CN1566331A - 用于培养淋巴细胞的无血清培养基 - Google Patents

Abstract

本发明涉及适于在体外培养淋巴细胞的培养基，具体地涉及了一种在体外能使淋巴细胞增生的无血清培养基。该培养基包括基本培养基、白介素－2、脂肪酸、胆固醇、甘油酯、转铁蛋白，不含血清，价格便宜，扩增淋巴细胞的效率与含有人血清的培养基相当且杀死肿瘤细胞的活性高。

Description

用于培养淋巴细胞的无血清培养基

技术领域

本发明涉及适于在体外培养淋巴细胞的培养基，具体地涉及了一种在体外能使淋巴细胞增生的无血清培养基。

背景技术

随着组织工程核基因工程的兴起和发展，干细胞的研究称为21世纪的热点之一。在人和动物的个体发生发育过程中，在胚胎和成年组织中均存在着具有高度更新能力和多向分化潜能的干细胞。干细胞可体外分离、扩增和冷冻保藏，而且在适当条件下可以被诱导分化成多种细胞和组织，这为探讨人和动物胚胎发生、组织细胞分化、基因表达调控等发育生物学问题提供了理想的模型***，同时也为临床组织缺陷性疾病和遗传性疾病的细胞替代治疗和基因治疗开拓了新途径。

造血干细胞是一类倍受关注的具有多向分化能力的干细胞，在不同的生理条件下，如在不同的造血细胞生长因子的刺激下可以向着淋巴细胞或髓性细胞的方向分化，髓性细胞进一步增殖可以产生成熟的红细胞、白细胞或巨核细胞。每个巨核细胞又能产生数千个有功能的血小板。将造血干细胞输入体内，可以很快分化成增殖形成成熟血细胞，因此，可以治疗各种血细胞减少症，也可以移植给骨髓衰竭病人，重建其造血功能。

淋巴细胞是一种具有重要用途的造血干细胞，进一步分化可以发育成功能性的淋巴细胞。Grimm，E.A等发现如果从癌症患者体内提取外周血淋巴细胞(Peripheral Blood Lymphocyte，PBL)，将其在存在白细胞介素-2的条件下体外培养，该细胞能获得识别并破坏癌肿瘤细胞的能力(参见Grimm，E.A等，J.Exper.Med.，155：1823-1841)1982)；Grimm，E.A等，J.Exper.Med.，157：884-897(1983)；Grimm，E.A等，J.Exper.Med.，158：1356-1361(1983))。这一发现对于治疗癌症患者是非常有意义的，医生可以从患者体内提取少量的淋巴细胞，体外培养以产生大量的具有抗肿瘤特异性的免疫淋巴细胞，即淋巴因子激活的杀手细胞(Lymphokine activated killer cells，LAK)。

Grimm，E.A等首次用含有人血清的培养基在体外成功培养出LAK细胞(J.Exper.Med.，157：884-887(1993))。然而，人血清价格昂贵，不适宜于大规模扩增。Mazumder，A.等(J.Exper.Med.，159：495-507(1984))和Rosentein，M等(J.Natl.Canc.Inst.，72：1161-1165(1984))研究证实含有胎儿牛血清的培养基也能刺激LAK细胞的产生。但是，发现胎儿牛血清诱导LAK细胞形成的效率较低(Imir，P等，Clin.Immunol.Immunopath.，36：289-296(1 985))，其诱导产生的LAK的数量只有用人血清诱导产生的LAK细胞的数量的1/9。而且，胎儿牛血清对LAK细胞前体或LAK细胞自身具有毒性。针对上述缺陷，Froelich，C.J.，等(J.Immunol.Meth.，86：205-211(1986))设计出了无血清培养基，该培养基是Dulbecco改良的Eagle培养基，其中补加了牛血清蛋白和三种脂肪酸：亚油酸、油酸和棕榈酸，另外还含有胰岛素、转铁蛋白和乙醇胺。这种培养基能使LAK细胞增殖，但是其效率仍然比含有人血清的培养基要低得多。

因此，为了克服现有技术的缺陷，本发明提供一种新的培养基，该培养基不含血清，价格便宜，扩增淋巴细胞的效率与含有人血清的培养基相当且杀死肿瘤细胞的活性高。

发明内容

本发明的目的是提供一种在体外培养淋巴细胞的无血清培养基。该培养基包括基本培养基、白介素-2(IL-2)、脂肪酸、胆固醇、甘油酯、转铁蛋白。

基本培养基是Iscove改良的Dulbecco培养基(Iscove’s modified Kulbecco’smedium，IMDM)、McCoy’s5A或Dulbecco改良的Eagle培养基与Ham’s-F12培养基以1∶1的比例混合而形成的培养基。优选地，该基本培养基是Iscove改良的Dulbecco培养基。

IL-2的用量是用常规方法测得，通常在T细胞株培养中加入不同浓度的IL-2，以3H-dR掺入法检测细胞生长情况，选择最佳浓度的IL-2用于淋巴细胞的培养。以3H-dR达到最大掺入量的50％时所需的IL-2的量为一个单位(U)，那么，IL-2的浓度一般为3-1000U/ml，优选为100-800U/ml，更优选为600U/ml。

可用的脂肪酸包括环状糊精，如α-环状糊精、β-环状糊精、γ-环状糊精，亚油酸，油酸或棕榈酸其中的一种或几种的组合。优选的是环状糊精和亚油酸，更优选的是β-环状糊精和亚油酸。脂肪酸在培养基中以有效量存在，优选含量为0.001-100ug/ml，更优选为0.1-10ug/ml。

胆固醇的含量为0.5-2.0ug/ml，优选为1.0-1.8ug/ml，更优选为1.5ug/ml。

可用的甘油酯包括甘油二脂和乙酰甘油酯，优选为甘油二酯，更优选为sn-1，2-甘油二酯。其浓度为0.5-20ug/ml，更优选为5-20ug/ml。上述化合物微溶于水，但加入助溶剂，如Tween(浓度为1-20ug/ml)可以使其溶解度增大。

转铁蛋白可以用公知的方法从动物或人体中提取纯化。所用的纯的转铁蛋白的浓度为80-500ug/ml，优选为130-500ug/ml，更优选为275-400ug/ml，更优选为300ug/ml。

该培养基所使用的缓冲溶液是碳酸氢纳或HEPES。培养基的pH值保持在6.8-7.2之间，优选为7.0。

为了选择性培养特定的淋巴细胞，可以向培养基中加入有效量的抗生素，如青霉素、庆大霉素或链霉素中的一种或几种。

用上述培养基37℃培养分离的淋巴细胞，所得的淋巴细胞与用含有人血清的培养基培养所得的干细胞比较，效率相当，且杀死细胞活性高、培养费用较低。

具体实施方式

本发明用下面的实施例作进一步的说明，但对本发明的范围不起限制作用。

实施例1：淋巴细胞的分离与培养

从患白血病的病人的静脉中采血5-10ml，加入到肝素抗凝的离心管中，肝素的终浓度为40U/ml，用IMDM梯度密度离心分离提取单个核细胞，用IMDM洗涤2次，调整细胞浓度为1×10⁶/ml备用。如果有必要，可以用常规的玻璃黏附法(glass adherence)对上述淋巴细胞进行进一步的纯化。

在IMDM中加入青霉素100U/ml、链霉素100U/ml、亚油酸8ug/ml、胆固醇1.5ug/ml、甘油二酯15ug/ml、Tween80 5ug/ml、转铁蛋白300ug/ml，2600ug/mlHEPES缓冲液(pH 7.0)、2500ug/ml碳酸氢钠。在使用培养基之前，向培养基中加入600U/ml的IL-2。将4ml上述分离的细胞加入到该培养基中，5％CO₂，饱和湿度下在24孔板中37℃培养7天，每3天更换培养液，每天观察细胞生长或死亡情况。

实施例2：与含有血清的培养基所产生的细胞集落数进行比较

以补加了2％人血清的RPMI-1640培养基或Darfler培养基或IMDM培养基作为对照，按照与实施例1相同的方法培养淋巴细胞，在倒置的显微镜下计算同一孔板内的菌落数，结果发现，用实施例1的培养基培养所得的菌落数与用含有人血清的培养基培养得到的菌落数相当。这表明本发明的无血清培养基完全可以代替含血清的培养基。

实施例3：Nk细胞毒性试验

将效应细胞，即上述培养分离的淋巴细胞用IMDM洗涤3次，配制成5×10⁶个/ml细胞悬液。将靶细胞，即K562细胞用IMDM洗涤1次，配制成密度为5×10⁷个/ml悬液，取细胞悬液0.1ml，加入0.1ml(100uCi)预先用生理盐水配置的Na₂ ⁵¹CrO₄(1.0mCi/ml)，置37℃温育1h，用IMDM洗涤3次。计数后用培养液配成密度为1×10⁵个/ml的细胞悬液。然后，分组加样，反应在U型微孔板中进行。分3组，每组3复孔：1)试验组：每孔加效应细胞和靶细胞悬液各100ul；2)自发释放组：每孔加靶细胞悬液和培养液各100ul；3)最大释放组：每孔加靶细胞悬液和1％Triton X-100水溶液各100ul。最后，将微孔反应板方在带有反应板支架的离心机上以800r/min离心5min，以促进效应细胞和靶细胞结合。然后，置37℃5％CO₂培养箱中培养，6h后，取出反应板，测定cpm值。

取各组3管均值计算自发释放率和自然杀伤率(即NK细胞活性)。结果，用本发明的培养基培养出的淋巴细胞的自然杀伤率为79％，高出正常值。

Claims (20)

1、一种在体外培养淋巴细胞的无血清培养基，其特征在于该培养基含有基本培养基、细胞生长因子IL-2、脂肪酸、胆固醇、甘油酯、转铁蛋白。

2、权利要求1的培养基，其中的基本培养基是Iscove改良的Dulbecco培养基、McCoy’s5A或Dulbecco改良的Eagle培养基与Ham’s-F12培养基以1∶1的比例混合而形成的培养基。

3、权利要求1的培养基，其中的基本培养基是Iscove改良的Dulbecco培养基。

4、权利要求1的培养基，其中细胞生长因子IL-2的浓度为3-1000U/ml。

5、权利要求1的培养基，其中细胞生长因子IL-2的浓度为100-800U/ml。

6、权利要求1的培养基，其中细胞生长因子IL-2的浓度为600U/ml。

7、权利要求1的培养基，其中的脂肪酸包括α-环状糊精、β-环状糊精、γ-环状糊精，亚油酸，油酸或棕榈酸其中的一种或几种的组合。

8、权利要求1的培养基，其中的脂肪酸是β-环状糊精和/或亚油酸。

9、权利要求1的培养基，其中脂肪酸的含量为0.001-100ug/ml。

10、权利要求1的培养基，其中脂肪酸的含量为0.1-10ug/ml。

11、权利要求1的培养基，其中胆固醇的含量为0.5-2.0ug/ml。

12、权利要求1的培养基，其中胆固醇的含量为1.0-1.8ug/ml。

13、权利要求1的培养基，其中胆固醇的含量为1.5ug/ml。

14、权利要求1的培养基，其中的甘油酯包括甘油二脂和/或乙酰甘油酯。

15、权利要求14的培养基，其中甘油酯的浓度为0.5-20ug/ml。

16、权利要求14的培养基，其中甘油酯的浓度为5-20ug/ml。

17、权利要求1的培养基，其中的转铁蛋白的浓度为80-500ug/ml。

18、权利要求1的培养基，其中的转铁蛋白的浓度为300ug/ml。

19、权利要求1的培养基，其pH值保持在6.8-7.2之间。

20、权利要求1的培养基，其pH值为7.0。