CN101190906B

CN101190906B - 红花黄色素b的制备方法及其应用

Info

Publication number: CN101190906B
Application number: CN2007101177437A
Authority: CN
Inventors: 张树祥; 熊国裕
Original assignee: BEIJING XINGHAO MEDICAL Co Ltd
Current assignee: BEIJING XINGHAO MEDICAL Co Ltd
Priority date: 2007-06-22
Filing date: 2007-06-22
Publication date: 2011-01-12
Anticipated expiration: 2027-06-22
Also published as: CN101190906A

Abstract

本发明涉及一种红花黄色素B的制备方法及其应用。红花经极性溶剂浸泡渗漉提取后，采用层析柱和醇沉结合的方式进行精制分离，即可得本发明红花黄色素B。本发明制备红花黄色素B的方法能提高产物红花黄色素B的得率，适合工业化生产。分离得到的红花黄色素B可用于预防和治疗心脑血管疾病。

Description

红花黄色素B的制备方法及其应用

技术领域

本发明属于天然药物有效成分提取制备领域，具体涉及从红花中分离羟基红花黄色素B的工艺，本发明还涉及羟基红花黄色素B在制药及心脑血管领域方面的应用。

背景技术

红花为菊科植物红花Carthamus tinctorius L.的干燥花，夏季花由黄变红时采摘，阴干或晒干，具有活血祛瘀、通经止痛的功效。红花中主要有三种水溶性黄色素，分别为羟基红花黄色素A、红花黄色素B、红花黄色素C。目前众多研究——包括提取方法、药理及临床——都是针对羟基红花黄色素A的，对其余两种成分的研究较少。中国专利CN1785988A公开了一种富含红花黄色素B的红花黄色素的制备方法和用途，发明采用水浸泡提取，聚酰胺分离精制。由于聚酰胺存在一些小分子可溶性酰胺杂质，目前也没有对其残留的统一检测项，且聚酰胺对多酚羟基类化合物吸附牢固，死吸附量大，较难洗脱下来，聚酰胺的可重复利用次数也较少。而红花黄色素B含多个酚羟基，且还有临酚羟基，被聚酰胺吸附牢固，用聚酰胺分离时相对损失较大。

发明内容

本发明的目的在于提供一种制备红花黄色素B的方法。本发明首先采用含水极性溶剂渗漉提取红花中的红花黄色素B，与水浸泡提取相比，提取率更高，黄色素B溶出更完全。

在醇沉与过大孔树脂的顺序上，本发明采用先过大孔树脂柱，因红花黄色素B能较好的被大孔树脂吸附，用水或含醇量低于15％的乙醇洗脱时，黄色素B不被洗脱下，这样可以除去一些水溶性多糖及不被大孔树脂吸附的成分，如羟基红花黄色素A，在后续醇沉时，由于水溶性杂质干扰的减少，醇沉时黄色沉淀中黄色素B含量更高也更纯。

本发明在对红色素B的精制时采用反相填料柱，如Sephadex-LH20、GEL-MCI、ODS填料，这类填料不会产生对多酚羟基类化合物的死吸附，可重复利用性高，且极少醇溶性低分子杂质，处理填料时更简单。采用这类填料对黄色素B进行精制，最终的产物红花黄色素B的产量明显得到提高。

本发明中所用的反相填料，可以是葡聚糖凝胶、反相硅胶、反相GEL-MCI填料，优选葡聚糖凝胶Sephadex-LH20。

本发明在渗漉提取中所用的溶剂，为极性有机溶剂质量分数低于60％的含水极性溶剂。其中的含水有机溶剂可以是含水甲醇、含水乙醇或含水丙酮，还可以单用水，优选乙醇。更优先50％的乙醇。

本发明的另一目的在于提供含有本发明方法所得到的红花黄色素B在制药中的应用。

本发明的再一目的在与提供由本发明方法所得到的红花黄色素B在制备具有预防和治疗心脑血管疾病药物中的应用。

实现本发明，可以通过如下技术方案实现：红花极性有机溶剂质量分数低于60％的含水极性溶剂浸泡24小时后，然后用水或含水乙醇渗漉提取，至渗漉液中基本无红花黄色素B，合并渗漉提取液，60℃下减压浓缩，至相对密度为1.05～1.15，上大孔吸附树脂柱，药材与大孔吸附树脂用量的比例为1g生药材/0.5～2mL树脂，先用低于15％的乙醇洗脱至洗脱液颜色变淡，再用30％～50％的乙醇洗脱至无红花黄色素B流下，合并乙醇洗脱液，60℃减压浓缩至相对密度约为1.05～1.30，在不断搅拌下加入乙醇使含醇量为75％～85％，冷处放置24小时，析出黄色沉淀，过滤，取黄色沉淀，用至少3倍量沉淀的去离子水溶解，静置，过滤，取滤液，滤液60℃减压浓缩至无醇味，相对密度为1.05～1.15，上反相填料柱分离，低于15％的乙醇洗脱至洗脱液颜色变淡，改用35％～55％的乙醇洗脱，收集红花黄色素B含量大于90％的流份，合并；红花黄色素B含量小于90％的流份合并再上反相柱，低于15％的乙醇洗脱至洗脱液颜色变淡，35％～55％的乙醇洗脱，收集红花黄色素B含量大于90％的流份，并入到上述红花黄色素B含量大于90％的流份中，如此反复精制，至红花黄色素B大部分被分离出，60℃减压浓缩红花黄色素B含量大于90％的合并液得浓缩液，浓缩液冷冻干燥，得红花黄色素B。

本发明渗漉提取所用的溶剂优选50％的乙醇，精制红花黄色素B的填料优选Sephadex-LH20。

通过对比本发明方法和水浸泡提取聚酰胺精制方法，对提取时红花黄色素B的提取率和最终的红花黄色素B得率进行比较，本发明均有提高。

下面通过对比实验给予说明，比较结果见表1。

提取方案一：已有对比技术方案

云南红花1kg，以水浸泡三次，溶剂用量分别为10L、8L、8L，浸泡时间分别为24小时、12小时、12小时。过滤，合并滤液，60℃减压浓缩至相对密度为1.20，搅拌下加入乙醇使含纯量为80％，精制24小时，析出黄色沉淀，取黄色沉淀，用4倍量的水溶解，过滤，取滤液，上HP-20大孔吸附树脂柱，先用10％的乙醇洗脱，再用50％的乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，合并，减压浓缩后上处理好的聚酰胺柱，先用50％的乙醇洗脱5个柱体积，再用95％的乙醇洗脱，收集红花黄色素B含量大于90％的流份，得红花黄色素B(A2)。

提取方案二：本发明技术方案

云南红花1kg，10L50％的乙醇浸泡24小时后，渗漉提取，至红花黄色素B基本提尽，总溶剂用量为26L，合并渗漉液，60℃减压浓缩至相对密度为1.10，上HP-20大孔吸附树脂柱，先用10％的乙醇洗脱，弃此部分，改用50％的乙醇洗脱，收集50％的乙醇洗脱液，合并，60℃减压浓缩至相对密度为1.20，搅拌下加入乙醇使含醇量为80％，冷处放置24小时，析出黄色沉淀，过滤，取沉淀，用沉淀量5倍的去离子水溶解，过滤，取滤液，减压浓缩至相对密度为1.10，上Sephadex-LH20柱，15％的乙醇洗脱，弃去，再用50％的乙醇洗脱，收集红花黄色素B含量大于90％的流份，合并，减压浓缩，干燥，既得。

表1 两种方法分离红花黄色素B的比较

从上表结果可知，利用本发明技术方案提取分离红花黄色素B，提取物中红花黄色素的提取率和最终红花黄色素B的得率均优于对比技术方案。

本发明技术方案所得到的红花黄色素B，具有预防和治疗心脑血管疾病的作用，如对缺血性脑中风、心肌缺血等疾病。用含有有效量的本发明技术方案所得到的红花黄色素B，可用于制备各种具有预防和治疗心脑血管疾病的药物剂型，可以是口服固体制剂，如片剂、胶囊剂、滴丸剂等，也可以是注射型制剂，如注射液、冻干粉针、大输液等。

本发明的口服固体制剂(胶囊剂)可以通过如下方案实现：

红花黄色素B 28g

干淀粉 172g

制备工艺为：称取红花黄色素B和干淀粉，采用等量递增法将红花黄色素B和干淀粉混合均匀，装入空心胶囊中，既得胶囊剂。

本发明药物组合物片剂的制备：

红花黄色素B 28g

85％的乙醇适量

淀粉适量

称取红花黄色素、淀粉，混匀，用85％的乙醇制粒，加入适量的崩解剂和润滑剂，压片制成1000片。

本发明冻干粉针剂的制备：

红花黄色素B 14g

甘露醇适量

注射用水适量

称取红花黄色素B，用注射用水溶解，0.1M的NaOH调pH至6.5左右，加入甘露醇，超声溶解，过0.22um的微孔滤膜，冻干，既得。

具体实施例

以下从具体实施例对本发明做进一步说明，需要指出的是，所列举的实施例并不是为了限制本发明技术方案，而是为了更清楚的说明本发明。以下红花所选用的原料均来自云南。

实施例1

称取干燥红花20kg，以去离子水200L浸泡24小时后，转入渗漉桶中，进行渗漉提取，流速为0.06BV/min，药材上不断补充新鲜的去离子水，至渗漉液中基本无红花红色素B，共计用水量520L，合并渗漉液，60℃减压浓缩至相对密度约为1.10，上已处理好的HP-20大孔吸附树脂柱，树脂用量为20L，先用10％的乙醇洗脱5个柱体积，弃此部分洗脱液，改用50％的乙醇洗脱，至留出液基本无红花黄色素B，合并50％的乙醇洗脱液，60℃减压浓缩至相对密度为1.20，搅拌下加入95％的乙醇使含醇量为81％，冷处放置24小时，析出黄色沉淀，过滤，取黄色沉淀，加入5倍沉淀量的去离子水，搅拌使溶解，过滤，取滤液，60℃减压浓缩至相对密度为1.10，上Sephadex-LH20葡聚糖凝胶柱，浓缩液体积比与填料体积比为1：10，以15％的乙醇洗脱，至流出液颜色变淡，改用55％的乙醇洗脱，收集红花黄色素B含量大于90％的流份，合并；红花黄色素B含量小于90％的流份合并浓缩后，按上述凝胶纯化步骤操作，收集红花黄色素B含量大于90％的流份，将所收集到的红花黄色素B含量大于90％的流份合并，60℃减压浓缩，冷冻干燥得红花黄色素B100g，含量为94.37％。

实施例2

称取干燥红花20kg，以60％的乙醇浸泡24小时后，转入渗漉桶中，进行渗漉提取，流速为0.06BV/min，药材上不断补充新鲜的60％的乙醇，至渗漉液中基本无红花红色素B，共计用60％的醇为520L，合并渗漉液，60℃减压浓缩至相对密度约为1.10，上已处理好的AB-8型大孔吸附树脂柱，树脂用量为20L，先用5％的乙醇洗脱5个柱体积，弃此部分洗脱液，改用30％的乙醇洗脱，至流出液基本无红花黄色素B，合并30％的乙醇洗脱液，60℃减压浓缩至相对密度为1.20，搅拌下加入95％的乙醇使含醇量为75％，冷处放置24小时，析出黄色沉淀，过滤，取黄色沉淀，加入4倍沉淀量的去离子水，搅拌使溶解，过滤，取滤液，60℃减压浓缩至相对密度为1.10，上GEL-MCI反相柱，浓缩液体积比与填料体积比为1：8，以10％的乙醇洗脱，至流出液颜色变淡，改用45％的乙醇洗脱，收集红花黄色素B含量大于90％的流份，合并，浓缩，冷冻干燥，得含量为96.82％的红花黄色素B110g。

实施例3

称取干燥红花20kg，以50％的乙醇200L浸泡24小时后，转入渗漉桶中，进行渗漉提取，流速为0.06BV/min，药材上不断补充新鲜的50％的乙醇，至渗漉液中基本无红花红色素B，共计用50％的乙醇量为520L，合并渗漉液，60℃减压浓缩至相对密度约为1.10，上已处理好的D-101型大孔吸附树脂柱，树脂用量为20L，先用15％的乙醇洗脱5个柱体积，弃此部分洗脱液，改用40％的乙醇洗脱，至留出液基本无红花黄色素B，合并40％的乙醇洗脱液，60℃减压浓缩至相对密度为1.20，搅拌下加入95％的乙醇使含醇量为85％，冷处放置24小时，析出黄色沉淀，过滤，取黄色沉淀，加入5倍沉淀量的去离子水，搅拌使溶解，过滤，取滤液，60℃减压浓缩至相对密度为1.10，上反相ODS硅胶柱，浓缩液体积比与填料体积比为1：12，以10％的乙醇洗脱，至流出液颜色变淡，改用35％的乙醇洗脱，收集红花黄色素B含量大于90％的流份，合并；红花黄色素B含量小于90％的流份合并浓缩后，按上述凝胶纯化步骤操作，收集红花黄色素B含量大于90％的流份，将所收集到的红花黄色素B含量大于90％的流份合并，60℃减压浓缩，冷冻干燥，得含量为92.79％的红花黄色素B115g。

实施例4

称取干燥红花20kg，以30％的乙醇200L浸泡24小时后，转入渗漉桶中，进行渗漉提取，流速为0.06BV/min，药材上不断补充新鲜的30％的乙醇，至渗漉液中基本无红花红色素B，共计用30％的乙醇量为520L，合并渗漉液，60℃减压浓缩至相对密度约为1.10，上已处理好的HP-20大孔吸附树脂柱，树脂用量为20L，先用10％的乙醇洗脱5个柱体积，弃此部分洗脱液，改用50％的乙醇洗脱，至留出液基本无红花黄色素B，合并50％的乙醇洗脱液，60℃减压浓缩至相对密度为1.20，搅拌下加入95％的乙醇使含醇量为80％，冷处放置24小时，析出黄色沉淀，过滤，取黄色沉淀，加入5倍沉淀量的去离子水，搅拌使溶解，过滤，取滤液，60℃减压浓缩至相对密度为1.10，上Sephadex-LH20葡聚糖凝胶柱，浓缩液体积比与填料体积比为1：10，以15％的乙醇洗脱，至流出液颜色变淡，改用55％的乙醇洗脱，收集红花黄色素B含量大于96％的流份，合并；红花黄色素B含量小于96％的流份合并浓缩后，反复上述凝胶精制操作，约3次，合并各次所得的红花黄色素B，60℃减压浓缩，冷冻干燥，得含量为98.97％的红花黄色素B95g。

实施例5

称取干燥红花20kg，以10％的乙醇200L浸泡24小时后，转入渗漉桶中，进行渗漉提取，流速为0.06BV/min，药材上不断补充新鲜的10％的乙醇，至渗漉液中基本无红花红色素B，共计用10％的乙醇量为520L，合并渗漉液，60℃减压浓缩至相对密度约为1.10，上已处理好的HP-20大孔吸附树脂柱，树脂用量为20L，先用10％的乙醇洗脱5个柱体积，弃此部分洗脱液，改用50％的乙醇洗脱，至留出液基本无红花黄色素B，合并50％的乙醇洗脱液，60℃减压浓缩至相对密度为1.20，搅拌下加入95％的乙醇使含醇量为80％，冷处放置24小时，析出黄色沉淀，过滤，取黄色沉淀，加入5倍沉淀量的去离子水，搅拌使溶解，过滤，取滤液，60℃减压浓缩至相对密度为1.10，上Sephadex-LH20葡聚糖凝胶柱，浓缩液体积比与填料体积比为1：10，以15％的乙醇洗脱，至流出液颜色变淡，改用55％的乙醇洗脱，收集红花黄色素B含量大于96％的流份，合并；红花黄色素B含量小于96％的流份合并浓缩后，反复上述凝胶精制操作，约3次，合并各次所得的红花黄色素B，60℃减压浓缩，冷冻干燥，得含量为98.97％的红花黄色素B90g。

实施例5

红花黄色素B对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用实验。

动物：Wistar大鼠，雄性，体重250～300g。

药品：红花黄色素B(星昊医药股份有限公司制备)

超氧化物歧化酶(SOD)测定试剂盒、丙二醛(MDA)测定试剂盒、乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒、红四氮唑(TTC)

大鼠急性不完全性脑缺血再灌注模型：取Wistar大鼠40只，随机分成5组，给药组分别给予红花黄色素B3、6、9mg/kg，iv，1次/日，连续3天。对照组iv等容量生理盐水，假手术组除不结扎总动脉，其余处理同对照组。末次给药后10min，大鼠以乌拉坦1.0g/kg ip麻醉，参照文献(潘鑫鑫，刘天培.人参总皂苷对急性脑缺血的保护作用[J].南京医学院学报，1992，12(3):237～239.)方法结扎双侧颈总动脉，30min后再恢复脑供血，24h后取脑备用。

脑组织LDH、SOD活性及MDA含量的测定：大鼠断头取脑，去除小脑和脑干，制成10％匀浆，经分级离心后取上清液，按硫代巴比妥酸法测定MDA含量，按试剂盒说明书方法测定LDH活性及SOD活力，蛋白质定量用Folin酚法。结果见表2

表2红花黄色素B对大鼠急性不完全性缺血再灌注损伤的影响(x±s)

与假手术组相比，^#P<0.01；与对照组相比，^*P<0.05，^*P<0.01

结果表明，大鼠全脑缺血30min再灌注24小时，脑组织LDH、SOD活性明显降低，MDA含量明显升高，而红花黄色素6.0、9.0mg/kg iv能显著提高缺血脑组织的LDH、SOD活力，降低MDA含量，但不能达到假手术组水平。

实施例6

红花黄色素B对大鼠心肌耗氧量的影响

实验动物用戊巴比妥钠(30mg/kg)静脉麻醉，气管插管，链接人工呼吸机，开胸，分离颈总动脉抽取动脉血，经颈外静脉插管至冠状静脉窦取冠状静脉血，以血计氧测血氧含量。

实验共分两组，剂量分别为8、4mg/kg iv，每组10只，给药前测定各组血氧含量。

结果表明，红花黄色素B8mg/kg剂量能明显降低心肌耗氧量及耗氧指数。给药后1min，心肌耗氧量由给药前53.2±1.28降为34.3±1.20，降低了35.5±1.3％；耗氧指数由184.28±53.23降为116.36±75.50，下降了36.85±22.27％(P<0.05，P<0.01)。

Claims

1.一种红花黄色素B的制备方法，以红花为原料，其特征是红花以极性有机溶剂质量分数低于60％的含水极性溶剂浸泡后，渗漉提取，合并渗漉提取液，减压浓缩至相对密度为1.05～1.15，上大孔吸附树脂柱，先以含醇量低于15％的乙醇洗脱至洗脱液颜色变淡，弃此部分洗脱液，再用含醇量为30％～50％的乙醇洗脱至无红花黄色素B流下，合并此部分醇洗液，减压浓缩至相对密度为1.05～1.30，在不断搅拌下加入乙醇使含醇量为75％～85％，冷处放置，析出黄色沉淀，过滤取黄色沉淀，用至少为沉淀量3倍的水溶解，静置，过滤，取滤液，滤液减压浓缩至相对密度为1.05～1.15，上反相填料柱，浓缩液与填料的比例为1∶8-12，先用低于15％的乙醇洗脱至流出液颜色变淡，再用35％～55％的乙醇洗脱，收集红花黄色素B含量大于等于90％的流份，合并，减压浓缩，干燥，得红花黄色素B。

2.如权利要求1所述的红花黄色素B的制备方法，其特征是红花以极性有机溶剂质量分数低于60％的含水极性溶剂浸泡24小时后，渗漉提取，至渗漉液中基本无红花黄色素B，合并渗漉提取液，60℃下减压浓缩，至相对密度为1.10，上HP20大孔吸附树脂柱，药材与大孔吸附树脂用量的比例为1g生药材/0.8-1.2mL树脂，先用10％的乙醇洗脱至洗脱液颜色变淡，再用45％的乙醇洗脱至无红花黄色素B流下，合并45％的乙醇洗脱液，60℃减压浓缩至相对密度为1.20，在不断搅拌下加入乙醇使含醇量为81％，冷处放置24小时，析出黄色沉淀，过滤，取黄色沉淀，用5倍量沉淀的去离子水溶解，静置，过滤，取滤液，滤液60℃减压浓缩至无醇味，相对密度为1.10，上葡聚糖凝胶柱，浓缩液与凝胶的比例为1∶8-12，10％的乙醇洗脱至洗脱液颜色变淡，改用50％的乙醇洗脱，收集红花黄色素B含量大于90％的流份，合并；红花黄色素B含量小于90％的流份合并再上葡聚糖凝胶柱，15％的乙醇洗脱至洗脱液颜色变淡，45％的乙醇洗脱，收集红花黄色素B含量大于90％的流份，并入到上述红花黄色素B含量大于90％的流份中，如此反复精制，至红花黄色素B大部分被分离出，60℃减压浓缩红花黄色素B含量大于90％的合并液得浓缩液，浓缩液冷冻干燥，得红花黄色素B。

3.如权利要求1所述的红花黄色素B的制备方法，其中所述的反相填料是MCI-GEL、ODS填料。

4.如权利要求1或2所述的红花黄色素B的制备方法，其特征是所述的含水极性溶剂是指含水乙醇、含水甲醇或含水丙酮。

5.如权利要求1或2所述的红花黄色素B的制备方法，其特征是所述的红花黄色素B的含量大于90％而小于100％。