CN109913411A - 有效改善骨髓造血微环境的免疫细胞的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种有效改善骨髓造血微环境的免疫细胞的制备方法，包括如下步骤：从血液中分离出血细胞；将血细胞置于0‑5摄氏度的箱体内培养1‑2小时；将血细胞置于细胞激活培养基中进行血细胞激活培养10‑20小时，以便得到初步扩增的血细胞；将血细胞置于至少一种细胞培养基中加入激活试剂进行血细胞培养10‑30小时，以便得到激活的血细胞；将激活的血细胞经过至少一次的生理盐水清洗，从而得到有效改善骨髓造血微环境的免疫细胞的制备方法。本发明具有能通过改善骨髓造血微环境达到治疗再生障碍性贫血等造血性疾病的效果的优点。

Description

有效改善骨髓造血微环境的免疫细胞的制备方法

技术领域

本发明涉及医药领域，尤其是涉及一种有效改善骨髓造血微环境的免疫细胞的制备方法。

背景技术

再生障碍性贫血是一种骨髓造血功能衰竭症，主要表现为骨髓造血功能低下、全血细胞减少和贫血、出血、感染征候群。其中慢性再生障碍性贫血是一种发病缓慢，病程相对较长，非常难于治疗的血液***疾病。再生障碍性贫血是由多种病因引起的以全血细胞减少为主要临床表现的造血功能衰竭综合征。我国与东南亚属于再生障碍性贫血高发地区，年发病率为欧美地区的2-3倍。根据中性粒细胞数量(0.5×109/L)、血小板数(20×109/L)及病情发病急缓，分为重型再生障碍性贫血(SAA)和非重型再生障碍性贫血，其中重型再生障碍性贫血患者中性粒细胞小于0.2×109/L为极重型再生障碍性贫血(VSAA)。SAA尤其是VSAA预后差，不及时采取有效治疗措施，患者可能因感染、出血而危及生命。再生障碍性贫血主要治疗措施包括异基因造血干细胞移植、联合免疫抑制治疗和支持治疗。其中HLA全相合同胞间异基因造血干细胞移植为治疗SAA的首选治疗方法。抗胸腺/淋巴细胞球蛋白(ATG/ALG)联合环孢素(CsA)的免疫抑制治疗(IST)是不适于异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)的SAA患者的首选治疗方案，可使60％-80％的患者完全或部分恢复自身造血。在中国，由于同胞供者的缺乏，近年IST作为SAA的一线治疗方案已越来越多地应用于临床。ATG治疗达到完全缓解(CR)时间相对较慢，50％患儿在ATG治疗12个月达到CR，90％患儿在24个月才能达到CR。在IST未取得治疗反应之前，需要继续输注血制品或者注射G-CSF。此外，ATG属于异种血清，可发生多种不良反应，包括即刻及迟发型***反应。因此，本领域仍然需要改善骨髓造血微环境能用于治疗再生障碍性贫血的药物。

发明内容

有鉴于此，本发明目的在于提供一种能改善骨髓造血微环境用于治疗再生障碍性贫血的免疫细胞制剂。

本发明的目的是采用如下技术方案实现：

一种有效改善骨髓造血微环境的免疫细胞的制备方法，包括如下步骤：

从血液中分离出血细胞；

将血细胞置于0-5摄氏度的箱体内培养1-2小时；

将血细胞置于细胞激活培养基中进行血细胞激活培养10-20小时，以便得到初步扩增的血细胞；

将血细胞置于至少一种细胞培养基中加入激活试剂进行血细胞培养10-30小时，以便得到激活的血细胞；

将激活的血细胞经过至少一次的生理盐水清洗，从而得到有效改善骨髓造血微环境的免疫细胞的制备方法。

可选的，所述细胞激活培养基为添加了白介素-2和沙培林的无血清淋巴细胞培养基。

可选的，所述细胞激活培养基中添加了哺乳动物血清。

可选的，所述哺乳动物血清为哺乳动物胎血清。

可选的，所述激活试剂为钙离子载体。

可选的，所述钙离子载体选自A23187或离子霉素。

可选的，所述激活试剂为腺病毒。

可选的，所述血细胞包括从受试者获得的外周血单个核细胞。

可选的，其中获得外周血单个核细胞的步骤包括：在注射器中抽取血液，利用Ficoll-Hypaque分层法分层所述血液，并在Ficoll的界面处收集外周血单个核细胞。

可选的，还包括进行白细胞去除术的步骤。

本发明提供的有效改善骨髓造血微环境的免疫细胞的制备方法能通过改善骨髓造血微环境达到治疗再生障碍性贫血等造血性疾病的效果。

具体实施方式

应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

一种有效改善骨髓造血微环境的免疫细胞的制备方法，根据本发明待处理的血细胞可以从患者或免疫学上可接受的供体获得，例如患有再生障碍性贫血的患者。通过离体培养激活血细胞的一种方案包括从患者或免疫学上可接受的供体获得血液样品，从血液样品中分离血细胞，并培养激活的血细胞。“免疫学上可接受的供体”是具有组织的人，其包括血细胞，其不具有医学上不可接受水平的受体反应(例如，溶血性贫血，心力衰竭，肾衰竭)。然后将血液样品分层到离心分离介质如Ficoll-Hypaque(PharmaciaCorporation)或淋巴细胞分离培养基(LittonBioneticsCorporation)上来回收血细胞。再将血细胞置于0-5摄氏度的箱体内培养1-2小时，发明人发现利用前期在0-5摄氏度的箱体内培养1-2小时能增加血细胞的活性。

将血细胞置于细胞激活培养基中进行血细胞激活培养10-20小时，以便得到初步扩增的血细胞；尽管可以在本发明的方法中可使用任何细胞激活培养基，但优选使用添加了白介素-2和沙培林的无血清淋巴细胞培养基培养10-20小时，以便得到初步扩增的血细胞；在另一实施例中细胞激活培养基还可以添加哺乳动物血清，其中的哺乳动物血清优选为哺乳动物胎血清，例如胎牛血清，添加量为10％和15％左右。体外激活细胞最基本的营养物质是合适的培养基。这些培养基一般由生理盐水、氨基酸、维生素和其他化合物组成，它们可以直接地被细胞利用，优选RPMI1640培养基或无血清培养基AIM-V。培养基可以补充哺乳动物免疫血清，如胚胎牛免疫血清将血细胞置于至少一种细胞培养基中加入激活试剂进行血细胞培养10-30小时，以便得到激活的血细胞；在本发明的方法中可使用任何细胞培养基，但优选使用添加了钙离子载体的细胞培养基培养10-30小时，其中的钙离子载体选自A23187或离子霉素；在另一实施例中激活试剂也可以选择腺病毒。将激活的血细胞经过至少一次的生理盐水清洗，在本发明实施例中优选经过二次的生理盐水清洗，从而得到有效改善骨髓造血微环境的免疫细胞的制备方法。

培养温度例如在30和42℃之间。在其他实施方案中，在32和40℃之间，或在37和38℃之间，或其中包含的任何范围。本领域普通技术人员将认识到，在这些明确范围内的其他范围的时期和温度是预期的，并且在本公开内。或其中包含的任何范围。本领域普通技术人员将认识到，在这些明确范围内的其他范围的时期和温度是预期的，并且在本公开内。或其中包含的任何范围。本领域普通技术人员将认识到，在这些明确范围内的其他范围的时期和温度是预期的，并且在本公开内。

本发明涉及的有效改善骨髓造血微环境的免疫细胞的制备方法的制备方法。通过使血细胞与有激活试剂接触，可以激活这些血细胞，被激活的血细胞具有低的自发免疫功能水平，但在进一步培养或体内对高剂量的第二信号有高度敏感性。因此，本发明的被激活的血细胞需要进一步暴露于免疫刺激剂，例如抗原；靶细胞，例如肿瘤细胞或病毒感染的细胞；炎症分子；粘附分子；免疫细胞，例如辅助细胞；细胞因子；或其任何组合，以实现完全免疫效应功能。

钙离子载体是一种特殊金属离子物质，它可以自由通过脂质双分子层和可溶性脂质。有两种离子载体：载体或通道形成的离子，像腺病毒为载体，在特殊的离子周围形成一个像笼状般的结构，可以在疏水性双分子层疏水区进行自由扩散；通道形成的离子，如革兰氏阳性菌，在双层分子膜中形成连续的液体的极面，允许离子扩散通过。另外，除了上述所述的载体外，本发明适合的离子载体包括钙离子载体A23187(钙霉素)、钠盐、镁盐等。如钙离子载体A23187，这些载体能够对PH梯度的变化作出反应，以聚集钙离子。钙离子载体A23187具有一个酸性羧基团，它可以在整个生物膜中与其他阳离子进行交换，当离子交换完成之后，则回到膜的另一端。离子载体的有效浓度在0.05-0.5ug/毫升，离子载体的有效浓度是血细胞激活的有效浓度。

下面的临床试验描述了从患有再生障碍性贫血的人的血液中分离血细胞并在体外进行激活形成免疫细胞制剂后再注入患者体内从而通过改善骨髓造血微环境治疗再生障碍性贫血。

临床试验1

20名患者已被诊断患有再生障碍性贫血，患者中男女各10名，年龄在2至55岁。利用试管抽取每个患者的血液样品10ml，将各在血液样品利用离心分离介质如Ficoll-Hypaque(PharmaciaCorporation)分层，回收血细胞，将来自每位患者的分离的血细胞在离心机中快速旋转，然后在柠檬酸盐缓冲液中漂洗以除去任何过量的血浆、相关蛋白质或钙；将分离出的血细胞立即置于冰上以防止细胞粘附在试管壁，并放置在2摄氏度冰柜中冷却1个小时；将冷却处理后的血细胞放入有细胞激活培养基的试管中，其中的细胞激活培养基为添加有白介素-2和沙培林的无血清淋巴细胞培养基并添加了10％的胎牛血清，在培养室中缓慢升温至37摄氏度，培养15个小时后得到初步扩增的血细胞；再将血细胞置于加入有A23187激活试剂的细胞培养基的试管中进行在培养室在培养20小时，将激活培养后的血细胞经过二次生理盐水清洗，洗好的细胞先溶于5-10毫升生理盐水，再稀释于50毫升生理盐水，通过静脉输入给病人；每周治疗一次，共治疗12个月。

治疗效果：

血液学的参数，白细胞数量，红细胞数量，血红蛋白水平和血小板数量在对每一个病人治疗前后都进行监控。从这些病人得到的数据表明这种治疗在增加外周血细胞的数量方面是有效的。18个病人在所列的指标中有增加和改善，另外2个则血小板数量有好转。大多数病人在四次治疗之后血细胞数量开始改善，通过进一步的治疗病人情况持续改善。通过24次治疗后20个病人中有19个的血液学参数到达正常水平或接近正常水平。虽然总体来说病人的改善程度有所不同，例如，有些病人有小辐度的红细胞改善但却有大辐度的血小板数量增加。在治疗中注意到，所有病人的血小板都有不同程度的增加。

本治疗总体来说毒副反应少。18个病人在前二次均有表现出不适，发热到37℃至39℃、恶心呕吐、食欲降低等反应，在第四次治疗时，所有症状均消失。

临床试验2

8名患者已被诊断患有再生障碍性贫血，患者中男女各4名，年龄在20至48岁。利用试管抽取每个患者的血液样品10ml，将各在血液样品利用离心分离介质如Ficoll-Hypaque(PharmaciaCorporation)分层，回收血细胞，将来自每位患者的分离的血细胞在离心机中快速旋转，然后在柠檬酸盐缓冲液中漂洗以除去任何过量的血浆、相关蛋白质或钙；将分离出的血细胞立即置于冰上以防止细胞粘附在试管壁，并放置在2摄氏度冰柜中冷却1个小时；将冷却处理后的血细胞放入有细胞激活培养基的试管中，其中的细胞激活培养基为添加有白介素-2和沙培林的无血清淋巴细胞培养基并添加了10％的胎牛血清，在培养室中缓慢升温至37摄氏度，培养15个小时后得到初步扩增的血细胞；再将血细胞置于加入有腺病毒激活试剂的细胞培养基的试管中在培养室再培养18小时，将激活培养后的血细胞经过二次生理盐水清洗，洗好的细胞先溶于5-10毫升生理盐水，再稀释于50毫升生理盐水，通过静脉输入给病人；每周治疗一次，共治疗15个月。

治疗效果：

血液学的参数，白细胞数量，红细胞数量，血红蛋白水平和血小板数量在对每一个病人治疗前后都进行监控。从这些病人得到的数据表明这种治疗在增加外周血细胞的数量方面是有效的。8个病人在所列的指标中都有增加和改善。1个病人在三次治疗之后血细胞数量开始改善，5个病人在四次治疗之后血细胞数量开始改善，还有3个病人在五次治疗之后血细胞数量开始改善，通过进一步的治疗病人情况持续改善。通过24次治疗后8个病人的血液学参数都到达正常水平或接近正常水平。

本治疗总体来说毒副反应少。8个病人在前二次均有表现出不适，发热到37℃至39℃、恶心呕吐、食欲降低等反应，在第四次治疗时，所有症状均消失。

上面对本发明的实施例进行了描述，但是本发明并不局限于上述的具体实施方式，上述的具体实施方式仅仅是示意性的，而不是限制性的，本领域的普通技术人员在本发明的启示下，在不脱离本发明宗旨和权利要求所保护的范围情况下，还可做出很多形式，这些均属于本发明的保护之内。

Claims (10)

1.一种有效改善骨髓造血微环境的免疫细胞的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

从血液中分离出血细胞；

将血细胞置于0-5摄氏度的箱体内培养1-2小时；

将血细胞置于细胞激活培养基中进行血细胞激活培养10-20小时，以便得到初步扩增的血细胞；

将血细胞置于至少一种细胞培养基中加入激活试剂进行血细胞培养10-30小时，以便得到激活的血细胞；

将激活的血细胞经过至少一次的生理盐水清洗，从而得到有效改善骨髓造血微环境的免疫细胞的制备方法。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述细胞激活培养基为添加了白介素-2和沙培林的无血清淋巴细胞培养基。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述细胞激活培养基中添加了哺乳动物血清。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述哺乳动物血清为哺乳动物胎血清。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述激活试剂为钙离子载体。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述钙离子载体选自A23187或离子霉素。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述激活试剂为腺病毒。

8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述血细胞包括从受试者获得的外周血单个核细胞。

9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于：其中获得外周血单个核细胞的步骤包括：在注射器中抽取血液，利用Ficoll-Hypaque分层法分层所述血液，并在Ficoll的界面处收集外周血单个核细胞。

10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于：还包括进行白细胞去除术的步骤。