CN101250106B

CN101250106B - 一种提取绿原酸的方法

Info

Publication number: CN101250106B
Application number: CN2008101028634A
Authority: CN
Inventors: 宋曙辉; 许勇; 张宝海; 王文琪; 何洪巨; 唐晓伟; 冯丽
Original assignee: Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences
Current assignee: Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences
Priority date: 2008-03-27
Filing date: 2008-03-27
Publication date: 2011-05-18
Anticipated expiration: 2028-03-27
Also published as: CN101250106A

Abstract

本发明公开了一种提取绿原酸的方法。该方法，包括下述步骤：1)将朝鲜蓟叶片与乙醇溶液混和，在液相中乙醇的体积百分比浓度为60-80％的条件下提取，收集液相得到提取液；2)在提取液中加入澄清剂，沉淀溶液中的蛋白、鞣质、树胶杂质，过滤得到滤液；3)将滤液过以大孔树脂为填料的层析柱，先用水淋洗至洗脱液无色，然后以pH值为1-3的乙醇溶液为洗脱剂洗脱，回收含有绿原酸的洗脱液；4)浓缩含有绿原酸的洗脱液得到含有绿原酸的固体，然后用体积百分浓度为95％以上的乙醇溶液、水依次重悬洗涤3-5次。本发明的方法得到绿原酸的纯度达到90％以上，生产成本低，得到的产品安全性好。

Description

一种提取绿原酸的方法

技术领域

本发明涉及一种提取绿原酸的方法，特别涉及一种从朝鲜蓟叶中提取绿原酸的方法。

背景技术

朝鲜蓟原产地中海沿岸的北非和南欧。作为一种多年生草药早在古罗马，古希腊时就被用作治疗消化不良和保肝。朝鲜蓟的可食用部分主要为未开放花蕾的花托和花苞基部。我国目前在云南，浙江地区有较大面积的栽培。主要以出口花蕾的罐头产品。随着国际贸易的进一步扩大，朝鲜蓟的生产面积和加工产量都将进一步提高。作为副产品的叶片产量也将大大增加，一株朝鲜蓟叶片的产量远远高于花球。而目前的叶片处理或弃掉，或作为饲料。已有的研究表明，叶片中含有较多的多酚类化合物，以其中的绿原酸含量最高，最高的可达4％以上(以干重计)，可以达到甚至超过金银花或元宝枫及杜仲叶中的绿原酸含量。根据我们的测定，不同品种的朝鲜蓟叶片中的含量不同，不同生长期的叶片中绿原酸含量差异也较大。

绿原酸(chlorogenic acid)，化学名称3-O-咖啡酰奎尼酸。具有抗菌，消炎，利胆，利尿，降脂，降压，抗氧化，抗肿瘤等多种功能。最新的研究又表明，绿原酸在抗艾滋病，治疗糖尿病等方面也有一定的疗效。

目前，已有多项专利申请绿原酸的提取纯化.所用主要原料为金银花，杜仲叶，另有从牛蒡叶，元宝枫叶等原料中提取。这些专利中使用了较多的有机试剂，如甲醇(03111946.8；200310111180.2)，氯仿(200510000484.0)，丙酮，石油醚，乙酸乙酯(专利申请号200510020706.5；200410035758.5)等，使得提取和纯化过程较为复杂，易引入有机溶剂的残留。

发明内容

本发明的目的是提供一种提取绿原酸的方法。

本发明所提供的提取绿原酸的方法，可包括下述步骤：

1)将朝鲜蓟叶片与乙醇溶液混和，在液相中乙醇的体积百分比浓度为60-80％的条件下提取，收集液相得到提取液；

2)在步骤1)得到的提取液中加入澄清剂，沉淀溶液中的蛋白、鞣质、树胶杂质，过滤得到滤液；

3)将步骤2)得到的滤液过以大孔树脂为填料的层析柱，先用水淋洗至洗脱液无色，然后以pH值为1-3的乙醇溶液为洗脱剂洗脱，回收含有绿原酸的洗脱液；

4)浓缩步骤3)得到的含有绿原酸的洗脱液得到含有绿原酸的固体，然后用体积百分浓度为95％以上的乙醇溶液和水分别重悬洗涤3-5次。

所述方法中，所述步骤1)中，所述朝鲜蓟叶片先经干燥粉碎后得到朝鲜蓟叶片粉末再与体积百分比浓度为60-80％的乙醇溶液混和提取，或直接与体积百分比浓度为90-97％的乙醇溶液匀浆提取。

所述朝鲜蓟叶片先经干燥粉碎后得到朝鲜蓟叶片粉末与所述体积百分比浓度为60-80％的乙醇溶液混和的比例为1kg∶7-9L；所述朝鲜蓟叶片与所述90-97％的乙醇溶液的比例为1kg∶2-3L。所述朝鲜蓟叶片粉末的大小为20-40目。

所述方法中，所述步骤2)中，所述澄清剂为ZTC-II型澄清剂。

所述方法中，所述步骤2)中，所述ZTC-II型澄清剂中澄清剂A的添加的终质量百分浓度为1-2％；所述ZTC-II型澄清剂中澄清剂B的添加的终质量百分浓度为2-4％。

所述方法中，所述步骤3)中，所述大孔树脂优选为粒径为0.3-1.25mm的苯乙烯型吸附树脂。

所述方法中，所述步骤3)中，所述洗脱剂的pH值用盐酸溶液调节。所述洗脱剂中的乙醇的体积百分比浓度为60-80％。所述洗脱剂优选为含0.05M盐酸的体积百分浓度为60-80％的乙醇溶液。

所述方法中，所述步骤1)，将所述提取后得到的滤渣可重新用体积百分含量为60-80％的乙醇溶液进行提取，合并两次提取的液相得到提取液。

本发明的方法是使用乙醇(食品级)作为提取剂和纯化剂，提取在常温下进行，可用生产用萃取罐可用多功能搅拌或匀浆提取罐，生产成本低。本发明的方法使用一次柱层析纯化粗提物，经过醇洗和水洗进行精制后得到的绿原酸提取物中绿原酸的纯度达到90％以上。

附图说明

图1为本发明方法的流程图

具体实施方式

下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。

下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。

下述实施例中的方法，如无特别说明，均在常温下(15-28℃)进行。

本发明的方法主要包括下述步骤(流程图如图1所示)：

1、材料准备：朝鲜蓟叶片采收，晾干或通氮烘干，粉碎成20-40目的粒度的朝鲜蓟干叶片粉末；或者直接采集朝鲜蓟鲜叶片备用。

2、提取：将步骤1制备的朝鲜蓟干叶片粉末按1kg∶7-9L的比例加入体积百分浓度为60-80％的乙醇溶液，搅拌提取2小时以上(为了节省时间可选择2-3小时)，过滤收集滤液即得到提取液；可将滤渣进行第二次提取，第二次提取按朝鲜蓟干叶片粉末原料与乙醇溶液1kg∶4-6L的比例在滤渣中加入体积百分浓度为60-80％的乙醇溶液，回收两次提取得到的提取液；

或者将步骤1制备的朝鲜蓟鲜叶片按1kg∶2-3L的比例加入体积百分浓度为90-97％的乙醇溶液中，匀浆，静置1-2小时，间歇搅拌2-3次，过滤收集滤液即得到提取液；可将滤渣进行第二次提取，第二次提取按滤渣与乙醇溶液1kg∶1L的比例在滤渣中加入体积百分浓度为60-80％的乙醇溶液，回收两次提取得到的提取液；

第二次提取得到的滤液可根据工业生产线的需要，可直接用于下一批原料的第一次提取，然后再合并提取液。

3、沉降：将步骤2得到的提取液浓缩，加入澄清剂B和A，搅拌后沉降，沉降后，吸取上清液，离心后获得最终提取液。

4、纯化：将步骤3得到的提取液加入以大孔吸附树脂为填料的层析柱，用水淋洗直至流出液无色为止，然后以含酸0.05M(盐酸、硫酸、磷酸、乙酸等)的60％-80％乙醇溶液进行柱层析，收集含绿原酸部分的洗脱液。

5、脱色脱盐：将步骤4得到的含绿原酸部分的洗脱液用1mol/L的碳酸钠溶液调节pH值至6.0-6.5，浓缩至近干得到固体。将浓缩得到的固体加入体积百分浓度为95％的乙醇悬浮，离心获得沉淀。然后再用水悬浮洗涤进行脱盐(水洗脱盐)，离心得到沉淀，干燥后得粗产品，约含绿原酸30％。再以水悬浮洗涤再脱盐、脱去水溶性色素；以95％乙醇溶液悬浮洗涤脱去脂溶性成分和色素。如此反复3-4次，最终产品绿原酸含量在90％以上。

以下述具体实施例为例，说明本发明的方法和效果。

实施例1、从朝鲜蓟叶中提取绿原酸的方法及其效果验证

按照下述的步骤从朝鲜蓟叶中提取绿原酸：

1、朝鲜蓟叶片晾干或通氮烘干，粉碎成20-40目的粒度的朝鲜蓟干叶片粉末；称取10公斤朝鲜蓟干叶片粉末加入90升体积百分浓度为70％的乙醇溶液，搅拌提取3小时，过滤，收集过滤液得到第一次提取液。将滤渣进行第二次提取，按1kg朝鲜蓟干叶片粉末：4L体积百分浓度为70％乙醇溶液的量加入40升体积百分浓度为70％乙醇溶液，提取2小时。第二次提取完毕，静止沉降后吸取上清液，将沉淀进行100目膜过滤得到滤液，合并滤液和上清液得到第二次提取液。合并第一次和第二次提取的提取液，即得到乙醇提取液。

2、将步骤1得到的乙醇提取液在50℃减压浓缩至原液体积的1/4，加入ZTC-II型澄清剂(天津正天成澄清技术有限公司)的澄清剂B使其终质量百分比浓度为2％加入，ZTC-II型澄清剂(天津正天成澄清技术有限公司)的澄清剂A使其终质量百分比浓度为1％，每30分钟间歇搅拌一次，2小时后，室温沉降过夜(静置15小时)，分离上清液和沉淀，去除沉淀，得到上清液。

3、用粒径为1mm的ADS-21型大孔树脂装层析柱(柱长为100cm，柱体积为3.0L)，用水洗去除杂质；然后将步骤2得到的上清液按每小时两个柱体积的速度过层析柱，直到流出液刚刚检测到绿原酸为止。然后用水淋洗柱，直至流出液基本无色。用含0.05M的盐酸的体积百分浓度为70％的乙醇溶液为洗脱剂进行洗脱绿原酸，以颜色变深为流出液接收开始，洗脱4-5个柱体积，合并含绿原酸的洗脱液。以水淋洗层析柱，直至流出液呈中性。

4、将步骤3得到的洗脱液，用1mol/L碳酸钠溶液调节pH值至6.0-6.5，然后在50℃，减压浓缩至近干(含水质量百分含量为5-10％)，得到固体。然后将得到的固体用体积百分含量为95％乙醇溶液悬浮充分洗涤，沉降后离心得沉淀物。再以水悬浮洗涤脱去其中的绝大部分盐，沉淀物干燥后得粗产品500克，经过HPLC测定表明，该粗产品中绿原酸质量百分含量为35％。

重复步骤4采用体积百分含量为95％乙醇溶液悬浮洗涤，用水悬浮洗涤，重复3次干燥后得到80g白色粉末。经HPLC测定表明最终产品中绿原酸质量百分含量为93.7％。

实施例2、从朝鲜蓟叶中提取绿原酸的方法及其效果验证

按照下述的步骤从朝鲜蓟叶中提取绿原酸：

1、称取10公斤朝鲜蓟鲜叶片加入20升体积百分浓度为95％的乙醇溶液，用捣碎机匀浆。匀浆后液相的乙醇体积百分浓度为68％，静置2小时，间歇搅拌2-3次，过滤，收集过滤液得到第一次提取液。将滤渣进行第二次提取，按1kg滤渣∶1L体积百分浓度为70％乙醇溶液的量将滤渣与70％乙醇溶液混和，搅拌机搅拌30分钟得到第二次提取液。合并第一次和第二次提取得提取液，即得到乙醇提取液。

2、将步骤1得到的乙醇提取液在50℃减压浓缩至原液体积的1/4，ZTC-II型澄清剂(天津正天成澄清技术有限公司)的澄清剂B使其终质量百分比浓度为4％加入，ZTC-II型澄清剂(天津正天成澄清技术有限公司)的澄清剂A使其终质量百分比浓度为2％，每30分钟间歇搅拌一次，2小时后，室温沉降过夜(静置10小时)，分离上清液和沉淀，去除沉淀，得到上清液。

3、用粒径为0.8mm的ADS-21型大孔树脂装层析柱(柱长为100，柱体积为3.0L)，用水洗去除杂质；然后将步骤2得到的上清液按每小时两个柱体积的速度过层析柱，直到流出液刚刚检测到绿原酸为止。然后用水淋洗柱，直至流出液基本无色。用含0.05M的盐酸的体积百分浓度为80％的乙醇溶液为洗脱剂进行洗脱绿原酸，以颜色变深为流出液接收开始，洗脱4-5个柱体积，合并含绿原酸的洗脱液。以水淋洗层析柱，直至流出液呈中性。

4、将步骤3得到的洗脱液，用1M碳酸钠溶液调节pH值至6.0-6.5，然后在50℃，减压浓缩至近干(含水质量百分含量为5-10％)，得到固体。然后将得到的固体用体积百分含量为95％乙醇溶液悬浮充分洗涤，沉降后离心得沉淀物。再以水悬浮洗涤脱去其中的绝大部分盐，沉淀物干燥后得粗产品70克，经过HPLC测定表明，该粗产品中绿原酸质量百分含量为31.5％。

重复步骤4采用体积百分含量为95％乙醇溶液悬浮洗涤，用水悬浮洗涤，重复3次干燥后得到10g白色粉末。经HPLC测定表明最终产品中绿原酸的质量百分含量为93.0％。

上述实施例的实验表明，本发明的方法提取绿原酸的纯度达到90％以上。

Claims

1.一种提取绿原酸的方法，包括下述步骤：

2)在步骤1)得到的提取液中加入澄清剂，沉淀溶液中的蛋白、鞣质、树胶杂质，过滤得到滤液；所述澄清剂为ZTC-II型澄清剂；

3)将步骤2)得到的滤液过以大孔树脂为填料的层析柱，先用水淋洗至洗脱液无色，然后以pH值为1-3的乙醇溶液为洗脱剂洗脱，回收含有绿原酸的洗脱液；所述大孔树脂为粒径为0.3-1.25mm的苯乙烯型吸附树脂；

4)浓缩步骤3)得到的含有绿原酸的洗脱液得到含有绿原酸的固体，然后用体积百分比浓度为95％以上的乙醇溶液和水分别重悬洗涤3-5次。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤1)中，所述朝鲜蓟叶片先经干燥粉碎后得到朝鲜蓟叶片粉末再与体积百分比浓度为60-80％的乙醇溶液混和提取，或直接与体积百分比浓度为90-97％的乙醇溶液匀浆提取。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述步骤1)中，所述朝鲜蓟叶片先经干燥粉碎后得到朝鲜蓟叶片粉末与所述体积百分比浓度为60-80％的乙醇溶液混和的比例为1kg∶7-9L；所述朝鲜蓟叶片与所述90-97％的乙醇溶液的比例为1kg∶2-3L。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述朝鲜蓟叶片粉末的大小为20-40目。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤2)中，所述ZTC-II型澄清剂中的澄清剂A的添加的终质量百分浓度为1-2％；所述ZTC-II型澄清剂中的澄清剂B的添加的终质量百分浓度为2-4％。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤3)中，所述洗脱剂中的乙醇的体积百分比浓度为60-80％。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述步骤3)中，所述洗脱剂的pH值用盐酸溶液调节。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述洗脱剂为含0.05M盐酸的体积百分浓度为60-80％的乙醇溶液。