CN101129405B

CN101129405B - 一种治疗习惯性流产的生物学制剂

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Publication number: CN101129405B
Application number: CN2007100624876A
Authority: CN
Inventors: 崔瀓; 杨彦忠
Original assignee: Individual
Current assignee: Noncommissioned Officer Academy of Army Medical University
Priority date: 2007-07-31
Filing date: 2007-07-31
Publication date: 2011-05-11
Anticipated expiration: 2027-07-31
Also published as: CN101129405A

Abstract

一种治疗习惯性流产的生物学制剂，属医药技术领域。其技术方案是，抽取健康成年男性外周血；玻璃球脱纤维Hanks液1.5倍稀释，分离淋巴细胞，收集单个核细胞；Hanks液清洗，用RPMI-1640完全培养液重悬、计数，并调整细胞浓度至2×10⁶/ml，加入植物血凝素，37℃培养72h；收集培养液的上清，以离心超滤及蔗糖密度梯度离心法制备T细胞exosomes；用无菌滤膜过滤分装，-80℃保存即得成品。本发明能有效地诱导机体的免疫耐受，克服了免疫细胞过继疗法诱导免疫耐受的诸多不足，使临床应用更为简单易行；制剂可大规模工业化制备，使质量控制更为稳定、可控性更强。将其应用于治疗习惯性流产，取得良好的疗效。

Description

一种治疗习惯性流产的生物学制剂

技术领域

本发明涉及一种利用非细胞成分取代传统细胞成分制作治疗不明原因习惯性流产的免疫学制剂，属医药技术领域。

背景技术

习惯性流产是指连续发生三次或以上流产者，发病率约占总妊娠数的1％，占自然流产数的15％，为一种严重危害孕妇身心健康的产科疾病。临床曾有病例连续发生7次流产者，病人十分痛苦。此种疾病病因十分复杂，包括遗传因素、解剖异常、内分泌异常、感染等等，但是，在排除上述临床病因后，仍有59.42％的习惯性流产患者，称为不明原因习惯性流产URSA(Unexplanted recurrent spontaneous abortion)，它与母体免疫因素有关，已成为目前人们关注的热点。目前临床上将URSA患者分为自身免疫型和同种免疫型两大类，其中国内外针对同种免疫型URSA患者，常规采用“免疫细胞过继疗法”进行治疗，旨在诱导受孕母体对半同种异体胎儿抗原的免疫耐受，帮助孕妇度过危险期。

虽然此方法的疗效较肯定，国内外报道有效率达70％-95％，但仍存在以下不足，从而限制了它的临床应用：(1)治疗用免疫细胞的制备难度较大；(2)个体之间差异较大，影响疗效的稳定性；(3)免疫细胞的新鲜分离稳定性差，因此，使用免疫细胞的技术方案仍然不是人们理想的方案。

有资料表明，采用丈夫或无关男性个体淋巴细胞过继治疗的疗效无统计学差异，且发挥免疫耐受诱导作用的是T细胞。这说明，采用男性同种异体T细胞进行过继转输均可能通过不同男性个体T细胞上的某些共同抗原成分发挥作用，诱导母体对半同种异体胎儿抗原的免疫耐受；而T细胞在生长增殖过程中分泌释放的一种称为exosomes的非细胞成分膜性微囊结构，浓缩了整套T细胞自身的抗原成分，并可克服细胞成分治疗的诸多缺点，有可能开辟一条新的治疗免疫性疾病的道路。目前采用exosome进行临床应用的实验室探索，多局限于做为生物治疗载体应用于肿瘤治疗，以促进机体的抗瘤免疫效应为目的。但有关其做为免疫耐受诱导剂用于习惯性流产的治疗，则尚未见文献报道，更不用说进入实用治疗的制剂了。

发明内容

本发明所用于克服已有技术的不足、从而提供一种便于临床规范使用的治疗习惯性流产的生物学制剂。

本发明的问题是以下述技术方案实现的：

一种治疗习惯性流产的生物学制剂，它以男性外周血为原材料，并按下述步骤进行：

a.培养男性外周血T细胞：

抽取健康成年男性外周血50ml；玻璃球脱纤维Hanks液1.5倍稀释，分离淋巴细胞，收集单个核细胞；Hanks液清洗，用RPMI-1640完全培养液重悬、计数，并调整细胞浓度至2×10⁶/ml，加入植物血凝素(PHA)，使终浓度为100μg/ml；37℃培养72h；收集培养液的上清，4℃保存备用；

b.制备T细胞exosomes：

取上述外周血T细胞培养上清，以1500g离心10min去除细胞及细胞碎片；分子量100 000超滤管过滤浓缩5倍后；以30mg/ml蔗糖/D₂O为密度垫，以100 000g超速低温离心75min，收集底部的缓冲垫；PBS稀释，100 000g超速低温离心75min，获得exosomes；0.22μm无菌滤膜过滤分装，-80℃保存备用。

上述治疗习惯性流产的生物学制剂，所述体外培养应换用新鲜含PHA的培养液、在体外反复刺激、培养，均至镜下观察转化率大于75％。

一种治疗习惯性流产的生物学制剂的用途，可用于制备治疗习惯性流产、自身免疫性疾病的药剂或器官移植后免疫耐受的诱导剂。

本发明提供了一种非细胞免疫生物学制剂，它能有效地诱导机体的免疫耐受，克服了免疫细胞过继疗法诱导免疫耐受的诸多不足，使临床应用更为简单易行；本制剂可以按照GMP标准进行大规模工业化制备，使质量控制更为稳定、可控性更强。将其应用于治疗习惯性流产，取得良好的疗效。本发明提供的生物学制剂，其机理也可用于其他自身免疫性疾病、器官移植后免疫耐受的诱导，等等。

具体实施方式

本发明分为两大步骤，一是健康成年男性外周血T细胞的体外刺激和培养，二是以离心超滤及蔗糖密度梯度离心法制备T细胞exosomes。

首先抽取健康成年男性外周血50ml，玻璃球脱纤维，1.5倍稀释后，以淋巴细胞分离液分离收集单个核细胞；Hanks(细胞清洗液)液彻底清洗两次后，RPMI-1640(细胞培养基)完全培养液重悬细胞，计数并调整细胞浓度至2×10⁶/ml，加入植物血凝素(PHA)使终浓度为100μg/ml；37℃培养72h后镜下观察T细胞转化情况；换用新鲜含PHA的培养液体外反复刺激、培养。收集的培养上清可于4℃保存备用。

然后制备生物制剂，取经体外刺激、培养的T细胞(2×10⁷个)培养上清，1500g 10min去除细胞及细胞碎片；分子量100 000 MWCO Centriplus超滤管超滤浓缩5倍后，以30mg/ml蔗糖/D₂O为密度垫，100 000g超速低温离心75min，收集底部的缓冲垫；PBS(磷酸盐缓冲液)稀释，100 000g超速低温离心75min，获得exosomes，0.22μm无菌滤膜过滤分装，-80℃保存即得成品。

本发明使T细胞在生长增殖过程中可分泌释放一种称为exosomes(外来体)的膜性微囊结构，与T细胞相比，T细胞exosomes作为一种非细胞成分，具有以下特点：1.浓缩了整套T细胞自身的抗原成分，含有与自身细胞特殊功能相关的蛋白(MHC-II类分子、TCR、整合素等)，可引导exosomes到达靶细胞；2.界膜稳定，一旦获得即可长时间冷冻贮藏，省去了新鲜分离并长期培养细胞的不便和困难；3.分离和提纯容易，其可操作性和可控性更强；4.非细胞成分，体积小，易清除，无繁殖能力，抗原性弱，应用于人体副作用很小，稳定高效。

分离得到的exosomes以紫外分光光度计定量，并采用免疫电镜、Western印迹检测其所携带的特征性分子(HLA-I、HLA-II、ICAM-1等)，作为质量控制标准。

将本发明产品以多点皮下注射的接种方式对URSA患者进行治疗，每次间隔3周，受孕后巩固治疗至超过以往流产月份。

临床疗效按如下标准评判：

以再次流产大于以往流产月份作为治疗有效；以足月分娩正常新生儿作为治疗成功；以再次流产小于以往流产月份作为治疗失败，可与常规免疫细胞过继疗法进行对比。其结果是妊娠成功率约90.0％，较过继转输细胞法的84.80％妊娠成功率有显著升高。

本发明在用于治疗URSA的动物实验中，也取得良好结果，其动物试验如下：

建立动物模型。

实验动物为8～10周龄清洁级CBA/J(雌性♀)、DBA/2(雄性

)和BALB/c(雄性

)近交系小鼠。以♀CBA/J×DBA/2为URSA实验组(文献报道胚胎丢失率高达25％～45％)，♀CBA/J×

BALB/c为正常对照组(文献报道胚胎丢失率仅为5％～8％)。雌雄小鼠按2∶1交配，自同居之日起，每天8:00和15:00分别观察一次阴栓，如见阴栓，即确定为妊娠第1天，于妊娠第12～14天将小鼠处死，观察胚胎发育情况。

父系外周单个核细胞(PBMC)exosomes的制备。

取雄性DBA/2小鼠，摘眼球放血处死，无菌解剖取脾，研磨、200目铜网过滤获得单个细胞悬液；离心弃去上清液后，依次加入双蒸水1.5mL、等量1.8％NaCl，洗涤后计数，培养液配制成2.5×10⁶/ml，加入刀豆蛋白A(ConA)使终浓度为10μg/ml；37℃培养72h后镜下观察T细胞转化情况。

将URSA动物模型小鼠随机分为无治疗对照组、免疫细胞过继治疗组、exosomes治疗组：

对无治疗对照组：确定怀孕后，不进行任何治疗；

对免疫细胞过继治疗组：确定怀孕后，取父系PBMC进行注射治疗；

对exosomes治疗组：确定怀孕后，将提取的经ConA刺激后父系PBMC的exsomes进行注射治疗；

对孕鼠胚胎吸收率的影响胚胎吸收的判断标准为胚胎体积明显缩小，胎儿胎盘单位有明显出血或坏死者。胎盘吸收率＝吸收胚胎数/(吸收胚胎数+存活胚胎数)

其结果为：

URSA动物模型无治疗对照组的胚胎吸收率为28.21％±2.56％，显著高于正常对照组5.26％±0.69％。经传统免疫细胞过继治疗后，胚胎吸收率11.40％±1.84％显著降低。exosomes治疗组的胚胎吸收率为9.76％±1.27％，均显著低于流产无治疗对照组和传统免疫细胞过继治疗组。从而说明采用制剂可取得更好的效果，详情见下表：

附表不同治疗方式或制剂对小鼠URSA治疗效果的比较(x±s)

与正常对照组相比，^*：P＜0.05，^**：P＜0.001，^***：P＜0.0005

与无治疗对照组相比，^#：P＜0.05，^##：P＜0.001

与免疫细胞过继治疗组相比，^$：P＜0.05。

Claims

1.一种治疗习惯性流产的生物学制剂，其特征在于，它以男性外周血为原材料，并按下述步骤进行：

a.培养男性外周血T细胞：

将健康成年男性外周血50ml用玻璃球脱纤维Hanks液1.5倍稀释，分离淋巴细胞，收集单个核细胞；Hanks液清洗，用RPMI-1640完全培养液重悬、计数，并调整细胞浓度至2×10⁶/ml，加入植物血凝素(PHA)，使终浓度为100μg/ml；37℃培养72h；收集培养液的上清，4℃保存备用；

b.制备T细胞exosomes：

取上述外周血T细胞培养上清，以1500g离心10min去除细胞及细胞碎片；分子量100000超滤管过滤浓缩5倍后；以30mg/ml蔗糖/D₂O为密度垫，以100000g超速低温离心75min，收集底部的缓冲垫；PBS稀释，100000g超速低温离心75min，获得exosomes；0.22μm无菌滤膜过滤分装，-80℃保存备用。

2.根据权利要求1所述的治疗习惯性流产的生物学制剂，其特征在于，在所述a.步骤中，在采用37℃培养72h后，换用新鲜含PHA的培养液、反复刺激、培养，至镜下观察T细胞转化率大于75％。