CN101231273A - 穿心莲提取物的指纹图谱测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及穿心莲提取物的指纹图谱测定方法，首先将穿心莲用乙醇提取，制备穿心莲提取物，然后精密称取穿心莲提取物，加甲醇溶液，浸泡，超声处理，放冷，加甲醇至刻度，摇匀，用微孔滤膜滤过，作为供试品；采用以十八烷基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱；采用梯度洗脱，流动相A为乙腈，流动相B为0.1％磷酸溶液；检测波长为254nm；精密吸取供试品溶液注入液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，得到指纹图谱。本发明穿心莲提取物的指纹图谱测定方法简便，易于掌握，且稳定性、精密度和重现性均良好，可用于穿心莲提取物的质量控制，确保穿心莲提取物相关产品的有效性、安全性、稳定性和均一性。
Description
技术领域
本发明涉及一种药用植物指纹图谱测定的方法，特别是穿心莲提取物指纹图谱测定方法的建立。
背景技术
穿心莲为爵床科植物穿心莲Andrographis paniculata(Burm.f.)Nees的干燥地上部分，为常用的传统中药材，性味苦，寒。归心、肺、大肠、膀胱经。具有清热解毒、凉血、消肿等功效，常用于感冒发热，咽喉肿痛，口舌生疮，顿咳劳嗽，泄泻痢疾，热淋涩痛，痈肿疮疡，毒蛇咬伤。近年来研究发现穿心莲具有广泛的生理活性，除了抗菌消炎作用外，还有抗肿瘤、增强免疫、抗病毒、防治心血管疾病等作用，广泛应用于临床。
穿心莲提取物是由穿心莲经过提取加工而成，其为常用中药成方制剂穿心莲片、穿心莲胶囊、莲芝消炎片等的中间体及一些化妆品、兽药的原料。建立穿心莲提取物有效的质量评价方法，确保穿心莲提取物的质量稳定，直接关系到穿心莲提取物相关产品的有效性、安全性、稳定性和均一性。
公开文献报道，穿心莲主要有效成分是二萜内酯类成分，穿心莲药材及其复方制剂多以该类成分中含量较高的穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯的含量作为质量控制指标。然而，单一的某成分含量测定不能完全反映中药的药效作用。指纹图谱技术是目前反映中药作用机理的最有效途径，是中药现代化的关键技术之一，是中药质量控制最先进技术。因此，我们将指纹图谱的技术应用于穿心莲提取物的质量控制中。我们建立了穿心莲提取物的HPLC指纹图谱测定方法，为穿心莲提取物的质量控制提供有效方法。
目前公开文献报道了一些穿心莲药材指纹图谱的研究，例如：
【题名】规范化种植穿心莲药材HPLC指纹图谱研究【作者】祝晨蔯 莫建霞【刊名】中国药学杂志.2004，39(10).-737-739【文摘】目的 为规范化种植穿心莲药材质量研究提供新的基础研究资料。方法RP-HPLC建立穿心莲指纹图谱，并进行不同种植基地(产地)与商品药材、不同生长期、不同药用部位指纹图谱的比较，采用计算机辅助的相似度评价软件进行相似度评价。结果在选定的色谱条件下，226nm检测波长下的15个峰构成穿心莲药材的指纹特征，各批次样品指纹图谱均具有上述特征，但特征峰的相对含量分布差异导致色谱概貌存在一定差异。计算机辅助相似度评价，5个规范化种植基地产穿心莲药材指纹特征相互间较为吻合，具有较好的一致性，商品药材则差异较大。不同生长期药材指纹图谱也具有较好的一致性，多数特征峰含量呈现随生长期而增加的动态累积过程，不同部位则特征峰的含量分布叶中大大高于茎。结论实行规范化种植对于保证药材质量的稳定性具有重要的意义，所建立的方法可较全面地反映穿心莲药材多成分特征，并进行药材质量评价。
【题名】穿心莲药材的色谱指纹图谱【作者】张尊建[1]董海娟[1]余静[2]【刊名】中国天然药物.2005，3(6).-373-376【文摘】目的：建立穿心莲药材的HPLC/UV色谱指纹图谱，并对不同产地的药材进行比较。方法：应用Shimadzu VP-ODS柱，0.1％甲酸乙腈与0.2％甲酸进行梯度洗脱，流速为1.0ml/min，检测波长254nm，柱温为室温。结果：得到分离度、重现性均较好的穿心莲药材HPLC/UV指纹图谱，标示了9个共有峰。应用HPLC/MS技术对其7个主要色谱峰进行了初步归属，并对不同产地药材的色谱指纹图谱进行了相似度评价。结论：穿心莲药材指纹图谱的建立，为其质量控制提供了依据。
【题名】不同产地穿心莲药材色谱指纹图谱的比较研究【作者】董海娟[1]张尊建[1]余静[2]【刊名】中成药.2006，28(3).-321-324【文摘】目的：建立穿心莲药材的HPLC指纹图谱，为其全面质量评价及控制提供参考。方法：采用HPLC/UV法，测定了10个不同产地的23批穿心莲药材样品。色谱条件：Shimadzu ODS柱，流动相为0.1％甲酸乙腈与0.2％甲酸，梯度洗脱，流速1.0ml/min，检测波长254nm，住温为室温。应用聚类分析、非线性映射和相似度计算等方法对所得指纹图谱进行了定性、定量评价。结果：建立了操作简单、分离度佳、重现性好的穿心莲药材指纹图谱检测方法，不同产地药材指纹图谱具有一定差异。结论：聚类分析、非线性映射和相似度计算等方法可实现对指纹图谱的定性、定量评价，所建立的色谱指纹图谱可用于穿心莲药材的鉴别及质量评价。
上述公开报道的文献主要是对穿心莲药材指纹图谱的研究，而本发明是对穿心莲提取物的指纹图谱测定方法的建立。穿心莲提取物是由穿心莲经过提取加工而成，为常用中药成方制剂穿心莲片、穿心莲胶囊、莲芝消炎片等的中间体及一些化妆品、兽药的原料。穿心莲提取物的指纹图谱测定方法尚未见有文献报道和专利申请。
发明内容
本发明提供从穿心莲中制备穿心莲提取物的方法及穿心莲提取物的指纹图谱测定方法。制备得到的穿心莲提取物可以作为常用中药成方制剂穿心莲片、穿心莲胶囊、莲芝消炎片等的中间体及一些化妆品、兽药的原料。通过穿心莲提取物的指纹图谱测定方法能有效地控制穿心莲提取物的质量，从而确保穿心莲提取物相关产品的有效性、安全性、稳定性和均一性。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
1.将穿心莲用乙醇提取，制备穿心莲提取物；
2.供试品溶液的制备：精密称取穿心莲提取物，加甲醇溶液，浸泡，超声处理，放冷，加甲醇至刻度，摇匀，用微孔滤膜滤过，即为供试品；
3.色谱条件：色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶为填料；采用梯度洗脱，流动相A为乙腈，流动相B为磷酸溶液；检测波长为254nm；
4.测定：精密吸取供试品溶液注入液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，得到指纹图谱。
以上所述第1步的穿心莲提取物的制备方法：取干燥的穿心莲的地上部分，粉碎成粗粉，用85％乙醇(体积浓度)热浸提取二次，每次2小时，每次加8倍量85％乙醇(体积比)，合并提取液，滤过，滤液80℃以下减压回收乙醇浓缩至相对密度为1.30～1.32(60℃)，80℃以下真空干燥，即得。
以上所述第2步的中的甲醇溶液为40％甲醇(体积比)的水溶液。
以上所述第3步的中供试品溶液的制备：精密称取穿心莲提取物(过四号筛)0.5g，置25mL量瓶中，加入40％甲醇(体积比)20mL，浸泡1h，超声处理(功率160W，频率40kHz)20min，放冷，加40％甲醇(体积比)至刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.45μm)滤过，即为供试品样；
以上所述第3步的中的流动相B为0.1％磷酸水溶液。
以上所述第4步的中所述色谱条件：检测波长为254nm；柱温：25℃；进样量：5μl；流动相：A相为乙腈，B相为0.1％磷酸溶液，流速为1.0mL/min。采用梯度洗脱，梯度洗脱程序如下：
0～18分钟，流动相A为23.5％的乙腈、B为76.5％的0.1％磷酸溶液；
18～40分钟，流动相A为38％的乙腈、B为62％的0.1％磷酸溶液；
40～55分钟，流动相A为46％的乙腈、B为54％的0.1％磷酸溶液；
55～60分钟，流动相A为24％的乙腈、B为76％的0.1％磷酸溶液。
以上所述A相乙腈和流动B溶液的配制比例是按体积比配制。
以上所述穿心莲提取物的指纹图谱测定方法参照高效液相色谱法(《中国药典》2005年版一部附录VI D)，结合指纹图谱的要求进行测定。
色谱条件与***适用性试验用Waters XTerraTMRP18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)色谱柱；以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸溶液为流动相B，按比例进行梯度洗脱，流速为1.0mL/min；检测波长为254nm。理论板数按穿心莲内酯峰计算应不低于8000，按脱水穿心莲内酯峰计算应不低于70000。
参照物溶液的制备精密称取穿心莲内酯与脱水穿心莲内酯对照品适量，加甲醇制成每1mL各含0.1mg的溶液，摇匀，即得。
测定法分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪，测定，记录色谱图。
本发明的突出的实质性特点和显著的进步是：
1.穿心莲药材及其复方制剂多以二萜内酯类成分中含量较高的穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯的含量作为质量控制指标。然而，单一的某成分含量测定不能完全反映中药的药效作用。指纹图谱技术是目前反映中药作用机理的最有效途径，是中药现代化的关键技术之一，是中药质量控制最先进技术。因此，我们将指纹图谱的技术应用于穿心莲提取物的质量控制中。
2.本发明建立的穿心莲提取物HPLC指纹图谱，代表着穿心莲部分药理活性，能有效地表征穿心莲提取物的质量。
3.以穿心莲提取物的HPLC指纹图谱作为控制其质量的手段，既避免了因只测定一、二个化学成分而判定穿心莲整体质量的片面性，又减少了为质量达标而人为处理的可能性。本发明为完整、准确评价穿心莲提取物的质量提供了有效方法，从而使其进一步的产品的质量及疗效得到保证。
4.本发明具有方法简便，易于掌握，稳定，精密度高，重现性好的特点。
具体实施方式
实施例1
穿心莲提取物的制备：取干燥的穿心莲的地上部分，粉碎成粗粉，用体积比85％乙醇热浸提取二次，每次2小时，每次加8倍量85％乙醇，合并提取液，滤过，滤液80℃以下减压回收乙醇浓缩至相对密度为1.30～1.32(60℃)，80℃以下真空干燥，即得。
实施例2
穿心莲提取物的指纹图谱测定方法：取上述实施例1得到的穿心莲提取物，粉碎过四号筛，精密称取0.5g，置25mL量瓶中，加入体积比40％甲醇20mL，浸泡1h，超声处理(功率160W，频率40kHz)20min，放冷，加40％甲醇至刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.45μm)滤过，即为供试品样；另精密称取穿心莲内酯与脱水穿心莲内酯对照品适量，加甲醇制成每1mL各含0.1mg的溶液，摇匀，作为参照物溶液；分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪，测定。
实施例2的色谱柱的选择
曾选用Lichrospher C18柱(4.6mm×250mm，5μm)、Waters μBONDAPAKTM C18色谱柱(PIN27324)和Waters XTerraTMRP18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)进行试验筛选，比较分离度、出峰数、峰形和柱效，结果Waters XTerraTMRP18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)较为合适，故选其作为指纹图谱研究的色谱柱。
实施例2的流动相的选择
试验过程中曾选择甲醇-水、甲醇-磷酸溶液和乙腈-磷酸溶液等多组流动相***，以不同的比例和不同的梯度进行梯度洗脱。结果以乙腈-0.1％磷酸溶液(体积比)的梯度洗脱为佳，色谱图上在254nm的各色谱峰分离效果及形状较好，故选其作为指纹图谱研究的流动相。
实施例2的检测波长的选择
参考有关文献，曾分别选用225nm和254nm为检测波长。以225nm为检测波长时，检出峰数虽较多，但分离效果不好，基线不平；而以254nm为检测波长时，检出的峰数虽比在225nm检出的峰数少2个，但其分离度、峰形和柱效及出峰的稳定性较为满意，故选择254nm为检测波长。
实施例2的***适用性试验
根据以上研究结果，拟订色谱条件为：Waters XTerraTMRP18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)；以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸溶液为流动相B，按表1进行梯度洗脱，流速为1.0mL/min；检测波长为254nm；柱温：25℃；进样量：5μL。
表1流动相条件及梯度条件
| 时间(min) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0～1818～4040～5555～60 | 23.5384624 | 76.5625476 |
用拟订的色谱条件检测穿心莲提取物10批，按穿心莲内酯峰计算理论板数，结果均在8000以上，故拟订理论板数按穿心莲内酯峰计算应不低于8000；按脱水穿心莲内酯峰计算理论板数，结果均在70000以上，故拟订理论板数按脱水穿心莲内酯峰计算应不低于70000。
实施例2的参照峰的标定
取参照物溶液和供试液各5μL，注入液相色谱仪，记录色谱图(见图1～2)，供试品色谱图中，以参照物溶液中脱水穿心莲内酯峰保留时间相应位置上的峰为参照峰。
实施例2的记录时间
记录60min色谱图，35min以后没有出峰，提示35min内穿心莲提取物成分出峰完全。
实施例2的方法学考察
(1)稳定性试验
精密吸取同一样品(9#)溶液各5μL，每隔一定时间进样测定一次，共测定6次。结果各共有峰的相对保留时间和峰面积比值的RSD均小于3％(见表2～3)；使用相似度计算软件(国家药典委员会推荐的“中药色谱指纹图谱相似度评价***的操作规范(版本2004A)”，下同。)计算相似度，各指纹图谱相似度均为1.000，符合色谱指纹图谱研究技术要求。
表2稳定性试验各共有峰的相对保留时间
| 稳定性试验 | 相对保留时间 | |||||||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | |
| 9-1(0h)9-1(4h)9-1(9h)9-1(11h)9-1(20h)9-1(22h)平均值RSD％ | 0.2480.2490.2480.2370.2480.2480.2481.86 | 0.2890.2890.2900.2900.2890.2900.2900.19 | 0.3260.3270.3270.3280.3260.3260.3260.25 | 0.3800.3810.3820.3820.3800.3800.3800.26 | 0.4580.4590.4600.4610.4580.4580.4590.28 | 0.5340.5350.5360.5360.5340.5340.5350.18 | 0.6160.6170.6170.6180.6150.6150.6160.20 | 0.6670.6680.6700.6710.6670.6670.6680.26 | 0.7290.7360.7360.7370.7350.7350.7350.39 | 11111110 |
表3稳定性试验各共有峰的相对峰面积
| 稳定性试验 | 相对峰面积 | |||||||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | |
| 9-1(0h)9-1(4h)9-1(9h)9-1(11h)9-1(20h)9-1(22h)平均值RSD％ | 0.0450.0430.0440.0450.0450.0450.0441.88 | 0.0900.0890.0900.0900.0910.0910.0900.83 | 0.0170.0180.0170.0180.0180.0170.0183.13 | 0.4540.4560.4560.4550.4590.4540.4560.41 | 0.2470.2450.2460.2470.2440.2480.2460.60 | 0.0800.0790.0800.0800.0800.0800.0800.51 | 0.0550.0540.0530.0530.0550.0520.0542.26 | 0.1000.1010.1000.1010.1020.1020.1010.89 | 0.0240.0240.0240.0250.0230.0240.0242.64 | 11111110 |
(2)精密度试验
精密吸取同一样品(9#)溶液各5μL，分别连续6次进样测定。结果各共有峰的相对保留时间和峰面积比值的RSD均小于3％(见表4～5)；使用相似度计算软件计算相似度，各指纹图谱相似度均为1.000，符合色谱指纹图谱研究技术要求。
表4精密度试验各共有峰的相对保留时间
| 精密度试验 | 相对保留时间 | |||||||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | |
| 9-1(1)9-1(2)9-1(3)9-1(4)9-1(5)9-1(6)平均值RSD％ | 0.2480.2480.2480.2480.2360.2480.2461.99 | 0.2890.2890.2890.2900.2900.2890.2890.18 | 0.3260.3270.3270.3270.3280.3260.3270.23 | 0.3800.3800.3800.3820.3820.3800.3810.27 | 0.4580.4590.4590.4600.4610.4580.4590.25 | 0.5340.5350.5350.5360.5360.5340.5350.17 | 0.6160.6160.6160.6170.6180.6150.6160.17 | 0.6670.6680.6680.6690.6700.6670.6680.17 | 0.7290.7360.7360.7360.7370.7350.7350.40 | 11111110 |
表5精密度试验各共有峰的相对峰面积
| 精密度试验 | 相对峰面积 | |||||||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | |
| 9-1(1)9-1(2)9-1(3)9-1(4)9-1(5)9-1(6)平均值RSD％ | 0.0450.0450.0450.0440.0440.0440.0441.23 | 0.0890.0900.0900.0900.0910.0910.0900.83 | 0.0170.0180.0180.0170.0180.0170.0183.13 | 0.4570.4540.4570.4560.4550.4600.4570.45 | 0.2490.2480.2450.2460.2470.2440.2470.76 | 0.0800.0800.0810.0800.0810.0800.0800.64 | 0.0520.0540.0540.0530.0550.0510.0532.77 | 0.1000.1010.1010.1000.1010.1020.1010.75 | 0.0240.0250.0240.0240.0230.0250.0243.11 | 11111110 |
(3)重现性试验
取同一样品(9#)，制备6份供试品溶液，分别进样测定。结果各共有峰的相对保留时间和峰面积比值的RSD均小于3％(见表6～7)；使用相似度计算软件计算相似度，各指纹图谱相似度均为1.000，符合色谱指纹图谱研究技术要求。
表6重现性试验各共有峰的相对保留时间
| 重现性试验 | 相对保留时间 | |||||||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | |
| 9-19-29-39-49-59-6平均值RSD％ | 0.2340.2330.2330.2390.2370.2370.2361.07 | 0.2780.2770.2770.2820.2810.2800.2790.77 | 0.3110.3100.3100.3160.3150.3140.3130.85 | 0.3830.3830.3830.3870.3870.3860.3850.53 | 0.4450.4440.4450.4470.4480.4460.4460.33 | 0..5270.5270.5260.5290.5300.5290.5280.29 | 0.6020.6020.6050.6030.6050.6040.6040.23 | 0.6540.6530.6540.6560.6580.6560.6550.28 | 0.7280.7280.7280.7290.7310.7300.7290.17 | 11111110 |
表7重现性试验各共有峰的相对峰面积
| 重现性试验 | 相对峰面积 | |||||||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | |
| 9-19-29-39-49-59-6平均值RSD％ | 0.0460.0470.0470.0470.0460.0470.0471.11 | 0.0810.0800.0800.0800.0800.0800.0800.51 | 0.0150.0160.0160.0150.0160.0160.0163.30 | 0.4470.4480.4450.4440.4470.4460.4460.33 | 0.2440.2450.2400.2430.2450.2450.2440.81 | 0.0800.0810.0820.0810.0810.0810.0810.78 | 0.0580.0560.0560.0570.0560.0560.0571.48 | 0.0900.0900.0900.0910.0900.0900.0900.45 | 0.0220.0210.0210.0220.0220.0220.0222.38 | 11111110 |
实施例2的样品的测定
取实施例1穿心莲提取物10批，每批2份，制成穿心莲提取物供试液，按拟订的色谱条件测定，记录色谱图。
实施例2的共有峰的选择
根据10批样品测定结果，各批样品指纹图谱色谱峰均在35min内全部出完。我们主要是对穿心莲内酯类成分指纹图谱研究，而色谱保留时间5分钟前一般是溶剂及杂质峰，故选择共有峰时扣除保留时间5分钟前的色谱峰。综合10批样品的色谱图，从5min之后，有10个峰是10批样品所共有，其中6号峰为穿心莲内酯峰，10号峰为脱水穿心莲内酯峰。各批样品的10个峰总面积占总峰面积比例均大于90％，因此确定这10个峰为共有指纹峰。
实施例2的穿心莲提取物指纹图谱检测标准的建立
采用国家药典委员会推荐的中药色谱指纹图谱相似度评价***的操作规范(版本2004A)，采用均值法，由10批样品的20个指纹图谱生成对照指纹图谱(见图3)。
以对照谱图为参照，各样品指纹图谱与对照谱图进行比较，计算得不同批次穿心莲提取物指纹图谱相似度值，结果各批提取物与对照指纹图谱之间的相似度均大于0.90，平均0.942，RSD为3.28％(见表8)。
表8 10批穿心莲提取物指纹图谱测定结果(n＝2)
| 编号 | 相似度(对照) | 平均值 | RSD％ |
| 1-11-22-12-23-13-24-14-25-15-26-16-27-17-28-18-29-19-210-110-2 | 0.9590.9040.9120.9680.9720.9700.9580.9640.9130.9130.9600.9590.9050.9030.9650.9650.9110.9110.9700.974 | 0.942 | 3.28％ |
根据以上试验结果，并结合中药指纹图谱研究的技术要求，暂定本品指纹图谱应与对照指纹图谱一致，相似度值不得低于0.90。
附图说明
图1是本发明实施例2所说的参照物图。
图2是本发明实施例2所说的穿心莲提取物指纹图谱。
图3是本发明实施例2所说的穿心莲提取物对照指纹图谱。图中的编号1～10为共有峰，6和10分别为穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯参照峰。
Claims (6)
1.一种穿心莲提取物的指纹图谱测定方法，其特征在于：
(a)将穿心莲用乙醇提取，制备穿心莲提取物；
(b)供试品溶液的制备：精密称取穿心莲提取物，加甲醇溶液，浸泡，超声处理，放冷，加甲醇至刻度，摇匀，用微孔滤膜滤过，即为供试品；
(c)色谱条件：色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶为填料；采用梯度洗脱，流动相A为乙腈，流动相B为磷酸溶液；检测波长为254nm；
(d)测定：精密吸取供试品溶液注入液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，得到指纹图谱。
2.根据权利要求1所述的穿心莲提取物的指纹图谱测定方法，其特征在于：穿心莲提取物的制备方法是取干燥的穿心莲的地上部分，粉碎成粗粉，用体积比85％乙醇热浸提取二次，每次2小时，每次加8倍85％乙醇，合并提取液，滤过，滤液80℃以下减压回收乙醇浓缩至60℃时相对密度为1.30～1.32，80℃以下真空干燥，即得。
3.根据权利要求1所述的穿心莲提取物的指纹图谱测定方法，其特征在于：甲醇溶液为体积比40％的甲醇水溶液。
4.根据权利要求1所述的穿心莲提取物的指纹图谱测定方法，其特征在于：供试品溶液的制备是精密称取穿心莲提取物，过四号筛0.5g，置于量瓶中，加入体积比40％甲醇20mL，浸泡1h，用功率160W，频率40kHz超的声处理20min，放冷，加体积比40％甲醇至刻度，摇匀，用微孔滤膜滤过，即为供试品样。
5.根据权利要求1所述的穿心莲提取物的指纹图谱测定方法，其特征在于：流动相B为体积比0.1％磷酸水溶液。
6.根据权利要求1所述的穿心莲提取物的指纹图谱测定方法，其特征在于：所述色谱条件：检测波长为254nm；柱温：25℃；进样量：5μl；流动相：A相为乙腈，B相为按体积比0.1％磷酸溶液，流速为1.0mL/min。采用梯度洗脱，梯度洗脱程序如下：
0～18分钟，流动相A为体积比23.5％的乙腈、B为76.5％的0.1％磷酸溶液；
18～40分钟，流动相A为体积比38％的乙腈、B为62％的0.1％磷酸溶液；
40～55分钟，流动相A为体积比46％的乙腈、B为54％的0.1％磷酸溶液；
55～60分钟，流动相A为体积比24％的乙腈、B为76％的0.1％磷酸溶液。
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