CN101056883A - 包括含有嵌入性假核苷酸(ipn)的嵌入性核酸(ina)的扩增阻断剂 - Google Patents

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Abstract

一种扩增阻断剂，其包括含有两个或多个能够阻断或减少核酸扩增的内部嵌入性假核苷酸(IPNs)的嵌入性核酸(INA)。所述扩增阻断剂阻断或减少核酸扩增的应用。

Description

包括含有嵌入性假核苷酸(IPN)的嵌入性核酸(INA)的扩增阻断剂
技术领域
本发明涉及检测核酸的检测法，并且具体地涉及使用DNA扩增阻断剂的改善的检测法。本发明还涉及新型DNA扩增阻断剂，以及适用于特异性和灵敏性检测核酸中的5-甲基胞嘧啶碱基的方法。
背景技术
目前有许多方法可以用于检测特异的核酸分子。这些方法典型地依赖于目标核酸和核酸探针之间的序列-依赖性杂交，所述核酸探针在长度上可以从短的核苷酸(20个碱基或更少)到几千个碱基(kb)的序列。
从一组核酸序列中扩增特异的序列最广泛应用的方法是聚合酶链式反应(PCR)方法(Dieffenbach C和Dveksler G eds.PCR Primer：ALaboratory Manual.Cold Spring Harbor Press，Plainview NY)。在这种扩增方法中，互补链长度通常为15-30个核苷酸并且在要扩增区域两端的寡核苷酸，被用来在变性的单链DNA上起始DNA合成。使用热稳定性DNA聚合酶，变性、引物杂交和DNA链合成的连续循环使得引物之间的序列进行指数扩增。通过首先用反转录酶将RNA复制成DNA以产生cDNA拷贝，可以扩增RNA序列。扩增的DNA片段可以通过许多方法检测，包括凝胶电泳、印迹、标记探针杂交、使用允许后续鉴定的标记引物(例如通过酶连接的检测)、使用当与靶点DNA杂交时产生信号的荧光-标记引物(例如Beacon和TaqMan***)。
除了PCR，已经开发了许多其它检测和扩增特异的核酸序列的技术。一个实例是连接酶链式反应(Barany F Genetic disease detection and DNAamplification using cloned thermostable ligase.Proc.Natl.Acad.Sci.USA88：189-193(1991))。
对于直接检测，目标核酸最通常基于大小从凝胶电泳上分离，并且在与同所述目标序列互补的探针杂交之前，转移到固体支持物上(DNA和RNA印迹)。所述探针可以是天然核酸或类似物，诸如肽核酸(PNA)或锁定核酸(LNA)。探针可以直接标记(例如用32P)，或者可以使用间接的检测。间接方法通常依赖于将“标记”诸如生物素或洋地黄毒苷结合到探针中，并且然后通过诸如酶-连接底物转化或化学发光的方法检测所述探针。
另一种广泛应用的直接检测核酸的方法是“夹心式”杂交法。在这种方法中，将捕获探针偶联到固体支持物上，并且在溶液中，将目标核酸与结合的探针杂交。洗去未结合的目标核酸，并且使用与目标序列杂交的第二探针检测结合的核酸。检测可以使用上文列出的直接或间接的方法。“分支DNA”信号检测***是应用夹心式杂交原理的实例(Urdea MS等.Branched DNA amplification multimers for the sensitive，direct detection ofhuman hepatitis viruses.Nucleic Acids Symp Ser.1991；(24)：197-200)。
应用核酸杂交进行核酸序列的直接检测的快速发展领域是DNA微点阵领域(Young RA Biomedical discovery with DNA arrays.Cell 102：9-15(2000)；Watson A New tools.A new breed of high tech detectives.Science289：850-854(2000))。在这一方法中，将可以从寡核苷酸到更长的序列如cDNA克隆范围的单一核酸种类固定到格子模式的固体支持物上。然后，将标志的或标记的核酸群体与点阵杂交，并且定量与点阵中每点杂交的水平。尽管可以利用其它的检测***，但是最常见地将放射活性-或荧光-标记的核酸(例如cDNAs)用于杂交。
目前，检测DNA中甲基化变化(如在***癌GSTP1基因启动子中发现的甲基化变化)的选择方法依赖于在DNA亚硫酸氢盐修饰后PCR扩增这样的序列。在亚硫酸氢盐处理的DNA中，胞嘧啶被转化成尿嘧啶(并且因此在PCR过程中被扩增为胸腺嘧啶)，而甲基化的胞嘧啶不反应，并且保持为胞嘧啶(Frommer M，McDonald LE，Millar DS，Collis CM，Watt F，Grigg GW，Molloy PL和Paul CL.A genomic sequencing protocol whichyields a positive display of 5-methyl cytosine residues in individual DNAstrands.PNAS 89：1827-1831(1992)；Clark SJ，Harrison J，Paul CL和Frommer M.High sensitivity mapping of methylated cytosines.Nucleic AcidsRes.22：2990-2997(1994))。因此，在亚硫酸氢盐处理后，在序列上，含有5-甲基胞嘧啶碱基的DNA将不同于相应的未甲基化的DNA。可以选择引物而非选择性地扩增目的基因组区域，以确定其甲基化状态，或者可以设计引物而选择性地扩增其中具体的胞嘧啶被甲基化的序列(Herman JG，Graff JR，Myohanen S，Nelkin BD和Baylin SB.Methylation-specific PCR：anovel PCR assay for methylation status of CpG islands.PNAS 93：9821-9826(1996))。
检测胞嘧啶甲基化的备选方法包括用限制性酶消化，其切口被位点-特异性DNA甲基化封闭或未被之封闭，之后对目的区域进行DNA印迹和杂交探测。这种方法受到环境的限制，其中有显著比例(一般＞10％)的DNA在所述位点被甲基化，并且其中存在足够的DNA，大约1-5μg，以允许用于检测。使用其切口被位点-特异性DNA甲基化封闭的限制性酶消化，之后使用在所述限制性酶位点两侧的引物进行PCR扩增。这种方法可以使用更少量的DNA，但是由于除DNA甲基化之外的原因引起的完全的酶消化的任何缺少都可能导致假阳性信号。
现在，本发明人研发了使用嵌入性核酸(INAs)的方法，其适用于灵敏地并且特异性地检测甲基化的核酸，其可以极大地减少与甲基化特异性PCR(MSP)反应相关的问题。应用一种出乎意料的INAs特性来实行本发明。
发明内容
在第一方面，本发明提供一种扩增阻断剂，其包括含有两种或多种能够阻断或减少核酸扩增的内部嵌入性假核苷酸(IPNs)的嵌入性核酸(INA)。
优选地，INA在长度上为约15-50个，更优选地约18-35个核苷酸或核苷酸类似物，具有2-10个，优选地2-6个位于内部的IPNs。然而，应该理解，可以使用具有多于10个IPNs的更长的INAs。本发明人已经发现，位于在寡核苷酸3′或5′端2个或多个碱基处的IPNs提供良好的DNA聚合酶的阻断活性。不同于其它抑制策略，诸如向寡核苷酸加入3种起始-双脱氧碱基以停止延伸，按照本发明的阻断剂不需要化学实体的3′或5′定位而起作用。
优选地，在所述核苷酸的3′或5′端，所述INA不含IPNs。
IPN优选地选自1-(4，4’-二甲氧基三苯基甲基氧基)-3-芘甲基氧基-2-丙醇的亚磷酰胺。优选地，嵌入性假核苷酸选自(S)-1-(4，4’-二甲氧基三苯基甲基氧基)-3-芘甲基氧基-2-丙醇的亚磷酰胺或(R)-1-(4，4’-二甲氧基三苯基甲基氧基)-3-芘甲基氧基-2-丙醇的亚磷酰胺。更优选地，IPN是(S)-1-(4，4’-二甲氧基三苯基甲基氧基)-3-芘甲基氧基-2-丙醇的亚磷酰胺。
用于本发明实例的一个IPN实例是(S)-1-(4，4’-二甲氧基三苯基甲基氧基)-3-芘甲基氧基-2-丙醇的亚磷酰胺。然而，应该理解，还可以使用其它化学形式的IPNs。
按照本发明的阻断剂适合用于任何扩增形式，诸如PCR和等温扩增方法。由于PCR是目前保健科学工业所用的优选方法，所以，本发明人使用PCR提供本发明的实例。然而，应该理解，本发明不限于PCR或任何其它扩增形式。
在第二方面，本发明提供按照本发明第一方面的阻断剂阻断或减少核酸扩增的应用。
在第三方面，本发明提供一种检测核酸分子目标区域甲基化状态的方法，其包括：
在某种条件下，用修饰胞嘧啶碱基但是不修饰5-甲基-胞嘧啶碱基的试剂处理所述核酸分子，以形成修饰的核酸模板；
在扩增反应中提供按照本发明第一方面的第一阻断剂，所述第一阻断剂与所修饰的核酸模板第一链上未甲基化的目标区域互补；
在扩增反应中提供按照本发明第一方面的第二阻断剂，所述第二阻断剂与所修饰的核酸模板第一链的互补第二链下游上的区域互补；
提供第一引物，其与所修饰的核酸模板第一链上目标区域上游的核酸区域互补；
提供第二引物，其与所修饰的核酸模板第一链的互补第二链上第二阻断剂区域下游的核酸区域互补；和
进行扩增反应，其中如果所述目标区域被甲基化，那么将有扩增产物，并且如果所述目标区域未被甲基化，那么将没有扩增产物。
在第四方面，本发明提供一种检测核酸分子目标区域甲基化状态的方法，其包括：
在某种条件下，用修饰胞嘧啶碱基但是不修饰5-甲基-胞嘧啶碱基的试剂处理所述核酸分子，以形成修饰的核酸模板；
在扩增反应中提供按照本发明第一方面的第一阻断剂，所述第一阻断剂与所修饰的核酸模板第一链上甲基化的目标区域互补；
在扩增反应中提供按照本发明第一方面的第二阻断剂，所述第二阻断剂与所修饰的核酸模板第一链的互补第二链下游上的区域互补；
提供第一引物，其与所修饰的核酸模板第一链上目标区域上游的核酸区域互补；
提供第二引物，其与所修饰的核酸模板第一链的互补第二链上第二阻断剂区域下游的核酸区域互补；
进行聚合酶扩增反应，其中如果所述目标区域未被甲基化，那么将有扩增产物，并且如果所述目标区域被甲基化，那么将没有扩增产物。
在一种优选的形式中，所述方法还包括：
在扩增反应中提供按照本发明第一方面的第三和第四阻断剂，所述第三和第四阻断剂与第一和第二阻断剂区域的内部区域互补；和
提供第三和第四引物，其与第三和第四阻断剂区域的外部区域以及第一和第二引物区域的内部区域互补。
在另一种优选的形式中，所述方法还包括：
提供按照本发明第一方面的一种或多种其它阻断剂，所述阻断剂针对所述核酸分子上的一个或多个区域。
优选地，核酸分子上的区域与修饰的核酸模板上的一个或多个区域对应。
所述方法还可以包括：
提供按照本发明第一方面的三种或更多种阻断剂，所述阻断剂针对与第一和第二引物区域之间的区域互补的第一或第二链。
在第五方面，本发明提供一种检测核酸分子目标区域转化状态的方法，其包括：
在某种条件下，用修饰胞嘧啶碱基但是不修饰5-甲基-胞嘧啶碱基的试剂处理所述核酸分子，以形成修饰的核酸模板；
在扩增反应中提供按照本发明第一方面的第一阻断剂，所述第一阻断剂与所修饰的核酸模板第一链上未转化的目标区域互补；
在扩增反应中提供按照本发明第一方面的第二阻断剂，所述第二阻断剂与所修饰的核酸模板第一链的互补第二链下游上的区域互补；
提供第一引物，其与所修饰的核酸模板第一链上目标区域上游的核酸区域互补；
提供第二引物，其与所修饰的核酸模板第一链的互补第二链上第二阻断剂区域下游的核酸区域互补；
进行扩增反应，其中如果所述目标区域被转化，那么将有扩增产物，并且如果所述目标区域未被转化，那么将没有扩增产物。
在第六方面，本发明提供一种检测核酸分子目标区域转化状态的方法，其包括：
在某种条件下，用修饰胞嘧啶碱基但是不修饰5-甲基-胞嘧啶碱基的试剂处理所述核酸分子，以形成修饰的核酸模板；
在扩增反应中提供按照本发明第一方面的第一阻断剂，所述第一阻断剂与所修饰的核酸分子第一链上转化的目标区域互补；
在扩增反应中提供按照本发明第一方面的第二阻断剂，所述第二阻断剂与所修饰的核酸模板第一链的互补第二链下游上的区域互补；
提供第一引物，其与所修饰的核酸模板第一链上目标区域上游的核酸区域互补；
提供第二引物，其与所修饰的核酸模板第一链的互补第二链上第二阻断剂区域下游的核酸区域互补；
进行扩增反应，其中如果所述目标区域未被转化，那么将有扩增产物，并且如果所述目标区域被转化，那么将没有扩增产物。
在第七方面，本发明提供一种检测核酸分子目标区域状态的方法，其包括：
在某种条件下，用修饰胞嘧啶碱基但是不修饰5-甲基-胞嘧啶碱基的试剂处理所述核酸分子，以形成修饰的核酸模板；
在扩增反应中提供按照本发明第一方面的第一阻断剂，所述第一阻断剂与具有不理想状态的修饰的核酸模板第一链上的目标区域互补；
在扩增反应中提供按照本发明第一方面的第二阻断剂，所述第二阻断剂与所修饰的核酸模板第一链的互补第二链下游上的区域互补；
提供第一引物，其与所修饰的核酸模板第一链上目标区域上游的核酸区域互补；
提供第二引物，其与所修饰的核酸模板第一链的互补第二链上第二阻断剂区域下游的核酸区域互补；
进行扩增反应，其中如果所述目标区域具有理想的状态，那么将有扩增产物，并且如果所述目标区域具有不理想的状态，那么将没有扩增产物。
在第八方面，本发明提供一种检测核酸分子目标区域状态的方法，其包括：
在某种条件下，用修饰胞嘧啶碱基但是不修饰5-甲基-胞嘧啶碱基的试剂处理所述核酸分子，以形成修饰的核酸模板；
在扩增反应中提供按照本发明第一方面的第一阻断剂，所述第一阻断剂与具有理想状态的修饰的核酸模板第一链上的目标区域互补；
在扩增反应中提供按照本发明第一方面的第二阻断剂，所述第二阻断剂与所修饰的核酸模板第一链的互补第二链下游上的区域互补；
提供第一引物，其与所修饰的核酸模板第一链上目标区域上游的核酸区域互补；
提供第二引物，其与所修饰的核酸模板第一链的互补第二链上第二阻断剂区域下游的核酸区域互补；
进行扩增反应，其中如果所述目标区域具有不理想的状态，那么将有扩增产物，并且如果所述目标区域具有理想的状态，那么将没有扩增产物。
优选地，所述状态是甲基化、突变或单核苷酸多态性。
在第九方面，本发明提供一种阻断或减少核酸扩增的方法，其包括：
在核酸扩增反应中提供一种阻断剂，其包括含有两种或多种内部IPNs的INA核酸，其中所述阻断剂与目的核酸序列互补；和
进行扩增反应，以致所述阻断剂与目的核酸序列结合，并且阻断或减少在目的序列处或在接近目的序列处的扩增。
在第十方面，本发明提供一种阻断或减少核酸扩增的方法，其包括：
在核酸扩增反应中提供按照本发明第一方面的阻断剂，其中所述阻断剂与目的核酸序列互补；和
进行扩增反应，以致所述阻断剂与目的核酸序列结合，并且阻断或减少在目的序列处或在接近目的序列处的扩增。
在一种有效的形式中，扩增检测是PCR形式的聚合酶扩增。
所述核酸分子可以是DNA或RNA。优选地，所述核酸分子是DNA。
在一种优选的形式中，甲基化状态是甲基化的。
在另一优选的形式中，甲基化状态是未甲基化的。
优选地，潜在的碱基化位点是在3′侧连鸟嘌呤(G)的胞嘧啶(C)，在本领域中叫作CpG双联体。
修饰试剂优选地选自亚硫酸氢盐、醋酸盐或柠檬酸盐。更优选地，所述试剂是亚硫酸氢钠，这是一种在水的存在下将胞嘧啶修饰成尿嘧啶的试剂。
亚硫酸氢钠(NaHSO3)易于与胞嘧啶的5，6-双键反应，形成易于脱氨基的磺化的胞嘧啶反应中间体，并且在水的存在下，形成尿嘧啶亚硫酸盐。如果需要，可以在弱碱条件下将亚硫酸基去除，导致尿嘧啶的形成。因此，潜在地，所有胞嘧啶都将被转化成尿嘧啶。然而，由于受到甲基化保护，任何甲基化的胞嘧啶不能被修饰试剂转化。
在一种优选的形式中，一种或多种阻断剂针对核酸分子上一种或多种潜在的甲基化位点。
在另一种优选的形式中，阻断剂不与核酸分子上潜在的甲基化位点结合。
在一种更常见的形式中，本发明人发现，可以通过将探针/阻断剂杂交到DNA区域上，而阻滞聚合酶沿DNA片段的移动。这在PCR中(Saiki等，(1998)Primer-directed enzymatic amplification of DNA with athermostable DNA polymerase.Science 239：487-491)，或其它扩增方法中引起某些序列扩增的抑制，诸如但不限于，连接酶链式反应(LCR，Barany F.(1991)Genetic disease detection and DNA amplification using clonedthermostable ligase.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：189-193)，和等温扩增方法，包括链置换扩增(SDA，Walker等，(1992)Isothermal in vitroamplification of DNA by a restriction/DNA polymerase system.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：392-396)，基于核酸序列的扩增(NASBA，Kievitis等，(1991)NASBATM isothermal enzymatic in vtro nucleic acid amplificationoptimised for the diagnosis ofHIV-1.J.Virol.Methods 35：273-286)，基于转录的扩增((TAS)Kwoh等(1989)Transcription-based amplification systemand detection of amplified human immunodeficiency virus type 1 with abead-based sandwich hybridization format.Proc Natl Acad Sci USA.4：1173-7)，解旋酶链式反应(HCR，Vincent and Kong，(2004)Helicase-dependent isothermal DNA amplification.EMBO Reports 5(8)：1-6)，滚环式扩增(RCA，Fire A.和Xu S.Q.，(1995)Rolling replication of shortDNA circles.Proc.Natl.Acad.Sci USA 92：4641-4645)，自动维持序列复制(3SR，Guatelli等，(1990)Isothermal，in viro amplification of nucleic acids bya multienzyme reaction modelled after retroviral replication.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：1874-1878)。使用修饰的3’寡核苷酸序列如加入3’双脱氧核苷酸已经表现出终止聚合酶延伸。出乎意料地，发现IPN分子不必位于寡核苷酸的3’末端，而是实际上可以位于INA内部，并且仍然阻断聚合酶的延伸。
表明如果INA引物具有位于其内部的多个IPNs，那么DNA聚合酶很难转移/降解已经杂交到给出的基因组区域的INA引物。INA中的IPNs有效地作用为聚合酶进程的阻断剂。INAs这种未曾意料到的特性意味着人们可以阻断区域中未甲基化的序列扩增，并且只扩增甲基化的序列。另外，不同于其它防止聚合酶延伸的方法，诸如在3’端加成双脱氧核苷酸，本发明人发现IPN分子可以位于内部，并且不必在3’就产生阻断作用。因此，在甲基化和未甲基化序列的混合群体中，人们可以去除所有的背景。
本发明还适用于‘实时’检验的检测法。
在其最简单的形式中，本发明涉及应用INA阻断剂区分地扩增以最少两种状态存在的人或动物或植物或微生物基因组的任何需要区域。这两种状态备选地位于同一基因座，但是在人或动物或植物或微生物样品水平上，通常内含在细胞的混合群体中，其中在一种群体中存在一种具体的基因组状态，并且在另一种群体中存在一种不同的基因组状态。将‘干草堆中的针’作为比喻，本发明允许针的扩增，并且阻断组成干草堆的所有干草的扩增。
在实用分子术语中，这意指下述内容：如果针是出现在癌细胞中的具体甲基化基因组序列，而正常细胞在同一基因座上具有未甲基化的序列，那么本发明允许通过阻断不需要的未甲基化序列的扩增而扩增并且显现甲基化的序列。相反地也可以应用。如果正常细胞具有甲基化的基因组序列，并且癌细胞具有未甲基化的序列，那么本发明也允许通过阻断甲基化序列而扩增并且显现未甲基化的序列。
本发明的优点在于它允许在巨大量的不需要的实体中检测低水平的实体。用信号与噪声的比例来说，在疾病中，通常的情形是在数千正常细胞(噪声)中有很少的癌细胞(信号)。按照本发明的阻断剂技术完成了两件事；它抑制了噪声，并且另外从这两种类型的细胞的基因组中扩增了信号。
尽管本发明人已经列出了在下列实例中所示的5种基因的数据，但是本发明是一般的，并且适用于人或动物或植物或微生物基因组的任何部分，不管是它编码的还是不是它编码的，只要所述基因组部分以两种状态存在。尽管本发明可以用于任何情形，诸如检测SNPs和遗传突变，但是它在寻找基因组靶点的甲基化状态中具有非常有效的应用。
在整个说明书中，除非上下文另外需要，应该理解，词语“包括(comprise)”，或者诸如“comprises”或“comprising”的变化意味着包括一个指定的元件、整数或步骤，或者一组元件、整数或步骤，但是不排除任何其它的元件、整数或步骤，或者一组元件、整数或步骤。
包含在本说明书中的文献、法案、材料、装置、论文等的任何讨论完全是出于提供本发明的内容的目的。不应该被视作是承认任何或所有的这些内容形成部分现有技术基础，或者是在本说明书每一权利要求的优先权日之前在澳大利亚存在的与本发明相关领域中的普通常识。
为了更清楚地理解本发明，参考下述附图和实例，将描述优选实施方案。
附图简述
图1显示INA阻断剂方案的示例性详细内容，提供了在两轮DNA扩增中使用的引物和阻断剂的位置的概括图。
图2显示INA阻断剂方案怎样工作的示例性详细内容，提供了在包括甲基化或未甲基化DNA序列的两轮DNA扩增中使用的引物和阻断剂的位置的概括图。由于这一实例用于举例说明的目的，所以阻断剂和引物序列通常不用于真正的检测中。基因组DNA序列(SEQ ID NO 17)；亚硫酸氢盐处理的甲基化序列(SEQ ID NO 18)；亚硫酸氢盐处理的未甲基化序列(SEQ ID NO 19)；PCR引物#2(SEQ ID NO 20)；PCR引物#1(SEQ ID NO21)；甲基阻断剂#2(SEQ ID NO 22)；甲基阻断剂#1(SEQ ID NO 23)；非甲基阻断剂#2(SEQ ID NO 24)；非甲基阻断剂#1(SEQ ID NO 25)。
图3是显示PCR引物和甲基化的INA阻断剂与各种亚硫酸氢盐处理的DNA型杂交的示例。A.未转化的序列(SEQ ID NO 26)；B.亚硫酸氢盐处理的甲基化的序列(SEQ ID NO 27)；C.亚硫酸氢盐处理的未甲基化的序列(SEQ ID NO 28)；D.局部未转化的序列(SEQ ID NO 29)；PCR引物#1(SEQ ID NO 30)；甲基阻断剂#1(SEQ ID NO 31)。
图4是显示PCR引物和未甲基化的INA阻断剂与各种亚硫酸氢盐处理的DNA型杂交的示例。A.未转化的序列(SEQ ID NO 26)；B.亚硫酸氢盐处理的甲基化的序列(SEQ ID NO 27)；C.亚硫酸氢盐处理的未甲基化的序列(SEQ ID NO 28)；D.局部未转化的序列(SEQ ID NO 29)；PCR引物#1(SEQ ID NO 30)；非甲基阻断剂#1(SEQ ID NO 32)。
图5是显示PCR引物和未转化的INA阻断剂与各种亚硫酸氢盐处理的DNA型杂交的示例。A.未转化的序列(SEQ ID NO 26)；B.亚硫酸氢盐处理的甲基化的序列(SEQ ID NO 27)；C.亚硫酸氢盐处理的未甲基化的序列(SEQ ID NO 28)；D.局部未转化的序列(SEQ ID NO 29)；PCR引物#1(SEQ ID NO 30)；未转化的阻断剂#1(SEQ ID NO 33)。
图6显示使用常规PCR、MSP技术，或者图3，4和5中列出的INA阻断剂和引物组合，在琼脂糖凝胶电泳上显现的预计扩增产物。结果表示为使用各种扩增/检测方法，相对于确定系列的已知DNA标记，在凝胶上检测到的预计扩增产物的位置和大小的图示。
图7显示对亚硫酸氢盐处理的基因组DNA样品应用INA阻断剂技术的数据。将GSTP1启动子区的INA阻断剂和PCR引物的用于9种基因组DNA样品(表3所述)，以评估所述启动子区的甲基化状态。
图8显示将阻断剂和PCR引物用于表2所述的11种基因组DNA样品，靠近CDKN2B、CXCL-2、GSN和HIC-1的基因组区域的扩增结果和推断的甲基化状态。结果是将阻断剂和PCR引物用于表3所述的11种基因组DNA的结果，并且表示在CDKN2B、CXCL-2、GSN和HIC-1基因座周围的人基因组区域的扩增产物。
实施本发明的方式
材料和方法
INA/IPN定义
嵌入性核酸(INAs)是一类独特的DNA结合分子。INAs包含核苷酸和/或核苷酸类似物以及嵌入性假核苷酸(IPN)单体。INAs对于互补DNA具有非常高的亲和力，对于位于内部的IPNs稳定性达到10度，并且对于末端位置的IPNs稳定性达到11度。INA本身是一种选择性分子，相对于互补的RNA，其优选与DNA杂交。已经表明，与寡核苷酸引物相比，INAs与RNA的结合效率低约25倍。然而，常规寡核苷酸、寡核苷酸类似物和PNAs对于RNA和DNA具有相等的亲和力。因此，INAs是第一种真正选择性的DNA结合剂。另外，对于互补DNA，INAs具有比其它天然DNA分子更高的特异性和亲和性。
另外，在富含AT的环境中，IPNs更好地稳定DNA，这使得它们在外因基因组学研究领域中特别有用。典型地，IPNs作为突起或末端***物位于INA分子中。IPN主要是在核酸双联体中能够与核碱基共同堆积的平面(杂)聚芳香族化合物。
INA分子还显示出抗核酸外切酶攻击。这使得这些分子特别可以用作使用诸如phi29的酶的扩增的引物。由于phi29具有内在的核酸外切酶活性，用作扩增模板的引物必须在它们的3’末端进行特异性修饰，以防止酶降解。然而，可以加入没有进一步修饰的INA分子。
INAs可以用于常规PCR扩增反应，并且作为常规的引物。然而，INAs对于DNA模板具有更高的特异性，这使得它们理想地用于模板有限并且反应的灵敏性很重要的情形中。在富含AT的环境中，INAs最好地稳定DNA，这使得它们特别可以用于扩增亚硫酸氢盐处理的DNA序列。这是由于这样的事实，即，在亚硫酸氢盐转化后，所有的胞嘧啶残基都被转化为尿嘧啶，并且随后在PCR或其它扩增后被转化成胸腺嘧啶。因此，亚硫酸氢盐处理的DNA是非常富含T的。INA中增加的IPN分子数目导致INA/DNA双联体增加的稳定性。INA中IPNs越多，INA/DNA双联体的熔融温度越高。出乎意料地，当多个IPNs位于核苷酸分子中时，尽管INA对于其互补DNA具有非常高的特异性，在扩增反应中，包含IPNs导致对PCR聚合酶延伸的抑制。因此，如果INAs被设计成具有多个IPNs，那么它们在使用常规寡核苷酸不会发生的PCR扩增反应中作用为阻断剂。
本申请人先前已经研发了一类嵌入性假核苷酸，当结合到寡核苷酸或寡核苷酸类似物中时，其形成嵌入性核酸(INA)(WO 03/051901，WO03/052132，WO 03/052133和WO 03/052134，通过参考结合于此)，所述嵌入性核酸具有新型和有用的特点，作为寡核苷酸的补充或替代。现在已经发现，寡核苷酸或寡核苷酸类似物可以被修饰成包括一个或多个嵌入性假核苷酸(IPN)，而形成核酸扩增的阻断剂。
所述嵌入性假核苷酸优选地选自1-(4，4’-二甲氧基三苯基甲基氧基)-3-芘甲基氧基-2-丙醇的亚磷酰胺(phosphoramidite)。优选地，所述嵌入性假核苷酸选自(S)-1-(4，4’-二甲氧基三苯基甲基氧基)-3-芘甲基氧基-2-丙醇的亚磷酰胺，或(R)-1-(4，4’-二甲氧基三苯基甲基氧基)-3-芘甲基氧基-2-丙醇的亚磷酰胺。
寡核苷酸或寡核苷酸类似物可以选自DNA，RNA，锁定核酸(LNA)，肽核酸(PNA)，MNA，altritol nucleic acid(ANA)，己糖醇核酸(HNA)，嵌入性核酸(INA)，环己基核酸(CNA)以及它们的混合物和它们的杂化物，以及它们的磷原子修饰，诸如但不限于硫代磷酸盐、甲基磷酸盐(methylphospholates)、亚磷酰胺、phosphorodithiates、phosphoroselenoates、磷酸三酯和phosphoboranoates。非天然存在的核苷酸包括，但不限于包括在下列各项中的核苷酸：DNA，RNA，PNA，INA，HNA，MNA，ANA，LNA，CNA，CeNA，TNA，(2’-NH)-TNA，(3’-NH)-TNA，α-L-核糖-LNA，α-L-木糖-LNA，β-D-木糖-LNA，α-D-核糖-LNA，[3.2.1]-LNA，双环-DNA，6-氨基-双环-DNA，5-表-双环-DNA，α-双环-DNA，三环-DNA，双环[4.3.0]-DNA，双环[3.2.1]-DNA，双环[4.3.0]酰胺-DNA，β-D-吡喃核糖基-NA，α-L-吡喃来苏糖基-NA，2’R-RNA，α-L-RNA或α-D-RNA，β-D-RNA。另外，非含磷化合物可以用来连接核苷酸，诸如但不限于甲基亚氨基甲基、formacetate、thioformacetate以及包括酰胺的连接基团。另外，核酸和核酸类似物可以包括一种或多种嵌入性假核苷酸。
优选地，所述阻断剂是含有形成阻断性INAs的两种或多种内部IPNs的DNA寡核苷酸。
当IPNs位于用于特异性检测甲基化位点的INA分子中时，本发明人发现，避免将IPN位于潜在的CpG位点之间是有效的。这是由于这样的事实，即，当CpG位点用IPN分离时，获得的INA的特异性减少。
基因组核酸
基因组核酸可以是从植物，动物，微生物诸如细菌、真菌、酵母菌和病毒获得的DNA或RNA。优选地，所述核酸是DNA，更优选地是来自动物或人的基因组DNA，或者动物或人细胞的感染剂的核酸。DNA的亚硫酸氢盐处理
下文列出有效的亚硫酸氢盐处理核酸的示例性流程。该流程导致基本上保持所有的DNA得到处理。在本文中，这种方法也叫作人类遗传指纹(Human Genetic Signatures，HGS)方法。应该理解，样品或试剂的体积和用量可以变化。
关于亚硫酸氢盐处理的优选方法可以在US 10/428310或PCT/AU2004/000549中找到，其通过参考结合于此。
向2μg DNA(如果需要，其可以用适宜的限制性酶预先消化)中，加入2μl(1/10体积)3M NaOH(50ml水中6g，新鲜制备)，终体积为20μl。由于亚硫酸氢盐试剂优选地与单链分子反应，所以，这一步骤将双链DNA分子变性成单链形式。将混合物在37℃温育15分钟。在高于室温的温度温育可以用来提高变性的效率。
温育后，连续加入208μl 2M偏亚硫酸氢钠(7.6g在20ml水与416ml10N NaOH中；BDH AnalaR #10356.4D；新鲜制备)和12μl 10mM醌醇(0.055g在50ml水中，BDH AnalR#103122E；新鲜制备)。醌醇是一种还原剂，并且帮助减少试剂的氧化。还可以使用其它还原剂，例如，二硫苏糖醇(DTT)、巯基乙醇、醌(氢醌)或其它适当的还原剂。将样品用200μl矿物油覆盖。矿物油覆盖防止试剂的蒸发和氧化，但不是必要的。然后将样品在55℃温育过夜。备选地，样品可以在热循环仪中循环，如下：温育4个小时或过夜，如下：步骤1，55℃/2hr，在PCR仪中循环；步骤2，95℃/2min。步骤1可以在从约37℃-约90℃的任何温度下进行，并且时间可以在5分钟-8小时变化。步骤2可以在从约70℃-约99℃的任何温度下进行，并且时间可以在1秒钟到60分钟或更长时间变化。
在用偏亚硫酸氢钠处理后，去除油，如果DNA浓度低，那么加入1μltRNA(20mg/ml)或2μl糖原。这些添加剂是任选的，并且可以用于通过与目标DNA共同沉淀而提高得到的DNA产量，特别是当DNA以低浓度存在时。当核酸量＜0.5μg时，通常需要应用添加剂作为更有效沉淀核酸的载体。
如下进行异丙醇清理处理：将800μl水加入到样品中，混合，然后加入1 ml异丙醇。水或缓冲液将反应容器中亚硫酸氢盐的浓度减少到所述盐不会随目的靶点核酸一起沉淀的水平。稀释一般为约1/4-1/1000，只要盐的浓度稀释到需要的范围之下，如本文公开的那样。
再次混合样品，并且置于4℃最少5分钟。将样品在微量离心机中离心10-15分钟，并且将沉淀用70％ETOH洗涤2x，每次都振荡。洗涤处理去除与核酸一起沉淀的任何残留的盐。
干燥所述沉淀，然后重悬在适当体积的T/E(10mM Tris/0.1mMEDTA)pH 7.0-12.5中，诸如50μl。发现pH 10.5的缓冲液特别有效。将样品在37℃-95℃温育1min-96hr，这是悬浮核酸所需要的。
阻断剂生产
在Christensen UB，Pedersen EB Intercalating nucleic acids containinginsertions of 1-O-(1-pyrenylmethyl)glycerol：stabilisation of dsDNA anddiscrimination of DNA over RNA.Nucleic Acids Res.2002 Nov15；30(22)：4918-25中可以找到适用于生产INA阻断剂的方法，其通过参考结合于此。
阻断剂
当在本文中定义时，‘阻断剂’是一种嵌入性核酸(INA)，其含有两种或多种能够阻断或减少核酸扩增的内在的嵌入性假核苷酸(IPNs)。
当在本文中定义时，‘甲基阻断剂’是设计成靶向最初在其未处理的基因组状态中被甲基化的转化的核酸区域的阻断剂。
当在本文中定义时，‘非甲基阻断剂’是设计成靶向在其未处理基因组状态中没有被甲基化的转化的核酸区域的阻断剂。
当在本文中定义时，‘转化的阻断剂’是设计成靶向转化的核酸区域的阻断剂。
当在本文中定义时，‘未转化的阻断剂’是设计成靶向基因组核酸区域(即，没有通过亚硫酸氢盐或其它处理而被转化)的阻断剂。
在GSTP1基因示例性实例中使用的INA阻断剂的实例如下：
MB-1 5’TYT TCG GTT AGY TTG CGC GGC GAY TTT CGG YGG A(SEQ ID NO 1)
UB-1 5’TYT TTG GTT AGY TTG TGT GGT GAY TTT TGG YGG A(SEQ ID NO 2)
NCB-1 5’CYC CCG GCC AGY CTG CGC GGC GAYCTC CGG YGG A(SEQ ID NO 3)
MB-2 5’TTA YTA ACG AAA YAC TYA CGA CGA CGA AAC YTC C(SEQ ID NO 4)
UB-2 5’TTA YTA ACA AAA YAC TYA CAA CAA CAA AAC YTC C(SEQ ID NO 5)
NCB-2 5’TGG YTG GCG AAG YAC TYG CGG CGG CGA AAC YTG C(SEQ ID NO 6)
MB-3 5’TTY AGG GCG TYT TTT TYT GCG GTC GAC GTY T(SEQ ID NO 7)
UB-3 5’TTY AGG GTG TYT TTT TYT GTG GTT GAT GTY T(SEQ ID NO 8)
NCB-3 5’CCY AGG GCG CYC CCT CYT GCG GCC GAC GCY C(SEQ ID NO 9)
MB-4 5’ATY AAT CCC GCC YCC GCT YCC GCC CCA YAT A(SEQ ID NO 10)
UB-4 5’ATY AAT CCC ACC YCC ACT YCC ACC CCA YAT A(SEQ ID NO 11)
NCB-4 5’GTY GGT CCC GCC YCC GCT YCC GCC CCA YGT G(SEQ ID NO 12)
其中Y指定为IPN。优选地，IPN是以(S)-1-(4，4’-二甲氧基三苯基甲基氧基)-3-芘甲基氧基-2-丙醇的亚磷酰胺的形式。
MB是甲基化的阻断剂
UB是未甲基化的阻断剂
NCB是未转化的阻断剂
标码‘Y’表示IPN在序列中的位置，并且被包含在序列的碱基计数中。
PCR引物
用于举例说明的引物如下：
GSTP1-1 TTT GTT GTT TGT TTA TTT TTT AGG TTT(SEQ ID NO 13)
GSTP1-2 AAC CTA ATA CTA CTA ATT AAC CCC AT(SEQ ID NO 14)
GSTP1-3 GGA TTT GGG AAA GAG GGA AAG GTT TT(SEQ ID NO 15)
GSTP1-4 ACT AAA AAC TCT AAA CCC CAT CCC(SEQ ID NO 16)
第1轮INA阻断性PCR
GSTP1-1/2+适当的阻断剂1/2
第2轮INA阻断性PCR
GSTP1-3/4+适当的阻断剂3/4。
DNA的常规亚硫酸氢盐修饰和给定基因组区域产物的显现
这包括用亚硫酸氢盐处理DNA样品，然后是PCR扩增步骤。PCR步骤的产物，也就是凝胶上条带的显现，不会告知研究者DNA是否在这一步骤被甲基化，只是告知样品中存在对于具体基因区域的亚硫酸氢盐处理的DNA。PCR和显现后，产物还需要用限制性酶消化，以观察特定位点是否被所述酶切割，(并且因此是否被甲基化)，或者DNA条带或片段需要测序，以确定在特定的组织样品中所述基因区域是否被甲基化。PCR条带的测序将表明，CpG双联体如在所述区域中的每一个C是否被甲基化。由于只有大于10％的样品被甲基化，甲基化才能在测序仪上可靠地和常规地检测出来，所以这种方法缺乏灵敏性。例如，在具体的组织样品中，如果样品中90％的细胞在研究区域具有未甲基化的DNA，并且10％的细胞具有甲基化的DNA，那么上述常规方法将缺少准确确定甲基化模式的灵敏性。此外，进行这种现有技术方法是非常劳动密集型的并且费时的。
甲基化特异性PCR(MSP)
尽管MSP已经得到甲基化研究团体的广泛接受，但是MSP具有在文献中记录的很多很严重的局限或缺点。这些局限或缺点包括：
I.这种方法很倾向于假阳性信号，特别是如果在正常的和癌症细胞的混合群体中存在少量具有甲基化DNA区域的癌细胞，由于肿瘤的异源性，大多数癌症组织的也存在这样的情况。为了易于举例说明，正常细胞在未甲基化状态具有它们等价的区域。当用亚硫酸氢盐处理时，假阳性信号表现为DNA局部未转化的结果。因此PCR引物扩增DNA的未转化区域(见图3，4和5区域D)，并且因此，人们得到他们相信为甲基化的答案，但是实际上，那只是没有被亚硫酸氢盐处理转化的基因区域。由于可能包括未转化的INA阻断剂，其将阻断未转化DNA区域的扩增，所以，INA阻断剂没有这种问题。如果使用INA阻断剂技术得到阳性结果，那么所述信号将是完全转化的DNA的结果。因此，使用按照本发明的阻断剂，消除了假阳性PCR信号。
II.除非在常规亚硫酸氢盐处理(不是灵敏的方法)后所述区域已经先测序过，否则研究者不会首先得知靶点CpG位点是否被甲基化。因此，某个CpG位点可能是未甲基化的或者是甲基化的，并且除非所述区域得到测序，否则针对所述具体CpG设计的MSP引物将产生假阴性反应，或者低估所述基因的甲基化程度。此外，由于可以针对不含CpG二核苷酸的区域设计PCR引物，所以，按照本发明的INA阻断剂技术克服了这一局限。因此，不管基因甲基化与否，PCR引物都将结合。
III.如果所述序列只含有小的甲基化区域，例如，在所述序列的第一部分，并且这没有延伸到序列的全长，那么使用MSP将产生假阴性结果。这是由于这样的事实，即，尽管第一MSP引物将与互补CpG位点结合，但是由于第二区域是未甲基化的，所以第二MSP引物不结合。由于PCR引物可以针对将要扩增的区域而设计，不管它们是否被甲基化，所以，阻断剂没有如上文已经描述的这种问题。
IV.由于反应依赖PCR酶在甲基化的C或未甲基化的T碱基的3’末端碱基终止(prime off)的能力，所以MSP很难最优化。因此，对于不同基因区域的不同的MSP反应可能在MSP引物和转化的靶点区域之间具有很不相同的杂交温度(最佳Tm)。如果一个基因区域含有非常密集的CpG岛，并且其它基因区域具有少得多的CpG’s，那么来自CpG岛的基因区域可能具有70℃的Tm，而其余的基因区域可能具有50℃的Tm。因此，如果MSP反应在高严紧度进行，那么具有70℃Tm的基因将产生PCR产物，而具有50℃Tm的MSP反应将不能产生扩增产物。因而，由于每个孔将具有不同的最佳Tm，并且扩增与否将以不可预料的方式而不同，所以，几乎不可能进行多个MSP反应(每个在同一96孔平板或384孔PCR平板的不同的孔中)，并且从另一端得到灵敏的结果。此外，由于在按照本发明的阻断剂技术中的PCR引物可以针对没有CpGs的基因区域设计，所以多个不同基因的最佳Tm要容易控制得多，甚至在相对密集的CpG岛中也容易控制得多。通常可能在没有CpG二核苷酸的岛内找到可以作为PCR引物的起始位点的小区域。
V.MSP只检测每一引物在某个具体CpG位点甲基化的存在，因此MSP反应只在每个基因区域的两个位点报告。这总是一种记录很好的批评。它没有告诉研究者关于PCR引物之间的区域甲基化状态的任何事情。阻断剂INAs可以平均含有3-4个CpG位点，因此，每个基因使用4个阻断剂，本发明可以用来审查平均12-16个CpG位点的甲基化状态。
结果
阻断剂策略
本发明首先通过下述扩增检测进行举例说明。
图1中，PCR引物#1和阻断剂#1与来自目的基因组区域的亚硫酸氢盐处理的DNA杂交。那么，Taq聚合酶从PCR引物#1延伸一直到它结合在上端DNA链上的阻断剂#1，在这一点上酶终止。如果由于某种原因，酶绕过了阻断剂#1，那么酶将复制DNA的上链，并且产生互补链，该互补链产生用于PCR引物#2的结合位点。因此，加入与PCR#2内部序列互补的阻断剂。那么这确保没有基因组区域的扩增。
由于亚硫酸氢盐处理的DNA的性质，当现在DNA基本上由3碱基基因组组成时，扩增效率，特别是通过PCR的扩增效率减小。因此，为了最大的灵敏性，可以进行第二轮PCR。第二轮PCR将反应的灵敏性至少提高了5个数量级，因而使得所述方法理想地用于检测发生在少量细胞亚群中的DNA甲基化变化，诸如发生在临床样品中癌症和正常细胞的混合群体中很少量的癌症细胞中的DNA甲基化变化。在这一点上，加入在PCR引物#1和引物#2内部的第三和第四PCR引物(PCR引物#3和引物#4)以及两外两种阻断剂(阻断剂#3和阻断剂#4)。因此，每一PCR引物具有一种与所述PCR引物内部序列互补的阻断剂序列。
因此，对于每一目的基因组区域，总共合成4种PCR引物。如果需要检测甲基化DNA序列的存在，将使用4种未甲基化的阻断序列来阻断未甲基化DNA的扩增。另外，为了保证所述序列通过亚硫酸氢盐处理被完全转化(一个与一些亚硫酸氢盐处理反应相关的潜在问题)，可以使用另外第四种未转化的序列来阻断只有部分转化的DNA区域的扩增。在这一点上，在每次PCR(或其它的扩增)反应中，将存在2种PCR引物，2种未甲基化的阻断剂和2种未转化的阻断剂。
相反，如果需要检测未甲基化DNA序列的存在，可以使用4种甲基化的阻断剂来阻断甲基化DNA的扩增。另外，为了保证所述序列通过亚硫酸氢盐处理被完全转化，可以使用另外第四种未转化的序列来阻断只有部分转化的DNA区域的扩增。同样，在每次PCR反应中，将存在2种PCR引物，2种甲基化的阻断剂和2种未转化的阻断剂。
应该理解，阻断剂可以用来阻断核酸的任何扩增。
阻断剂特异性扩增
图2显示示范目的的正常的和亚硫酸氢盐处理的人工DNA序列，靶向不含CpG区域的PCR引物#1和引物#2，以及与它们适当的靶点区域杂交的4种阻断剂序列(两种甲基化的和两种未甲基化的)的序列。PCR引物和INA阻断剂与未转化的DNA(野生型)的杂交
在图3中，由于不充分的序列相似性，PCR引物#1只与B、C和D杂交，不与未转化的序列A杂交。同样由于不充分的序列相似性，甲基-阻断剂只与亚硫酸氢盐处理的甲基化的序列B结合，不与未转化的、未甲基化的或者局部未转化的DNA序列结合。然后，Taq聚合酶将开始延长B、C和D所示的序列。然而，在B情形中，酶将到达甲基阻断剂，但将不能越过所述甲基-阻断剂，因此没有形成产物。在C情形中，由于TpG位点的错配碱基没有阻断剂结合，因此Taq将产生需要的PCR片段。在D情形中，由于不充分的序列相似性，没有阻断剂结合，因此将获得PCR产物，但是这一产物将含有未转化的序列。PCR引物和阻断剂与转化的甲基化DNA序列的杂交
在图4中，由于不充分的序列相似性，PCR引物#1只与B、C和D杂交，不与未转化的序列A杂交。同样由于不充分的序列相似性，非甲基-阻断剂只与亚硫酸氢盐处理的未甲基化的序列C结合，不与未转化的、甲基化的或者局部未转化的DNA序列结合。然后，Taq聚合酶将开始延长B、C和D所示的序列。在C情形中，酶将到达非甲基阻断剂，但将不能越过所述非甲基-阻断剂，因此没有形成产物。在B情形中，由于在CpG的错配碱基没有阻断剂结合，因此Taq将产生需要的PCR片段。在D情形中，由于不充分的序列相似性，没有阻断剂结合，因此将获得PCR产物，但是这一产物将含有未转化的序列。
PCR引物和阻断剂与局部未转化的DNA序列的杂交
在图5中，由于不充分的序列相似性，PCR引物#1只与B、C和D杂交，不与未转化的序列A杂交。同样由于不充分的序列相似性，未转化的阻断剂只与未转化的序列A和局部未转化的序列D结合，不与甲基化的或者未甲基化的DNA序列结合。然后，Taq聚合酶将开始延长B、C和D所示的序列。在D情形中，酶将到达非转化的阻断剂，但将不能越过所述非转化的阻断剂，因此没有形成产物。在B和C情形中，由于在CpG和TpG位点的错配碱基序列没有阻断剂结合，因此Taq将产生需要的PCR片段。
因此，未转化的阻断剂可以与适当的阻断剂和引物一起加入在图3和图4中列出的情形中，以防止局部未转化序列的扩增，这是常规MSP的主要问题。
方法学比较
图6显示使用常规亚硫酸氢盐PCR、甲基化特异性PCR(MSP)和INA阻断剂技术，将在琼脂糖凝胶上观察到的条带模式的图示。
使用常规亚硫酸氢盐PCR，不管样品是否含有甲基化的序列，正常组织相对癌症组织，都将观察到条带(两组中的泳道1)。这种具体的方法只检测到样品中亚硫酸氢盐处理的DNA的存在，并且必须进一步处理才能确定甲基化状态，通常通过双脱氧测序进行确定。
使用MSP检测甲基化DNA序列，由于正常组织不被甲基化，所以在来自正常组织样品的泳道2将不会观察到条带。然而，在癌症组织样品的泳道2将观察到条带。使用针对未甲基化序列的MSP引物，在正常组织样品中(泳道3)将观察到条带，但是在癌症组织样品中(见泳道3)没有观察到条带。
使用甲基化阻断剂的INA阻断剂，在正常组织(泳道4)中将观察到条带，但是在癌症组织(见泳道4)中没有观察到条带。使用未甲基化的阻断剂，在癌症组织(泳道5)中观察到条带，但是在正常组织(见泳道5)中没有观察到条带。
应用到亚硫酸氢盐处理的基因组DNA样品的阻断剂技术
图7显示，当未甲基化的阻断剂加入到PCR反应混合物中时，使用亚硫酸氢盐转化的DNA HeLa细胞系、来自临床样品的T细胞和乳腺癌细胞系T47D2，产生阳性PCR信号。
表1
  泳道   样品   细胞类型  甲基化@
  1   HeLa   子宫颈(细胞系)  是
  2   HuVec   内皮细胞(细胞系)  否
  3   THP   单核细胞(细胞系)  否
  4   T-细胞   血液  否
  5   B-细胞   血液   否
  6   CD34+   血液   否
  7   T47D2   胸腺(细胞系)   是/否$
  8   500ng胎盘DNA   胎盘   否
  9   100ng胎盘DNA   胎盘   否
@.通过常规亚硫酸氢盐PCR测得的甲基化，常规亚硫酸氢盐PCR只检测大于10％的样品含有甲基化序列的甲基化。
$当通过常规亚硫酸氢盐测序对T47D2测序时，发现第一半部分序列被甲基化而第二半部分序列没有被甲基化。
从全血中纯化T-细胞、B-细胞和CD34+细胞
样品获得于在澳大利亚悉尼Royal North Shore Hospital进行白细胞除去法的患者。样品先获得道德委员会的批准。按照制造者的用法说明，使用Ficoll Paque plus(Amersham Biosciences#17-1440-03；Piscataway NJ)浓缩白血细胞。按照制造者的用法说明，分别使用CELLection CD2Dynabeads(Dynal#116.03；Lake Success NY)，Dynabeads CD19(Pan B)Dynal#111.43和Dynal CD34祖先细胞收集***(Dynal#113.01)，从白细胞群体分离T-细胞、B-细胞和CD34+细胞。
所用的序列和引物在表2中列出。
PCR预混合物制备如下：
                   未甲基化的混合物     甲基化的混合物    对照反应
X2Master混合物     12.5μl              12.5μl           12.5μl
(Promega)
100ng/μl PCR#1    1μl                 1μl              1μl
100ng/μl PCR#2    1μl                 1μl              1μl
100ng/μl阻断剂#1  3μl(U)              3μl(M)           -
100ng/μl阻断剂#2    3μl(U)     3μlM)      -
水                   3.5μl      3.5μl      9.5μl
表2
  名称  序列  SEQ ID NO   PCR引物   序列 SEQ ID NO
  CDKN2B MB-1 GAT TYT TGC GYA CGC GYT TCG TAT YTT TG  34   CDKN2B-1   TTTTTGGTTTAGTTGAAAAAGGAATTT 35
CDKN2B MB-2 GTT YAA CGA YTC GGT CGT YTC GGT TYA TTG 36 CDKN2B-2 TTAGGAGTTTTTTTTTAGAAGTAATTTAGG 37
  CDKN2B MB-3 CCY CGC GCC GCG YAC GCT YAA CCY AAA C  38   CDKN2B-3   ACTTCCAAAAACTATGTGACCTTCTCCACTAA 39
  CDKN2B MB-4 AAC TCC GTT YAA AAY TCC GCG CCG YAC TTY C  40   CDKN2B-4   AAACCCTAAAACCCCAACTACCTAA 41
  CDKN2B UB-1 GAT TYT TGT GYA TGT GYT TTG TAT YTT TG  42
  CDKN2B UB-2 GTT YAA TGA YTT GGT TGT YTT GGT TYA TTG  43
  CDKN2B UB-3 CCY CAC ACC ACA YAC ACT YAA CCY AAA C  44
  CDKN2B UB-4 AAC TCC ATT YAA AAY TCC ACA CCA YAC TTY C  45
  CDK2NB-NCB1 GAC TYC CGC GYA CGC GYT CCG CAC YCC TG  46
  CDK2NB-NCB2 GCT YAA CGA YCC GGC CGC YTC GGC CYA CTG  47
  CDK2NB-NCB3 CCY CGC GCC GCG YGC GCT YGG CCY AGA C  48
  CDK2NB-NCB4 GAC TCC GTT YGG GAY TCC GCG CCG YGC TTY C  49
  CYCL-2MB-1 GGT TTY ACG AYA GCG TTT TYT TCG TAG YGC G  50   CYCL2-1   ATTGAAATGTTTTTTAGAGAAGTAATTTT 51
  CYCL-2MB-2 GAY GCG GCG GGT YTT TCG TYT TTC GTT TTY AG  52   CYCL2-2   GTGGGTTTAAGGGATTTGATTT 53
  名称 序列  SEQ ID NO   PCR引物   序列   SEQ ID NO
  CYCL-2MB-3 YCC CGA AAC TCC AYA ATC GAT CYC CGA ATY TC  54   CYCL2-3   ACCCCTTTTATACATAATTAAAAC   55
CYCL-2MB-4 YCT AAA AYA ACC CGA AYA TCC CGA ACY C 56 CYCL2-4 AACTAACAAAAAACTACCTATAACC 57
  CYCL-2UB-1 GGT TTY ATG AYA GTG TTT TYT TTG TAG YGT G  58
  CYCL-2UB-2 GAY GTG GTG GGT YTT TTG TYT TTT GTT TYT AG  59
  CYCL-2UB-3 YCC CAA AAC TCY CAA ATC AAT CYC CAA ATY TC  60
  CYCL-2UB-4 YCT AAA AYA ACC CAA AYA TCC CAA ACY C  61
  CYCL2-NCB 1 GGT TCY ACG AYA GCG CCT CYC TCG CAG YGC G  62
  CYCL2-NCB2 GAY GCG GCG GGC YTC TCG CYT CCC GCT CCYAG  63
  CYCL2-NCB3 YCC CGG AGC TCC AYG ATC GAT CYC CGA GTYTC  64
  CYCL2-NCB4 YCT GGA AYA GCC CGG AYG TCC CGG GYC C  65
  GSNMB-1 GTT YGG GTT CGT CGY TCG TTC GTY GTT TYG  66   GSN-1   TTGTAAAATGGGTTGGTAGTTGTATTT   67
  GSNMB-2 GTT YAG CGT YTC GTC GTA TYG TTA YGG  68   GSN-2   TTGAAAAGGATGTGTTGATGTT   69
GSNMB-3 AYT CGA CCC GYA CAA AYA CGC GAC AYA C 70 GSN-3 AATCTTAAAAACATCTAAATTC 71
GSN MB-4 YCC CGC CCA TCY CCG CCC AAY ACC GAA AYA C 72 GSN-4 ACAAAAAACCCAATCTACAAC 73
  GSN UB-1 GTT YGG GTT TGT TGY TTG TTT GTY GTT TYG  74
  名称   序列  SEQ ID NO  PCR引物   序列  SEQ ID NO
  GSN UB-2   GTT YAG TGT YTT GTT GTA TYG TTA YGG  75
  GSN UB-3   AYT CAA CCC AYA CAA AYA CAC AAC AYA C  76
  GSN UB-4   YCC CAC CCA TCY CCA CCC AAY ACC AAA AYA C  77
  GSN-NCB1   GCT YGG GCT CGC CGY CCG CTC GTY GCC TYG  78
  GSN-NCB2   GCT YAG CGC YCC GCC GTA TYG TCA YGG  79
  GSN-NCB3   AYT CGA CCC GYA CAG GYG CGC GGC AYG C  80
  GSN-NCB4   YCC CGC CCA TCY CCG CCC AAY GCC GGG GYA C  81
  HIC-1MB-1   GYT TTT YGG GGC GTG TYA GGT CGT TTT YGG  82  HIC1-1   GGTAATTGTTTTTAAAAGGGTTAT  83
  HIC-1MB-2   GYG TTA GGC GGT TYA GGG CGT CGT YAC GGY T  84  HIC1-2   GTTTTTATTTTAGAGGGTAGTTGG  85
  HIC-1MB-3   TAY ACC GAY ACG CCT CCY ATC GTA TCY C  86  HIC1-3   ATTAAACTAATTATCATACACCACCAAAA  87
  HIC-1MB-4   CTT YAT ACG CGC GAY AAA AAY AAC GTY TC  88  HIC1-4   ATATAAATAAAATCCAACACCAAACTAAAC  89
  HIC-1UB-1   GYT TTT YGG GGT GTG TYA GGT TGT TTT YGG  90
  HIC-1UB-2   GYG TTA GGT GGT TYA GGG TGT TGT YAT GGY T  91
  HIC-1UB-3   TAY ACC AAY ACA CCT CCY ATC ATA TCY C  92
  HIC-1UB-4   CTT YAT ACA CAC AAY AAA AAY AAC ATY TC  93
  HIC1-NCB1   GYC CCT YGG GGC GTG CYA GGC CGC CCT YGG  94
  名称   序列  SEQ ID NO  PCR引物   序列  SEQ ID NO
  HIC1-NCB2  GYG CCA GGC GGC CYA GGG CGC CGC YAC GGYC  95
  HIC1-NCB3  TGY GCC GGY GCG CCT CCYATC GTG TYC C  96
  HIC1-NCB4  CTT YGT GCG CGC GGY AAG AGY GGC GTY TC  97
按照图1所述的原理，在Hybaid PX2热循环仪中进行两轮PCR扩增。向第一轮PCR的每个反应管中加入1μl亚硫酸氢盐处理的基因组DNA。PCR进行如下。
95℃        3分钟        1个循环
95℃        1分钟
55℃        2分钟        30个循环
72℃        2分钟
72℃        10分钟       1个循环
在完成第一轮PCR后，将1μl第一轮PCR反应混合物转移到第二轮扩增管中，并且重复上述PCR程序。
然后将10μl PCR反应混合物在2％琼脂糖凝胶上分离。
这些样品的常规亚硫酸氢盐基因组测序表明，对于这一具体的基因组区域，HeLa细胞DNA系完全被甲基化。然而，T-细胞DNA表现出缺少甲基化，常规亚硫酸氢盐基因组测序的结果只有10％。使用限制性酶Taq1(切割TCGA)和BstU1(切割CGCG)限制性消化扩增的产物揭示扩增子中的甲基化。这表明，在低水平甲基化序列的检测上，INA阻断剂技术明显地优于常规亚硫酸氢盐基因组测序。另外，当通过常规亚硫酸氢盐测序对T47D2DNA测序时，发现第一半部分序列是甲基化的而第二半部分序列没有甲基化。可以在图7A和7B中看出，使用未甲基化的阻断剂和甲基化的阻断剂，检测到一条条带。如果使用MSP，由于对于第二MSP PCR引物的起始位点将是未甲基化的，因而引物不会结合，所以这种具体的样品将产生假阳性条带。
使用甲基化的INA阻断剂，所有的结果与使用常规亚硫酸氢盐测序得到的结果一致。
临床检测结果
图8和表3显示关于来自11种不同的细胞系样品或临床样品的4种基因组区域(CDKN2B，CXCL-2，GSN和HIC-1)的阻断剂实验的结果。所用的阻断剂和实验流程如下：
对于每一目的基因区域，PCR预混合物制备如下：
                      未甲基化的混合物     甲基化的混合物
X2Master混合物        12.5μl              12.5μl
(Promega)
100ng/μl PCR#        11μl                1μl
100ng/μl PCR#        21μl                1μl
200ng/μl阻断剂#      11.5μl(U)           1.5μl(M)
200ng/μl阻断剂#      21.5μl(U)           1.5μl(M)
200ng/μl阻断剂#      31.5μl(U)           1.5μl(M)
200ng/μl阻断剂#      41.5μl(U)           1.5μl(M)
水                    3.5μl               3.5μl
按照图1所述的原理，在Hybaid PX2热循环仪中进行两轮PCR扩增。向第一轮PCR的每个反应管中加入1μl亚硫酸氢盐处理的基因组DNA。PCR进行如下。
95℃         3分钟        1个循环
95℃         1分钟
55℃         2分钟        30个循环
72℃         2分钟
72℃         10分钟       1个循环
在完成第一轮PCR后，将1μl第一轮PCR反应混合物转移到第二轮扩增管中，并且重复上述PCR程序。
然后将10μl PCR反应混合物在2％琼脂糖凝胶上分离。
表3
  甲基化
  泳道   样品   来源   CDKN2B   CXCL-2   GSN   HIC-1
  1-CL   Du145   ***癌   ND   ND   ND   ND
  2-CL   BL13   膀胱癌   否   否   混合   是
  3-CL   MRC-5   成纤维细胞-正常的   ND   ND   ND   ND
  4-CL   T47D2   乳腺癌细胞   ND   ND   ND   ND
  5-CL   HeLa   子***   否   否   ND   是
  6-CL   SMC   肌肉-正常   ND   ND   ND   ND
  7-CL   MCF-7   乳腺癌   否   否   混合   ND
  8-CL   LNCaP   ***癌   否   否   混合   是
  9-Pa   粒细胞   血液-白血病   否   否   否   否
  10-Pa   T-细胞   血液-白血病   否   否   混合   否
  11-CL   THP-1   血液-白血病   ND   ND   ND   ND
CL-表示物质来源于细胞系。
Pa-表示细胞获得于患者。
ND-未确定
No-通过直接测序PCR产物，没有检测到甲基化
混合-不是所有的CpG位点甲基化或者甲基化局限在扩增子的一个区域内
是-通过直接测序扩增子检测到甲基化。
除少量甲基化在粒细胞中表现出弱条带之外，几乎在所有样品中，发现基因组区域CDKN2B和CXCL-2未被甲基化。通过对选择样品的独立扩增之后再对PCR产物直接测序而证实这一结果。在CDKN2B或CXCL-2任一PCR片段中，直接的DNA测序没有显示有甲基化。直接测序的灵敏性是这样的，除非大于10％的扩增物质是甲基化的，否则序列将被读作是未甲基化的。因此，在粒细胞样品中CXCL-2弱条带的存在是在这一样品中通过阻断剂检测而检测到的很低的甲基化水平的指示。
在对于GSN基因组区域测序的所有样品中，观察到的混合的甲基化模式与阻断剂检测的结果一致。这一基因组区域的甲基化模式在PCR扩增子的全长中变化，并且在许多情形中，并不是所有的CpG二核苷酸都被甲基化，或者在单个CpG位点观察到未甲基化和甲基化序列的混合物。
对于BL13、Hela和LNCaP细胞系，观察到癌症过度甲基化(Hypermethylated In Cancer，HIC-1)基因的甲基化，所有CpG位点都显示出100％的甲基化。有趣地是，正常SMC(样品6)细胞系是没有显示HIC-1基因甲基化的唯一的细胞系。来自消除了白血病的患者的粒细胞和T-细胞(样品9和10)通过阻断剂检测表现出混合的甲基化，并且尽管对于大部分的PCR扩增子表现出未甲基化，但是这也可能是由于直接测序方法缺乏灵敏性。
从所述结果可以看出，按照本发明的阻断剂检测是检测人基因组不同区域的甲基化模式的有力工具。
本领域的技术人员应该理解，可以对本发明进行许多改变和/或改进，如在具体实施方案中广泛描述的不背离本发明的精神或范围的那些。因此，在所有方面，本实施方案视作是示例性的，并且不是限制性的。
                     序列表
<110>人类遗传标记控股有限公司
<120>扩增阻断剂
<130>205576242
<160>97
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>34
<212>DNA
<213>人工的
<400>1
tyttcggtta gyttgcgcgg cgaytttcgg ygga                            34
<210>2
<211>34
<212>DNA
<213>人工的
<400>2
tytttggtta gyttgtgtgg tgayttttgg ygga                            34
<210>3
<211>34
<212>DNA
<213>人工的
<400>3
cycccggcca gyctgcgcgg cgayctccgg ygga                            34
<210>4
<211>34
<212>DNA
<213>人工的
<400>4
ttaytaacga aayactyacg acgacgaaac ytcc                             34
<210>5
<211>34
<212>DNA
 <213>人工的
<400>5
ttaytaacaa aayactyaca acaacaaaac ytcc                             34
<210>6
<211>34
<212>DNA
<213>人工的
<400>6
tggytggcga agyactygcg gcggcgaaac ytcc                             34
<210>7
<211>31
<212>DNA
<213>人工的
<400>7
ttyagggcgt ytttttytgc ggtcgacgty t                                31
<210>8
<211>31
<212>DNA
<213>人工的
<400>8
ttyagggtgt ytttttytgt ggttgatgty t                             31
<210>9
<211>31
<212>DNA
<213>人工的
<400>9
ccyagggcgc yccctcytgc ggccgacgcy c                             31
<210>10
<211>31
<212>DNA
<213>人工的
<400>10
atyaatcccg ccyccgctyc cgccccayat a                             31
<210>11
<211>31
<212>DNA
<213>人工的
<400>11
atyaatccca ccyccactyc caccccayat a                             31
<210>12
<211>31
<212>DNA
<213>人工的
<400>12
gtyggtcccg ccyccgctyc cgccccaygt g                             31
<210>13
<211>27
<212>DNA
<213>人
<400>13
tttgttgttt gtttattttt taggttt                                  27
<210>14
<211>26
<212>DNA
<213>人
<400>14
aacctaatac tactaattaa ccccat                                   26
<210>15
<211>26
<212>DNA
<213>人
<400>15
ggatttggga aagagggaaa ggtttt                                   26
<210>16
<211>24
<212>DNA
<213>人
<400>16
actaaaaact ctaaacccca tccc                                     24
<210>17
<211>111
<212>DNA
<213>人工的
<400>17
cgggtgaccc ctctcccctg ccctgtgaag cgggtgccgg cgcgccgagg ccgcgaagtt    60
cgctgcctgc gcggcgactc cggggaatgg ggccacctgc agcatctccc g             111
<210>18
<211>112
<212>DNA
<213>人工的
<400>18
cgggtgattt tttttttttg ttttgtgaag cgggtgtcgg cgcgtcgagg tcgcgaagtt    60
cgttgtttgc gcggcgattt cggggaatgg ggttaatttg tagtattttt cg            112
<210>19
<211>112
<212>DNA
<213>人工的
<400>19
tgggtgattt tttttttttg ttttgtgaag tgggtgttgg tgtgttgagg ttgtgaagtt    60
tgttgtttgt gtggtgattt tggggaatgg ggttaatttg tagtattttt tg            112
<210>20
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<400>20
tttttttttt tttgttttgt                                                 20
<210>21
<211>24
<212>DNA
<213>人工的
<400>21
taccccaatt aaacatcata aaaa                                        24
<210>22
<211>17
<212>DNA
<213>人工的
<400>22
gaagcgggtg tcggcgc                                                17
<210>23
<211>17
<212>DNA
<213>人工的
<400>23
gcgccgctaa agcccct                                                17
<210>24
<211>17
<212>DNA
<213>人工的
<400>24
gaagtgggtg ttggtgt                                                17
<210>25
<211>18
<212>DNA
<213>人工的
<400>25
acacctacta aaacccct                                             18
<210>26
<211>49
<212>DNA
<213>人工的
<400>26
cgggtgaccc ctctcccctg ccctgtgaag cgcctgccgc cgcccccga            49
<210>27
<211>49
<212>DNA
<213>人工的
<400>27
cgggtgattt tttttttttg ttttgtgaag cgcctgtcgt cgttttcga             49
<210>28
<211>49
<212>DNA
<213>人工的
<400>28
tgggtgattt tttttttttg ttttgtgaag tgtttgttgt tgtttttga             49
<210>29
<211>50
<212>DNA
<213>人工的
<400>29
cgggtgattt tttttcccct gccctgtgaa gcgcctgccg tcgcccccga           50
<210>30
<211>11
<212>DNA
<213>人工的
<400>30
ccactaaaaa a                                                     11
<210>31
<211>14
<212>DNA
<213>人工的
<400>31
aaacagcagc aaaa                                                  14
<210>32
<211>14
<212>DNA
<213>人工的
<400>32
aaacaacaac aaaa                                                  14
<210>33
<211>14
<212>DNA
<213>人工的
<400>33
ggacggcggc gggg                                                  14
<210>34
<211>29
<212>DNA
<213>人工的
<400>34
gattyttgcg yacgcgyttc gtatytttg                                   29
<210>35
<211>27
<212>DNA
<213>人工的
<400>35
tttttggttt agttgaaaaa ggaattt                                     27
<210>36
<211>30
<212>DNA
<213>人工的
<400>36
gttyaacgay tcggtcgtyt cggttyattg                                  30
<210>37
<211>30
<212>DNA
<213>人工的
<400>37
ttaggagttt ttttttagaa gtaatttagg                                  30
<210>38
<211>28
<212>DNA
<213>人工的
<400>38
ccycgcgccg cgyacgctya accyaaac                                28
<210>39
<211>32
<212>DNA
<213>人工的
<400>39
acttccaaaa actatgtgac cttctccact aa                           32
<210>40
<211>31
<212>DNA
<213>人工的
<400>40
aactccgtty aaaaytccgc gccgyactty c                            31
<210>41
<211>25
<212>DNA
<213>人工的
<400>41
aaaccctaaa accccaacta cctaa                                   25
<210>42
<211>29
<212>DNA
<213>人工的
<400>42
gattyttgtg yatgtgyttt gtatytttg                           29
<210>43
<211>30
<212>DNA
<213>人工的
<400>43
gttyaatgay ttggttgtyt tggttyattg                          30
<210>44
<211>28
<212>DNA
<213>人工的
<400>44
ccycacacca cayacactya accyaaac                            28
<210>45
<211>31
<212>DNA
<213>人工的
<400>45
aactccatty aaaaytccac accayactty c                        31
<210>46
<211>29
<212>DNA
<213>人工的
<400>46
gactyccgcg yacgcgytcc gcacycctg                           29
<210>47
<211>30
<212>DNA
<213>人工的
<400>47
gctyaacgay ccggccgcyt cggccyactg                             30
<210>48
<211>28
<212>DNA
<213>人工的
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Claims (36)

1.一种扩增阻断剂，其包括含有两个或多个能够阻断或减少核酸扩增的内部嵌入性假核苷酸(IPNs)的嵌入性核酸(INA)。
2.按照权利要求1的阻断剂，其中所述INA在长度上约15-50个核苷酸或核苷酸类似物，具有2-6个位于内部的IPNs。
3.按照权利要求2的阻断剂，其中所述INA在长度上约18-35个核苷酸或核苷酸类似物，具有2-6个位于内部的IPNs。
4.按照权利要求1-3中任一项的阻断剂，其中所述IPNs位于寡核苷酸3′或5′端2个或多个碱基处。
5.按照权利要求1-4中任一项的阻断剂，其中所述INA在寡核苷酸的3′或5′端不含IPNs。
6.按照权利要求1-5中任一项的阻断剂，其中所述IPN选自1-(4，4’-二甲氧基三苯基甲基氧基)-3-芘甲基氧基-2-丙醇的亚磷酰胺。
7.按照权利要求6的阻断剂，其中所述IPN选自(S)-1-(4，4’-二甲氧基三苯基甲基氧基)-3-芘甲基氧基-2-丙醇的亚磷酰胺或(R)-1-(4，4’-二甲氧基三苯基甲基氧基)-3-芘甲基氧基-2-丙醇的亚磷酰胺。
8.按照权利要求7的阻断剂，其中所述IPN是(S)-1-(4，4’-二甲氧基三苯基甲基氧基)-3-芘甲基氧基-2-丙醇的亚磷酰胺。
9.按照权利要求1-8中任一项的阻断剂用于阻断或减少核酸扩增的应用。
10.一种检测核酸分子目标区域甲基化状态的方法，其包括：
在某种条件下，用修饰胞嘧啶碱基但是不修饰5-甲基-胞嘧啶碱基的试剂处理所述核酸分子，以形成修饰的核酸模板；
在扩增反应中提供按照权利要求1-8中任一项的第一阻断剂，所述第一阻断剂与所修饰的核酸模板第一链上未甲基化的目标区域互补；
在扩增反应中提供按照权利要求1-8中任一项的第二阻断剂，所述第二阻断剂与所修饰的核酸模板第一链的互补第二链下游上的区域互补；
提供第一引物，其与所修饰的核酸模板第一链上目标区域上游的核酸区域互补：
提供第二引物，其与所修饰的核酸模板第一链的互补第二链上第二阻断剂区域下游的核酸区域互补；
进行扩增反应，其中如果所述目标区域被甲基化，那么将有扩增产物，并且如果所述目标区域未被甲基化，那么将没有扩增产物。
11.一种检测核酸分子目标区域甲基化状态的方法，其包括：
在某种条件下，用修饰胞嘧啶碱基但是不修饰5-甲基-胞嘧啶碱基的试剂处理所述核酸分子，以形成修饰的核酸模板；
在扩增反应中提供按照权利要求1-8中任一项的第一阻断剂，所述第一阻断剂与所修饰的核酸模板第一链上甲基化的目标区域互补；
在扩增反应中提供按照权利要求1-8中任一项的第二阻断剂，所述第二阻断剂与所修饰的核酸模板第一链的互补第二链下游上的区域互补；
提供第一引物，其与所修饰的核酸模板第一链上目标区域上游的核酸区域互补；
提供第二引物，其与所修饰的核酸模板第一链的互补第二链上第二阻断剂区域下游的核酸区域互补；
进行扩增反应，其中如果所述目标区域未被甲基化，那么将有扩增产物，并且如果所述目标区域被甲基化，那么将没有扩增产物。
12.按照权利要求10或11的方法，其还包括：
在扩增反应中提供按照权利要求1-8中任一项的第三和第四阻断剂，所述第三和第四阻断剂与第一和第二阻断剂区域的内部区域互补；和
提供第三和第四引物，其与第三和第四阻断剂区域的外部区域以及第一和第二引物区域的内部区域互补。
13.按照权利要求10-12中任一项的方法，其还包括：
提供一种或多种其它的按照权利要求1-8中任一项的阻断剂，其针对所述核酸分子上一个或多个区域。
14.按照权利要求13的方法，其中所述核酸分子上的区域与所修饰的核酸模板的一个或多个区域相对应。
15.按照权利要求10-14中任一项的方法，其还包括：
提供三种或多种按照权利要求1-8中任一项的阻断剂，其针对与第一和第二引物区域之间的区域互补的第一或第二链。
16.一种检测核酸分子目标区域转化状态的方法，其包括：
在某种条件下，用修饰胞嘧啶碱基但是不修饰5-甲基-胞嘧啶碱基的试剂处理所述核酸分子，以形成修饰的核酸模板；
在扩增反应中提供按照权利要求1-8中任一项的第一阻断剂，所述第一阻断剂与所修饰的核酸模板第一链上未转化的目标区域互补；
在扩增反应中提供按照权利要求1-8中任一项的第二阻断剂，所述第二阻断剂与所修饰的核酸模板第一链的互补第二链下游上的区域互补；
提供第一引物，其与所修饰的核酸模板第一链上目标区域上游的核酸区域互补；
提供第二引物，其与所修饰的核酸模板第一链的互补第二链上第二阻断剂区域下游的核酸区域互补；
进行扩增反应，其中如果所述目标区域被转化，那么将有扩增产物，并且如果所述目标区域未被转化，那么将没有扩增产物。
17.一种检测核酸分子目标区域转化状态的方法，其包括：
在某种条件下，用修饰胞嘧啶碱基但是不修饰5-甲基-胞嘧啶碱基的试剂处理所述核酸分子，以形成修饰的核酸模板；
在扩增反应中提供按照权利要求1-8中任一项的第一阻断剂，所述第一阻断剂与所修饰的核酸分子第一链上转化的目标区域互补；
在扩增反应中提供按照权利要求1-8中任一项的第二阻断剂，所述第二阻断剂与所修饰的核酸模板第一链的互补第二链下游上的区域互补；
提供第一引物，其与所修饰的核酸模板第一链上目标区域上游的核酸区域互补；
提供第二引物，其与所修饰的核酸模板第一链的互补第二链上第二阻断剂区域下游的核酸区域互补；
进行扩增反应，其中如果所述目标区域未被转化，那么将有扩增产物，并且如果所述目标区域被转化，那么将没有扩增产物。
18.按照权利要求10-17中任一项的方法，其中所述目标区域是3′侧连鸟嘌呤(G)的胞嘧啶(C)。
19.按照权利要求10-18中任一项的方法，其中所述修饰试剂选自亚硫酸氢盐、醋酸盐或柠檬酸盐。
20.按照权利要求19的方法，其中所述试剂是亚硫酸氢钠。
21.按照权利要求10-20中任一项的方法，其中所述核酸分子是DNA或RNA。
22.按照权利要求21的方法，其中所述核酸分子是DNA。
23.按照权利要求10-22中任一项的方法，其中所述扩增检测是PCR。
24.一种检测核酸分子目标区域状态的方法，其包括：
在某种条件下，用修饰胞嘧啶碱基但是不修饰5-甲基-胞嘧啶碱基的试剂处理所述核酸分子，以形成修饰的核酸模板；
在扩增反应中提供按照权利要求1-8中任一项的第一阻断剂，所述第一阻断剂与具有不理想状态的修饰的核酸模板第一链上的目标区域互补；
在扩增反应中提供按照权利要求1-8中任一项的第二阻断剂，所述第二阻断剂与所修饰的核酸模板第一链的互补第二链下游上的区域互补；
提供第一引物，其与所修饰的核酸模板第一链上目标区域上游的核酸区域互补；
提供第二引物，其与所修饰的核酸模板第一链的互补第二链上第二阻断剂区域下游的核酸区域互补；
进行扩增反应，其中如果所述目标区域具有理想的状态，那么将有扩增产物，并且如果所述目标区域具有不理想的状态，那么将没有扩增产物。
25.一种检测核酸分子目标区域状态的方法，其包括：
在某种条件下，用修饰胞嘧啶碱基但是不修饰5-甲基-胞嘧啶碱基的试剂处理所述核酸分子，以形成修饰的核酸模板；
在扩增反应中提供按照权利要求1-8中任一项的第一阻断剂，所述第一阻断剂与具有理想状态的修饰的核酸模板第一链上的目标区域互补；
在扩增反应中提供按照权利要求1-8中任一项的第二阻断剂，所述第二阻断剂与所修饰的核酸模板第一链的互补第二链下游上的区域互补；
提供第一引物，其与所修饰的核酸模板第一链上目标区域上游的核酸区域互补；
提供第二引物，其与所修饰的核酸模板第一链的互补第二链上第二阻断剂区域下游的核酸区域互补；
进行扩增反应，其中如果所述目标区域具有不理想的状态，那么将有扩增产物，并且如果所述目标区域具有理想的状态，那么将没有扩增产物。
26.按照权利要求24或25的方法，其中所述状态是甲基化、突变或单一核苷酸多态性。
27.一种阻断或减少核酸扩增的方法，其包括：
在核酸扩增反应中提供一种阻断剂，其包括含有两种或多种内部IPNs的INA核酸，其中所述阻断剂与目的核酸序列互补；和
进行扩增反应，以致所述阻断剂与目的核酸序列结合，并且阻断或减少在目的序列处或在接近目的序列处的扩增。
28.一种阻断或减少核酸扩增的方法，其包括：
在核酸扩增反应中提供按照权利要求1-8中任一项的阻断剂，其中所述阻断剂与目的核酸序列互补；和
进行扩增反应，以致所述阻断剂与目的核酸序列结合，并且阻断或减少在目的序列处或在接近目的序列处的扩增。
29.按照权利要求27或28的方法，其还包括：
提供第二对引物，其与位于第一对引物的互补区域之间的核酸区域互补。
30.按照权利要求27-29中任一项的方法，其中所述核酸分子是DNA或RNA。
31.按照权利要求30的方法，其中所述核酸分子是DNA。
32.按照权利要求27-31中任一项的方法，其中在提供阻断剂之前，在某种条件下将核酸用修饰胞嘧啶碱基但是不修饰5-甲基-胞嘧啶碱基的试剂处理，以形成含有潜在的甲基化位点的修饰的核酸模板。
33.按照权利要求32的方法，其中所述修饰试剂选自亚硫酸氢盐、醋酸盐或柠檬酸盐。
34.按照权利要求33的方法，其中所述试剂是亚硫酸氢钠。
35.按照权利要求27-34中任一项的方法，其中一种或多种阻断剂针对核酸分子上的一个或多个潜在的甲基化位点。
36.按照权利要求27-34中任一项的方法，其中一种或多种阻断剂不与核酸分子上的潜在的甲基化位点结合。
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