在本发明的范围内。发明人的目的是这些变化包括在本发明的范围内。