CN1748028A - 用于变异基因检测的信号扩增方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种用于变异基因检测的信号扩增方法，该方法通过PALSAR法使DNA芯片上的变异基因的检测灵敏度提高，更有效地确立信号扩增，通过在PALSAR法中使用的寡核苷酸·探针的设计上想办法，能够简便地完成检测。所述方法，包含使用DNA连接酶的连接反应以及寡核苷酸形成双链有规则的高级结构的自集合体的自集合反应，使DNA芯片的变异基因的检测灵敏度提高。

Description

用于变异基因检测的信号扩增方法
技术领域
本发明涉及利用连接反应以及形成自集合体的自集合反应，可以使DNA芯片、DNA微阵列、微孔或球状珠(在本发明中，将DNA芯片、DNA微阵列、微孔或球状珠总称为DNA芯片)的变异基因的检测灵敏度提高的信号扩增方法。
背景技术
以往的基因变异检测利用使寡核苷酸彼此与靶结合，用DNA连接酶使它们连接的OLA(Oligonucleotide Ligation Assay)法(参照例如美国专利第4,988,617号说明书以及D.Nickerson.Proc Natl.Acad.Sci.，vol.87，pp.8923-8927(1990))、使用标记的ddNTP，使单个碱基延伸的TDI(Template-directed dye-termiantor incorporation)法(参照例如Chen X etal.，Nucleic Acids Research，vol.25，No.2，pp.347-353(1997))、INVADE(インベ—ダ—)法(参照例如美国专利第5,985,557号说明书)等各种各样的方法，但上述方法在多通路检测或成本、通用性等方面仍存在待研究的课题。
另外，将许多DNA探针高密度地固定在对表面进行特殊加工的载玻片等支撑体上，使标记的靶或信号检测用探针杂交，对信号进行检测的技术与以往一直用的Southern blot法比较，灵敏度低至十分之一(参照例如村松正明等人，“DNA微阵列和最新PCR法”秀润社、85-86，2000。)，存在时间长的问题。
鉴于上述问题，本发明人等报告了不使用酶的新的等温核酸扩增法(参照例如专利第3267576号公报)。该方法是使用由3处区域构成的一对寡核苷酸(HoneyComb Probe，以下称为HCP)的方法，在碱基序列上想办法使得第一HCP和第二HCP的各3处区域含有彼此互补的碱基序列，当使两者反应时，只与区域中的一处进行杂交。通过这样的办法，使一对HCP反应时，彼此进行杂交，通过HCP的自集合反应使集合体形成(以下将通过该自集合反应形成集合体的形成法称为PALSAR法)。
发明内容
鉴于上述以往技术的现状，本发明人使用上述的PALSAR法，不断进行为了使变异基因的检测灵敏度提高的锐意研究，结果完成了本发明。
本发明的目的在于提供一种用于变异基因检测的信号扩增方法，即，通过PALSAR法使DNA芯片的变异基因的检测灵敏度提高，更有效地确立信号的扩增，进一步通过对PALSAR法中使用的寡核苷酸·探针的设计上想办法，能够完成简便检测。
为了解决上述问题，本发明的用于变异基因检测的信号扩增方法的第1方式，是包含使用DNA连接酶的连接反应以及寡核苷酸形成双链有规则的高级结构的自集合体的自集合反应，使DNA芯片的变异基因的检测灵敏度提高的方式。
本发明的用于变异基因检测的信号扩增方法的第2方式的特征是：包含使捕捉用探针和第1探针与靶DNA杂交的第1工序，当靶DNA的变异部位与该捕捉用探针互补时，通过使用DNA连接酶的连接反应使上述捕捉用探针与上述第1探针连接的第2工序，使上述靶DNA除去的第3工序，以及添加多个寡核苷酸·探针、通过该寡核苷酸·探针的自集合反应形成自集合体而使信号扩增的第4工序，上述捕捉用探针和上述第1探针的碱基序列的构成，要能够在上述第1工序中使上述捕捉用探针的末端处于上述靶DNA的变异部位，而且该末端与上述第1探针以邻接的状态与靶DNA退火，上述多个寡核苷酸·探针中的至少一个含有与上述第1探针互补的区域。通过上述信号扩增方法，可以使DNA芯片的变异基因的检测灵敏度提高。在上述第1工序中，捕捉用探针和第1探针与靶DNA的结合可以使捕捉用探针和第1探针同时与靶DNA结合，也可以使捕捉用探针与靶DNA结合后，使第1探针与靶DNA结合，也可以使第1探针与靶DNA结合后，使捕捉用探针与靶DNA结合，结合顺序没有特别限定。
最好是将在上述自集合反应中使用的寡核苷酸·探针的碱基序列预先做成与上述第1探针互补的序列。
作为上述自集合反应，第1可以使用如下所述的自集合反应，即，使用彼此互补的部分由n(n≥3)处数构成的一对寡核苷酸·探针(在本发明中称为HCP)，使得它们交错地进行交叉那样杂交，寡核苷酸自集合，使双链的自集合体形成。当检测一种变异基因时，上述一对HCP中的一方最好是能够作为上述第1探针使用。
作为上述自集合反应，第2可以使用如下所述的自集合反应，即，具有下述第1系和第2系，所述第1系是包含多对在将No.1和No.2的一对寡核苷酸的各寡核苷酸分为3′侧区域、中央区域以及5′侧区域3个区域，以各寡核苷酸的中央区域作为彼此互补的碱基序列形成二聚体探针的同时，以3′侧区域和5′侧区域作为彼此非互补的碱基序列的一对二聚体形成用探针的第1系，
所述第2系是包含多对在将No.3和No.4的一对寡核苷酸的各寡核苷酸分为3′侧区域和5′侧区域2个区域，以各寡核苷酸的3′侧区域以及5′侧区域作为彼此非互补碱基序列的一对交联探针的第2系，
使该交联探针形成对由该二聚体形成用探针形成的二聚体可进行交联的碱基序列，通过使该探针杂交，寡核苷酸自集合，形成双链自集合体。上述一对二聚体形成用探针以及上述一对交联探针的构成，最好是要使得该探针中的任一个、优选一对二聚体形成用探针的一方能够作为上述第1探针使用。
可以使上述探针的碱基序列形成为分别使第1系的No.1-寡核苷酸的3′侧区域和第2系的No.3-寡核苷酸的3′侧区域、第1系的No.2-寡核苷酸的5′侧区域和第2系的No.4-寡核苷酸的5′侧区域、第2系的No.4-寡核苷酸的3′侧区域和第1系的No.2-寡核苷酸的3′侧区域、第2系的No.3-寡核苷酸的5′侧区域和第1系的No.1-寡核苷酸的5′侧区域互补的碱基序列。
可以使上述探针的碱基序列形成为分别使第1系的No.1-寡核苷酸的3′侧区域和第2系的No.3-寡核苷酸的3′侧区域、第1系的No.2-寡核苷酸的5′侧区域和第2系的No.3-寡核苷酸的5′侧区域、第1系的No.2-寡核苷酸的3′侧区域和第2系的No.4-寡核苷酸的3′侧区域、第1系的No.1-寡核苷酸的5′侧区域和第2系的No.4-寡核苷酸的5′侧区域互补的碱基序列。
对于上述靶DNA可以使用单链DNA或双链DNA。在上述信号扩增方法中，直接作为靶DNA使用的可以是单链DNA，也可以通过将双链解离，使用双链DNA。例如，可以使用以DNA为模板的基因扩增法(例如，PCR法或LCR法等)被扩增的DNA。另外，靶基因是RNA时，也可以使用以RNA为模板的基因扩增法(例如，RT-PCR法等)被扩增的DNA，都包括在本发明中。
上述DNA芯片含有结合用于捕捉靶DNA的捕捉用探针的支撑体，作为该支撑体可以使用微滴板型、载玻片型、微粒子型、或导电性基板型等的支撑体。对于上述微滴板型和微粒子型支撑体的材质可以使用塑料或聚苯乙烯等。而在载玻片型支撑体中可以使用玻璃或塑料等材料。对于导电性基板型支撑体可以使用金电极或ITO电极(indium oxide电极)等。
对于上述自集合体，可以使预先用发色系酶、发光系酶、或放射性同位素等标记的标记探针杂交，检测自集合体的存在。
对于上述自集合体，可以添加带有与核酸结合的性质的荧光物质，通过该荧光物质的光化学上的变化检测上述自集合体的存在。
用荧光物质预先对形成自集合体的寡核苷酸进行标记，可以通过荧光物质的光化学上的变化检测上述自集合体的存在。
用放射性同位素预先对形成自集合体的寡核苷酸进行标记，可以通过放射性同位素检测上述自集合体的存在。
用发色系酶或发光系酶预先对形成自集合体的寡核苷酸进行标记，可以通过光化学上的变化检测上述自集合体的存在。
上述寡核苷酸是由选自DNA、RNA、PNA或LNA中任一个碱基构成。
附图说明
图1是从原理上表示本发明的信号扩增方法的工序顺序的第1～第4例中步骤100的模式图。
图2是从原理上表示本发明的信号扩增方法的工序顺序的第1～第4例中步骤102的模式图。
图3是从原理上表示本发明的信号扩增方法的工序顺序的第1例中步骤110的模式图。
图4是从原理上表示本发明的信号扩增方法的工序顺序的第1例中步骤112的模式图。
图5是从原理上表示本发明的信号扩增方法的工序顺序的第1例中步骤114的模式图。
图6是从原理上表示本发明的信号扩增方法的工序顺序的第1例中步骤116的模式图。
图7是从原理上表示本发明的信号扩增方法的工序顺序的第2例中步骤124的模式图。
图8是从原理上表示本发明的信号扩增方法的工序顺序的第2例中步骤126的模式图。
图9是从原理上表示当靶DNA的变异部位与捕捉用探针的末端不互补时的参考例中步骤200的模式图。
图10是从原理上表示当靶DNA的变异部位与捕捉用探针的末端不互补时的参考例中步骤202的模式图。
图11是从原理上表示当靶DNA的变异部位与捕捉用探针的末端不互补时的参考例中步骤204的模式图。
图12是从原理上表示当靶DNA的变异部位与捕捉用探针的末端不互补时的参考例中步骤206的模式图。
图13是从原理上表示本发明的信号扩增方法的工序顺序的第3例中步骤136的模式图。
图14是从原理上表示本发明的信号扩增方法的工序顺序的第3例中步骤138的模式图。
图15是从原理上表示本发明的信号扩增方法的工序顺序的第4例中步骤146的模式图。
图16是从原理上表示本发明的信号扩增方法的工序顺序的第4例中步骤148的模式图。
图17是从原理上表示本发明的信号扩增方法的工序顺序的第5例中步骤150的模式图。
图18是从原理上表示本发明的信号扩增方法的工序顺序的第5例中步骤152的模式图。
图19是从原理上表示本发明的信号扩增方法的工序顺序的第5例中步骤154的模式图。
图20是从原理上表示本发明的信号扩增方法的工序顺序的第5例中步骤156的模式图。
图21是从原理上表示本发明的信号扩增方法的工序顺序的第6例中步骤160的模式图。
图22是从原理上表示本发明的信号扩增方法的工序顺序的第6例中步骤162的模式图。
图23是从原理上表示本发明的信号扩增方法的工序顺序的第6例中步骤163的模式图。
图24是从原理上表示本发明的信号扩增方法的工序顺序的第6例中步骤164的模式图。
图25是从原理上表示本发明的信号扩增方法的工序顺序的第6例中步骤165的模式图。
图26是从原理上表示本发明的信号扩增方法的工序顺序的第6例中步骤166的模式图。
图27是表示实施例1的结果的照片。
图28是表示实施例2的结果的照片。
具体实施方式
以下根据附图对本发明的实施方式进行说明，由于这些实施方式是作为例子给出的，不言而喻只要是不脱离本发明的技术思想，以各种变形都是可能的。
图1～图6是从原理上表示本发明的信号扩增方法的工序顺序的第1例的模式图。第1例表示靶DNA(10a)的变异部位(11a)与捕捉用探针(12a)的末端(13a)互补的情形。而且第1例是利用使用由彼此互补的3区域构成的、能够自身自集合形成集合体的一对寡核苷酸·探针[即，一对HCP；HCP-1(5’-X-Y-Z-3’)(16a)以及HCP-2(5’-X’-Y’-Z’-3’)(18a)]的PALSAR法的信号扩增方法，该一对HCP(16a，18a)的构成，如图3所示是预先用荧光物质(22)标记的，HCP-1(16a)具有与靶DNA(10a)互补的区域，与捕捉用探针邻接后可与靶DNA(10a)杂交。
就象图1所示的那样，使含有与靶DNA(10a)互补的区域且该靶DNA(10a)的基因变异部位(11a)位于末端(13a)的捕捉用探针(12a)结合在支撑体(14)上，添加靶DNA(10a)(步骤100)。然后如图2所示的那样，捕捉靶DNA(10a)后(步骤102)，如图3所示的那样，使具有与该靶DNA(10a)互补的区域并且可以自身自集合形成集合体的用荧光物质(22)标记的一方的HCP-1(16a)以与捕捉用探针(12a)邻接的形式结合(步骤110)。
由于靶DNA(10a)的变异部位(11a)与捕捉用探针(12a)的末端(13a)互补，如图4所示，通过连接反应，捕捉用探针(12a)与HCP-1(16a)连接(步骤112)。连接反应后，就象图5所示的那样，将靶DNA(10a)除去(步骤114)。图5表示使靶DNA(10a)解离，使HCP-1(16a)连接的捕捉用探针(12a)结合在支撑体(14)的状态。
就象图6所示的那样，加一对HCP(16a，18a)后，通过自集合反应形成自集合体(20a)，可以对信号进行扩增(步骤116)。
图7和图8是从原理上表示本发明的信号扩增方法的工序顺序的第2例的模式图。第2例是表示利用使用了一对HCP(16a，18a)的PALSAR法的信号扩增方法，而且使用了含有与靶DNA(10a)互补的区域并且没有用荧光物质(22)标记的一对HCP(16a，18a)的例子。
与上述的第1例子同样，进行步骤100和步骤102后，使含有与该靶DNA(10a)互补的区域并且可以自身自集合形成集合体的一方的HCP-1(16a)以与捕捉用探针(12a)邻接的形式结合。
通过连接反应，使捕捉用探针(12a)与HCP-1(16a)连接后，将靶DNA(10a)除去(步骤120)。加一对HCP(16a，18a)，通过自集合反应形成自集合体(20b)后(步骤122)，就象图7所示的那样，对于形成的自集合体(20b)***嵌入剂(24)(步骤124)，如图8所示可以进行信号扩增(步骤126)。另外，也可以同时进行步骤122和步骤124。
图9～图12是从原理上表示当靶DNA(10b)的变异部位(11b)与捕捉用探针(12a)的末端(13a)不互补时的参考例的模式图。如图9所示那样，捕捉靶DNA(10b)后(步骤200)，如图10所示的那样，使含有与该靶DNA(10b)互补的区域并且可以自身自集合形成集合体的用荧光物质(22)标记的一方的HCP-1(16a)以与捕捉用探针(12a)邻接的形式结合(步骤202)。然后如图11所示，由于靶DNA(10b)的变异部位(11b)与捕捉用探针(12a)的末端(13a)没有互补，所以不能进行连接反应(步骤204)，如图12所示那样，如果使靶DNA(10b)解离(步骤206)，变成了只有捕捉用探针(12a)结合在支撑体(14)的状态，然后通过加一对HCP(16a，18a)形成的自集合体(20a)，由于不能与捕捉用探针(12a)结合，通过清洗等被除去，所以不能进行信号扩增。
图13和图14是从原理上表示本发明的信号扩增方法的工序顺序的第3例的模式图。第3例是表示靶DNA(10a)的变异部位(11a)与捕捉用探针(12a)的末端(13a)互补的情形。另外第3例是表示下述的例子，即利用使用了自身形成二聚体的一对二聚体形成用探针[形成二聚体用探针-1，2(5’-X-a-b-3’，5’-d-a’-e-3’)(26，28)]以及可对由该二聚体形成用探针形成的二聚体进行交联的一对交联探针[交联探针-1，2(5’-d’-b’-3’，5’-X’-e’-3’)(30，32)]的PALSAR法的信号扩增方法，使用预先用荧光物质(22)标记的一对二聚体形成用探针(26，28)形成的二聚体的情况。另外该二聚体形成用探针-1(26)的构成，是含有与靶DNA(10a)互补的区域，而且与捕捉用探针(12a)邻接，能够与靶DNA(10a)进行杂交。
与上述的第1例子同样，进行步骤100和步骤102后，使由含有与该靶DNA(10a)互补的区域并且用荧光物质(22)标记的一对二聚体形成用探针1，2(26，28)形成的二聚体以与捕捉用探针(12a)邻接的形式结合。然后，通过连接反应，将捕捉用探针(12a)与二聚体形成用探针-1(26)连接(步骤132)，使靶DNA(10a)解离后(步骤134)，如图13所示，添加由二聚体形成用探针1，2(26，28)形成的二聚体以及交联探针1，2(30，32)，使上述探针(26，28，30和32)杂交(步骤136)，如图14所示，通过二聚体形成用探针(26，28)和交联探针(30，32)的自集合反应使自集合体(20c)形成，可以使信号扩增(步骤138)。
图15和图16是从原理上表示本发明的信号扩增方法的工序顺序的第4例的模式图。第4例是表示下述的例子，即，利用使用了自身形成二聚体的一对二聚体形成用探针[形成二聚体用探针-1，2(26，28)]以及可对由该二聚体形成用探针形成的二聚体进行交联的一对交联探针(30，32)]的PALSAR法的信号扩增方法，使用由一对二聚体形成用探针形成的二聚体，对二聚体形成用探针(26，28)以及交联探针(30，32)不进行标记的情况。
与上述的第1例子同样，进行步骤100和步骤102后，使由含有与该靶DNA(10a)互补的区域的一对二聚体形成用探针1，2(26，28)形成的二聚体以与捕捉用探针(12a)邻接的形式结合(步骤140)。
通过连接反应，使捕捉用探针(12a)与二聚体形成用探针-1(26)连接后，除去靶DNA(10a)(步骤142)。添加由一对二聚体形成用探针(26，28)形成的二聚体以及一对交联探针(30，32)，通过自集合反应使自集合体(20d)形成后(步骤144)，如图15所示，对于形成的自集合体(20d)***嵌入剂(24)(步骤146)，如图16所示，可以对信号进行扩增(步骤148)。另外，也可以同时进行步骤144和步骤146。
在上述例子中，给出了形成自集合体的寡核苷酸·探针的一个与第1探针为同一个时的例子，也不一定非要同一个，也可以使用能够结合第1探针和寡核苷酸·探针中的至少一个的探针。
在上述例子中，虽然使用了预先结合于支撑体的捕捉用探针，但使捕捉用探针与支撑体结合的阶段，只要是在除去靶DNA的阶段之前，无论什么时候都可以，没有特别限定。例如，可以是使捕捉用探针与靶DNA结合后，捕捉用探针、靶DNA、第1探针都结合后，以及连接反应后等。
图17～图20是从原理上表示本发明的信号扩增方法的工序顺序的第5例的模式图。第5例是表示下述的例子，即，同时对多个变异基因进行检测的方法，使用在前端具有各个靶DNA(10e，10f，10g)的互补序列，含有2处HCP的第1探针(34e，34f，34g)和一对HCP(16e，18e)。第1探针的数只需要靶基因的数，在该例子中，由于给出的是3种基因(10e，10f，10g)的例子，所以使用前端区域不同的3种第1探针(34e，34f，34g)。由于第1探针除了前端区域的2区域含有共通的HCP序列，所以不管第1探针种类如何，仅以一对HCP就可以对信号进行扩增。
象图17所示那样，使含有与靶DNA-1(10e)互补的区域而且该靶DNA的基因变异部位(11e)处于末端(13e)、该末端碱基各不相同的4种捕捉用探针(12e)，含有与靶DNA-2(10f)互补的区域而且该靶DNA的基因变异部位(11f)处于末端(13f)、该末端碱基各不相同的4种捕捉用探针(12f)，以及含有与靶DNA-3(10g)互补的区域而且该靶DNA的基因变异部位(11g)处于末端(13g)、该末端碱基各不相同的4种捕捉用探针(12g)，分别结合于支撑体(14)上(步骤150)。另外，在图17～图20中，只是末端不同的捕捉用探针以及该末端分别用同一符号表示。然后，如图18所示那样，使靶DNA(10e、10f以及10g)以及第一探针(34e、34f以及34g)按照相应捕捉用探针(12e，12f，12g)结合(步骤152)。即使当变异部位不能互补时，除去末端部分之外也可以同样进行结合，但在该图中只给出了末端部分互补的情形。然后如图19所示，连接反应后除去靶DNA(10e，10f，10g)以及未反应的探针(步骤154)。
如图20所示那样，添加一对HCP(16e，18e)，使自集合体(20e)形成，可以对信号进行扩增(步骤156)。另外，在第5例中，虽然给出了就有关基因变异部位的所有4碱基进行分析的情形，但捕捉用探针末端的碱基可以根据需要适当选择，没有特别限定。
图21～图26是从原理上表示本发明的信号扩增方法的工序顺序的第6例的模式图。第6系具有在2处进行连接反应、使HCP-1(16h)和捕捉用探针(12h)结合于第1探针(34h)的特征。HCP-1(16h)、第1探针(34h)、捕捉用探针(12h)，按照彼此邻接那样设计。对多个变异基因同时进行检测时，与第5例同样，除了将第1探针的前端区域做成与各个靶DNA互补外，对于第2探针、一对HCP，不管种类如何，都可以使用共通的寡核苷酸·探针。
图21表示第1探针(34h)、第2探针(36)、靶DNA(10h)以及固定于支撑体(14)上的捕捉用探针(12h)(步骤160)。第1探针(34h)含有与靶DNA(10h)互补的序列，而且含有1处HCP-1(16h)的序列，第2探针(36)含有2处与HCP-2(18h)相同序列。就象图22所示的那样，第1探针(34h)与第2探针(36)和靶DNA(10h)两者进行杂交(步骤162)。如图23所示，添加HCP-1(16h)进行杂交，通过HCP-1(16h)和第2探针(36)进行杂交，HCP-1(16h)和第1探针(34h)邻接。其结果第1探针(34h)的两末端变成分别与捕捉用探针(12h)和HCP-1(16h)邻接的状态(步骤163)。而步骤162和步骤163也可以同时进行。如图24、图25所示，当捕捉用探针(12h)的末端部分(13h)与靶DNA(10h)的变异部位(11h)互补时，连接反应后(步骤164)，通过除去靶DNA(10h)、第2探针(36)以及未反应探针，捕捉用探针(12h)、第1探针(34h)、HCP-1(16h)变成了连接成一条链的状态(步骤165)。如图26所示，通过加一对HCP(16h，18h)，自集合体(20h)形成(步骤166)，可以对信号进行扩增。
在本发明的信号扩增方法中，对于一对寡核苷酸·探针预先附加作为用于检测的标记物质，如125I或32P等放射性同位素，异羟基洋地黄毒苷配基或吖啶鎓·酯等发光物质或用于利用Cy3·Cy5等荧光物质、4-methylunbelliferyl phosphate等荧光物质的生物素等，用于利用荧光共振能量转移(FRET)的供体荧光色素和受体荧光色素，也可以检测靶DNA。
通过添加具有与核酸结合性质的色素，也可以检测靶DNA。如图8和图16所示，使用象嵌入剂那样的具有与核酸结合的性质的荧光物质，检测靶DNA是优选的。作为荧光物质，只要是具有与核酸结合的性质的荧光物质，并没有特别限定，例如，可以使用SYBR Green I stain、SYBR GreenII stain、SYBR Green Gold stain、Vista Green stain、Gelstar stain、Radlant Redstain、PicoGreen、RiboGreen、011Green、Hoechst 33258(Bis-Benzimide)、Propidium Iodide、YO-PRO-1 Iodide、YO-PRO-3 Iodide(以上、MolecularProbe公司生产)、溴化乙锭、Distamycin A、TOTO、Psoralen、吖啶鎓橙(Acridine Orange)、AOAO(homodimer)等。
构成上述的寡核苷酸·探针的核酸，通常可以由DNA或RNA构成，但只要是核酸类似物就可以。作为核酸类似物，例如肽核酸(PNA、参照例如国际公开第92/20702号单行本)或Locked Nucleic Acid(LNA，参照例如Koshkin AA et al.Tetrahedron 1998.54，3607-3630.、Koshkin AA etal.J.Am.Chem.Soc.1998.120，13252-13253.、以及Wahlestedt C etal.PNAS.2000.97，5633-5638.)。另外，一对寡核苷酸·探针，通常可以由同种类核酸构成，但即使是例如DNA探针和RNA探针构成一对也可以。即探针的核酸种类可以从DNA、RNA或核酸类似物(例如PNA或LNA等)选择。另外，在一个探针内的核酸组成不需要只是由一种、例如只是由DNA构成，根据需要，也可以使用例如由DNA和RNA构成的寡核苷酸·探针(嵌合探针)，都包括在本发明中。
本发明中的靶基因测定用样品，可以使用可能含有该核酸的样品。靶基因可以是从样品经适当制备或分离的基因，没有特别限定。例如，来自血液、血清、尿、粪便、脑脊髓液、组织液、细胞培养物等生物体的样品、病毒、细菌、霉菌等的含有或可能感染的样品等。另外，也可以使用通过众所周知方法对样品中的靶基因进行扩增的核酸。
另外，在图中，前端尖角部分表示3’末端，而起始端黑圆标记表示5’末端。
(实施例)
以下给出实施例，进一步对本发明进行说明，由于这些实施例是给出的例子，不言而喻不应当作为限定地解释。
(实施例1)
1.目的
使用PALSAR法尝试根据变异末端部位的碱基不同进行变异基因的检测。
2.材料
以下给出了实施例中使用的寡核苷酸·探针的碱基序列。
(1)捕捉用探针
CP-1-A：5’(氨基)-GG GGAAGAGCAGAGATATACGT A-3’
CP-1-T：5’(氨基)-GG GGAAGAGCAGAGATATACGT T-3’
CP-1-G：5’(氨基)-GG GGAAGAGCAGAGATATACGT G-3’
CP-1-C：5’(氨基)-GG GGAAGAGCAGAGATATACGT C-3’
(2)靶基因-1(以Hemochromatosis基因的碱基序列为基础合成。变异部位(845位氨基酸)用下划线表示。)
 靶基因-1-T：
5’-GGC CTGGGTGCTCCACCTGG  TACGTATATCTCTGCTCTTCC-3’
靶基因-1-A：
5’-GGC CTGGGTGCTCCACCTGG  AACGTATATCTCTGCTCTTCC-3’
靶基因-1-C：
5’-GGC CTGGGTGCTCCACCTGG  CACGTATATCTCTGCTCTTCC-3’
靶基因-1-G：
5’-GGC CTGGGTGCTCCACCTGG  GACGTATATCTCTGCTCTTCC-3’
(3)第1探针
第1探针-1a：5’(磷酸化)-CCAGGTGGAGCACCCAG
CATATGTAGCAGAGCGTAAGTCATGTCCACC-3’(Alexa532标记)
(4)HCP
HCP-1-1：
5’(Cy3标记)-CCAGGTGGAGCACCCA GCATATGTAGCAGAGC GTAAGTCATGTCCACC-3’
HCP-1-2：
5’(Cy3标记)-TGGGTGCTCCACCTGG GCTCTGCTACATATGC GGTGGACATGACTTAC-3’
作为杂交溶液，制备[最终浓度6×SSC、0.1mg/mL鲑的***DNA、5×Denhard溶液、0.2％SDS]。
作为固定捕捉用探针的基盘，使用氨基修饰寡DNA固定微阵列用涂敷载玻片(MATSUNAMI GLASS公司生产)，作为点印机使用DNA微阵列32针型(Greiner bio-one公司生产)。
3.方法
3-1.载玻片的制作
a)捕捉用探针的点印
将各个捕捉用探针(100pmol/μl)与点印溶液(MATSUNAMI GLASS公司生产)等量混合，制备4种探针溶液。将得到的探针溶液按照N＝4那样点印于载玻片上。当点印不同的探针溶液时，用灭菌水、以及冷乙醇将针洗净风干。点印后的载玻片放入湿润箱，避光静置过夜。
b)捕捉用探针的固定
染色盒中分别准备封闭液(MATSUNAMI GLASS公司生产)1份、灭菌水2份、冷乙醇1份，依次将点印后的载玻片于封闭液浸20分钟、各灭菌水3分钟、冷乙醇3分钟，固定后风干，做成载玻片。
3-2.检测
a)杂交反应
将各个靶基因按照各30pmol(30μL)添加到4组杂交溶液中，加第1探针30pmol(30μL)。使于95℃热解离2分钟的各个溶液25μL在固定了上述捕捉用探针的载玻片上的槽内于4℃下反应2小时，使捕捉用探针、靶基因、第1探针杂交。反应后的玻片用2×SSC+0.1％SDS溶液洗2次、用1×SSC溶液洗1次、0.2×SSC溶液洗1次，然后使其风干。
b)连接反应以及碱变性
连接酶使用耐热性连接酶(Tth DNA ligase)。使用该连接酶附带的缓冲液(buffer)，在液量30μL中添加连接酶(30U)，使该溶液的25μL于槽内反应。反应条件设定为65℃、15分钟。
连接反应后，将载玻片用0.2×SSC溶液轻轻洗净，于0.25M NaOH溶液中进行10分钟碱处理，除去未反应探针以及剩余探针。另外，在NaOH溶液的中和中使用0.25M HCl溶液。变性后的玻片用2×SSC+0.1％SDS溶液洗2次、用1×SSC溶液洗1次、0.2×SSC溶液洗1次，然后使其风干。
c)自集合体形成反应
向杂交溶液中按照最终浓度1pmol/μL添加5’末端分别进行Cy3标记的一对HCP(HCP-1-1和HCP-1-2)。使于95℃热解离2分钟的该溶液25μL在碱变性后洗净风干的载玻片上的槽内于68℃下反应2小时，使自集合体形成。反应后的玻片用2×SSC+0.1％SDS溶液洗2次、用1×SSC溶液洗1次、0.2×SSC溶液洗1次后风干的载玻片上的Cy3的荧光用荧光显微镜观察。结果如图27所示。
就象图27所示的那样，只有靶基因的变异部位与捕捉用探针互补时，信号被扩增。
(实施例2)
1.目的
进行12种基因中的多通路(multiplex)检测的研究。
2.材料
以下给出了实施例2中使用的寡核苷酸·探针的碱基序列。
(1)捕捉用探针
CP-1-G：与实施例1的CP-1-G相同。
CP-1-A：与实施例1的CP-1-A相同。
CP-2-T：5’(氨基)-GCGCGGACATGGAGGACGTG T-3’
CP-2-C：5’(氨基)-GCGCGGACATGGAGGACGTGC-3’
CP-3-C：5’(氨基)-ATGCCGATGACCTGCAGAAGC-3’
CP-3-T：5’(氨基)-ATGCCGATGACCTGCAGAAGT-3’
CP-4-G：5’(氨基)-CTTGAATTCCAAGAGCACACG-3’
CP-4-A：5’(氨基)-CTTGAATTCCAAGAGCACACA-3’
CP-5-C：5’(氨基)-GGAGAAGGTGTCTGCGGGAGC-3’
CP-5-T：5’(氨基)-GGAGAAGGTGTCTGCGGGAGT-3’
CP-6-A：5’(氨基)-TGCTGGCTGAAATGGCAATGA-3’
CP-6-G：5’(氨基)-TGCTGGCTGAAATGGCAATGG-3’
CP-7-A：5’(氨基)-TGTTCTGGGTACTACAGCAGA-3’
CP-7-G：5’(氨基)-TGTTCTGGGTACTACAGCAGG-3’
CP-8-C：5’(氨基)-TGGATGATTTGATGCTGTCCC-3’
CP-8-T：5’(氨基)-TGGATGATTTGATGCTGTCCT-3’
CP-9-G：5’(氨基)-AATGCCAGAGGCTGCTCCCCG-3’
CP-9-C：5’(氨基)-AATGCCAGAGGCTGCTCCCCC-3’
CP-10-C：5’(氨基)-AGCTGTTCGTGTTCTATGATC-3’
CP-10-G：5’(氨基)-AGCTGTTCGTGTTCTATGATG-3’
CP-11-G：5’(氨基)-ACTTGTGGTAGTTGGAGCTGG-3’
CP-11-T：5’(氨基)-ACTTGTGGTAGTTGGAGCTGT-3’
CP-12-A：5’(氨基)-TATTCTCGACACAGCAGGTCA-3’
CP-12-T：5’(氨基)-TATTCTCGACACAGCAGGTCT-3’
(2)第1探针
第1探针1b：
5’(磷酸化)-CCAGGTGGAGCACCCAGGCC GAACTATGCCGATAACCGTGGTATAGTACGCTTGCACGTG CCCGTACATGCGTTGTAATG-3’
第1探针2：
5’(磷酸化)-GCGGCCGCCTGGTGCAGTAC GAACTATGCCGATCCGTGGTATAGTACGCTTGCACGTG CCCGTACATGCGTTGTAATG-3’
第1探针3：
5’(磷酸化)-GCCTGGCAGTGTACCAGGCC GAACTATGCCGATAACCGTGGTATAGTACGCTTGCACGTG CCCGTACATGCGTTGTAATG-3’
第1探针4：
5’(磷酸化)-GTCTTCAGTGAAGCTGCAGG GAACTATGCCGATAACCGTGGTATAGTACGCTTGCACGTG CCCGTACATGCGTTGTAATG-3’
第1探针5：
5’(磷酸化)-CGATTTCATCATCACGCAGC GAACTATGCCGATAACCGTGGTATAGTACGCTTGCACGTG CCCGTACATGCGTTGTAATG-3’
第1探针6：
5’(磷酸化)-AAGTTGAACTAGCTAGAATG GAACTATGCCGATAACCGTGGTATAGTACGCTTGCACGTG CCCGTACATGCGTTGTAATG-3’
第1探针7：
5’(磷酸化)-AGGGTATGCGGAAGCGAGCA GAACTATGCCGATAACCGTGGTATAGTACGCTTGCACGTG CCCGTACATGCGTTGTAATG-3’
第1探针8：
5’(磷酸化)-CGGACGATATTGAACAATGG GAACTATGCCGATAACCGTGGTATAGTACGCTTGCACGTG CCCGTACATGCGTTGTAATG-3’
第1探针9：
5’(磷酸化)-CGTGGCCCCTGCACCAGCAG GAACTATGCCGATAACCGTGGTATAGTACGCTTGCACGTG CCCGTACATGCGTTGTAATG-3’
第1探针10：
5’(磷酸化)-ATGAGAGTCGCCGTGTGGAG GAACTATGCCGATAACCGTGGTATAGTACGCTTGCACGTG CCCGTACATGCGTTGTAATG-3’
第1探针11：
5’(磷酸化)-TGGCGTAGGCAAGAGTGCCT GAACTATGCCGATAACCGTGGTATAGTACGCTTGCACGTG CCCGTACATGCGTTGTAATG-3’
第1探针12：
5’(磷酸化)-AGAGGAGTACAGTGCAATGA GAACTATGCCGATAACCGTGGTATAGTACGCTTGCACGTG CCCGTACATGCGTTGTAATG-3’
(3)靶基因
靶基因-3(与3’侧区域CP-3-T互补)：
5’-GGCCTGGTACACTGCCAGGC  ACTTCTGCAGGTCATCGGCAT-3’
靶基因-6(与3’侧区域CP-6-A互补)：
5’-CATTCTAGCTAGTTCAACTT  TCATTGCCATTTCAGCCAGCA-3’
靶基因-7(与3’侧区域CP-7-G互补)：
5’TGCTCGCTTCCGCATACCCT  CCTGCTGTAGTACCCAGAACA-3’
靶基因-9(与3’侧区域CP-9-G互补)：
5’-CTGCTGGTGCAGGGGCCACG  CGGGGAGCAGCCTCTGGCATT-3’
靶基因-10(与3’侧区域CP-10-C互补)：
5’-CTCCACACGGCGACTCTCAT  GATCATAGAACACGAACAGCT-3’
靶基因-12(与3’侧区域CP-12-T互补)：
5’-TCATTGCACTGTACTCCTCT  AGACCTGCTGTGTCGAGAATA-3’
(4)HCP
HCP-2-1：
5’(Cy3标记)-GAACTATGCCGATAACCGTG GTATAGTACGCTTGCACGTG CCCGTACATGCGTTGTAATG-3’
HCP-2-2：
5’(Cy3标记)-CACGGTTATCGGCATAGTTC CACGTGCAAGCGTACTATACCATTACAACGCATGTACGGG-3’
而上述捕捉用探针、第1探针的3’侧区域以及靶基因是分别以下述基因的碱基序列为基础合成的。
Hemochromatosis基因：CP-1以及第1探针-1(变异部位845位碱基)，CP-10、第1探针-10以及靶基因-10(变异部位187位碱基)、ApolipoproteinE基因：CP-2以及第1探针-2(变异部位112位氨基酸)，CP-3、第1探针-3以及靶基因-3(变异部位158位氨基酸)、ApolipoproteinB100基因：CP-4以及第1探针-4，Methylenetetrahydrofolate reductase基因：CP-5以及第1探针-5，MediumChain Acyl-CoenzymeA Dehydrogenase基因：CP-6、第1探针-6以及靶基因-6、Angiotensinogen基因：CP-7、第1探针-7、p53基因：CP-8以及第1探针-8(变异部位第47位氨基酸)，CP-9、第1探针-9以及靶基因-9(变异部位第72位氨基酸)，KRAS基因：CP-11以及第1探针-11(变异部位12位氨基酸)，CP-12以及第1探针-12(变异部位61位氨基酸)。
杂交溶液、载玻片以及点印机使用与实施例1同样的溶液和机器。
3.方法
3-1.载玻片的制作
将各个捕捉用探针(CP100pmol/μl)与点印溶液(MATSUNAMIGLASS公司生产)等量混合，制备24种探针溶液。将该探针溶液按照N＝1那样以12基因份、点印24处于载玻片上。当点印不同的探针溶液时，用灭菌水、以及冷乙醇将针洗净风干。点印后的载玻片放入湿润箱，避光静置过夜。
然后与实施例1同样进行捕捉用探针的固定，制作载玻片。
3-2.检测
将6种靶基因按照各30pmol(30μL)添加到杂交溶液中，再加所有12种第1探针各30pmol(30μL)。使于95℃热解离2分钟的各个溶液25μL在固定了24个上述捕捉用探针的载玻片上的槽内于42℃下反应2小时，使捕捉用探针靶基因、第1探针杂交。反应后的玻片用2×SSC+0.1％SDS溶液洗2次、用1×SSC溶液洗1次、0.2×SSC溶液洗1次，然后使其风干。
然后，除了作为HCP使用HCP-2-1和HCP-2-2以外，与实施例1同样，进行连接反应、碱处理以及自集合体形成反应，通过荧光显微镜观察载玻片上的荧光。结果如图28所示。
就象图28所示的那样，只有靶基因的变异部位与捕捉用探针互补时，信号被扩增。
产业上利用的可能性
如上所述，根据本发明可以提供一种用于变异基因的检测的信号扩增方法，所述方法，通过PALSAR法使DNA芯片上的变异基因的检测灵敏度提高，更有效地确立信号扩增，再通过对在PALSAR法中使用的寡核苷酸·探针的设计想办法，能够简便完成检测。
                             序列表
序列表
<110>卫材株式会社
<120>用于变异基因检测的信号扩增方法
<130>76422-PCT-CN
<140>PCT/JP2004/002007
<141>2004-02-20
<150>JP2003-044859
<151>2003-02-21
<160>53
<210>1
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)
<223>连接在5’末端的氨基
<220>
<223>人工序列的描述：CP-1-A
<400>1
ggggaagagc agagatatac gta                                                 23
<210>2
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)
<223>连接在5’末端的氨基
<220>
<223>人工序列的描述：CP-1-T
<400>2
ggggaagagc agagatatac gtt                                                 23
<210>3
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)
<223>连接在5’末端的氨基
<220>
<223>人工序列的描述：CP-1-G
<400>3
ggggaagagc agagatatac gtg                                                 23
<210>4
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)
<223>连接在5’末端的氨基
<220>
<223>人工序列的描述：CP-1-C
<400>4
ggggaagagc agagatatac gtc                                            23
<210>5
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：靶基因-1-T
<400>5
ggcctgggtg ctccacctgg tacgtatatc tctgctcttc c                        41
<210>6
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：靶基因-1-A
<400>6
ggcctgggtg ctccacctgg aacgtatatc tctgctcttc c                        41
<210>7
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：靶基因-1-C
<400>7
ggcctgggtg ctccacctgg cacgtatatc tctgctcttc c                        41
<210>8
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：靶基因-1-G
<400>8
ggcctgggtg ctccacctgg gacgtatatc tctgctcttc c                        41
<210>9
<211>48
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)
<223>连接在5’末端的磷酸酯基
<220>
<223>人工序列的描述：primary probe-1a
<400>9
ccaggtggag cacccagcat atgtagcaga gcgtaagtca tgtccacc                 48
<210>10
<211>48
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：HCP-1-1
<400>10
ccaggtggag cacccagcat atgtagcaga gcgtaagtca tgtccacc  48
<210>11
<211>48
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：HCP-1-2
<400>11
tgggtgctcc acctgggctc tgctacatat gcggtggaca tgacttac 48
<210>12
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)
<223>连接在5’末端的氨基
<220>
<223>人工序列的描述：CP-2-T
<400>12
gcgcggacat ggaggacgtg t                                                    21
<210>13
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)
<223>连接在5’末端的氨基
<220>
<223>人工序列的描述：CP-2-C
<400>13
gcgcggacat ggaggacgtg c                                                    21
<210>14
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)
<223>连接在5’末端的氨基
<220>
<223>人工序列的描述：CP-3-C
<400>14
atgccgatga cctgcagaag c                                                    21
<210>15
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)
<223>连接在5’末端的氨基
<220>
<223>人工序列的描述：CP-3-T
<400>15
atgccgatga cctgcagaag t                                                    21
<210>16
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)
<223>连接在5’末端的氨基
<220>
<223>人工序列的描述：CP-4-G
<400>16
cttgaattcc aagagcacac g                                                    21
<210>17
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)
<223>连接在5’末端的氨基
<220>
<223>人工序列的描述：CP-4-A
<400>17
 cttgaattcc aagagcacac a                                                   21
<210>18
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)
<223>连接在5’末端的氨基
<220>
<223>人工序列的描述：CP-5-C
<400>18
 ggagaaggtg tctgcgggag c                                                   21
<210>19
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)
<223>连接在5’末端的氨基
<220>
<223>人工序列的描述：CP-5-T
<400>19
ggagaaggtg tctgcgggag t                                                    21
<210>20
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)
<223>连接在5’末端的氨基
<223>人工序列的描述：CP-6-A
<400>20
tgctggctga aatggcaatg a                                                    21
<210>21
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)
<223>连接在5’末端的氨基
<220>
<223>人工序列的描述：CP-6-G
<400>21
tgctggctga aatggcaatg g                                                    21
<210>22
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)
<223>连接在5’末端的氨基
<220>
<223>人工序列的描述：CP-7-A
<400>22
tgttctgggt actacagcag a                                                    21
<210>23
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)
<223>连接在5’末端的氨基
<220>
<223>人工序列的描述：CP-7-G
<400>23
tgttctgggt actacagcag g                                                    21
<210>24
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)
<223>连接在5’末端的氨基
<220>
<223>人工序列的描述：CP-8-C
<400>24
tggatgattt gatgctgtcc c                                                    21
<210>25
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)
<223>连接在5’末端的氨基
<220>
<223>人工序列的描述：CP-8-T
<400>25
tggatgattt gatgctgtcc t                                                    21
<210>26
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)
<223>连接在5’末端的氨基
<220>
<223>人工序列的描述：CP-9-G
<400>26
aatgccagag gctgctcccc g                                                    21
<210>27
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)
<223>连接在5’末端的氨基
<220>
<223>人工序列的描述：CP-9-C
<400>27
aatgccagag gctgctcccc c                                                    21
<210>28
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)
<223>连接在5’末端的氨基
<220>
<223>人工序列的描述：CP-10-C
<400>28
agctgttcgt gttctatgat c                                                    21
<210>29
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)
<223>连接在5’末端的氨基
<220>
<223>人工序列的描述：CP-10-G
<400>29
agctgttcgt gttctatgat g                                                    21
<210>30
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)
<223>连接在5’末端的氨基
<220>
<223>人工序列的描述：CP-11-G
<400>30
acttgtggta gttggagctg g                                                   21
<210>31
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)
<223>连接在5’末端的氨基
<220>
<223>人工序列的描述：CP-11-T
<400>31
acttgtggta gttggagctg t                                                   21
<210>32
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)
<223>连接在5’末端的氨基
<220>
<223>人工序列的描述：CP-12-A
<400>32
tattctcgac acagcaggtc a                                                   21
<210>33
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)
<223>连接在5’末端的氨基
<220>
<223>人工序列的描述：CP-12-T
<400>33
tattctcgac acagcaggtc t                                                   21
<210>34
<211>80
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)
<223>连接在5’末端的磷酸酯基
<220>
<223>人工序列的描述：primary probe-1b
<400>34
ccaggtggag cacccaggcc gaactatgcc gataaccgtg gtatagtacg cttgcacgtg 60
cccgtacatg cgttgtaatg                                           80
<210>35
<211>80
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)
<223>连接在5’末端的磷酸酯基
<220>
<223>人工序列的描述：primary probe-2
<400>35
gcggccgcct ggtgcagtac gaactatgcc gataaccgtg gtatagtacg cttgcacgtg 60
cccgtacatg cgttgtaatg                                          80
<210>36
<211>80
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)
<223>连接在5’末端的磷酸酯基
<220>
<223>人工序列的描述：primary probe-3
<400>36
gcctggcagt gtaccaggcc gaactatgcc gataaccgtg gtatagtacg cttgcacgtg 60
cccgtacatg cgttgtaatg                                           80
<210>37
<211>80
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)
<223>连接在5’末端的磷酸酯基
<220>
<223>人工序列的描述：primary probe-4
<400>37
gtcttcagtg aagctgcagg gaactatgcc gataaccgtg gtatagtacg cttgcacgtg 60
cccgtacatg cgttgtaatg                                           80
<210>38
<211>80
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)
<223>连接在5’末端的磷酸酯基
<220>
<223>人工序列的描述：primary probe-5
<400>38
cgatttcatc atcacgcagc gaactatgcc gataaccgtg gtatagtacg cttgcacgtg 60
cccgtacatg cgttgtaatg                                80
<210>39
<211>80
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)
<223>连接在5’末端的磷酸酯基
<220>
<223>人工序列的描述：primary probe-6
<400>39
aagttgaact agctagaatg gaactatgcc gataaccgtg gtatagtacg cttgcacgtg 60
cccgtacatg cgttgtaatg                                          80
<210>40
<211>80
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)
<223>连接在5’末端的磷酸酯基
<220>
<223>人工序列的描述：primary probe-7
<400>40
agggtatgcg gaagcgagca gaactatgcc gataaccgtg gtatagtacg cttgcacgtg 60
cccgtacatg cgttgtaatg                                            80
<210>41
<211>80
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)
<223>连接在5’末端的磷酸酯基
<220>
<223>人工序列的描述：primary probe-8
<400>41
cggacgatat tgaacaatgg gaactatgcc gataaccgtg gtatagtacg cttgcacgtg 60
cccgtacatg cgttgtaatg                                           80
<210>42
<211>80
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)
<223>连接在5’末端的磷酸酯基
<220>
<223>人工序列的描述：primary probe-9
<400>42
cgtggcccct gcaccagcag gaactatgcc gataaccgtg gtatagtacg cttgcacgtg 60
cccgtacatg cgttgtaatg                                           80
<210>43
<211>80
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)
<223>连接在5’末端的磷酸酯基
<220>
<223>人工序列的描述：primary probe-10
<400>43
atgagagtcg ccgtgtggag gaactatgcc gataaccgtg gtatagtacg cttgcacgtg 60
cccgtacatg cgttgtaatg                                           80
<210>44
<211>80
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)
<223>连接在5’末端的磷酸酯基
<220>
<223>人工序列的描述：primary probe-11
<400>44
tggcgtaggc aagagtgcct gaactatgcc gataaccgtg gtatagtacg cttgcacgtg 60
cccgtacatg cgttgtaatg                                            80
<210>45
<211>80
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)
<223>连接在5’末端的磷酸酯基
<220>
<223>人工序列的描述：primary probe-12
<400>45
agaggagtac agtgcaatga gaactatgcc gataaccgtg gtatagtacg cttgcacgtg 60
cccgtacatg cgttgtaatg                                            80
<210>46
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：靶基因-3
<400>46
ggcctggtac actgccaggc acttctgcag gtcatcggca t                        41
<210>47
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：靶基因-6
<400>47
cattctagct agttcaactt tcattgccat ttcagccagc a                        41
<210>48
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：靶基因-7
<400>48
tgctcgcttc cgcataccct cctgctgtag tacccagaac a                        41
<210>49
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：靶基因-9
<400>49
ctgctggtgc aggggccacg cggggagcag cctctggcat t                        41
<210>50
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：靶基因-10
<400>50
ctccacacgg cgactctcat gatcatagaa cacgaacagc t                        41
<210>51
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：靶基因-12
<400>51
tcattgcact gtactcctct agacctgctg tgtcgagaat a                        41
<210>52
<211>60
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：HCP-2-1
<400>52
gaactatgcc gataaccgtg gtatagtacg cttgcacgtg cccgtacatg cgttgtaatg 60
<210>53
<211>60
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：HCP-2-2
<400>53
cacggttatc ggcatagttc cacgtgcaag cgtactatac cattacaacg catgtacggg 60

Claims (17)

1.一种用于变异基因检测的信号扩增方法，其特征在于，包含使用DNA连接酶的连接反应以及寡核苷酸形成双链有规则的高级结构的自集合体的自集合反应，使DNA芯片的变异基因的检测灵敏度提高。
2.一种用于变异基因检测的信号扩增方法，其特征在于，包含：
使捕捉用探针和第1探针与靶DNA杂交的第1工序；
当靶DNA的变异部位与该捕捉用探针互补时、通过使用DNA连接酶的连接反应使上述捕捉用探针与上述第1探针连接的第2工序，
使上述靶DNA除去的第3工序，以及
添加多个寡核苷酸·探针、通过该寡核苷酸·探针的自集合反应形成自集合体而使信号扩增的第4工序，
上述捕捉用探针和上述第1探针的碱基序列的构成，要能够在上述第1工序中使上述捕捉用探针的末端位于上述靶DNA的变异部位，而且该末端与上述第1探针以邻接的状态与靶DNA退火，
上述多个寡核苷酸·探针中的至少一个含有与上述第1探针互补的区域。
3.根据权利要求1或2所述的信号扩增方法，其特征在于，上述自集合反应，使用彼此互补的部分由n(n≥3)处数构成的一对寡核苷酸·探针，通过使它们以交错地交叉的方式进行杂交，寡核苷酸自集合，形成双链的自集合体。
4.根据权利要求1或2所述的信号扩增方法，其特征在于，上述自集合反应是如下所述的自集合反应，即，具有下述第1系和第2系，所述第1系是包含多对在将No.1和No.2的一对寡核苷酸的各寡核苷酸分为3′侧区域、中央区域以及5′侧区域3个区域，以各寡核苷酸的中央区域作为彼此互补的碱基序列而形成二聚体探针的同时，以3′侧区域和5′侧区域作为彼此非互补的碱基序列的一对二聚体形成用探针的第1系，
所述第2系是包含多对在将No.3和No.4的一对寡核苷酸的各寡核苷酸分为3′侧区域和5′侧区域2个区域，以各寡核苷酸的3′侧区域以及5′侧区域作为彼此非互补碱基序列的一对交联探针的第2系，
使该交联探针的碱基序列形成为对由该二聚体形成用探针形成的二聚体可进行交联的碱基序列，
通过使该探针杂交，寡核苷酸自集合，形成自集合体。
5.根据权利要求4所述的信号扩增方法，其特征在于，使上述探针的碱基序列形成为分别使
第1系的No.1-寡核苷酸的3′侧区域和第2系的No.3-寡核苷酸的3′侧区域、
第1系的No.2-寡核苷酸的5′侧区域和第2系的No.4-寡核苷酸的5′侧区域、
第2系的No.4-寡核苷酸的3′侧区域和第1系的No.2-寡核苷酸的3′侧区域、
第2系的No.3-寡核苷酸的5′侧区域和第1系的No.1-寡核苷酸的5′侧区域互补的碱基序列。
6.根据权利要求4所述的信号扩增方法，其特征在于，使上述探针的碱基序列形成为分别使
第1系的No.1-寡核苷酸的3′侧区域和第2系的No.3-寡核苷酸的3′侧区域、
第1系的No.2-寡核苷酸的5′侧区域和第2系的No.3-寡核苷酸的5′侧区域、
第1系的No.2-寡核苷酸的3′侧区域和第2系的No.4-寡核苷酸的3′侧区域、
第1系的No.1-寡核苷酸的5′侧区域和第2系的No.4-寡核苷酸的5′侧区域互补的碱基序列。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的信号扩增方法，其特征在于，上述靶DNA使用单链DNA或双链DNA。
8.根据权利要求1～7中任一项所述的信号扩增方法，其特征在于，预先使在上述自集合反应中使用的寡核苷酸的碱基序列形成为与上述第1探针互补的序列。
9.根据权利要求1～8中任一项所述的信号扩增方法，其特征在于，上述捕捉用探针结合在支撑体上。
10.根据权利要求9所述的信号扩增方法，其特征在于，上述支撑体是微滴板型、载玻片型、微粒子型、或导电性基板型的支撑体。
11.根据权利要求1～10中任一项所述的信号扩增方法，其特征在于，对于上述自集合体，通过使标记探针杂交，检测上述自集合体的存在。
12.根据权利要求11所述的信号扩增方法，其特征在于，上述标记探针是用发色系酶、发光系酶、或放射性同位素标记的标记探针。
13.根据权利要求1～10中任一项所述的信号扩增方法，其特征在于，对于上述自集合体，添加具有与核酸结合的性质的荧光物质，通过该荧光物质的光化学上的变化来检测上述自集合体的存在。
14.根据权利要求1～10中任一项所述的信号扩增方法，其特征在于，预先用荧光物质对形成自集合体的寡核苷酸进行标记，通过荧光物质的光化学上的变化来检测上述自集合体的存在。
15.根据权利要求1～10中任一项所述的信号扩增方法，其特征在于，预先用放射性同位素对形成自集合体的寡核苷酸进行标记，通过放射性同位素来检测上述自集合体的存在。
16.根据权利要求1～10中任一项所述的信号扩增方法，其特征在于，预先用发色系酶或发光系酶对形成自集合体的寡核苷酸进行标记，通过光化学上的变化来检测上述自集合体的存在。
17.根据权利要求1～16中任一项所述的信号扩增方法，其特征在于，上述寡核苷酸是由选自DNA、RNA、PNA或LNA中任一个的碱基构成。
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WO (1) WO2004074480A1 (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102304565A (zh) * 2011-04-29 2012-01-04 广州益善生物技术有限公司 一种hfe基因多态性检测特异性引物和液相芯片
CN107075585A (zh) * 2014-10-14 2017-08-18 雅培日本有限公司 具有锁核酸的序列转换和信号扩增dna以及使用其的检测方法

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2006219362B2 (en) * 2005-02-28 2011-08-25 Sekisui Medical Co., Ltd. Assist probes and method of using the same
ATE526402T1 (de) 2005-02-28 2011-10-15 Eisai R&D Man Co Ltd Hilfssonden und verfahren zur verwendung davon
US20090117560A1 (en) * 2005-09-27 2009-05-07 Toshihiko Fujikawa Method of Forming Self Assembly Substance on Microsphere and Method of Detecting Target Analyte
EP1997908A4 (en) * 2006-03-15 2010-09-29 Eisai R&D Man Co Ltd METHOD FOR FORMING A SIGNAL CONDUCTOR POLYMER
US8450058B2 (en) * 2007-08-14 2013-05-28 Eisai R&D Management Co., Ltd. Method of detecting target substance
JP5289315B2 (ja) * 2007-08-14 2013-09-11 エーザイ・アール・アンド・ディー・マネジメント株式会社 標的物質の検出方法
EE201000013A (et) 2010-01-29 2011-10-17 Selfdiagnostics O� Meetod ja kiirtesti seade sihtm„rk-molekuli proovimaterjalist detekteerimiseks
EP2789688A4 (en) 2011-12-09 2015-07-15 Eisai R&D Man Co Ltd METHOD FOR DETECTING NUCLEOTIDE MUTATION AND DETECTION KIT
CN108277260A (zh) * 2018-04-16 2018-07-13 吉林大学 一种检测brafv600e基因突变的方法
JP7161173B2 (ja) * 2018-06-29 2022-10-26 積水メディカル株式会社 ｓｉＲＮＡの定量方法
WO2020054700A1 (ja) * 2018-09-11 2020-03-19 積水メディカル株式会社 オリゴヌクレオチドの検出、または定量方法
EP4060047A4 (en) * 2019-11-14 2023-12-13 Sekisui Medical Co., Ltd. METHOD FOR DETECTING OR QUANTIFYING OLIGONUCLEOTIDES

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4988617A (en) * 1988-03-25 1991-01-29 California Institute Of Technology Method of detecting a nucleotide change in nucleic acids
DK51092D0 (da) 1991-05-24 1992-04-15 Ole Buchardt Oligonucleotid-analoge betegnet pna, monomere synthoner og fremgangsmaade til fremstilling deraf samt anvendelser deraf
CA2182517C (en) * 1994-02-07 2001-08-21 Theo Nikiforov Ligase/polymerase-mediated primer extension of single nucleotide polymorphisms and its use in genetic analysis
US5985557A (en) * 1996-01-24 1999-11-16 Third Wave Technologies, Inc. Invasive cleavage of nucleic acids
US20020150921A1 (en) * 1996-02-09 2002-10-17 Francis Barany Detection of nucleic acid sequence differences using the ligase detection reaction with addressable arrays
EP2574617B1 (en) * 1996-02-09 2016-04-20 Cornell Research Foundation, Inc. Detection of nucleic acid sequence differences using the ligase detection reaction with addressable arrays
US6852487B1 (en) * 1996-02-09 2005-02-08 Cornell Research Foundation, Inc. Detection of nucleic acid sequence differences using the ligase detection reaction with addressable arrays
EP1112378A1 (en) * 1998-07-17 2001-07-04 GeneTag Technology, Inc. Methods for detecting and mapping genes, mutations and variant polynucleotide sequences
US6211111B1 (en) 1998-08-17 2001-04-03 The Dow Chemical Company Activator composition comprising aluminum compound mixture
JP3267576B2 (ja) 1998-11-09 2002-03-18 三光純薬株式会社 プローブ高分子の形成方法
CN1364199B (zh) 2000-03-31 2012-05-09 爱代尔株式会社 探针聚合物制备用探针、探针聚合物的制备方法及其应用
WO2002018642A1 (en) 2000-08-30 2002-03-07 Sanko Junyaku Co., Ltd. Method of detecting gene
KR20040041529A (ko) * 2001-09-28 2004-05-17 산코 준야쿠 가부시키가이샤 Ｄｎａ 칩의 시그널 증폭방법
JPWO2003040367A1 (ja) 2001-11-08 2005-03-03 三光純薬株式会社 遺伝子増幅反応で合成されたオリゴヌクレオチドによる自己集合体の形成方法、自己集合体及び遺伝子の検出方法

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102304565A (zh) * 2011-04-29 2012-01-04 广州益善生物技术有限公司 一种hfe基因多态性检测特异性引物和液相芯片
CN102304565B (zh) * 2011-04-29 2014-03-05 益善生物技术股份有限公司 一种hfe基因多态性检测特异性引物和液相芯片
CN107075585A (zh) * 2014-10-14 2017-08-18 雅培日本有限公司 具有锁核酸的序列转换和信号扩增dna以及使用其的检测方法
CN107075585B (zh) * 2014-10-14 2021-07-20 雅培实验室 具有锁核酸的序列转换和信号扩增dna以及使用其的检测方法

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