CN105777724B - 一种红花中脱水红花黄色素b的提取和纯化方法 - Google Patents
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Abstract
一种红花中脱水红花黄色素B的提取和纯化方法，属于植物提取方法技术领域。包括以下步骤：1）温浸法提取红花水提液；2）大孔吸附树脂的预处理；3）大孔树脂吸附；4）大孔树脂洗脱。上述一种红花中脱水红花黄色素B的提取和纯化方法，提取率高，纯化后脱水红花黄色素B的含量提升为纯化前的3‑4倍，为高效提取和纯化红花中的脱水红花黄色素B提供依据。
Description
技术领域
本发明属于植物提取方法技术领域，具体为一种红花中脱水红花黄色素B的提取和纯化方法。
背景技术
红花为菊科植物红花 Carthamus tinctorius L. 的干燥花，主要产于河南、浙江、四川等地，为活血化瘀的中药之一，也是一种重要的天然食用色素资源。红花黄色素是红花中多种水溶性查耳酮的混合物，具有抗氧化、抗血栓、抗缺氧缺血、降血脂、镇痛、抗炎等多种生理功效，对冠心病、血管栓塞性疾病、高血压、糖尿病并发症等有良好的疗效。红花黄色素中以羟基红花黄色素A和脱水红花黄色素B（AHSYB）的含量最高，为红花中具有生理活性的主要有效成分。但目前的研究基本集中于羟基红花黄色素A，对AHSYB的提取工艺等报道甚少。
发明内容
针对现有技术中存在的上述问题，本发明的目的在于设计提供一种红花中脱水红花黄色素B的提取和纯化方法的技术方案，采用该方法提取率高，为高效提取和纯化红花中的脱水红花黄色素B提供依据。
所述的一种红花中脱水红花黄色素B的提取和纯化方法，其特征在于包括以下步骤：
1）温浸法：将红花置于密闭容器内，加入红花重量15-25倍的水，55-85℃下温浸26-38min，过滤，药渣再加原药材重量9-13倍的水，55-85℃下温浸26-38min，滤过，合并滤液，减压浓缩成浓度为0.04-0.08g/mL的红花水提液；
2）大孔吸附树脂的预处理：将HPD-300型大孔树脂置于烧杯中，先用95%乙醇浸泡24h充分溶胀后，湿法装柱，用乙醇通柱淋洗至洗出液加水不显浑浊为止，改用大量水洗，直至无醇味，备用；
3）大孔树脂吸附：取浓度为0.04-0.08g/mL的红花水提液，用稀盐酸调节上样药液pH为2.6-3.2，以流速1.5-2.5 mL/min通过HPD-300型大孔树脂柱，用HPLC对流出液进行实时监测，当泄漏时即停止上样；
4）大孔树脂洗脱：用浓度为65-85 %的乙醇进行洗脱，控制洗脱流速为1.0-2.0mL/min，洗脱体积为3-5BV，合并洗脱液，即得含脱水红花黄色素B的洗脱液。
所述的一种红花中脱水红花黄色素B的提取和纯化方法，其特征在于步骤1）中：加入红花重量17-23倍的水，优选18-20倍的水；室温浸泡16-24min，优选18-20min；60-80℃下温浸28-35min，优选65-75℃下温浸30-32min。
所述的一种红花中脱水红花黄色素B的提取和纯化方法，其特征在于步骤3）中：红花水提液的浓度为0.05-0.07g/mL，优选0.055-0.06g/mL。
所述的一种红花中脱水红花黄色素B的提取和纯化方法，其特征在于步骤3）中：上样药液pH为2.7-3.1，优选pH为2.8-3.0。
所述的一种红花中脱水红花黄色素B的提取和纯化方法，其特征在于步骤3）中：上样药液流速1.7-2.3 mL/min，优选1.8-2.1 mL/min。
所述的一种红花中脱水红花黄色素B的提取和纯化方法，其特征在于步骤4）中：乙醇浓度为70-80 %，优选73-75%。
所述的一种红花中脱水红花黄色素B的提取和纯化方法，其特征在于步骤4）中：洗脱流速为1.2-1.8 mL/min，优选1.4-1.6 mL/min；洗脱体积为4BV。
上述一种红花中脱水红花黄色素B的提取和纯化方法，提取率高，纯化后脱水红花黄色素B的含量提升为纯化前的3-4倍，为高效提取和纯化红花中的脱水红花黄色素B提供依据。
附图说明
图1为对照品溶液中脱水红花黄色素B的HPLC色谱图；
图2为供试品溶液中脱水红花黄色素B的HPLC色谱图；
图3为提取次数对脱水红花黄色素B提取率的影响图；
图4为液料比对脱水红花黄色素B提取率的影响图；
图5为提取温度对脱水红花黄色素B提取率的影响图；
图6为提取时间对脱水红花黄色素B提取率的影响图；
图7-8为液料比与提取温度对脱水红花黄色素B提取率的影响；
图9-10为液料比与提取时间对脱水红花黄色素B提取率的影响；
图11-12为提取温度与提取时间对脱水红花黄色素B提取率的影响；
图13为上样液pH对比吸附量的影响；
图14为上样流速对比吸附量的影响；
图15为上样液浓度对比吸附量的影响；
图16为洗脱流速对比解吸量的影响；
图17为洗脱剂体积对比解析量的影响；
图18-19上样流速与上样液pH对脱水红花黄色素B比吸附量的影响；
图20-21洗脱剂体积与洗脱流速对脱水红花黄色素B比解吸量的影响。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1：
1）温浸法：将红花置于密闭容器内，加入红花重量15倍的水，55℃下温浸26min，过滤，药渣再加原药材重量9倍的水，55℃下温浸26min，滤过，合并滤液，减压浓缩成浓度为0.04g/mL的红花水提液；
2）大孔吸附树脂的预处理：将HPD-300型大孔树脂置于烧杯中，先用95%乙醇浸泡24h充分溶胀后，湿法装柱，用乙醇通柱淋洗至洗出液加水不显浑浊为止，改用大量水洗，直至无醇味，备用；
3）大孔树脂吸附：取浓度为0.04g/mL的红花水提液，用稀盐酸调节上样药液pH为2.6，以流速1.5 mL/min通过HPD-300型大孔树脂柱，用HPLC对流出液进行实时监测，当泄漏时即停止上样；
4）大孔树脂洗脱：用浓度为65 %的乙醇进行洗脱，控制洗脱流速为1.0mL/min，洗脱体积为3BV，合并洗脱液，即得含脱水红花黄色素B的洗脱液。
实施例2
1）温浸法：将红花置于密闭容器内，加入红花重量20倍的水，75℃下温浸30min，过滤，药渣再加原药材重量11倍的水，75℃下温浸26-38min，滤过，合并滤液，减压浓缩成浓度为0.06g/mL的红花水提液；
2）大孔吸附树脂的预处理：将HPD-300型大孔树脂置于烧杯中，先用95%乙醇浸泡24h充分溶胀后，湿法装柱，用乙醇通柱淋洗至洗出液加水不显浑浊为止，改用大量水洗，直至无醇味，备用；
3）大孔树脂吸附：取浓度为0.06g/mL的红花水提液，用稀盐酸调节上样药液pH为2.9，以流速2.0 mL/min通过HPD-300型大孔树脂柱，用HPLC对流出液进行实时监测，当泄漏时即停止上样；
4）大孔树脂洗脱：用浓度为75 %的乙醇进行洗脱，控制洗脱流速为1.5 mL/min，洗脱体积为4BV，合并洗脱液，即得含脱水红花黄色素B的洗脱液。
实施例3
1）温浸法：将红花置于密闭容器内，加入红花重量25倍的水,85℃下温浸38min，过滤，药渣再加原药材重量13倍的水， 85℃下温浸38min，滤过，合并滤液，减压浓缩成浓度为0.08g/mL的红花水提液；
2）大孔吸附树脂的预处理：将HPD-300型大孔树脂置于烧杯中，先用95%乙醇浸泡24h充分溶胀后，湿法装柱，用乙醇通柱淋洗至洗出液加水不显浑浊为止，改用大量水洗，直至无醇味，备用；
3）大孔树脂吸附：取浓度为0.08g/mL的红花水提液，用稀盐酸调节上样药液pH为3.2，以流速2.5 mL/min通过HPD-300型大孔树脂柱，用HPLC对流出液进行实时监测，当泄漏时即停止上样；
4）大孔树脂洗脱：用浓度为85 %的乙醇进行洗脱，控制洗脱流速为2.0 mL/min，洗脱体积为5BV，合并洗脱液，即得含脱水红花黄色素B的洗脱液。
实施例4
1）温浸法：将红花置于密闭容器内，加入红花重量22倍的水，73℃下温浸31min，过滤，药渣再加原药材重量11倍的水， 73℃下温浸31min，滤过，合并滤液，减压浓缩成浓度为0.06g/mL的红花水提液；
2）大孔吸附树脂的预处理：将HPD-300型大孔树脂置于烧杯中，先用95%乙醇浸泡24h充分溶胀后，湿法装柱，用乙醇通柱淋洗至洗出液加水不显浑浊为止，改用大量水洗，直至无醇味，备用；
3）大孔树脂吸附：取浓度为0.06g/mL的红花水提液，用稀盐酸调节上样药液pH为2.8，以流速1.9 mL/min通过HPD-300型大孔树脂柱，用HPLC对流出液进行实时监测，当泄漏时即停止上样；
4）大孔树脂洗脱：用浓度为74 %的乙醇进行洗脱，控制洗脱流速为1.6mL/min，洗脱体积为4.4BV，合并洗脱液，即得含脱水红花黄色素B的洗脱液。
以下通过在建立脱水红花黄色素B定量方法的基础上，依据单因素试验选取影响提取的因素与水平，以脱水红花黄色素B提取率为响应值，采用三因素三水平的响应面法建立数学模型并获得最优提取条件。而后采用9种型号的大孔树脂，通过静态吸附对脱水红花黄色素B的吸附量、吸附率以及解吸率进行评估，筛选出最佳树脂。通过动态吸附，在单因素试验的基础上选取试验的因素与水平，根据中心组合试验设计原理，以脱水红花黄色素B的比吸附量和比解吸量为响应值，建立数学模型并获得最优大孔树脂纯化条件。
因此本申请在建立脱水红花黄色素B定量分析方法的基础上，以脱水红花黄色素B提取率为响应值，依据单因素试验的结果，采用中心组合试验设计，对红花中脱水红花黄色素B的提取工艺进行研究。而后采用9种型号的大孔树脂，通过静态吸附对脱水红花黄色素B的吸附量、吸附率以及解吸率进行评估，筛选出纯化脱水红花黄色素B的最佳树脂。通过动态吸附，在单因素试验的基础上选取试验的因素与水平，以脱水红花黄色素B的比吸附量和比解吸量为响应值，采用三因素三水平的响应面法建立数学模型并获得最优大孔树脂纯化条件，为红花中脱水红花黄色素B的分离制备和进一步的药效研究奠定基础。
一、 仪器与材料
1. 仪器 Agilent 1260 Infinity 型高效液相色谱仪（美国AgilentTechnologies），ZKSY型智能水浴锅（巩义市予华仪器有限责任公司），RE-52A型旋转蒸发仪（上海亚荣生物仪器厂），HA-A型恒温数显水浴振荡器（上海双舜实验发展有限公司），METTLER AL104型万分之一电子天平（梅特勒-托利多仪器公司）。
2. 材料 红花（购自杭州惠远实业有限公司，产地新疆，批号：141014，经浙江中医药大学陈孔荣副教授鉴定为菊科植物红花 (Carthamus tinctorius L.）的干燥花，甲醇（色谱纯，美国TEDIA公司，批号：12105038）、乙腈（色谱纯，美国TEDIA公司，批号：12085004）、水为超纯水。脱水红花黄色素B（自制，HPLC≥97%），D201、HPD-300、AB-8、HPD-722、HPD-400、ADS-17、NKA-9、ADS-7、HPD-100型大孔树脂（河北省沧州宝恩吸附材料科技有限公司）。
二、脱水红花黄色素B的定量分析方法
1. 对照品溶液的配制
精密称取脱水红花黄色素B对照品1mg，置于10mL的容量瓶中，加入25%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得0.1mg/mL的脱水红花黄色素B对照品储备液。
2. 供试品溶液的制备
精密称取0.5g红花，加入20倍量的水，在60°C下温浸20min，过滤，药渣再加10倍量的水，60°C下温浸20min，滤过，合并滤液，置于100mL容量瓶中并用水定容至刻度。提取液过0.22μm滤膜，即得供试品溶液。
3. 色谱条件 Alltech Alltima-C18 色谱柱(4.6 mm×250 mm, 5 μm) 以及Alltech Alltima-C18保护柱(4.6 mm×12.5 mm, 5 μm)，流动相：乙腈(A) - 0.01%三氟乙酸(B)，梯度洗脱：0-2 min，24%-27%A；2-8 min，27%-30%A；8-10 min，30%-24%A，体积流量1.0 mL/min，检测波长403 nm，柱温为30°C，进样量20 μL。对照品溶液与供试品溶液的色谱图如图1-2所示。
4. 标准曲线的建立 分别精密吸取脱水红花黄色素B对照品储备液0.025、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8 mL，置于2 mL容量瓶中，用25%甲醇稀释至刻度，摇匀，配成一系列质量浓度的对照品溶液，按照“3”项下色谱条件进行测定。以脱水红花黄色素B的含量(C)为横坐标，峰面积(A)为纵坐标Y，绘制标准曲线。得回归方程A=60.804C-4.8826（n=6)，r2=0.9997，表明脱水红花黄色素B在1.25 µg/mL-40µg/mL浓度范围内与峰面积的线性关系良好。
5. 精密度试验 精密吸取5μg/mL的脱水红花黄色素B对照品溶液，按上述色谱条件操作，平行测定6次，得脱水红花黄色素B峰面积RSD为0.12%，表明精密度良好。
6. 重复性试验 取同一批次的红花样品，按“2项”平行制备样品溶液6份，按上述色谱条件操作，样品中脱水红花黄色素B平均含量为2.96mg/g，其RSD为1.30%。
7. 稳定性试验 取红花药材，按“2项”制备样品溶液，于制备好后的0，1，2，4，8，12h在上述色谱条件下进样检测，得脱水红花黄色素B峰面积RSD为1.34%。表明供试液在12小时内稳定。
8. 加样回收率试验 称取0.25g已知含量的红花样品6份，分别精密加入与样品等量的脱水红花黄色素B对照品，按“2项”制备样品溶液，用上述色谱条件进行测定，依据得到的峰面积计算回收率，结果平均回收率为101.3%，其RSD为0.76%。
三、红花中脱水红花黄色素B的提取工艺优化
（一） 单因素考察
1. 提取方法的考察
冷浸法：准确称取3份红花，每份0.5g，置于密闭容器内，各加入20倍量的水，室温浸泡40min，每10min振摇一次，滤过，药渣再各加10倍量的水，室温放置20min，每10min振荡一次，滤过，合并滤液。置于100mL的容量瓶中定容，提取液经HPLC测定，计算脱水红花黄色素B的提取率。
温浸法：准确称取3份红花，每份0.5g，置于密闭容器内，各加入20倍量的水，60°C下温浸20min，过滤，药渣再各加10倍量的水，60°C下温浸20min，滤过，合并滤液。置于100mL的容量瓶中定容，提取液经HPLC测定，计算脱水红花黄色素B提取率。
超声法：准确称取3份红花，每份0.5g，置于密闭容器内，各加入20倍量的水，超声20min，滤过，药渣再各加10倍量的水，超声20min，滤过，合并滤液。置于100mL的容量瓶中定容，提取液经HPLC测定，计算脱水红花黄色素B提取率。结果见表1。
如表1所示，冷浸法的提取率较低，超声法的提取率适中，而温浸法的提取效率最高，因此在下列实验中采用温浸法进行提取。
2. 提取次数的考察
准确称取3份红花，每份0.5g，置于密闭容器内，各加入20倍量的水，在60°C下分别提取1次、2次、3次，每次20min，置于100mL的容量瓶中。经HPLC测定计算提取率，结果见图3。
如图3所示，温浸1次时的提取率较低，温浸2次以后提取率明显升高，温浸3次时脱水红花黄色素B提取率略高于温浸2次，考虑到试验成本与时间问题，以温浸2次作为提取次数。
3. 液料比的考察
准确称取5份红花，每份0.5g，置于密闭容器内，分别加入14、16、18、20、22倍量的水，于60°C下提取20min，滤过。第2次提取时分别加入7、8、9、10、11倍量的水，在60°C下提取20min，滤过，合并滤液。置于100mL的容量瓶中。经HPLC测定，计算提取率，结果见图4。
如图4所示，脱水红花黄色素B的提取率随着提取溶剂的增加而升高，当加入18倍量的水时趋于平缓，因此选取18，20，22为液料比的三个水平。
4. 提取温度的考察
准确称取5份红花，每份0.5g，各加入22倍量的水，置于密闭容器内，分别在40、50、60、70、80°C提取20min，滤过。再各加11倍量的水，相同条件下继续提取20min，滤过，合并滤液。置于100mL的容量瓶中。经HPLC测定计算提取率，结果见图5。
如图5所示，在40°C条件下脱水红花黄色素B的提取率较低，随着水浴温度的升高，提取率呈上升趋势，在70°C下达到最高，然后缓慢下降，因此选取60°C、70°C、80°C作为提取温度的三个水平。
5. 提取时间的考察
准确称取5份红花，每份0.5g，各加入22倍量的水，于70°C提取1次，提取时间分别为l0、20、30、40、50min，再各加11倍量的水再提取1次，时间分别为l0、20、30、40、50min，滤过，合并滤液，置于100mL的容量瓶中。经HPLC测定计算提取率，结果见图6。
如图6所示，提取时间为30min时，脱水红花黄色素B的提取率为最大，随着提取时间的增加，脱水红花黄色素B的提取率逐渐下降，可能是与脱水红花黄色素B的热不稳定性有关。因此选取20min、30min、40min为提取时间的三个水平。
（二） 响应面分析法优化提取工艺
在单因素试验的基础上，根据Box-Behnken的中心组合实验设计原理，选取对脱水红花黄色素B提取效果影响显著的因素，确定液料比、提取温度、提取时间3个因素为自变量，以脱水红花黄色素B提取率为响应值，采用三因素三水平响应面分析方法。
表2 Box-Behnken试验因素水平
依据Design-Expert 8.0.5.0软件设计，对液料比Z1，提取温度Z2，提取时间Z3作出如下变换：X1=(Z1-20)/2，X2=(Z2-70)/10，X3=(Z3-30)/10，以X1，X2，X3为自变量，以脱水红花黄色素B的提取率为响应值(Y)，响应面分析试验方案与结果见表3。
表3中，17个试验分为析因点和零点，试验号1、3-5、8-13、15-16是析因实验，2、6、7、14、17是中心试验，用以估计实验误差。利用Design-Expert 8.0.5.0软件，对表的实验数据进行二次多项回归拟合，得到二次多元回归方程：
Y=0.45 + 0.014X1 + 0.027X2 - 2.250E - 003X3 + 3.250E - 003X1X2 + 6.250E- 003X1X3 - 2.250E - 003X2X3 - 7.925E - 003X1 2 - 0.054X2 2 - 0.012X3 2
表4为回归分析结果。回归方差分析显著性证明，该模型回归高度显著(P<0.01)，失拟项显著，并且该模型的R2=0.9974，RAdj 2=0.9942，说明模型的拟合度较好，可以用于脱水红花黄色素B 提取实验的理论预测。回归方程各项的方差分析结果还表明，方差一次项X1，X2极显著，二次项X1 2、X2 2、X3 2极显著，而交互项X1X3高度显著，说明各具体试验因子对响应值的影响不是简单的线性关系。同时表明液料比(X1)和提取温度(X2)在脱水红花黄色素B提取过程中发挥重要作用。
图7-8为液料比与提取温度对脱水红花黄色素B提取率的影响，当液料比保持不变时，随着提取温度的上升，脱水红花黄色素B的提取率呈上升趋势，而当提取温度在75°C -80°C范围内增加时，脱水红花黄色素B的提取率逐渐降低，当提取温度保持不变时，脱水红花黄色素B的提取率随着液料比的增加逐渐升高而后又降低，由此可以说明液料比与提取温度在一定的范围内有利于脱水红花黄色素B的提取。
图9-10为液料比与提取时间对脱水红花黄色素B提取率的影响，当液料比不变时，脱水红花黄色素B的提取率随着提取时间的增加而增大，当提取时间不变时，脱水红花黄色素B的提取率先呈上升趋势，然后缓慢下降，说明液料比与提取时间对脱水红花黄色素B的提取率有影响。
图11-12为提取温度与提取时间对脱水红花黄色素B提取率的影响，当提取时间不变时，提取温度在一定范围内的增加会使脱水红花黄色素B的提取率先上升后下降，当提取温度不变时，随着提取时间的增加脱水红花黄色素B的提取率呈上升趋势，说明提取时间与提取温度对脱水红花黄色素B的提取率有很大的影响。
对二次多元回归方程求解，得X1=1.000，X2=0.280，X3=0.142，代入变换式，解得Z1=22，Z2=72.80，Z3=31.42，预测脱水红花黄色素B的最佳提取率为0.464%。根据实际情况，将所得值修正为液料比22：1，提取温度73°C，提取时间31min，提取2次，并进行三次验证性实验。实际测得脱水红花黄色素B的平均提取率为0.468%，实际测定值与理论预测值的差值仅占理论的0.862%，可见该模型能在一定程度上反映出脱水红花黄色素B的提取条件。
三、脱水红花黄色素B的大孔树脂纯化工艺优化
1. 红花提取液的制备 精密称取适量红花，置于密闭容器内，加入22倍水，73°C下温浸31min，过滤；滤渣再加11倍水，73°C下温浸31 min，滤过后合并滤液。用旋转蒸发仪减压浓缩成一定浓度的红花提取液。
2.大孔吸附树脂的预处理 将D201、HPD-300、AB-8、HPD722、HPD-400、ADS-17、NKA-9、ADS-7、HPD-100型大孔树脂分别置于烧杯中，先用95%乙醇浸泡24h充分溶胀后，湿法装柱，用乙醇通柱淋洗至洗出液加水不显浑浊为止，改用大量水洗，直至无醇味，备用。
3.大孔吸附树脂的静态吸附与静态解吸 精确称取经预处理的9种大孔树脂各0.5g，置于密闭锥形瓶中，精密加入0.05 g/mL的红花提取液10 mL，将锥形瓶置于25℃恒温振荡器中震荡24 h，转速为100 rpm，吸附平衡后的溶液按“（二）3”项下进行HPLC分析。
以10mL的95%乙醇考察静态解吸率。将上述考察静态吸附的大孔树脂抽滤至流沙状以除去吸附液。将抽滤好的大孔树脂倒回锥形瓶中，加入10 mL 95%乙醇。将锥形瓶置于25℃恒温振荡器中震荡24 h，转速为100 rpm。吸取解吸液过膜后进行HPLC分析，按以下公式计算静态吸附下每克树脂吸附脱水红花黄色素B的质量Q，静态吸附率Z和静态解吸率S，结果如表5所示，可以看出HPD300型大孔树脂对脱水红花黄色素B均有比较好的静态吸附和静态解吸性能，因此选择HPD300型大孔树脂进行后续试验。
其中：Q-每克树脂静态吸附脱水红花黄色素B的质量（mg/g）；C0-红花水提液初始浓度（mg/ml）；Cv-静态吸附平衡时红花水提液浓度（mg /mL）；V-红花水提液上样体积（ml）；M-每柱体积所含湿树脂质量（g）
其中：Z-大孔树脂静态吸附率（%）；C0-红花水提液初始浓度（mg/ml）；Cv-静态吸附平衡时红花水提液浓度（mg /mL）；
其中：S-大孔树脂静态解吸率（%）；V-洗脱剂上样体积（mL)；C-静态解吸平衡时解吸液浓度（mg/mL）；M-每柱体积所含湿树脂质量（g）；Q-每克树脂静态吸附脱水红花黄色素B的质量（mg/g树脂）
（一） 单因素考察
1. 大孔吸附树脂的动态吸附
1.1 上样液pH值的确定 取浓度为0.05g/mL的红花水提液，分别用稀氨水或稀盐酸调节上样药液pH为2、3、4、5、6，以流速2.0mL/min分别通过HPD-300树脂柱，用HPLC对流出液进行实时监测，当泄漏时即停止上样并计算比吸附量。比吸附量=（上样液中脱水红花黄色素B质量-上柱流出液中脱水红花黄色素B质量）/湿树脂质量。结果见图13，当pH为3时，比吸附量最大。
1.2 上样流速的确定 取浓度为0.05g/mL、pH为3的红花水提液，分别调整流速为1.0 mL/min、1.5 mL/min、2.0 mL/min、2.5 mL/min，用HPLC对流出液进行实时监测，泄漏时即停止上样。结果见图14，当流速为2.0 mL/min时，比吸附量最大。
1.3 上样液浓度的确定 分别配制浓度为0.04 g/mL、0.05 g /mL、0.06 g /mL、0.07 g /mL、0.08 g/mL的红花水提液。调整药液pH为3，控制上样流速为2.0 mL/min，用HPLC对流出液进行实时监测，泄漏时即停止上样。结果见图15，当上样浓度为0.06 g /mL时，比吸附量最大。
2. 大孔吸附树脂的静态吸附
2.1洗脱剂浓度的确定 按上项所确定的吸附条件上样，用HPLC检测到泄漏时停止上样。分别用浓度为15 %，35 %，55 %，75 %，95 %的乙醇洗脱，控制上样流速为1.0 mL/min，洗脱体积为4BV，合并洗脱液。进行HPLC分析，并计算指标。比洗脱量=洗脱液中脱水红花黄色素B质量/湿树脂质量，结果见图16，当洗脱剂浓度为75%时，比解吸量最大。
2.3洗脱剂体积的确定 按“1”项所确定的吸附条件上样，用HPLC检测到泄漏时停止上样。控制上样流速为2.0 mL/min，再分别用2 BV、4 BV、6 BV、8 BV、10 BV浓度为75 %的乙醇溶液洗脱，合并洗脱液。进行HPLC分析，并计算指标。结果见图17，当用4BV浓度为75 %的乙醇洗脱时，洗脱已基本完全。
（二） 响应面分析法优化纯化工艺
1. 试验的设计以及结果
在上述单因素试验的基础上，根据Box-Behnken Design（BBD）中心组合试验设计原理，选择影响大孔树脂吸附效果的三个因素即上样液pH，上样流速及上样液浓度为自变量，比吸附量为响应值，采用三因素三水平响应面分析方法建立数学模型。同时，影响大孔树脂解吸效果的三个因素即洗脱剂浓度、洗脱剂用量和洗脱流速为自变量，比解吸量为响应值，采用三因素三水平响应面分析方法建立数学模型。试验设计及结果见表8。
依据Design-Expert 8.0.5.0软件设计，对上样液pH Z1，上样流速Z2，上样液浓度Z3作出如下变换：X1=(Z1-3)，X2=(Z2-2)/0.5，X3=(Z3-0.06)/0.01，以X1，X2，X3 为自变量，以脱水红花黄色素B的比吸附量为响应值(Y)，响应面分析试验方案见表6。
依据Design-Expert 8.0.5.0软件设计，对洗脱剂浓度Z1，洗脱流速Z2，洗脱剂体积Z3作出如下变换：X1=(Z1-75)/20，X2=(Z2-1.5)/0.5，X3=(Z3-4)/1，以X1，X2，X3 为自变量，以脱水红花黄色素B的提取率为响应值(Y)，响应面分析试验方案见表7。
表8中，17个试验分为析因点和零点，试验号1-5、9、11、13-17是析因实验，6-8、10、12是中心试验，其中析因点为自变量取值在X1、X2、X3所构成的三维顶点，零点为区域的中心点用以估计实验误差。
2. 模型的建立以及显著性的分析 通过Design-Expert 8.0.5.0软件对表8的数据进行分析，响应值与各因素编码值进行回归拟合，动态吸附中各因素拟合的二次多元回归方程：Y=1.08-0.16X1-0.058X2-0.036X3+0.11X1X2+0.039X1X3-5.000E-004X2X3-0.13X1 2-0.039X2 2-0.074X3 2。动态解析中各因素拟合的二次多元回归方程：Y=0.84+0.035X1+0.031X2+0.073X3-0.011X1X2+0.052X1X3 +0.034X2X3-0.022X1 2-0.053X2 2-2.950E-003X3 2。
利用Design-Expert 8.0.5.0软件，对表8中实验数据进行多元回归拟合及对模型进行方差分析。从表9可以看出，此模型回归显著(P<0.05)，失拟项不显著，并且该模型的R2=0.9300，说明这种实验方法是可靠的，通过观察P值，方差一次项X1极显著，二次项X1 2、X3 2极显著，交互项X1X2显著，说明实验因子对响应值不是简单的线性关系。对动态吸附的过程中影响比吸附量的因素为：A-X 1 （上样PH）>C-X 3 （上样液浓度）>B-X 2 （上样速率）。
从表10可以看出，此模型回归显著(P<0.05)，失拟项不显著，并且该模型的R2=0.9022，说明这种实验方法是可靠的，通过观察P值，方差一次项X3高度显著，二次项X1 2、X2 2高度显著，交互项X2X3显著，说明实验因子对响应值不是简单的线性关系。对动态吸附的过程中影响比吸附量的因素为：C-X 3 （洗脱剂体积）>B-X 2 （洗脱流速）>A-X 1 （洗脱剂浓度）。
3. 交互项对响应值的影响
在大孔树脂动态吸附方程中、交互项X1X2的相互作用显著（见图18-19）。当上样流速一定时，随着上样液pH值不断的增加，脱水红花黄色素B比吸附量先上升，然后呈下降趋势，说明合适的pH有利于脱水红花黄色素B吸附。当上样液的pH一定时，脱水红花黄色素B比吸附量随着上样流速的增加而增大，当到达一定的水平时逐渐减小，说明流速过快不利于脱水红花黄色素B动态吸附。在大孔树脂动态解吸的方程中、交互项X2X3的相互作用显著（见图20-21）。当洗脱体积一定时，洗脱流速在一定范围内的增加会使脱水红花黄色素B的比解吸率增加，说明合适的洗脱流速有利于脱水红花黄色素B的解吸。当洗脱流速保持不变时，随着洗脱体积的增高，脱水红花黄色素B的比解吸量逐渐上升而后趋于平缓，说明解析基本完全。
4. 验证性实验 通过Design-Expert 8.0.5.0软件求解方程，得出最优的纯化工艺，即大孔树脂对脱水红花黄色素B的最佳动态吸附条件为：上样液pH为2.79，流速为1.89mL/min，上样浓度为0.06 g/mL，最大预测综合指标1.080mg/g。最佳动态解吸工艺条件为：洗脱剂浓度为73.5%，洗脱流速为1.62mL/min，洗脱体积为4.39BV，最大预测综合指标0.891mg/g。
依据以上最佳条件进行吸附和解吸验证试验，考虑到操作可行性，将吸附的最佳工艺条件确定为：上样液PH为2.8，上样流速为1.9 mL/min上样浓度为0.06 g/mL。解吸工艺条件确定为：洗脱流速为1.6mL/min，洗脱体积为4.4BV，洗脱剂浓度为74%。同时进行三次平行验证性实验，实际测得脱水红花黄色素B的平均比吸附量为1.095mg/g，平均比解吸量为0.906mg/g，实际测定值与理论预测值的差值分别占理论的1.389%和1.684%，可见该模型能在一定程度上反映出脱水红花黄色素B动态吸附与解吸的条件。
Claims (7)
1.一种红花中脱水红花黄色素B的提取和纯化方法，其特征在于包括以下步骤：
1）温浸法：将红花置于密闭容器内，加入红花重量15-25倍的水，55-85℃下温浸26-38min，过滤，药渣再加原药材重量9-13倍的水，75-85℃下温浸26-38min，滤过，合并滤液，减压浓缩成浓度为0.04-0.08g/mL的红花水提液；
2）大孔吸附树脂的预处理：将HPD-300型大孔树脂置于烧杯中，先用95%乙醇浸泡24h充分溶胀后，湿法装柱，用乙醇通柱淋洗至洗出液加水不显浑浊为止，改用大量水洗，直至无醇味，备用；
3）大孔树脂吸附：取浓度为0.04-0.08g/mL的红花水提液，用稀盐酸调节上样药液pH为2.6-3.2，以流速1.5-2.5 mL/min通过HPD-300型大孔树脂柱，用HPLC对流出液进行实时监测，当泄漏时即停止上样；
4）大孔树脂洗脱：用浓度为65-85 %的乙醇进行洗脱，控制洗脱流速为1.0-2.0 mL/min，洗脱体积为3-5BV，合并洗脱液，即得含脱水红花黄色素B的洗脱液。
2.如权利要求1所述的一种红花中脱水红花黄色素B的提取和纯化方法，其特征在于步骤1）中：加入红花重量17-23倍的水。
3.如权利要求1所述的一种红花中脱水红花黄色素B的提取和纯化方法，其特征在于步骤3）中：红花水提液的浓度为0.05-0.07g/mL。
4.如权利要求1所述的一种红花中脱水红花黄色素B的提取和纯化方法，其特征在于步骤3）中：上样药液pH为2.7-3.1。
5.如权利要求1所述的一种红花中脱水红花黄色素B的提取和纯化方法，其特征在于步骤3）中：上样药液流速1.7-2.3 mL/min。
6.如权利要求1所述的一种红花中脱水红花黄色素B的提取和纯化方法，其特征在于步骤4）中：乙醇浓度为70-80 %。
7.如权利要求1所述的一种红花中脱水红花黄色素B的提取和纯化方法，其特征在于步骤4）中：洗脱流速为1.2-1.8 mL/min，洗脱体积为4BV。
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