CN101072791B - 固相合成中的s-烷基-硫基保护基团 - Google Patents

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Abstract

揭示了一种在树脂上形成基于二硫键的肽环化的新方法。

Description

固相合成中的S-烷基-硫基保护基团
本发明涉及一种在固相肽合成(SPPS)中形成树脂上二硫键的方法，还涉及相应肽固相偶联物。
许多保护基团可用于保护半胱氨酸残基，例如，三苯甲基、乙酰氨基甲基-、叔丁基、三甲基乙酰氨基甲基、2，4，6-三甲氧基苄基、甲氧基三苯甲基、叔丁基硫基(t-butylsulphenyl)。
最普通地，在肽合成中，三苯甲基用于简单保护。为了保护随后要进行环化反应形成胱氨酸的半胱氨酸，最广泛使用的是乙酰氨基甲基(acm)保护基团以及碘氧化(Kamber等，1980，Helv.Chim.Acta 63，899-915；Rietman等，1994，Int.J.Peptide Protein Res.44，199-206)。缺点是因为使用碘，使别处易受影响的侧链部分氧化而明显增加了副产物杂质的数量。例如，Tyr、Met会因为使用碘而受到不利影响。更重要的是，用碘氧化会产生游离HI，该酸最终会促进侧链脱保护和/或一最重要地一从树脂上切割。因此，如果使用该方法，则该方法必须只作为合成中从树脂上切割后的后期终了步骤。
现有技术已经知道除碘之外的多种氧化剂，加入这些氧化剂是为了形成胱氨酸(Albericio等在Chan和White编著的‘FMOC Solid-phase PeptideSynthesis’，Oxford university Press 2000，第91-114页中举了一些例子：在水性缓冲液中的谷胱甘肽、DMSO、铁***、Ellman试剂、5，5’-二硫代二(2-硝基苯甲酸)、碘、三氟乙酸铊(III)、烷基三氯硅烷-亚砜、三氟甲烷磺酸银-DMSO在强酸性介质中介导的氧化。
通常，所有这些方法都产生不利的多种副产物，需要10-20小时的长时间反应，才能得到最佳产率，因此给不利的副产物的发生提供了充足的时间。
Volkmer-Engert等(在肽中表面辅助催化形成分子内二硫键
(Surface-assisted catalysis of intramolecular disulfide formation in peptides)，J.Peptide Res.51，1998，365-369)描述了使用溶解在溶剂(即水)中的氧在水中经炭催化氧化形成二硫键。小心控制表明物理溶解在水性介质中的氧气部分是必需的，并且足以使炭负载氧气用于氧化。与传统的在无催化剂存在下进行空气鼓泡相比，使用炭可以明显加快反应速率。
使用炭不可避免地要求在均相溶液中而不是在树脂上进行这种反应；然而之后的脱保护反应不能容忍炭的继续存在，炭无法从肽树脂固相中除去。因此，从树脂上切割后在溶液中进行环化反应。在该方案中，在环化反应之前，从固相载体上切割和完全脱保护是必需进行的。作为另一个缺点，Atherton等(1985，J.Chem.Perkin Trans.I.，2065)报导了在酸性脱保护中使用常用的既做清除剂又做酸解促进剂的茴香硫醚也会使acm、叔丁基和叔丁基硫基保护的半胱氨酸发生部分的、过早的脱保护。
US 6476186描述了八肽在乙腈/水(1∶1)中、在痕量炭存在下形成分子内二硫键。在2-氯三苯甲基树脂上合成肽，所述肽除了包含疏水性残基和半胱氨酸外，还包含赖氨酸和苏氨酸。用酸不稳定性三苯甲基保护半胱氨酸。在切割和脱保护后，在水性溶剂混合物中进行炭催化的环化反应。
本发明的目的是提供一种通过固相合成方法合成二硫键化的环肽的更为简单直接且改进的新方法。依据本发明，可以通过包括以下步骤的肽合成方法来实现此目的：
a.合成与固相连接的肽，所述肽包含至少两个半胱氨酸或高半胱氨酸的残基，这些半胱氨酸的侧链都被S-烷基-硫基(S-alkyl-sulphenyl)保护基团保护，其中所述烷基可进一步被芳基、芳氧基、烷氧基、它们的卤代形式或卤素取代，其中所述两个保护基可相同或不同，优选在侧链都被S-叔丁基硫基保护，
b.使肽进一步与S-叔丁基硫基保护基团去除剂反应，优选使肽与叔膦反应，
c.通过在空气和/或氧气存在下，但是，优选在无非均相催化剂存在下形成二硫键来使肽环化。
依据本发明的肽可以是任何包含天然或非天然氨基酸的肽，所述氨基酸包括例如高半胱氨酸(该高半胱氨酸优选在侧链包含2-15个亚甲基和一个巯基(thiol group))、高精氨酸、D-环己基-丙氨酸、ε-赖氨酸、γ-赖氨酸、青霉酰胺(Penicillinamide，简称Pen)或鸟氨酸(Orn)、或天然L-氨基酸的D-类似物。较佳地，肽只包含天然氨基酸或其D-类似物或高-或正-类似物。本文中的术语肽骨架或骨架、侧链和前缀“正-(nor-)”、“高-(homo-)”根据IUPAC-IUB定义来理解(Joint IUPAC-IUB Commission on B iochemicalNomenclature，‘Nomenclature and symbolism for amino acids and peptides’，Pure Appl.Chem.，56，595-624(1984))。在其狭义和优选的意义中，“高-”和“正-”分别指侧链部分仅增加一个或失去一个桥亚甲基，优选除高半胱氨酸以外，高半胱氨酸优选如上所定义。
特别需要注意的是对形成肽序列的氨基酸的侧链保护，特别是当涉及肽序列中包含的半胱氨酸、高半胱氨酸或正半胱氨酸残基时，这些残基在环化反应中需要被保护而不是参与到反应中。较佳地，这些包含巯基部分的残基被三烷基膦非敏感性的，更优选三叔丁基膦非敏感性的保护基团保护，更佳地，这种非敏感性的巯基保护基团选自下组：三苯甲基-、叔丁基-、乙酰氨基甲基-、烷基化的乙酰氨基甲基-、烷基化的三苯甲基-保护基团。
更一般地，常用在本领域中的侧链保护基团(参见，例如Bodansky，M.，《肽合成原理》(Principles of Peptide Synthesis)，第2版，Springer VerlagBerlin/Heidelberg，1993)可用于保护易受影响的侧链，否则这些侧链会在偶联和脱保护循环中被修饰。具有易受影响的侧链的氨基酸的例子是Cys、Asp、Glu、Ser、Arg、高Arg、Tyr、Thr、Lys、Orn、Pen、Trp、Asn和Gln。或者，可以在固相合成后对肽酰胺进行化学修饰，以得到所需的侧链。例如，在不同的参考文献(EP-301850；Yajima等，1978，J.Chem.Cos.Chem.Commun.，第482页；Nishimura等，1976，Chem.Pharm.Bull.24：1568)中充分描述的，可通过肽链中包含的赖氨酸残基的胍化(guanidation)来制备高精氨酸(Har)，通过肽链中包含的鸟氨酸残基的胍化来制备精氨酸。从需要其它反应步骤的角度看，这种方法是不那么可行的选择。值得注意地，偶联(例如Har的偶联)需要较长的偶联时间，并且需要补充偶联剂。依据本发明，一个优选的实施方式是在不使用侧链保护基团的情况下使Arg或Har偶联，优选当分别用作FMOC-Arg和FMOC-Har时。这通过确保各Arg或Har残基发生后偶联来实现，在发生任何其它偶联反应之前，胍基部分定量地质子化，与有机溶剂中的质子给体形成稳定的离子对。优选通过用过量酸性偶联辅助剂BtOH或相似物质处理与树脂结合的肽酰胺来实现上述目的，在下文的实验部分将更详细地进行描述。清除胍鎓基的电荷的另一个例子是如US 4,954,616中所述使用Fmoc保护的HAR的四苯基硼酸盐进行合成。
固相载体或树脂可以是本领域已知的适用于固相合成的任何载体。该固相定义包括肽通过官能连接基或连接臂(handle)基团与固相或树脂结合或连接。优选地，固相载体如本领域中常见的是基于聚苯乙烯或聚二甲基丙烯酰胺聚合物。依据本发明，肽可以通过合适的氨基酸侧链(包括例如肽中不参加环化反应的其它半胱氨酸残基上的巯基部分)或通过C端的α-羧基通过例如醚键、硫醚键、酯键、硫酯键或酰胺键结合到树脂上。包含连接臂基团的固体载体的例子是三苯甲基、2-氯-三苯甲基-、4-甲氧基三苯甲基-、“Rink酰胺”4-(2’，4’-二甲氧基苄基-氨基甲基)-苯氧基-、Sieber树脂(9-氨基-6-苯基甲氧基-呫吨-)、4-羟基甲基苯氧基乙酰基-、4-羟甲基苯甲酸(后者要求通过对二甲基氨基吡啶催化的酯化作用连接第一个氨基酸，这会使易受影响的氨基酸(例如，Trp，特别是半胱氨酸)外消旋化，参见Atherton，E.等，1981，J.Chem.Soc.Chem.Commun.，第336页)。WO04/050686中详细地描述了对树脂提供硫酯键的方法。所述参考文献还描述了硫酯键在Fmoc合成中使用的标准脱保护条件下非常容易受到破坏，及使用取代基可以克服这一问题。但是在本发明的一个优选实施方式中，用于使肽部分结合到固相上的硫酯键，虽然它位于C-末端或侧链产生的键中，但特别排除(disclaim)在外，因为在至少略碱性pH下会发生硫酯交换副反应。在用S-叔丁基-硫基保护基团去除剂处理时，特别是巯基还原型试剂如β-巯基乙醇以接近或超过化学计量比的量进行处理时，硫酯键容易受到破坏。但是使用叔膦也会发生上述情况，释放出半胱氨酰基、高半光氨酰基，或者具有游离巯基的普通残基，后者会进一步与固相锚定的硫酯键发生分子内硫酯交换反应。但是，可以通过空间距离和依赖于序列的构象局限性来高度调节分子内反应，因此施加上述排除剂(disclaimer)取决于S-叔丁基硫基去除剂的类型和给定肽的特定序列。较佳地和任选地，在通过硫酯键将肽部分结合到固相上时，S-叔丁基硫基保护基团去除剂是膦，更优选是三-(C1-C8)烷基膦，其中烷基可以独立地被卤素或(C1-C4)烷氧基或(C1-C4)酯进一步取代。更佳地，去除剂是三-(C2-C5)烷基膦，其中烷基可以独立地被(C1-C2)烷氧基进一步取代。
值得注意的是，依据本发明，包含S-S键的树脂连接臂如Brugidou，J.等，Peptide Research(1994)7：40-7和Mery等，Int.J.Peptide and ProteinResearch(1993)，42：44-52描述的HPDI双官能羟基和二硫连接臂当然要从本发明的范围中排除，因为它们无法进行树脂上环化反应。
本发明的树脂上环化反应可以避免分子间副反应引起的问题，因此通常使用稀释技术或催化表面吸收技术。
Rink酰胺、Sieber树脂(Tetrahedron Lett.1987，28，2107-2110)或类似的9-氨基-呫吨基类树脂、PAL树脂(Albericio等，1987，Int.J.Pept.ProteinResearch 30，206-216)或特别取代的三苯甲基胺衍生物(依据Meisenbach等，1997，Chem.Letters，第1265页)是固相连接基团的例子，在肽从树脂上切割后，由这些固相连接基产生或释放Cα-羧酰胺。在此情况中，在从树脂上切割后生成羧酰胺的固相，如果是之前的酸性侧链或肽的C-末端的羧酰胺，则在本文中称为产酰胺固相。
较佳地，肽的C-末端通过酰胺或酯键锚定在固相上。更佳地，固相是酸敏感性或酸不稳定性固相，更佳地，固相是生成酰胺的酸不稳定性固相。这些酸不稳定性固相需要在极性非质子溶剂中至少0.1％的三氟乙酸(TFA)、更优选至少0.5％的TFA，用于从树脂上切割。最佳地，固相是在弱酸性条件下切割的酸敏感性固相，也就是说在室温下温育达5小时后，在所述溶剂中0.1-10％的TFA足以得到至少90％的切割效率。这类对酸非常不稳定的固相是例如2-氯三苯甲基树脂；4，4’-二甲氧基三苯甲基树脂等；三苯甲基-基苯基醇树脂，诸如NovasynTM TGT，它是通过用Bayer的4-羧基三苯甲基连接基或所述连接基的4-甲氧基苯基、4，4’-二甲氧基苯基或4-甲基-衍生物对常规氨基甲基树脂进行酰基化得到的；其它Sieber树脂；Rink酰胺树脂或4-(4-羟甲基-3-甲氧基苯氧基)丁酸(HMPB)树脂；(4-甲氧基二苯甲基-)或(4-甲基二苯甲基)-苯基树脂，上述Sieber和Rink树脂在酸解后特异性生成C-末端酰胺化的肽。这类酸不稳定性固相在对侧链保护基团进行树脂上脱保护化学反应时特别容易受到损害，因此在这些情况中必需格外注意。
在侧链经C-末端半胱氨酸残基锚定到固体载体的连接臂基团上的情况下，所述连接臂基团必须是硫醚键或硫酯键。用于侧链锚定的其它合适的残基是酸性侧链的羧基，羟基，特别是赖氨酸的ε-氨基。当然在侧链锚定的情况中，通常在进行第一偶联反应之前，例如使用FMOC-Lys-羧酰胺通过酯化或酰胺化使侧链氨基官能团连接到固相上，从而保护C-末端的游离羧基。
在一个优选的实施方式中，一种S-烷基-硫基保护的半胱氨酸，优选一种S-叔丁基-硫基保护的半胱氨酸是肽的C-末端残基，并且其羧基末端通过酯键或酰胺键连接到固相上，前提是所述连接键不是苄基酯部分，而优选是如上所述在弱酸性反应条件下被切割的酸不稳定性树脂。C-末端半胱氨酸在酸性条件下，例如在强酸性条件下切割和/或脱保护后，特别容易发生外消旋化作用。
最终排除了用于空气引起(air-borne)的氧化环化的异相(heterogenous)催化剂例如炭，该材料与固相使用不相容。不能有效地除去炭。较佳地，涉及不存在催化有效量或大量的此类异相催化剂。尽管，在本发明的目的不需要时，不使用不合适的催化剂对本领域技术人员来说应该是不言而喻的。
用于肽合成的偶联剂在本领域是众所周知的(参见，Bodansky，M.，《肽合成原理》，第2版，Springer Verlag Berlin/Heidelberg，1993；特别参考其中关于偶联添加助剂的作用的讨论)。偶联剂可以是混合酸酐(例如T3P：丙膦酸酐)或其它酰化剂，诸如活化的酯或酰基卤(例如，ICBF，异丁基氯甲酸酯)，或者它们可以是碳二亚胺(例如，1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺)，活化的苯并三嗪衍生物(DEPBT：3-(二乙氧基磷酰氧基)-1，2，3-苯并三嗪-4(3H)-酮)或苯并***的脲鎓或鏻盐衍生物。
从链延伸期间最佳产率、短反应时间、避免外消旋化的保护的角度看，最优选的偶联剂选自能活化游离羧酸官能团的苯并***的脲鎓盐和鏻盐，并且最优选在碱存在下进行反应。这类脲鎓和鏻偶联盐的合适且优选的例子是HBTU(六氟磷酸O-1H-苯并***-1-基)-N，N，N’，N’-四甲基脲鎓)、BOP(六氟磷酸苯并***-1-基-氧基-三-(二甲基氨基)-鏻)、PyBOP(六氟磷酸苯并***-1-基-氧基三吡咯烷鏻)、PyAOP、HCTU(六氟磷酸O-(1H-6-氯-苯并***-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓)、TCTU(四氟硼酸O-1H-6-氯苯并***-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓)、HATU(六氟磷酸O-(7-氮杂苯并***-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓)、TATU(四氟硼酸O-(7-氮杂苯并***-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓)、TOTU(四氟硼酸O-[氰基(乙氧基羰基)亚甲基氨基]-N，N，N’，N”-四甲基脲鎓)、HAPyU(六氟磷酸O-(苯并***-1-基)氧基双-(吡咯烷)-脲鎓)。
较佳地，当使用DEPBT或类似物时，需要使用脲鎓或鏻盐试剂、其它或第二弱碱试剂来进行偶联步骤。这与共轭酸的pKa值为pKa7.5-15、更优选为pKa7.5-10且不具有肽或氨基酸或氨基酸衍生物的α-氨基官能团的碱相匹配，优选的碱是空间位阻叔胺。这类碱和其它优选碱的例子是Hünig碱(N，N-二异丙基乙胺)、N，N’-二烷基苯胺、2，4，6-三烷基吡啶或N-烷基吗啉，其中烷基是直链或支链C1-C4烷基，更优选的是N-甲基吗啉或可力丁(2，4，6-三甲基吡啶)，最优选的是可力丁。
偶联添加剂，特别是苯并***类的偶联添加剂的用途也是已知的(参见上述Bodansky)。当使用高活性的上述脲鎓或鏻盐偶联剂时，特别优选使用它们。因此，更优选的是，偶联剂添加剂是能够形成活性酯的亲核羟基化合物，更优选含有酸性亲核N-羟基官能团，其中N是酰亚胺，或者是N-酰基或N-芳基取代的三氮烯基(triazeno)，最优选的偶联剂是N-羟基-苯并***衍生物(或1-羟基-苯并***衍生物)或者是N-羟基-苯并三嗪衍生物。WO 94/07910和EP-410182中广泛和大量地描述了这类偶联添加剂N-羟基化合物，它们的内容通过参考结合于此。例子是N-羟基-丁二酰亚胺、N-羟基-3，4-二氢-4-氧代-1，2，3-苯并三嗪(HOOBt)、1-羟基-7-氮杂苯并***(HOAt)和N-羟基-苯并***(HOBt)。特别优选的是N-羟基-苯并三嗪衍生物，在最优选的实施方式中，偶联剂添加剂是羟基-3，4-二氢-4-氧代-1，2，3-苯并三嗪。
偶联添加剂铵盐化合物是已知的，例如，US4806641中描述了它们在偶联化学中的应用。
在其它特别优选的实施方式中，脲鎓或鏻盐偶联剂是脲鎓盐试剂，优选是HCTU、TCTU或HBTU，更优选与N-羟基-3，4-二氢-4-氧代-1，2，3-苯并三嗪或其盐一起用在反应中。该实施方式主要优选用于肽合成中除去碱不稳定性Nα-保护基团之后的链延伸步骤，但是也可以在侧链环化过程中用于外消旋化反应。
在本发明中，需注意HCTU和TCTU被认为包括在术语“脲鎓盐试剂”的定义中，尽管通过晶体结构分析显示这些化合物和可能的类似物包含肟基部分而不是脲鎓部分(O.Marder，Y.Shvo，和F.Albericio“HCTU andTCTU：New Coupling Reagents：Development and Industrial Applications”，Poster，Presentation Gordon Conference February 2002)，而且杂环上的N-脒基取代基生成胍鎓(guanidium)结构。在本发明中，这类化合物称为本发明的脲鎓盐试剂的“胍鎓类亚型”。
在另一个特别优选的实施方式中，偶联剂是苯并***的鏻盐，诸如BOP、PyBOP或PyAOP。
碱不稳定性Nα的脱保护可以按照本领域中的常规途径进行，例如，当使用标准Fmoc化学法时，使用在N-甲基吗啉中的20％哌啶进行脱保护。最广泛地，用于N-末端的Fmoc或Boc保护化学通常用于固相合成，但是其它任选的Nα保护化学也是本领域已知的，在不干扰本发明时可以使用，即用于进行树脂偶联肽的基于二硫键的肽环化。
根据本发明，用通常能够除去(优选基本除去)这类残基中S-叔丁基-氧硫保护基团的试剂除去如通式II所示的保护半胱氨酸或高半光氨酸残基的巯基的S-烷基-硫基保护基团。人们已经描述了通过与叔膦反应将S-叔丁基硫基保护基团从(例如)半胱氨酸上除去，叔膦有(例如)三丁基膦(Atherton等，1985，J.Chem.Soc.，Perkin I.2057)和三乙基膦(Huang等，1997，Int.J.Pept.Protein Res.48，290)。作为使用叔膦的另一种选择，还可以通过β-巯基乙醇或二硫苏糖醇(DTT)之类的巯基试剂按照正交方式切割叔丁基硫基(Huang等，1997 Int.J.Pept.Protein Res.48，290；Rietmann等，1985，Recl.Trav.Chim.Pays-Bas，1141)。较佳地，叔膦是三苯基膦或者是(C1-C4)烷基化的或(C1-C4)烷氧基化的三苯基膦，诸如三-(对甲氧基苯基)膦，更优选的是三烷基膦，其中烷基可相同或不同，各烷基是C1-C7烷基，优选是C1-C4烷基，可以是支链或直链烷基。较佳地，烷基是直链烷基。例子是甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基。特别优选的是三正丁基膦和三乙基膦。烷基还可以任选地被卤素、(C1-C4)烷氧基(例如优选甲氧基或乙氧基)取代，或者还可以在与溶剂体系相容时被羧基取代，或者优选的未取代烷基。令人惊奇的是，在本发明的一个优选实施方式中，出乎意料地发现通过膦进行的二硫键切割还可以用于可在弱酸性反应条件下切割的酸不稳定性树脂如Sieber或2-氯-三苯甲基(CTC)树脂。
常常会忽略的是，巯基试剂通过本身形成二硫化物而还原并因此切割二硫键。较佳地，这类巯基试剂选自下组：赤-2，3-二羟基-1，4-丁二硫醇(或称为间-1，4-二硫赤藓糖醇或简称为DTE)、DL-苏-2，3-二羟基-1，4-丁二硫醇(或称为外消旋(rac)-1，4-二硫苏糖醇或简称为DTT)、L-苏-2，3-二羟基-1，4-丁二硫醇、D-苏-2，3-二羟基-1，4-丁二硫醇和它们的混合物。混合物可包含DTE和DTT，可以是其外消旋形式，或者作为DTT的光学活性制剂。更佳地，巯基试剂是DTT，表示它是D-、L-或其任何外消旋或非消旋混合物。-DTT和DTE也分别称为Cleland试剂和Cleland其它试剂(Cleland，W.，Biochemistry 3，480-482，1964)。在DTT的情况中，分子内环闭合非常有利，使其成为更强的二硫键还原试剂，并且可以明显防止与DTT形成稳定的分子间二硫化物加合物，在β-巯基乙醇的情况中，通过二硫键交换反应形成的任何分子间反应产物都是可行的。另外，新形成的二硫化物可进行进一步交换反应。使用巯基试剂，最常用2-巯基乙醇之类的简单巯基试剂是由于害怕发生副反应，例如使用强亲核性叔膦试剂时从树脂中渗漏。通过使用DTT等试剂，可以避免单巯基试剂固有的缺点。
在第一弱碱存在下、在极性非质子有机溶剂中、在空气和/或氧气存在下，但是显然在无加快速率的异相催化剂存在下，按照本发明进行环化反应。而且无先例的(without precedent)，依据本发明方法的环化步骤非常有效，仅需要约0.5至2小时的反应时间，在非常温和的反应条件(通常为室温，有利的温度范围是10℃至80℃，当然必需考虑溶剂的回流温度)下，使离析物(educt)精确定量地完全转化为所需的产物。转化是完全的。这是非常显著的成就，但至今为止在二硫键合驱动的肽环化中还没有实现过，之前也没有设计过这样简单、温和且快速的环化反应条件。从未产生异相催化剂的复杂的混合和分离问题。而且，反应速率与现有技术的基于催化剂的反应完全相当。由于反应简单直接的过程，几乎可以完全避免副产物的形成。
合适的极性非质子溶剂是例如乙腈、二甲基甲酰胺、二氯甲烷、N-甲基-吡咯烷酮、四氢呋喃。与水不同，这些溶剂通常不能物理溶解相关量的氧气，因此不能像前文所述的水性催化剂体系一样氧化形成二硫键。
因此，必需注意空气、空气/氧气或纯氧气的供应。可以通过彻底搅拌、涡流、特别设计用于搅拌的桨叶、将气体鼓泡到液体中提供空气/氧气。气体可以是注入或鼓泡到反应液体中的空气或纯氧气，或者是富含氧气的空气。在一个特别优选的实施方式中，对反应器的底部和/或侧壁的较大表面区域进行穿孔，以便在彻底搅拌下将气体鼓泡到液体中。更佳的是，反应容器包括烧结底部或表面积至少占底部总面积50％的烧结部分，以便在搅拌的同时，使上涨、鼓泡的空气通过底部注入到反应液体中。
第一弱碱试剂是共轭酸的pKa值为7.5-15、优选为8-10的弱碱，优选为空间位阻叔胺。这类碱和其它优选的碱的例子是Hünig碱(N，N-二异丙基乙胺)、N，N’-二烷基苯胺、2，4，6-三烷基吡啶或N-烷基吗啉，其中烷基是直链或支链C1-C4烷基，诸如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基，最优选的是N-甲基吗啉或可力丁(2，4，6-三甲基吡啶)或Hünig碱。
较佳地，之前依据本发明去除二硫键结合的保护基团，特别是去除S-叔丁基硫基，是在第一弱碱试剂存在下进行的，以避免因为在pH7.5-12(更优选8-11)下发生的少量酸解而导致从树脂中渗漏的任何风险。任选地，通过使用能够与水自由混溶的极性非质子溶剂如THF或乙腈，碱性盐如乙酸钠的水溶液可用于此目的。当使用叔膦进行所述二硫基团切割或去除步骤时，特别优选该实施方式。通过结合与这种二硫键保护基团去除相伴随的合适氧气供给，在本发明的其它实施方式中，例如在叔胺存在下使用极性非质子有机溶剂和供氧时，以及在使用对氧气呈惰性的叔膦保护时，不仅可以单罐反应而且可以作为单步反应进行二硫化物脱保护和环化。
由于本发明方法允许树脂上环化，所以不需要现有技术中大部分方法所需的上述复杂且降低产率的肽的高度稀释，相对于分子间环化，这有利于分子内环化。
本发明的树脂上操作模式能够快速且有效地仅进行分子内环化，而完全不会发生二聚化。
在另一个优选的实施方式中，肽是通式I或II的肽。术语“保护基团”解释为给定侧链官能团或特定侧链的保护基团，保护基团适用于标准叔丁氧基羰基(Boc)或9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)固相肽合成。这类保护基团和特定保护基团在特定侧链官能团中的应用在本领域是众所周知的(参见上述Chan等编辑；上述Bodansky等)。
例如，侧链基团R1(o)不应理解为是指一种类型的任选保护的氨基酸侧链；各残基R1(1)、R1(2)...可以是独特的，或者可以与至少一种其它残基相同。基团R2(x)、R3(q)同样如此。
由于可能的子结构的多样性，注意到通式I和II的肽还可以包含众所周知的常用在肽合成中的肽主链修饰：环氨基酸，诸如D-或L-Pro；连接两个肽基区段的间隔非肽部分，例如发夹或β-转角模拟物，特别是用在合成中的修饰主链的二肽基区段，例如用于引入酰胺保护的Asp-Gly(Hmb)区段，避免形成天冬亚酰胺(Packman等，1995，Tetrahedron Lett.36，7523)；或者肽模拟物；非酰胺结合的氨基酸类似物的二聚区段，所述氨基酸类似物用-CO-CH2-或CH2-NH2-之类的骨架区段替代肽键(有用的肽模拟物区段的综述可见于例如Morley，J.，Trends Pharm.Sci.(1980)，第463-468页)。
较佳地，通过至少两个氨基酸残基(或类似物)将环化反应中通过二硫键连接的两个半胱氨酸分隔开。α-螺旋肽构象的间距通常为i+3，可以达到二硫键合的最佳空间并列(juxtaposition)。按照此方式，可以促进环化。如下所述，根据更稳定的可能构象，主链产生的约束使环化更困难。但是，注意到掺入假脯氨酸作为螺旋断开物或者掺入D-氨基酸作为肽部分的间隔区段中β-转角构象的诱导物(即作为包含基团R2(x)的氨基酸之一)，能够高度调节这种简单规则，因此，是高度依赖于结构的。
在另一个实施方式中，可能不是通过将肽基部分永久性共价连接到固相上，而是通过稳定的金属螯合物将其非共价地可逆连接到固相上，从而在固相上合成肽(新闻稿，2004年10/11月，Lonza AG，Basel，瑞士联合AplaGenGmbH，Baesweiler，德国，2004年10月)，该方法与长久以来蛋白质纯化中所用的六-His标签技术类似。这类非共价固相连接或类似的其它实施方式也包括在本发明的范围内，上文和所附权利要求中所述的本发明的优选方式施用于此实施方式，用本文所述实施方式的非共价结合特征替代上述与树脂或连接臂的连接或结合。
本发明的另一个目的分别是各种加载在固相上的肽或固相肽偶联物。单独或组合的上文和下文中给出的相关定义同样适用于该目的。
因此，所述本发明的另一个目的是通式I或II的肽，
Figure G200580036519420070508D000131
或
Figure G200580036519420070508D000132
式中，m，n＝1-15，优选m，n＝1或2，其中Y＝H或Y是第一保护基团，Y优选是非碱不稳定性保护基团，o、x、q分别为0-200，其中R1(o)、R2(x)、R3(q)各自独立的是选自下组的氨基酸的侧链：天然氨基酸，包括环氨基酸；非天然氨基酸，包括环氨基酸或非酰氨结合的二肽基区段，天然氨基酸的非天然衍生物或其类似物，其中所述氨基酸链各自还可包含第二保护基团，各侧链的第二保护基团可相同或不同，其中A是树脂或树脂连接臂(handle)，或者任选地，各R2(x)或R3(q)基团连接到树脂或树脂连接臂上，前提是A选自OH、NH2、NR’1H或NR’1R’2，R’1，2是C1-C4烷基，其中R10、R11各自是烷基，该烷基可被芳基、芳氧基、烷氧基、它们的卤代变体或卤素进一步取代，这些烷基可相同或不同。
较佳地，x＝2-200。更佳地，o、x、q各自独立地是1-100，优选2-50，或者其中x是2-100，优选x是3-50。更优选q＝0，更优选在此情况中o是0-50，其中x是2-100，优选x是2-50。
实验
下表I给出了总合成方案：
表I
Figure G200580036519420070508D000151
1.1FMOC固相合成直链肽
Fmoc-Gly-Asp(tBu)-Trp(Boc)-Pro-Cys(S-tBu)-Sieber
之前已有关于合成FMOC-Cys(S-tBu)-OH的描述(Rietman等，1994，Synth.Commun.24，第1323页)。Sieber树脂是100-200目(美国标准局，筛目大小(US Bureau of Standards mesh sizing))的NovabiochemTM产品，基料是二乙烯基苯交联的聚苯乙烯，从Calbiochem-Novabiochem(属于EMDBiosciences，California/U.S.A.)购得。所有FMOC氨基酸，包括FMOC-Cys(S-tBu)-OH(目录号B-1530)都从Bachem AG(Bubendorf，Switzerland)购得。
树脂的装载量为0.52毫摩尔/克，共10克Sieber树脂。装载偶联时间是标准偶联时间的两倍，也就是共60分钟。在各为1当量的6-氯-HOBt、TCTU、Hünig碱(二异丙基乙胺)的二氯甲烷溶液中用各2当量的氨基酸进行偶联反应。用N-甲基-吡咯烷酮(NMP)进行洗涤。
通过3个用10％哌啶的N-甲基吡咯烷酮溶液处理15分钟的循环进行FMOC脱保护；分别用(水合)茚三酮反应和反相HPLC分析切割效率和合成完成情况。
1.2将1.1的肽延伸成Boc-Gly-Cys(S-tBu)-Har-Gly-Asp(tBu)-Trp(Boc)-Pro- C ys(S-tBu)-Sieber
在每当量氨基酸1当量HOBt(为了保持胍基质子化)存在下进行FMOC-Har残基的偶联；用HOBt和二异丙基碳二亚胺的NMP溶液预孵育FMOC氨基酸，然后与树脂混合。高精氨酸偶联进行了180分钟(其它氨基酸：30分钟)，然后用补充试剂进行第二轮反应，约60分钟。在此方法中，对于其它残基可以达到标准99.8％的偶联效率。
如上所述进行FMOC切割。显然，在FMOC切割后，进行NMP洗涤，随后用HOBt反复洗涤，以防止树脂进一步溶胀。
1.3用Bu 3 P使保护的(S-tBu)-半胱氨酸脱保护
用四氢呋喃(THF)悬浮和洗涤步骤1.2的树脂产物三次。用由19％(v/v)PBu3/77％(v/v)THF/4％(v/v)乙酸钠的饱和水溶液组成的50当量三丁基膦在室温下反应1小时；临用前过滤沉淀的盐。反应均匀地进行，得到一个主要的产物峰。通过反相HPLC确定产率，发现正确产物的量为98.9％。
14环化产生Boc-Gly-环(Cys-Har-Gly-Asp(tBu)-Trp(Boc)-Pro-Cys)-Sieber
用NMP将实验1.3的溶胀的肽-树脂偶联物洗涤三次。用6％DIEA(Hünig碱)的NMP溶液在室温下将树脂孵育1小时，从而完成环化；反应在竖式玻璃容器中进行，该容器的下部包括水平对分的密封的G3(16-40微米)玻璃料。玻璃料或烧结板开孔，便于下方空气通过，使得空气鼓泡通过玻璃料上方溶剂覆盖的反应物空间的整个截面，其中树脂在下方的鼓泡空气作用下漂浮。得到严格纯的均一产物，在该反应步骤后，没有出现明显或粉碎的(shattered)副产物。反相HPLC和LC-MS都确定产物的转化率为100％。RP-HPLC采用Hypersil-KeystoneTM BetabasicThermoElectron Corp.，Waltham Mass./U.S.A.)C18 150×4.6毫米柱进行，注入体积15微升，在柱温为35℃时在262纳米下检测。梯度运行为：
时间       乙腈(0.1％TFA)/水     (0.1％TFA)
0          60                    40
5          97                    3
16         97                    3
17         60                    40
1.6整体脱保护
通过使树脂在二氯甲烷(DCM)中溶胀三次来进行整体脱保护。由以下组分制备切割反应相混合物：
86.5％    TFA(785当量)
4.5％     苯硫基甲烷(Thioanisol)(36.5当量)
3％       苯酚(32.4当量)
3％       DCM(38当量)
3％       H2O(178当量)
反应在缓慢旋转式有轨摇床上在15℃进行2小时。在过滤树脂后，逐滴加入叔丁酸甲酯，以终止反应并使产物沉淀。产物是均一的峰；没有检测到大量副产物。在对照上测试上述整体脱保护的条件，发现不会影响肽中已经形成的二硫桥。
2.用DTT使保护的(S-tBu)-半胱氨酸脱保护
作为1.3中脱保护步骤的另一选择，基本上按照上述方法用DTT替代膦进行脱保护。DTT是外消旋DTT或L-DTT，从Biosynth AG/瑞士购得。用二甲基甲酰胺(DMF)悬浮和洗涤步骤1.2的树脂产物三次。使用50当量DTT(由DMF/DTT(1∶1)组成)，室温下的反应时间延长到3-5小时。然后，严格按照上文1.4-1.6节所述处理肽-树脂。得到的产率在相似纯度的情况下完全符合1.6的产率。
3.
Boc-D-Phe-Cys(S-tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp(Pbf)-Lys(Boc)-Val-Cys(S-tBu)-Trn(Pb f)-Sieber的环化
基本按照1.1节中所述合成一种抑生长素肽激动剂一伐普肽(Vapreotide)。其它处理基本按照1.2-1.6节所述进行，以极佳的产率和纯度提供脱保护的伐普肽羧酰胺。任选地，按照节2进行脱保护，同样得到极佳的结果。
4.
Boc-Lys(Boc)-Cys(S-tBu)-Asn-Thr(Trt)-Ala-Thr(Trt)-Cys(S-tBu)-Ala-Thr(Trt) -Gln-Arg(Pbf)-Leu-Ala-Asn-Phe-Leu-Val-His-Ser(Trt)-Ser(Trt)-Asn-Asn-Phe- Gly-Pro-Ile-Leu-Pro-Pro-Thr(Trt)-Asn-Val-Gly-Ser(Trt)-Asn-Thr(Trt)-Tyr-Sie ber的环化
基本按照1.1-1.6节所述合成和环化普兰林肽(Pramlintide peptide)(37-单体单元)。与直链肽的产率相比，肽本身的环化是定量进行的。但是，由于若干困难的独立偶联步骤，使得全长C至N-末端直链合成的产率一般。
5.Fmoc-Cys(S-tBu)-Asn-Thr(Trt)-Ala-Thr(Trt)-Cys(S-tBu)-Ala-Thr(Trt)-Gln- Arg(Pbf)-Leu-Ala-Asn-Phe-Leu-Val-His-Ser(Trt)-Ser(Trt)-A sn-A sn-Phe-Gly-P ro-Ile-Leu-Pro-Pro-Thr(Trt)-Asn-Val-Gly-Ser(Trt)-Asn-Thr(Trt)-Tyr-Rink的 环化
基本按照上述第4节中所述进行合成，不同的是在环化反应后在另一个偶联循环中添加最后的Lys残基，该合成在Rink酰胺树脂上进行，在整体脱保护之前在弱酸性或中等酸性条件下进行切割：通过3个15分钟的操作循环实现从树脂上切割，各循环在15℃，2％(w/w)TFA和1％(w/w)三乙基硅烷(TES)的二氯甲烷溶液中进行。通过鼓入氮气对反应进行搅拌。在各循环后，将整个反应液倒入到稀吡啶(吡啶/乙醇1∶9(v/v))中从而直接终止切割反应。然后，用玻璃料过滤除去树脂。滤液合并，真空下浓缩(RotaVap)，用DCM洗涤。
6.Boc-Lys(Boc)-Cys(S-tBu)-Asn-Thr(Trt)-Ala-Thr(Trt)-Cys(S-tBu)- Ala-(ψ Me，Me pro)Thr-2-CTC的环化
基本按照上文1.1-1.5节所述进行合成和环化，不同的是2-氯三苯甲基聚苯乙烯树脂(CBL Patras，希腊)用作固相，使用第2节的DTT方法替代1.3的膦方法。此外，在不进行侧链脱保护的情况下在中等酸性条件下进行切割，基本按照第5节所述。得到良好的产率。片段合成用作普兰林肽合成的任选途径：随后，对环化的包含桥接胱氨酸但仍受保护的肽进行标准肽偶联化学方法，其中通过常规片段偶联技术将普兰林肽的C-末端残基片段与TCTU(偶联)，其中C-末端受保护的片段位于固相上，或者优选位于液相中。

Claims (13)

1.一种肽合成方法，其包括以下步骤：
a.合成与固相连接的肽，所述肽包含至少两个半胱氨酸或高半胱氨酸的残基，所述诸半胱氨酸的侧链各自被S-烷基-硫基保护基团保护，其中所述烷基未被取代或被芳基、芳氧基、烷氧基、它们的卤代变体或卤素进一步取代，其中两个保护基相同或不同，和
b.使所述肽与S-叔丁基硫基保护基团去除剂反应，和
c.通过在空气和/或氧气存在下且在无异相加速催化剂存在下形成二硫键而使所述肽在树脂上环化，所述空气和/或氧气是鼓泡到液体中的，
d.从树脂上切割所述肽。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述半胱氨酸被至少3个残基隔开。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述固相树脂是酸不稳定性树脂。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述肽具有至少另一种侧链保护基团，该保护基团不是S-烷基-硫基保护基团，包括不同保护的其它半胱氨酸或高半胱氨酸残基。
5.如权利要求1或3所述的方法，其特征在于，所述高半胱氨酸的侧链包括2-15个亚甲基和1个巯基。
6.如权利要求1或6所述的方法，其特征在于，通过使所述肽与三烷基膦或巯基试剂反应来除去S-烷基-硫基。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在弱碱的极性非质子溶剂溶液的存在下使所述肽环化，其中反应容器的底部和/或侧壁穿孔或烧结，以便将气体鼓泡到液体中，这样可以将空气通入到液体中。
8.如权利要求1或7所述的方法，其特征在于，所述肽与所述固相的连接是酸不稳定性连接。
9.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述肽包括2-100个氨基酸残基。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在整体脱保护下，从树脂上切下所述肽。
11.如权利要求1或3所述的方法，其特征在于，所述肽基部分与所述固相树脂的连接不是硫酯键或二硫键连接。
12.一种通式II的肽，
式中，m，n＝1或2，其中Y＝H或Y是第一保护基团，o为0-50、x为2-50、q＝0，其中R1(o)、R2(x)、R3(q)各自独立的是选自下组的氨基酸的侧链：天然氨基酸，包括环氨基酸；非天然氨基酸，包括环氨基酸或非酰氨结合的二肽基区段，天然氨基酸的非天然衍生物或其类似物，其中所述氨基酸链各自不包含或包含第二保护基团，各侧链的第二保护基团相同或不同，A是树脂或树脂连接臂，
其中R10、R11各自是烷基，该烷基未被取代或被芳基、芳氧基、烷氧基、它们的卤代变体或卤素进一步取代，这些烷基相同或不同。
13.如权利要求12所述的肽，其特征在于，所述肽是Boc-Gly-Cys(S-tBu)-Har-Gly-Asp(tBu)-Trp(Boc)-Pro-Cys(S-tBu)-NH-Sieber树脂。
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