CN101052726A - IL－23p40特异性免疫球蛋白衍生蛋白、组合物、方法和用途 - Google Patents

IL－23p40特异性免疫球蛋白衍生蛋白、组合物、方法和用途 Download PDF

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Abstract

新型抗IL－23p40特异性人免疫球蛋白(Ig)衍生蛋白，包括但不限于抗体、融合蛋白和模拟体(mimetibody)、编码抗IL－23p40 Ig衍生蛋白的分离核酸、载体、宿主细胞、转基因动物或植物以及它的制备使用方法，用于治疗组合物、方法和装置。优选抗IL－23p40特异性人Ig衍生蛋白不与IL－12的p40亚基结合，因此不中和IL－12相关的活性。

Description

IL-23p40特异性免疫球蛋白衍生蛋白、组合物、方法和用途
                           发明领域
本发明涉及至少一种IL-23p40特异性人Ig衍生蛋白或它的片段、编码和互补核苷酸、宿主细胞、它的制备和使用方法，包括治疗剂型、给药方法和装置。
                           发明背景
白细胞介素-23(IL-23)为一种因子的名称，此因子由IL-12的p40亚基(IL-12β，IL-12-p40)和另外一种名称为p19的19kDa蛋白组成。p19在结构上涉及IL6、G-CSF和IL-12的p35亚基。象IL-12 p35，IL-23p19不能被分泌为单体，且没有证明其生物学功能。更准确的说，每一个亚基必须和p40配对，由抗原递呈细胞(APC)表达，介导生物学效应。在激活细胞后，树突状细胞分泌活性复合体。小鼠记忆T细胞(CD4(+)CD45 Rb(低))对IL-23应答而发生增殖，但对IL-12不发生应答。人IL23显示出能刺激PHA胚T细胞和记忆T细胞产生γ干扰素(IFNγ)。它也同时诱导这两种细胞发生增殖。人单核细胞衍生的巨噬细胞对病毒感染(副流感病毒而非甲型流感病毒)的应答，产生了IL-23。
在PHA胚T细胞中，IL-23结合IL-12受体的β1亚基而不结合β2亚基，活化了STAT蛋白的一种(STAT-4)。IL-23受体由受体链(称为IL-23R)和IL-12受体的β1亚基组成。人IL-23R基因位于人1号染色体，在150kb的编码IL-12Rβ2的基因内。IL-23活化的信号分子与IL-12的相同：JAK2、Tyk2、STAT-1、STAT-3、STAT-4和STAT-5。与IL-12相比，应答IL-23的SATA-4活化实际上较弱且形成不同的DNA-结合STAT复合体。IL-23R与JAK2组成型结合，并以配体依赖型方式与STAT-3结合。
转基因小鼠中p19的表达导致小鼠矮小(runting)、全身性炎症、不育、在3月龄前死亡。此动物显示出高血清浓度的促炎细胞因子α干扰素和IL1。循环中性粒细胞的数量也有所增加。急性期蛋白质组成型表达。在肝脏中特异性表达p19的动物并没有显出这些异常情况。p19的表达最有可能源于造血细胞，当骨髓移植表达p19的细胞时，导致在转基因动物中观察到相同表型。
具有生物学活性的IL-12以异源二聚体存在，由35(p35)和40(p40)KD 2个亚基共价结合组成。IL-12通过结合到IL-12β1和β2受体蛋白发挥作用，因此在存在这些受体的细胞中诱导信号传导。某些系列证据证明IL-12可诱导健康Th1产生免疫反应，特征为从CD4+T细胞产生IFNγ和IL-2。
IL-12由APC应答许各种病原体而产生。一个实例为原生动物寄生虫Leisllznazia major，其被用作体外模型用于确定T细胞发育相关的因子。抗性小鼠发生Th1反应特征为产生大量的IFNγ。相反，敏感小鼠证明Th2细胞因子的状况最常由IL-4、IL-5和IL-10产物所描述。显示出IL-12可在敏感小鼠中恢复免疫功能，并且在另外的抗性动物中给予抗p40的中和抗体引起疾病发生。这种疾病敏感性的变化与T细胞细胞因子状况的反转有关。因此，在确定Th1分化中IL-12被鉴定为关键性参数。
不合适的Th1反应，以及因此表达IL-12，被认为与许多免疫介导的炎性疾病和紊乱有关，如多发性硬化症、类风湿关节炎、炎性肠病、胰岛素依赖型糖尿病和眼色素层炎。在动物模型中，通过IL-12 p40亚基中和IL-12，显示出改善了免疫介导的炎性疾病。例如，给予重组IL-12加剧了EAE，用抗p40中和抗体治疗抑制了EAE的发病和复发。此外，尽管缺乏其它的促炎细胞因子如IFNγ、TNFα或LTα的小鼠保持敏感性，但IL-12 p40-/-小鼠完全抗EAE。IL-12 p35-/-小鼠对EAE完全敏感，意味着其它p40细胞因子如IL-23引起这种疾病。最近在研究中使用p19-/-小鼠确认了IL-23在EAE和胶原诱导的关节炎(CIA)中的作用。这些动物证明对疾病诱导完全抵抗，类似于p40-/-小鼠。
非人、嵌合体、多克隆(如抗血清)和/或单克隆抗体(Mab)和片段(如它的蛋白水解消化产物)为潜在的疗剂，在一些案例中尝试将其用于治疗某些疾病。然而，当这种包含非人部分的抗体用于人时，会引起免疫反应。这种免疫反应能导致免疫复合物介导的从循环中清除抗体，引起不适合治疗的重复给药，因此降低了患者的治疗利益且限制了Ig衍生蛋白的重复给予。例如，重复给予含有非人部分的抗体可引起血清病和/或过敏反应。为了避免这些和其它的这种问题，采取了许多方法降低这种抗体和其部分的免疫原性，包括本领域所熟知的嵌合和“人源化”。这些方法产生了免疫原性降低的抗体，但具有其它较不希望的性质。
相应地，需要提供抗IL-23p40抗体或其特定部分或变体、核苷酸、宿主细胞、组合物以及它们的制备和使用方法，以克服一个或多个这些问题。
                        发明概述
本发明提供了免疫球蛋白(Ig)衍生蛋白，特异性作用于IL-23的p40亚基并且优选不与IL-12的p40亚基结合(“抗IL-23p40 Ig衍生蛋白”或“IL-23p40 Ig衍生蛋白”)。这种Ig衍生蛋白包括抗体和拮抗剂或受体融合蛋白，通过结合到IL-23的p40亚基阻断IL-23与它的至少一种受体(例如，但不限于IL-23受体和/或IL-12β1受体)结合。优选这种抗IL-23p40 Ig衍生蛋白不结合或不抑制IL-12结合到一种或多种它的受体，例如但不限于IL-12β1受体和/或IL-12β2受体。本发明还提供了这种抗IL-23p40 Ig衍生蛋白的组合物、制剂、方法、装置和用途，包括治疗和诊断用途。
在又一个实施方案中，本发明提供了Ig衍生蛋白，其选择性抑制IL-23有关的活性，还任选不抑制IL-12的特异性活性，该IL-12特异性活性通过IL-12与它的一种或多种受体(例如但不限于，IL-12β1受体或IL-12β2受体)结合介导。
在另一个实施方案中，本发明提供了在抗原递呈细胞(APC)中抑制IL-23活性的Ig衍生蛋白，抗原递呈细胞例如但不限于巨噬细胞、小神经胶质细胞、系膜吞噬细胞、滑膜A细胞、干细胞前体、朗格罕氏细胞、枯否氏细胞、树突状细胞、B细胞等。这种APC可存在于不同的组织中，例如但不限于皮肤、表皮、肝、脾脏、大脑、脊髓、胸腺、骨髓、关节滑液、肾、血液等。这种APC也可被限制在血脑屏障外侧或内侧。
在又一个实施方案中，本发明提供了Ig衍生蛋白，其通过阻断IL-23与它的一种或多种受体结合适合于治疗至少一种与IL-23有关的疾病，并且任选其中Ig衍生蛋白不阻断IL-12与它的一种或多种受体结合。
因此本发明提供了分离的抗IL-23p40人Ig衍生蛋白(Ig衍生蛋白)，包括免疫球蛋白、受体融合蛋白、它的剪切产物和其它特定部分和变体，以及抗IL-23p40 Ig衍生蛋白组合物、编码或互补核苷酸、载体、宿主细胞、组合物、制剂、装置、转基因动物、转基因植物、制备和使用方法，如本文所描述和允许的，与本领域已知的结合。这种抗IL-23p40 Ig衍生蛋白可作为IL-23p40蛋白的拮抗剂，因此用于治疗IL-23p40病变。IL-23p40蛋白包括但不限于IL-23和IL-12，尤其是IL-23和IL-12的p40亚基和IL-12的p35亚基或IL-23的p19亚基。
本发明也提供了至少一种分离的IL-23p40 Ig衍生蛋白，或本文描述的和/或本领域所已知的特定部分或变体。
一方面，本发明提供了分离的核苷酸分子，其包含编码特异性IL23p40 Ig衍生蛋白或特定部分或变体的多核苷酸或与该多核苷酸互补或杂交，所述特定部分或变体包含至少一种它的特异序列、域、部分或变体。本发明还提供包含所述分离IL-23p40 Ig衍生蛋白核苷酸分子的重组载体，含有这种核苷酸和/或重组载体的宿主细胞，以及制备和/或使用这种Ig衍生蛋白核苷酸、载体和/或宿主细胞的方法。
本发明的至少一种Ig衍生蛋白或特定部分或变体结合至少一种IL-23p40蛋白、其亚基、片段、部分或任何组合的至少一种特异性表位。此至少一种表位可包含至少一种Ig衍生蛋白结合域，该结合域包含至少一部分所述蛋白，该表位优选由所述蛋白至少一种细胞外、水溶性、亲水性、外部或胞质部分组成。非限制性实例包括人p40亚基(306氨基酸)SEQ ID NO：1的至少一种以下片段的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个氨基酸：1-10、10-20、20-30、30-40，40-50、50-60、60-70、70-80、80-90、90-100、100-110、110-120、120-130、130-140、140-150、150-160、160-170、170-180、180-190、190-200、200-210、210-220、220-230、230-240、240-250、250-260、260-270、280-290、290-300、300-306、1-7、14-21、29-52、56-73、83-93、96-105、156-175、194-204、208-246、254-273、279-281或289-300。
该至少一种Ig衍生蛋白或特定部分或变体可任选包含至少一种CDR(如重链或轻链可变区的CDR1、CDR2或CDR3)和/或至少一种构架区的至少一种特定部分。该至少一种Ig衍生蛋白或特定部分或变体氨基酸序列还任选包含至少一种特定的置换、***或缺失。
本发明也提供至少一种组合物，包含(a)分离的IL-23p40 Ig衍生蛋白或特定部分或变体的编码核苷酸和/或本文描述的Ig衍生蛋白；和(b)合适的载体或稀释剂。依据已知方法，载体或稀释剂可任选是药物可接受的。此组合物还可任选包含至少一种其它化合物、蛋白或组合物。
本发明还提供至少一种在宿主细胞中表达至少一种IL-23p40 Ig衍生蛋白或特定部分或变体的方法，包括在一定条件下如本文描述的和/或本领域已知的培养宿主细胞，其中至少一种IL-23p40 Ig衍生蛋白或特定部分或变体以可检测或可回收的量表达。
本发明还在方法或组合物中提供至少一种IL-23p40 Ig衍生蛋白、特定部分或变体，按许多不同病症的需要，例如但不限于在相关疾病或治疗之前、之后或期间，当给予治疗有效量时，用于调整、治疗或减少免疫、神经学和有关紊乱的症状，所述紊乱包括但不限于多发性硬化症、类风湿性关节炎、青少年类风湿性关节炎、青少年类风湿性关节炎全身性发病、牛皮癣性关节炎、强直性关节炎、胃溃疡、血清阴性关节病、骨关节炎、炎性肠病、溃疡性结肠炎、***性红斑狼疮、抗磷脂综合症、虹膜睫状体炎/眼色素层炎/视神经炎、特发性肺纤维变性、全身性血管炎/韦格纳肉芽肿病、肉样瘤病、***/输精管切除逆转过程、过敏性/特异反应性疾病、哮喘、过敏性鼻炎、湿疹、过敏性接触性皮炎、过敏性结膜炎、过敏性肺炎、移植、器官移植排斥、移植物抗宿主疾病、全身炎症反应综合症、脓毒病综合症、革兰氏阳性脓毒症、革兰氏阴性脓毒症、培养阴性脓毒症(culture negative sepsis)、真菌脓毒症、中性白细胞缺乏性发热、尿脓毒症、脑膜炎球菌血症、创伤/出血、烧伤、电离射线照射、急性胰腺炎、成人呼吸窘迫综合症、类风湿性关节炎、酒精诱导的肝炎、慢性炎症性病变、肉样瘤病、节段性回肠炎、镰状细胞性贫血、糖尿病、肾病、特异反应性疾病、过敏性反应、过敏性鼻炎、枯草热、全年性鼻炎、结膜炎、子宫内膜异位、哮喘、荨麻疹、全身性过敏性反应、皮炎、恶性贫血、溶血性疾病、血小板减少、任何器官和组织的移植排斥、肾脏移植排斥、心脏移植排斥、肝脏移植排斥、胰腺移植排斥、肺移植排斥、骨髓移植(BMT)排斥、同种移植皮片排异反应、软骨移植排斥、骨移植物排斥、小肠移植排斥、胎儿胸腺植入排斥、甲状旁腺移植排斥、任何器官和组织的异种移植排斥、同种异体移植排斥、抗受体超敏反应、格拉夫斯症、雷诺病、B型胰岛素抗性糖尿病、哮喘、重症肌无力、抗体介导的细胞毒、III型超敏反应、***性红斑狼疮、POEMS综合症(多发性神经病、器官巨大症、内分泌疾病、单克隆丙种球蛋白病和皮肤变化综合症)、多发性神经病、器官巨大症、内分泌疾病、单克隆丙种球蛋白病和皮肤变化综合症、抗磷脂综合症、天疱疮、硬皮病、混合型***病、自发性阿狄森病、糖尿病、慢性活动性肝炎、原发性胆汁性肝硬化、白癜风、血管炎、MI心切开术后综合症、IV型超敏反应、接触性皮炎、过敏性肺炎、同种异体移植物排斥、细胞内生物引起的肉芽肿、药物敏感性、代谢/自发性疾病、威尔逊氏病、血色素沉着症、α1抗胰蛋白酶缺乏症、糖尿病视网膜病、桥本氏甲状腺炎、骨质疏松症、下丘脑-垂体-肾上腺轴评价、原发性胆汁性肝硬化、甲状腺炎、脑脊髓炎、恶病质、囊性纤维化、新生儿慢性肺病、肺慢性阻塞性疾病(COPD)、家族性噬红细胞性淋巴组织细胞增生症、皮肤疾病、牛皮癣、脱毛症、肾病综合症、肾炎、肾小球肾炎、急性肾功能衰竭、血液特析、***、中毒、先兆子痫、okt3治疗、抗cd3治疗、细胞因子疗法、化疗、放射治疗(如，包括但不限于虚弱、贫血、恶质病等)、慢性水杨酸酯中毒、急性或慢性细菌感染、急性或慢性寄生或感染过程、包括细菌、病毒或真菌感染、HIV感染/HIV神经病变、脑膜炎、肝炎(如甲型、乙型或丙型等)、脓毒性关节炎、腹膜炎、肺炎、会厌炎、大肠杆菌0157:h7、溶血性尿毒综合症/血栓溶解性血小板减少性紫癜、疟疾、登革出血热、利什曼病、麻风病、中毒性休克综合症、链球菌肌炎、气性坏疽病、结核分支杆菌、鸟分支杆菌细胞内水肿、卡氏肺囊虫性肺炎、***症性疾病、***/***、军团菌、莱姆病、A型流感、EB病毒、与生命有关的噬血细胞综合症、致命脑膜炎(vital encephalitis)/无菌性脑膜炎、神经变性疾病、多发性硬化症、偏头痛、艾滋病痴呆综合症、脱髓鞘性病如多发性硬化症和急性横贯性脊髓炎；锥体外和小脑疾病如皮质脊髓***损伤；基底核紊乱；运动机能亢进性运功失调如亨廷顿舞蹈症和老年性舞蹈病；药物引起的运动失调如由阻断中枢神经***多巴胺受体的药物诱导的疾病；运动机能减退的运动失调如帕金森病；进行性核上麻痹；小脑结构性损伤；脊髓小脑变性如脊髓性共济失调、弗里德赖希共济失调、小脑皮质变性、多重***退化(Mencel，Dejerine-Thomas，Shi-Drager，and Machado-Joseph)；***紊乱(多神经炎型遗传性运动失调、血β脂蛋白缺乏症(abetalipoprotemia)、共济失调、毛细血管扩张和线粒体多***疾病)；脱髓鞘核紊乱如多发性硬化症、急性横贯性脊髓炎；运动单位紊乱如神经原性肌肉萎缩(前角细胞变性，如肌萎缩性脊髓侧索硬化、婴儿型脊髓性肌萎缩和青少年脊髓性肌萎缩)；阿尔茨海默氏病；中年期唐氏综合症；弥漫性Lewy体疾病；Lewy体型老年痴呆症；韦尼克-科尔萨科夫综合症；慢性酒精中毒；克雅氏病；亚急性硬化性全脑炎、哈-斯病；拳击员痴呆、神经外伤性损伤(如但不限于脊髓损伤、脑损伤、震荡和重复性震荡)、疼痛、炎性痛、自闭症、抑郁、中风、认知功能紊乱、癫痫等，如本领域所已知。
本发明还在方法或组合物中提供至少一种IL-23p40 Ig衍生蛋白、特定部分或变体，按许多不同疾病的需要，例如但不限于有关疾病或治疗之前、之后或期间，当给予治疗有效量时，调整、治疗或减轻细胞、组织、器官、动物或患者中的至少一种IL-23p40疾病的症状，如本领域已知和/或本文描述。
本发明也提供至少一种组合物、装置和/或方法，用于传递治疗或预防有效量的至少一种本发明IL-23p40 Ig衍生蛋白、特定部分或变体。
本发明也提供至少一种分离的IL-23p40 Ig衍生蛋白，其包含至少一个免疫球蛋白互补决定区(CDR)或至少一个配体结合域(LBR)，所述CDR和LBR与至少一种IL-23p40蛋白特异性结合，其中所述IL-23p40 Ig衍生蛋白特异性结合至少一种包含至少1-3个至整个氨基酸序列的表位，所述氨基酸序列选自人IL-23(SEQ ID NO：1的1-306)的p40亚基，例如但不限于SEQ ID NO：1的至少一种以下片段的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个氨基酸：1-10、10-20、20-30、30-40，40-50、50-60、60-70、70-80、80-90、90-100、100-110、110-120、120-130、130-140、140-150、150-160、160-170、170-180、180-190、190-200、200-210、210-220、220-230、230-240、240-250、250-260、260-270、280-290、290-300、300-306、1-7、1 4-21、29-52、56-73、83-93、96-105、156-175、194-204、208-246、254-273、279-281或289-300。在一个优选的实施方案中，抗人IL-23p40 Ig衍生蛋白结合IL-23p40的亲和力至少为10-9M、至少10-10M、至少10-11M或至少10-12M。在另一个实施方案中，人Ig衍生蛋白实质上中和至少一种IL-23p40蛋白或受体的至少一种活性。
本发明也提供至少一种分离的IL-23p40人Ig衍生蛋白编码核苷酸，包含在严格条件下与编码IL-23p40 Ig衍生蛋白的核苷酸杂交的核苷酸或具有至少95％一致性的核苷酸。本发明还提供一种分离的IL-23p40人Ig衍生蛋白，包含由上述这种核苷酸编码的分离的人Ig衍生蛋白。本发明还提供IL-23p40人Ig衍生蛋白编码核苷酸组合物，包含这种分离的核苷酸和载体或稀释剂。本发明还提供包含这种核苷酸的Ig衍生蛋白载体，其中载体还任选包含至少一种启动子，此启动子选自晚期或早期SV40启动子、CMV启动子、HSV tk启动子、pgk(磷酸甘油酸激酶)启动子、人免疫球蛋白启动子或EF-1α启动子。这种载体还可任选包含至少一种选择基因或其部分，选自氨甲蝶呤(MTX)、二氢叶酸还原酶(DHFR)、绿色荧光蛋白(GFP)、新霉素(G418)或谷氨酰氨合成酶(GS)中的至少一种。本发明还包括含有这种分离核苷酸的哺乳动物宿主细胞，任选其中所述宿主细胞选自以下细胞的至少一种：COS-1、COS-7、HEK293、BHK21、CHO、BSC-1、HepG2,653、SP2/0、293、HeLa、骨髓瘤或淋巴瘤细胞或它们的任何衍生细胞、无限增殖化细胞或转化细胞。
本发明也提供至少一种用于生产至少一种IL-23p40人Ig衍生蛋白的方法，包括在体内、体外或原位条件下翻译这种核苷酸，或翻译在严格条件下与其杂交的内源核苷酸，如此表达可检测或可回收量的IL-23p40人Ig衍生蛋白。
本发明也提供至少一种IL-23p40人Ig衍生蛋白组合物，包含至少一种分离的IL-23p40人Ig衍生蛋白和载体或稀释剂，其中所述载体或稀释剂还任选为药物可接受的，和/或还包含至少一种选自以下化合物或蛋白：TNF拮抗剂、抗风湿剂、肌肉松弛药、***、非甾体抗炎药(NSAID)、止痛剂、麻醉剂、镇静剂、局部***、神经肌肉阻滞剂、抗微生物剂、抗牛皮癣剂、皮质类固醇、同化类固醇、IL-23p40药物、矿物质、营养剂、甲状腺剂、维生素、钙有关的激素、止泻剂、镇咳剂、止吐剂、抗溃疡药、缓泻药、抗凝血剂、***、非格司亭、沙格司亭、免疫接种、免疫球蛋白、免疫抑制剂、生长激素、激素替代药物、***受体调节剂、扩瞳药、睫状肌麻痹剂、烷化剂、抗代谢药、有丝***抑制剂、放射药物、抗抑郁药、抗躁狂剂、抗精神病药、抗焦虑剂、***、拟交感神经药、***、多奈哌齐、他克林、哮喘药、β激动剂、吸入类固醇、白三烯抑制剂、甲基黄嘌呤、色甘酸钠、肾上腺素或其类似物、链球菌DNA酶α、细胞因子或细胞因子拮抗剂。
本发明也提供至少一种治疗细胞、组织、器官或动物中IL-23p40疾病的方法，包括将免疫相关或感染相关疾病调节有效量的至少一种IL-23p40人Ig衍生蛋白与所述细胞、组织、器官或动物接触，或给予上述有效量，其中所述动物任选为灵长类动物，任选为猴类或人。此方法还可任选包括其中所述有效量为0.001-100mg/千克所述细胞、组织、器官或动物。这种方法还可包括其中通过至少一种选自以下的模式实现所述接触或所述给予：静脉内、肌内、推注(bolus)、腹膜内、皮下、呼吸作用、吸入、鼻、***、直肠、口腔、舌下、鼻内、皮下和透皮。这种方法还可包括在所述接触或给予之前、同时或之后给予至少一种组合物，所述组合物包含治疗有效量的至少一种选自以下的化合物或蛋白：TNF拮抗剂、抗风湿剂、肌肉松弛剂、***、非甾体抗炎药(NSAID)、止痛剂、麻醉剂、镇静剂、局部***、神经肌肉阻滞剂、抗微生物剂、抗牛皮癣剂、皮质类固醇、同化类固醇、IL-23p40剂、矿物质、营养剂、甲状腺剂、维生素、钙相关的激素、止泻剂、镇咳剂、止吐剂、抗溃疡药、缓泻药、抗凝血剂、***、非格司亭、沙格司亭、免疫接种、免疫球蛋白、免疫抑制剂、生长激素、激素替代药物、***受体调节剂、扩瞳药、睫状肌麻痹剂、烷化剂、抗代谢药、有丝***抑制剂、放射药物、抗抑郁药、抗躁狂剂、抗精神病药、抗焦虑剂、***、拟交感神经药、***、多奈哌齐、他克林、哮喘药、β激动剂、吸入类固醇、白三烯抑制剂、甲基黄嘌呤、色甘酸钠、肾上腺素或其类似物、链球菌DNA酶α、细胞因子或细胞因子拮抗剂。
本发明也提供至少一种医学装置，其包含至少一种IL-23p40人Ig衍生蛋白，其中所述装置适合于通过至少一种以下模式给予或接触至少一种IL-23p40人Ig衍生蛋白，所述模式选自静脉内、肌内、推注、腹膜内、皮下、呼吸作用、吸入、鼻、***、直肠、口腔、舌下、鼻内、皮下或透皮。
本发明也提供了至少一种人免疫球蛋白轻链IL-23p40蛋白，其包含至少一个可变区部分，该可变区包含至少一种本发明的人Ig衍生蛋白片段。
本发明也提供至少一种人免疫球蛋白重链或它的部分，其包含至少一个可变区部分，该可变区包含至少一种IL-23p40人Ig衍生蛋白片段。
本发明也包括至少一种人Ig衍生蛋白，其中所述人Ig衍生蛋白结合与IL-23p40人Ig衍生蛋白相同的表位或抗原区。
本发明也包括至少一种制剂，其包含至少一种IL-23p40人Ig衍生蛋白，和选自无菌水、无菌缓冲水的至少一种、至少一种选自以下的防腐剂：酚、间甲酚、对甲酚、邻甲酚、氯甲酚、苯甲醇、对羟基苯甲酸烷基酯、苯扎氯铵、苄索氯铵、脱氢乙酸钠和硫柳汞或它们在水稀释液中的混合物，其中IL-23p40人Ig衍生蛋白的浓度任选约为0.1mg/ml至约100mg/ml，还包含至少一种等渗剂或生理可接受的缓冲液。
本发明也包括至少一种制剂，其在第一个容器中包含至少一种冻干形式的IL-23p40人Ig衍生蛋白，任选在第二个容器中包含至少一种无菌水、无菌缓冲液或至少一种选自下列的防腐剂：酚、间甲酚、对甲酚、邻甲酚、氯甲酚、苯甲醇、对羟基苯甲酸烷基酯、苯扎氯铵、苄索氯铵、脱氢乙酸钠和硫柳汞或它们在水稀释液中的混合物，其中IL-23p40人Ig衍生蛋白的浓度进一步任选重建为约0.1mg/ml至约500mg/ml，还包含等渗剂，或还包含生理可接受缓冲液。
本发明还提供至少一种治疗至少一种IL-23p40介导的疾病的方法，包括给予需要的患者本发明的制剂。
本发明也提供至少一种人药用制品，包含包装材料和含有至少一种本发明IL-23p40人Ig衍生蛋白溶液或冻干形式的容器，其中所述容器进一步任选为具有塞子的玻璃或塑料容器，用于多次给药，其中所述容器进一步任选为泡壳包装，能被穿孔且用于静脉内、肌内、推注、腹膜内、皮下、呼吸作用、吸入、鼻、***、直肠、口腔、舌下、鼻内、皮下或透皮给药；所述容器为静脉内、肌内、推注、腹膜内、皮下、呼吸作用、吸入、鼻、***、直肠、口腔、舌下、鼻内、皮下或透皮传递装置或***的组件；所述容器为用于静脉内、肌内、推注、腹膜内、皮下、呼吸作用、吸入、鼻、***、直肠、口腔、舌下、鼻内、皮下或透皮的注射器或笔式注射器(pen-injector)装置或***的组件。
本发明还提供至少一种制备本发明至少一种IL-23p40人Ig衍生蛋白制剂的方法，包括将至少一种IL-23p40人Ig衍生蛋白混和入至少一种含有盐水或盐的缓冲液。
本发明也提供至少一种方法用于生产本发明至少一种IL-23p40人Ig衍生蛋白，包括提供能表达可回收量所述人Ig衍生蛋白的宿主细胞、转基因动物、转基因植物或植物细胞，其中所述宿主细胞进一步任选为哺乳动物细胞、植物细胞或酵母细胞；所述转基因动物为哺乳动物；所述转基因哺乳动物选自山羊、母牛、绵羊、马和非人类的灵长类动物。
本发明还提供至少一种表达至少一种本发明人Ig衍生蛋白的转基因动物或植物。
本发明还提供至少一种由本发明方法生产的IL-23p40人Ig衍生蛋白。
本发明还提供至少一种方法用于治疗至少一种IL-23p40介导的疾病，包括给予需要这种调整、治疗或治疗的细胞、组织、器官、动物或患者至少一种(a)有效量的包含至少一种IL-23p40人Ig衍生蛋白的组合物或药物组合物；在前述(a)中给药之前、同时和/或之后，进一步给予至少一种选自以下的免疫相关治疗剂：TNF拮抗剂、抗风湿剂、肌肉松弛剂、***、非甾体抗炎药(NSAID)、止痛剂、麻醉剂、镇静剂、局部麻醉剂、神经肌肉阻滞剂、抗微生物剂、抗牛皮癣剂、皮质类固醇、同化类固醇、神经药物、矿物质、营养剂、甲状腺剂、维生素、钙相关的激素、止泻剂、镇咳剂、止吐剂、抗溃疡药、缓泻药、抗凝血剂、***、非格司亭、沙格司亭、免疫剂、免疫球蛋白、免疫抑制剂、生长激素、激素替代药物、***受体调节剂、扩瞳药、睫状肌麻痹剂、烷化剂、抗代谢药、有丝***抑制剂、放射药物、抗抑郁药、抗躁狂剂、抗精神病药、抗焦虑剂、***、拟交感神经药、***、多奈哌齐、他克林、哮喘药、β激动剂、吸入类固醇、白三烯抑制剂、甲基黄嘌呤、色甘酸钠、肾上腺素或其类似物、链球菌DNA酶α、细胞因子或细胞因子拮抗剂。
本发明还提供任何本文描述的发明，且不限于任何本文提供的具体描述、实施方案或实施例。
                        附图简述
图1A为显示抗IL-23抗体对IL-23特异性的图表。
图1B为显示抗IL-23抗体对IL-23 p40亚基特异性的图表。
图1C为显示抗体对IL-7水平的效果的图表。
图1D为显示抗体对IFNγ水平的效果的图表。
图1E为显示抗体对EAE的临床抑制的图表。
图2A为显示具有临床评分严重性的大脑和脊髓病变相互关系的图表。
图2B为显示抗体的组织病理学等级的图表。
图3A为显示存在抗体时T细胞应答髓鞘碱性蛋白的图表。
图3B为显示存在抗体时IFNγ水平的图表。
图3C为显示存在抗体时IL-17水平的图表。
图3D为显示存在抗体时IL-5水平的图表。
图3E为显示存在抗体时IL-10水平的图表。
                         发明详述
本发明提供免疫球蛋白(Ig)衍生蛋白，其特异性作用于IL-23的p40亚基，且优选不与IL-12的p40亚基结合。这种Ig衍生蛋白包括抗体和抗体融合蛋白，通过与IL-23的p40亚基结合阻断IL-23结合到至少一种它的受体(如但不限于IL-23受体和/或IL-12β1受体)上。优选这种抗IL-23p40 Ig衍生蛋白不结合和/或抑制IL-12结合到它的一种或多种受体上，例如但不限于IL-12β1受体和/或IL-12β2受体。本发明还提供这种抗IL-23p40 Ig衍生蛋白的组合物、制剂、方法、装置和用途，包括治疗和诊断用途。
本发明也提供Ig衍生蛋白，其选择性抑制IL-23相关活性，且进一步任选不抑制IL-12特异性活性，IL-12特异性活性通过IL-12与它的一种或多种受体(如但不限于IL-12β1受体或IL-12β2受体)结合而介导。
本发明还提供Ig衍生蛋白，通过阻断IL-23结合到它的一种或多种受体上而适合于治疗至少一种IL-23相关的疾病，任选其中这种Ig衍生蛋白不阻断IL-12与它的一种或多种受体结合。
本发明也提供Ig衍生蛋白，其在抗原递呈细胞(APC)中抑制IL-23的活性，这种抗原递呈细胞例如但不限于，巨噬细胞、小神经胶质细胞、系膜吞噬细胞、滑膜A细胞、干细胞前体、朗格罕氏细胞、枯否氏细胞、树突状细胞、B细胞等。这种APC可存在于不同的组织中，例如但不限于皮肤、表皮、肝、脾脏、脑、脊髓、胸腺、骨髓、关节滑液、肾、血液等。这种APC也可被限制在血脑屏障外侧或内侧。
本发明提供了分离的、重组和/或合成的IL-23p40 Ig衍生蛋白，或特定部分或变体，以及组合物和编码核苷酸，所述编码核苷酸包含至少一种编码至少一种IL-23p40 Ig衍生蛋白的多核苷酸。本发明的这种Ig衍生蛋白或特定部分或变体包含了具体全长Ig衍生蛋白序列、其结构域、片段和特定变体，以及制备和使用所述核苷酸、Ig衍生蛋白或特定部分或变体的方法，包括治疗组合物、方法和装置。
本文所使用的“抗IL-23p40 Ig衍生蛋白”、“抗IL-23p40 Ig衍生蛋白部分”、“IL-23p40 Ig衍生蛋白片段”、“抗IL-23p40 Ig衍生蛋白变体”、“IL-23p40 Ig衍生蛋白”、“IL-23p40 Ig衍生蛋白部分”、“IL-23p40 Ig衍生蛋白片段”、“IL-23p40 Ig衍生蛋白变体”等，体外、原位和/或优选在体内降低、阻断、抑制、消除或干扰了IL-23p40蛋白的活性、结合或IL-23p40蛋白受体的活性或结合。本文使用的“IL-12p40”是指IL-23的p40亚基和活性部分、片段、亚型、剪接变体等，为本领域已知。
例如，本发明合适的IL-23p40 Ig衍生蛋白、特定部分或变体可结合至少一种IL-23p40蛋白或受体，包括抗IL-23p40 Ig衍生蛋白、它的抗原结合片段和与IL-23p40特异性结合的特定部分、变体或结构域。适合的IL-23p40 Ig衍生蛋白、特定部分或变体也可减少、阻断、消除、干扰、防止和/或抑制IL-23p40蛋白RNA、DNA或蛋白的合成、IL-23p40蛋白的释放、IL-23p40蛋白或受体的信号转导、膜IL-23p40蛋白的裂解、IL-23相关的活性、IL-23p40蛋白的产生和/或合成，例如如本文描述的或为本领域已知的。
用于本发明方法和组合物的抗IL-23p40 Ig衍生蛋白(也被称为抗IL-23p40 Ig衍生蛋白)，其特征为与IL-23p40蛋白的高亲和结合，并且优选和任选具有低毒性。具体地说，本发明的Ig衍生蛋白、特定片段或变体用于本发明，其中个别的元件如可变区、恒定区和构架，个别和/或全部、优选和任选为低免疫原性。可用于本发明的Ig衍生蛋白任选特征为它们能够长时间治疗患者，极好的减轻症状并且低毒。低免疫原性和/或高亲和性以及其它合适的性质可有助于获得治疗效果。“低免疫原性”本文被定义为提高治疗患者的有效HAHA、HACA或HAMA反应小于约75％，或优选小于约50％，和/或在治疗患者中引起低滴度(少于约300，优选少于约100，使用双抗原酶联免疫分析测定)(Elliott et al，Lancet 344：1125-1127(1994))，上述每个参考文献通过引用整体结合到本文中。
应用
本发明的分离核苷酸可用于生产至少一种IL-23p40 Ig衍生蛋白、它的片段或特定变体，这些IL-23p40 Ig衍生蛋白、片段或特定变体可用于细胞、组织、器官或动物(包括哺乳动物和人类)，以调节、治疗、减轻、帮助预防发生至少一种IL-23p40疾病，或减轻至少一种IL-23p40疾病的症状。
这种方法可包括向需要这种调节、治疗、减轻、阻止或减少症状、效应或机制的细胞、组织、器官、动物或患者，给予有效量的包含至少一种抗IL-23p40 Ig衍生蛋白、特定部分或变体的组合物或药物组合物。有效量可包含每单次给药或多次给药约0.001-500mg/kg的量，或者每单次给药或多次给药以获得0.01-5000μg/ml的血清浓度，或者本文的任何有效范围或值，使用本文所描述或相关领域已知的方法实施和检测。
引用
本文引用的所有出版物或专利，通过引用整体结合到本文中，无论是否被相应地特别指定，只要它们显示了本发明时期现有技术水平，和/或提供本发明地描述和允许。出版物是指任何科学的或专利的出版物，或任何介质形式的任何其它有用信息，包括所有录音的、电子或印刷的格式。下列参考文献通过引用整体结合到本文中：Ausubel等，ed.，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley &Sons，Inc.，NY，NY(1987-2003)；Sambrook等，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，第二版，Cold Spring Habor，NY(1989)；Harlow andLane，Ig derived proteins，a Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，NY(1989)；Colligan，等，eds.，Current Protocols in Immunology，John Wiley& Sons，Inc.，NY(1994-2003)；Colligan等，Current Protocols in ProteinScience，John Wiley & Sons，NY，NY，(1997-2003)。
本发明的Ig衍生蛋白
术语“Ig衍生蛋白”包括Ig衍生蛋白、它的消化片段、特定部分或变体，包括Ig衍生蛋白模拟物或包含模拟抗体或其特定片段或部分的结构和/或功能的Ig衍生蛋白部分，包括单链Ig衍生蛋白和它的片段；该术语也包括含有治疗蛋白、抗体和其消化片段、特定部分和变体的模拟物的蛋白，其中所述蛋白包含至少一种有功能的IL-23p40配体结合域(LBR)，任选代替至少一个抗体的互补决定区(CDR)，Ig衍生蛋白、部分或变体从此抗体衍生而来。这种IL-23p40 IgG衍生蛋白、特定部分或变体包括模拟至少一种IL-23p40蛋白拮抗剂的结构和/或功能的模拟物，如IL-23p40蛋白抗体或受体或配体蛋白，或片段或类似物。功能性片段包括与人IL-23p40蛋白或其片段结合的抗原结合片段。例如，Ig衍生蛋白片段能够与人IL-23p40蛋白或它的片段结合，包括但不限于Fab(例如通过木瓜蛋白酶消化)、Fab’(例如通过胃蛋白酶消化或部分还原)和F(ab’)2(例如通过胃蛋白酶消化)、facb(例如通过纤维蛋白溶酶消化)、pFc’(例如通过胃蛋白酶或纤维蛋白溶酶消化)、Fd(例如通过胃蛋白酶消化、部分还原或重聚集)、Fv或scFv(例如通过分子生物学技术)片段，都包含在本发明内(参见例如Colligan，Immunology，supra)。
这种片段可通过本领域已知的和/或本文描述的酶解、合成或重组技术生产。Ig衍生蛋白也可使用Ig衍生蛋白基因以各种截短的形式生产，其中在天然终止位点的上游引入了一个或多个终止密码子。例如，编码F(ab’)2重链部分的嵌合基因可被设计为包括编码CH1结构域和/或重链铰链区的DNA序列。Ig衍生蛋白的各部分可通过常规技术化学连接在一起，或者使用基因工程技术制备为连续蛋白。例如，可表达编码人Ig衍生蛋白链可变区和恒定区的核苷酸，产生连续的蛋白。关于片段参见例如Colligan，Immunology，supra，sections2.8 and 2.10，关于单链Ig衍生蛋白参见Ladner等，美国专利第4,946,778号和Bird，R.E.等，Science，242：423-426(1988)，每个出版物通过引用整体结合到本文中。
本文使用的术语“人Ig衍生蛋白”是指Ig衍生蛋白，其中基本上每一部分蛋白(例如，CDR、LBR、构架、CL、CH域(如CH1、CH2、CH3)、铰链区、(VL、VH))实质上为非免疫原性的，只具有少许的序列变化或变更。相对于未修饰的人Ig衍生蛋白，这种变化或变更任选和优选在人体中保持或降低免疫原性。因此，人Ig衍生蛋白区别于嵌合或人源化的Ig。需要指出的是，人Ig衍生蛋白可通过非人类动物、原核或真核细胞生产，所述细胞可表达功能重排的人免疫球蛋白(例如重链和/或轻链)基因。此外，当人Ig衍生蛋白为单链Ig衍生蛋白时，可包含接头多肽，此接头多肽并没有在天然人Ig衍生蛋白中发现。例如，Fv可包接头多肽，如约2-8个甘氨酸或其它氨基酸残基，其连接了重链可变区和轻链可变区。这种接头多肽被认为是人类来源。包含至少一种IL-23p40蛋白配体或其受体的IL-23p40 Ig衍生蛋白，可被设计为抗适当配体，如分离和/或IL-23p40蛋白，或它的部分(包括合成的分子如合成肽)。使用已知的技术制备这种IL-23p40 Ig衍生蛋白，以鉴定或表征至少一种IL-23p40蛋白或其部分的配体结合区或序列。
可产生特异性作用于p40亚基的人Ig衍生蛋白，抵抗适当的免疫原性抗原，如分离的IL-23蛋白或其部分(包括合成分子如合成肽)。免疫原性抗原和单克隆Ig衍生蛋白产品的制备可使用任何合适的技术进行。已描述了各种方法(参见例如Kohler等，Nature，256：495-497(1975)和Eur.J.ImmunoL 6：511-519(1976)；Milstein等，Nature 266：550-552(1977)；Koprowski等，美国专利第4,172,124号；Harlow，E.和D.Lane，1988，Ig derived proteins：A Laboratory Manual，(Cold SpringHabor Laboratory：Cold Spring Habor，NY)；Current Protocols InMolecular Biology，Vol.2(如Supplement 27，Summer’94)，Ausubel，F.M.等，Eds.，(John Wiley & Sons：New York，NY)，第11章，(1991-2003))，每个都通过引用整体结合到本文中。通常，通过将合适的无限增殖细胞系与Ig衍生蛋白生产细胞融合，可生产杂交瘤，无限增殖细胞例如骨髓瘤细胞系，例如但不限于Sp2/0、Sp2/0-AG14、NSO、NS1、NS2、AE-1、L.5、＞243、P3X63Ag8.653、Sp2 SA3、Sp2 MAI、Sp2 SS1、Sp2 SA5、U937、MLA 144、ACT IV、MOLT4、DA-1、JURKAT、WEHI、K-562、COS、RAJI、NIH 3T3、HL-60、MLA 144、NAMAIWA、NEURO 2A等，或杂交骨髓瘤(heteromyeloma)、它的融合产物，或从其衍生的任何细胞或融合细胞，或任何本领域已知的其它适合细胞系，参见例如 www.atcc.org、 www.lifetech.com等，每个通过引用整体结合到本文中，Ig衍生蛋白生产细胞例如但不限于分离或克隆的脾细胞，或其它任何表达重链或轻链恒定区或可变区或构架区或CDR序列的细胞，为内源性或异源性核苷酸，为重组体或内源性、病毒、细菌、藻类、原核、两栖动物、昆虫、爬行类、鱼、哺乳动物、啮齿目、马、羊、山羊、绵羊、灵长类、真核、基因组DNA、cDNA、rDNA、线粒体DNA或RNA、叶绿体DNA或RNA、hnRNA、mRNA、tRNA、单链、双链或三链、杂交体等，或它们的组合。参见例如Ausubel，supra和Colligan，Immunology，supra，第2章，每个通过引用整体结合到本文中。
可从用目标抗原免疫的人或其它适合动物的外周血液，或优选为脾脏或***中获得Ig衍生蛋白生产细胞。任何适合的宿主细胞也可用于表达异源或内源性核苷酸，所述核苷酸编码本发明的Ig衍生蛋白或它的特定片段或变体。使用选择培养条件或其它合适的已知方法可分离融合细胞(杂交瘤)或重组细胞，并且通过有限稀释或细胞分选或其它已知方法进行克隆。通过合适的试验(如ELISA)可选择能够产生具有所需特异性的Ig衍生蛋白的细胞。
可使用其它合适的方法生产或分离所需特异性抗体，包括但不限于从肽或蛋白文库(包括但不限于噬菌体、核糖体、寡核苷酸、RNA、cDNA等，展示库；如以下可获得的：Cambridge antibody Technologies，Cambridgeshire，UK；MorphoSys，Martinsreid/Planegg，DE；Biovation，Aberdeen，Scotland，UK；BioInvent，Lund，Sweden；Dyax Corp.，Enzon，Affymax/Biosite；Xoma，Berkeley，CA；Ixsys。参见例如欧洲专利第368,684号、PCT/GB91/01134；PCT/GB92/01755；PCT/GB92/002240；PCT/GB92/00883；PCT/GB93/00605；美国专利第8/350260(5/12/94)号；PCT/GB94/01422；PCT/GB94/02662；PCT/GB97/01835；(CAT/MRC)；WO90/14443；WO90/14424；WO90/14430；PCT/US94/1234；WO92/18619；WO096/07754；(Scripps)；WO96/13583，WO97/08320(MorphoSys)；WO95/16027(BioInvent)；WO88/06630；WO90/3809(Dyax)；美国专利第4,704,692号(Enzon)；PCT/US91/02989(Affymax)；WO89/06283；欧洲专利第371998号；欧洲专利第550 400号；(Xoma)；欧洲专利第229 046号；PCT/US91/07149(Ixsys)；或随机产生的肽或蛋白—美国专利第5723323号、第5763192号、第5814476号、第5817483号、第5824514号、第5976862号、WO 86/05803、欧洲专利第590689号(Ixsys，现为Applied Molecular Evolution(AME))，每个通过引用整体结合到本文中)中选择重组抗体的方法，或依赖免疫接种能够产生所有人抗体的转基因动物(例如SCID小鼠，Nguyen等，Microbiol. Immunol.41：901-907(1997)；Sandhu等，Crit.Rev.Biotechnol.16：95-118(1996)；Eren等，Immunol.93：154-161(1998)，每个以及相关的专利和申请通过引用整体结合到本文中)的方法，如本领域已知和/或本文描述。这种技术包括但不限于核糖体展示技术(Hanes等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，94：4937-4942(May 1997)；Hanes等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，95：14130-14135(Nov.1998))；单细胞抗体生产技术(如选择淋巴细胞抗体方法(“SLAM”)(美国专利第5,627,052号，Wen等，J.Immunol.17：887-892(1987)；Babcook等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：7843-7848(1996))；凝胶微滴和流式细胞术(Powell等，Biotechnol.8：333-337(1990)；One Cell Systems，Cambridge，MA；Gray等，J.Imm.Meth.182：155-163(1995)；Kenny等，Bio/Technol.13：787-790(1995))；B细胞选择(Steenbakkers等，Molec.Biol.Reports 19：125-134(1994)；Jonak等，Progress Biotech，Vol.5，In Vitro immunization in HybridomaTechnology，Borrebaeck，ed.，Elsevier Science Publishers B.V.，Amsterdam，Netherlands(1988))，它们每个都通过引用整体结合到本文中。
也可使用人源化非人Ig衍生蛋白的方法，这为本领域已知。通常，人源化抗体具有一个或多个被引入到抗体中的氨基酸残基，其为非人类来源。这些非人类氨基酸残基通常被称为“输入”残基，其典型地从“输入”可变区获得。根据Winter和其同事的方法(Jones等，Nature 321：522(1986)；Riechmann等，Nature 332：323(1988)；Verhoeyen等，Science 239：1534(1988)，它们每个通过引用整体结合到本文中)，通过用啮齿类动物CDR或CDR序列代替相应的人抗体序列，可实现本质人源化。相应地，这种“人源化”Ig衍生蛋白为嵌合Ig衍生蛋白(Cabilly等，supra)，其中实质上少于完整人可变区的部分被来源于非人物种的相应序列取代。事实上，人源化Ig衍生蛋白为典型的人类衍生蛋白，其中某些CDR残基或可能某些FR残基被来源于啮齿动物Ig衍生蛋白中相似位点的残基取代。
挑选用于制备人源化Ig衍生蛋白的轻链和重链人可变区，可用来降低抗原性。依据称为“最佳适应”的方法，对全部已知人可变区序列的库筛选啮齿动物抗体的可变区序列。然后将与啮齿动物序列最接近的人序列作为人构架(FR)，接受用于人源化抗体(Sims等，J.Immunol.151：2296(1993)；Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.196：901(1987)，每个通过引用整体结合到本文)。另一种方法使用来源于具体轻链或重链亚群的所有人Ig衍生蛋白共有序列的特殊构架。相同的构架可用于某些不同的人源化Ig衍生蛋白(Carter等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89：4285(1992)；Presta等，J.Immunol.151：2623(1993)，它们每个通过引用整体结合到本文中)。
Ig衍生蛋白也可被人源化，保留对抗原的高亲和力和其它有利的生物学性质。为达到这个目的，依据优选方法，使用亲本和人源化序列的三维模型，通过分析亲本序列和各种概念的人源化产物的过程，制备人源化Ig衍生蛋白。三维免疫球蛋白模型通常是可获得的，为本领域技术人员所熟悉。可获得阐明和展现所选候选免疫球蛋白序列的可能三维构象结构的计算机程序。检查这些展示允许分析在候选免疫球蛋白序列功能中可能起作用的残基，即分析影响候选免疫球蛋白与其抗原结合能力的残基。以这种方式，可从共有序列和输入序列中选择并组合FR残基，因此可获得所希望的抗体特征如增加对目标抗原的亲和力。一般而言，CDR残基直接或最大参与影响抗原结合。
通过杂交瘤方法可制备人单克隆Ig衍生蛋白。已经描述了人骨髓瘤和鼠-人杂交骨髓瘤细胞系生产人单克隆Ig衍生蛋白，例如Kozbor，J.Immunol.133：3001(1984)；Brodeur等，Monoclonal AntibodyProduction Techniques and Applications，pp.51-63(Marcel Dekker，Inc.，New York，1987)；和Boerner等，J.Immunol.147：86(1991)所描述，它们每个都通过引用整体结合到本文中。
或者，可使用噬菌体展示技术和上述呈现的技术，从未免疫供体的所有免疫球蛋白可变区(V)基因，在体外生产人Ig衍生蛋白和抗体片段。依据这种技术的一个非限制性实施例，将抗体可变区基因在读框内克隆入丝状噬菌体的主要或次要外壳蛋白基因，如M13或fd，并且作为功能性抗体片段在噬菌体颗粒的表面展示。因为丝状颗粒含有噬菌体基因组的单链DNA拷贝，因此依据抗体的功能性质所做的选择，也导致选择的基因编码了展现那些性质的抗体。因此，噬菌体模拟了B细胞的某些性质。噬菌体展示也可通过各种不同的方式进行，对它们的综述参见，例如，Johnson等，Current Opinion inStructural Biology 3：564(1993)，它们每个通过引用整体结合到本文中。某些来源的V基因片段可用于噬菌体展示。Clackson等，Nature 352：624(1991)从V基因的小型随机组合库中分离到了不同的抗唑酮Ig衍生蛋白，所述V基因来源于免疫小鼠的脾脏。基本上按照以下由Marks等，J.Mol.Biol.222：581(1991)，或Griffith等，EMBO J.12：725(1993)所描述的技术，可构建来源于未免疫人供体的所有V基因，并分离针对不同抗原(包括自身抗原)的Ig衍生蛋白，它们每个都通过引用整体结合到本文中。
在自然的免疫反应中，抗体基因以高速率累积突变(体细胞高度突变)。引起的某些变化将赋予较高的亲和力，在后来的抗原攻击期间展现高亲和力表面免疫球蛋白的B细胞优先复制和分化。通过运用被称为“链改组”的技术可模拟这种自然过程(Marks等，Bio/Technol.10：779(1992))。在这种方法中，通过噬菌体展示获得的“初级”人Ig衍生蛋白的亲和力可通过使用从未免疫供体获得的所有天然V区基因变体(所有组分)，依次代替重链和轻链V区基因而提高。这项技术允许生产亲和力在nM范围内的Ig衍生蛋白和抗体片段。Waterhouse等，Nucl.Acids Res.21：2265(1993)描述了制备大型噬菌体抗体所有成分的策略。也可使用基因改组，从啮齿动物Ig衍生蛋白中衍生人Ig衍生蛋白，其中人抗体与起始啮齿动物抗体具有相似的亲和性和特异性。依据这种也被称为“表位印记”的方法，用全部人V区基因代替由噬菌体展示技术获得的啮齿动物Ig衍生蛋白的重链或轻链V区基因，从而创造出啮齿动物-人嵌合体。使用抗原选择导致分离能恢复功能性抗原结合位点的人可变区，即表位决定(印记)配体选择。当为了代替剩余的啮齿动物V区而重复此过程时，获得人的抗体(参见PCT WO 93/06213，1993年4月1日公布)。不象通过CDR嫁接进行的传统啮齿动物Ig衍生蛋白的人源化，此项技术提供了完全的人Ig衍生蛋白，其没有任何啮齿动物来源的片段或CDR残基。
也可使用双特异性Ig衍生蛋白，其为单克隆、优选人或人源化的Ig衍生蛋白，能与至少两种不同抗原特异结合。在该情况中，其中一种结合特异性针对至少一种IL-23p40蛋白，另一种则针对任何其它抗原。例如，能特异性与IL-23p40蛋白和至少一种神经元营养因子结合的双特异性Ig衍生蛋白，或与两种不同类型的IL-23p40多肽特异性结合的双特异性Ig衍生蛋白，都在本发明范围内。
制备双特异性Ig衍生蛋白的方法为本领域已知。传统上，重组生产双特异性Ig衍生蛋白基于两种免疫球蛋白重链-轻链对的共表达，其中两个重链具有不同的特异性(Milstein and Cuello，Nature 305：537(1983))。因为随机组合免疫球蛋白重链和轻链，这些杂交瘤(quadromas)产生了10种不同抗体分子的潜在混合物，其中只有1种具有正确的双特异性结构。通常通过亲和层析步骤纯化正确的分子是相当烦琐的，而且产率很低。相似的流程公开于WO 93/08829，1993年3月13日公开；以及Traunecker等，EMBO J.10：3655(1991)中，通过引用整体结合到本文中。
依据不同的和更优选的方法，可将具有所需结合特异性(抗体-抗原结合位点)的抗体可变区融合入免疫球蛋白恒定区序列。优选与包含至少一部分铰链的免疫球蛋白重链恒定区、第二重链恒定区(C.sub.H2)和第三重链恒定区(C.sub.H3)融合。优选在至少一种融合物中有轻链结合必需位点的第一重链恒定区(C.sub.H1)存在。将编码免疫球蛋白重链融合物(假如需要，还有免疫球蛋白轻链)的DNA***到分离的表达载体中，并共转染入合适的宿主生物。这就在实施方案中提供了调节三种多肽片段相互比例的巨大灵活性，在构建物中使用不同比例的三种多肽链以提供最佳的产量。然而，当至少两种多肽链以等比例产生导致高产或者比例没有任何具体意义时，有可能在一个表达载体中***编码两种或所有三种多肽链的序列。在这种方法优选的实施方案中，双特异性Ig衍生蛋白由以下部分组成：在一条臂中的具有第一结合特异性的杂合免疫球蛋白重链，在另一条臂中的杂合免疫球蛋白重链-轻链对(提供第二结合特异性)。这种不对称的结构便于从不需要的免疫球蛋白链组合物中分离到所需双特异性化合物，因为免疫球蛋白轻链只存在于双特异性分子的一半中，这提供了容易的分离方式。生产双特异性Ig衍生蛋白的更多细节参见例如Suresh等，Methods in Enzymology 121：210(1986)。
复共轭对配合物(Heteroconjugate)Ig衍生蛋白也在本发明的范围之内。复共轭对配合物Ig衍生蛋白由两个共价结合的Ig衍生蛋白组成。这种Ig衍生蛋白已被计划用于例如将免疫***细胞靶向到不需要的细胞(美国专利第4,676,980号)，用于治疗HIV感染(WO91/00360；WO 92/00373；和EP 03089)。可使用任何方便的交联方法制备复共轭对配合物Ig衍生蛋白。适合的交联剂为本领域所已知，随同许多交联技术一起公开于美国专利第4,676,980号。
在优选的实施方案中，本发明的至少一种抗IL-23p40 Ig衍生蛋白或特定部分或变体由细胞系、混和细胞系、无限增殖化细胞或无限增殖细胞的克隆群产生。无限增殖的IL-23p40生产细胞可通过合适的方法进行生产，例如将人Ig衍生蛋白产生细胞和杂交骨髓瘤融合，或通过用EB病毒感染使活化的人B细胞无限增殖(Niedbala等，Hybridoma，17(3)：299-304(1998)；Zanella等，J Imniunol Methods，156(2)：205-215(1992)；Gustafsson等，Hum Ig derived proteins Hybridomas，2(1)26-32(1991))。优选人抗人IL-23p40蛋白或片段或特定部分或变体可由转基因动物(如小鼠、大鼠、仓鼠、非人灵长类动物等)免疫产生，所述转基因动物能够产生所有人Ig衍生蛋白，如本文所描述和/或本领域已知。可使用合适的方法，从这些动物细胞或无限增殖细胞中分离产生人抗IL-23p40 Ig衍生蛋白的细胞，例如本文所描述的方法。
可通过已知的方法(例如但不限于Lonberg等的美国专利第5,770,428号、第5,569,825号、第5,545,806号、第5,625,126号、第5,625,825号、5,633,425号、第5,661,016号和第5,789,650号；Jakobovitset al WO 98/50433，Jakobovits等WO 98/24893，Lonberg等WO98/24884，Lonberg等WO 97/13852，Lonberg等WO 94/25585，Kucherlapate等WO 96/34096，Kucherlapate等EP 0463 151 B1，Kucherlapate等EP 0710 719 Al，Surani等美国专利第5,545,807号，Bruggemann等WO 90/04036，Bruggemann等EP 0438 474 B1，Lonberg等EP 0814 259 A2，Lonberg等GB 2 272 440 A，Lonberg等Nature 368：856-859(1994)，Taylor等，Int.Immunol.6(4)579-591(1994)，Green et al，Nature Genetics 7：13-21(1994)，Mendez等，NatureGenetics 15：146-156(1997)，Taylor等，Nucleic Acids Research 20(23)：6287-6295(1992)，Tuaillon等，Proc Natl Acad Sci USA 90(8)3720-3724(1993)，Lonberg等，Int Rev Immunol 13(1)：65-93(1995)和Fishwald等，Nat Biotechnol 14(7)：845-851(1996)，它们每个通过引用整体结合到本文中)，生产能产生所有人Ig衍生蛋白的转基因小鼠，所述人Ig衍生蛋白与人抗原结合。通常，这些小鼠包含至少一种含有人免疫球蛋白基因座来源DNA的转基因，所述人免疫球蛋白基因座被功能性重排或者可经历功能性重排。可破坏或删除这种小鼠中的内源性免疫球蛋白基因座，以清除动物产生由内源性基因编码的Ig衍生蛋白的能力。
本文使用的术语“功能性重排”是指来源于经历了V(D)J重组的免疫球蛋白基因座的DNA片段，因此产出了编码免疫球蛋白链(如重链和轻链)或其任何片段的免疫球蛋白基因。使用合适的方法可直接或间接鉴定功能性重排的免疫球蛋白基因，所述方法例如核苷酸测序、使用可与基因片段间编码连接物退火的探针进行杂交(如DNA印迹法或RNA印迹法)，或使用可与基因片段间编码连接物退火的引物酶法扩增免疫球蛋白基因(如聚合酶链反应)。也可使用合适的方法测定细胞是否产生包含了特殊可变区或在可变区中包含特殊序列(如至少一种CDR序列)的Ig衍生蛋白。在一个实例中，可从Ig衍生蛋白产生细胞(如杂交瘤或重组细胞或其它合适的来源)中分离mRNA，并用于产生编码Ig衍生蛋白或其特定片段或变体的cDNA。此cDNA可被克隆和测序，或使用可与目标可变区部分(如CDR、编码接连物)特异性退火的第一引物和可与非可变区序列(如CH1、VH)特异性退火的第二引物，扩增此cDNA(如通过聚合酶链反应或其它已知或合适的方法)。
使用多肽展示库，可轻易地筛选与相似蛋白或片段特异性结合的Ig衍生蛋白或特定片段或变体。这种方法包含了对大量多肽进行筛选，以筛选出具有所需功能或结构的单个成员。多肽展示文库的Ig衍生蛋白筛选为本领域所已知。展示的肽序列在长度上可在3-5000或更多氨基酸之间，时常为5-100氨基酸长度，经常为约8-25氨基酸长度。除了直接的化学合成方法产生多肽库之外，已经描述了某些重组DNA方法。一种典型的方法包括在噬菌体或细胞表面展示肽序列。每个噬菌体或细胞含有编码具体展示多肽序列的核苷酸序列。这些方法在PCT专利公开第91/17271号、第91/18980号、第91/19818号和93/08278号中有所描述。其它产生多肽库的***具有体外化学合成和重组方法两方面。参见PCT专利公开第92/0525号、第92/14843号和第96/19256号。也参见美国专利第5,658,754号和第5,643,768号。多肽展示库、载体和扫选试剂盒，可从供应商诸如Invitrogen(Carlsbad，CA)和Cambridge Ig derived protein Technologies(Cambridgeshire，UK)处商业获得。参见例如Enzon的美国专利第4704692号、第4939666号、第4946778号、第5260203号、第5455030号、第5518889号、第5534621号、第5656730号、第576373号、第5767260号、第5856456号；Dyax的第5223409号、第5403484号、第5571698号、第5837500号；Affymax的第5427908号、第5580717号；Cambridge Ig derived protein Technologies的第5885793号；Genentech的第5750373号；Xoma、Colligan、supra的第5618920号、第5595898号、第5576195号、第5698435号、第5693493号、第5698417号；Ausubcl，supra；或Sambrook，supra，上述各个专利和公开通过引用整体结合到本文中。
也可使用至少一种IL-23p40 Ig衍生蛋白或特定部分或变体的编码核苷酸，将其提供给转基因动物或哺乳动物如山羊、奶牛、马、绵羊等，在它们的奶中产生这种Ig衍生蛋白或特定部分或变体，来制备本发明的Ig衍生蛋白、特定部分和变体。可使用已知的方法提供这种动物。参见例如但不限于美国专利第5,827,690号、第5,849,992号、第4,873,316号、第5,849,992号、第5,994,616号、第5,565,362号、第5,304,489号等，它们每个都通过引用整体结合到本文中。
此外，还可使用至少一种IL-23p40 Ig衍生蛋白或特定部分或变体编码核酸，将其提供给转基因植物或培养植物细胞(例如但不限于烟草和玉米)，在植物部分或细胞培养物中产生这种Ig衍生蛋白、特定部分或变体，来制备本发明的Ig衍生蛋白、特定部分或变体。作为一个非限制性实例，例如使用诱导型启动子，表达重组蛋白的转基因烟叶已经成功的被应用于提供大量的重组蛋白。参见例如Cramer等，Curr.Top.Microbol.Immunol.240：95-118(1999)和其引用的参考文献。也已使用转基因玉米在商业化生产水平表达哺乳动物蛋白，其生物活性与其它重组***中生产的或从天然来源纯化的蛋白相等。参见例如Hood等，Adv.Exp.Med.Biol.464：127-147(1999)和其引用的参考文献。也已经从转基因植物种子中大量生产了Ig衍生蛋白，包括Ig衍生蛋白片段，如单链Ig衍生蛋白(scFv)，植物包括烟草种子和马铃薯块茎。参见例如Conrad等，Plant Mol.Biol.38：101-109(1998)和其引用的参考文献。因此，也可依照已知的方法使用转基因植物生产本发明的Ig衍生蛋白、特定部分和变体。同样参见例如Fischerden，Biotechnol.Appl.Biochem.30：99-108(Oct.，1999)，Ma等，Trends Biotechnol.13：522-7(1995)；Ma等，Plant Physiol.109：341-6(1995)；Whitelam等，Biochem.Soc.Trans.22：940-944(1994)和其中引用的参考文献。上述各参考文献通过引用整体结合到本文中。
本发明的Ig衍生蛋白可结合人IL-23p40蛋白或片段的亲和力(KD)范围宽。在一个优选的实施方案中，至少一种本发明的人单克隆抗体可任选高亲和力结合人IL-23p40蛋白或片段。例如，人单克隆抗体可结合人IL-23p40蛋白或片段，具有的KD等于或小于约10-9M，更优选为KD等于或小于0.1-9.9(或其中的任何范围或值)×10-10M、10-11、10-12、10-13或其中的任何范围或值。
可使用任何合适的方法试验测定Ig衍生蛋白对抗原的亲和力或抗体亲抗原性。(参见例如Berzofsky等，″Ig derived protein-AntigenInteractions，″In Fundamental Immunology，Paul，W.E.，Ed.，Raven Press：New York，NY(1984)；Kuby，Janis Immunology，W.H.Freeman andCompany：New York，NY(1992)和本文描述的方法)。如果在不同条件下测量(例如盐浓度、pH)，测得的具体Ig衍生蛋白-抗原相互作用的亲和力可能有所不同。因此，亲和力和其它抗原结合参数(如KD、Ka、Kd)的测量优选使用标准Ig衍生蛋白和抗原溶液以及标准缓冲液进行测定，例如本文描述的缓冲溶液。
核苷酸分子
使用本文提供的信息，可使用本文描述的或本领域已知的方法获得编码至少一种IL-23p40 Ig衍生蛋白或特定部分或变体的本发明核苷酸分子。
本发明的核苷酸可是RNA形式，如mRNA、hnRNA、tRNA或其它的形式，也可是DNA形式，包括但不限于cDNA和通过克隆或合成获得的基因组DNA，或它们的任何组合。DNA可为三链、双链或单链，或它们的任何组合。至少一条DNA或RNA链的任何部分可为编码链，也被称为有义链，或者可为非编码链，也被称为反义链。
本发明分离的核苷酸分子可包括包含开放可读框(ORF)的核苷酸分子，其任选具有一个或多个内含子，例如但不限于至少一种CDR的至少一种特定部分，例如至少一种重链或轻链各自的CDR1、CDR2和/或CDR3；包含IL-23p40 Ig衍生蛋白或特定部分或变体的编码序列的核苷酸分子；含有的核苷酸序列实质上不同于上述核苷酸序列，但由于遗传密码的简并性仍然编码至少一种本文所述和/或本领域已知的L-23p40 Ig衍生蛋白的核苷酸分子。当然，遗传密码为本领域所熟知。因此，对于本领域技术人员而言，生产这种编码本发明具体L-23p40 Ig衍生蛋白或特定部分或变体的简并核苷酸变体是常规技术。参见例如Ausubel等，supra，这种核苷酸变体包括在本发明中。
如本文所指出的，本发明的核苷酸分子包含编码IL-23p40 Ig衍生蛋白或特定部分或变体的核苷酸，可包括但不限于由本身编码Ig衍生蛋白片段氨基酸序列的核苷酸分子；编码完整Ig衍生蛋白或部分的序列；编码Ig衍生蛋白、片段或部分以及另外序列的编码序列，另外序列例如至少一种信号前导物或融合肽的编码序列，带有或不带上述另外的编码序列如至少一个内含子，和另外的非编码序列一起，非编码序列包括但不限于非编码5’和3’序列，例如在转录、mRNA加工中起作用的转录不翻译序列，mRNA加工包括剪接和多腺苷酸化信号(例如结合核糖体和mRNA稳定性)；编码另外氨基酸的另外编码序列，所述氨基酸例如提供另外功能的氨基酸。因此，可将编码Ig衍生蛋白或特定部分或变体的序列与标记序列融合，如编码有助于纯化融合Ig衍生蛋白或特定部分或变体的多肽的序列，该融合蛋白包含Ig衍生蛋白片段或部分。
选择性地与本文描述的多核苷酸杂交的多核苷酸
本发明提供了分离的核苷酸，其在选择性杂交条件下与编码本发明的IL-23p40 Ig衍生蛋白的多核苷酸杂交。因此，这个实施方案的多核苷酸可被用于分离、检测和/或定量含有这种多核苷酸的核酸。例如，本发明的多核苷酸可用于在储存库中鉴定、分离或扩增部分或全长克隆。在一些实施方案中，多核苷酸为从人或哺乳动物核酸库分离到的基因组或cDNA序列，或为与cDNA互补的序列。
优选cDNA库包含至少80％全长序列，优选至少85％或90％全长序列，更优选至少95％全长序列。可规范化cDNA库以增加稀有序列的代表性。典型地但不是排他地，低或中等严格性杂交条件用于与互补序列相比序列一致性较低的序列。对于更高一致性的序列，可任选使用中等或高严格性条件。低严格性条件允许具有约70％序列一致性的序列进行选择性杂交，可被用于鉴定直向同源或共生同源序列。
任选本发明的多核苷酸将编码至少一部分本文所述多核苷酸编码的Ig衍生蛋白或特定部分或变体。本发明的多核苷酸包括核酸序列，其被用于与编码本发明Ig衍生蛋白、特定部分或变体的多核苷酸进行选择性杂交。参见例如Ausubel，supra；Colligan，supra，每个通过引用整体结合到本文中。
核苷酸的构建
可使用本领域已知的(a)重组方法、(b)合成技术、(c)纯化技术或它们的组合制备本发明分离的核酸。
该核酸可方便的包含本发明多核苷酸之外的序列。例如，可在核酸中***含有一个或多个核酸内切酶限制性酶切位点的多克隆位点，以帮助分离多核苷酸。也可***可翻译序列，以帮助分离本发明的已翻译多核苷酸。例如，六组氨酸标记序列提供了纯化本发明蛋白的便利方法。本发明的核酸-除编码序列以外-任选为用于克隆和/或表达本发明多核苷酸的载体、接头和联结子。
可向这种克隆和/或表达序列添加另外的序列，以在克隆和/或表达中优化它们的功能，有助于分离多核苷酸，或改善多核苷酸引入细胞。克隆载体、表达载体、接头和联结子的用途为本领域所熟知(参见例如Ausubel，supra；或Sambrook，supra)。
用于构建核酸的重组方法
本发明分离核酸组合物，如RNA、cDNA、基因组DNA或它们的任何组合，可使用任何本领域技术人员已知的克隆方法从生物源获得。在一些实施方案中，使用在严格条件下与本发明多核苷酸选择性杂交的寡核苷酸探针，在cDNA或基因组DNA文库中鉴定所需的序列。RNA的分离、cDNA和基因组文库的构建为本领域普通的技术人员所熟知(参见例如Ausubel，supra；或Sambrook，supra)。
核苷酸的筛选和分离方法
可使用基于本发明多核苷酸序列(例如本文所述多核苷酸序列)的探针，筛选cDNA和基因组DNA文库。探针可用来与基因组DNA或cDNA序列杂交，以在相同或不同生物体中分离同源基因。本领域的技术人员可理解的是，在试验中可运用不同程度的杂交严格性；杂交或洗涤介质都可为严格的。当杂交的条件变得更严格时，在探针和靶之间必须存在更高程度的互补，形成双链形式。通过温度、离子强度、pH和存在局部变性溶剂如甲酰胺的一个或多个，可控制严格性的程度。例如，通过反应溶剂极性的变化，如通过控制甲酰胺浓度在0％-50％之间，可方便的改变杂交严格性。可检测结合要求的互补性(序列一致性)程度依据杂交介质和/或洗涤介质的严格性而变化。互补程度最佳为100％，或90-100％，或其中的任何范围或值。然而，应当明白的是，通过降低杂交和/或洗涤介质的严格性，可补偿探针和引物中少许的序列变化。
RNA或DNA扩增的方法为本领域所熟知，且基于本文提供的教导和指导可相应的用于本发明而不需要过多的试验。
已知的扩增DNA或RNA的方法包括但不限于聚合酶链反应(PCR)和相关的扩增方法(参见例如Mullis等的美国专利第4,683,195号、第4,683,202号、第4,800,159号、第4,965,188号；Tabor等的第4,795,699号和第4,921,794号；Innis的第5,142,033；Wilson等的第5,122,464号；Innis的第5,091,310号；Gyllensten等的第5,066,584号；Gelfand等的第4,889,818；Silver等的第4,994,370号；Biswas等的第4,766,067号；Ringold的第4,656,134号)和RNA介导的扩增，其中使用反义RNA靶向序列，作为模板合成双链DNA(Malek等的美国专利第5,130,238号，商品名为NASBA)，参考文献的全部内容通过引用结合到本文中。(参见例如Ausubel，supra；或Sambrook，supra)。
例如，聚合酶链反应(PCR)技术可用来扩增本发明的多核苷酸序列或直接来自基因组DNA或cDNA文库的相关基因。PCR和其它的体外扩增方法也可用于，例如，克隆编码表达蛋白的核酸序列、制备核酸用作探针检测样品中是否存在所需的mRNA、核酸测序或其它目的。在体外扩增方法中足以指导技术人员的技术实例发现于Berger，supra；Sambrook，supra和Ausubel，supra，以及Mullis等，美国专利第4,683,202号(1987)；和Innis等，PCR Protocols A Guide toMethods and Applications，Eds.，Academic Press Inc.，San Diego，CA(1990)。用于基因组PCR扩增的商业试剂盒为本领域已知。参见例如Advantage-GC基因组PCR试剂盒(Clontech)。可使用T4基因32蛋白(Boehringer Mannheim)增加长PCR产物的产量。
用于构建核酸的合成方法
本发明的分离核酸也可通过已知方法经直接化学合成制备(参见例如Ausubel等，supra)。化学合成通常产生单链寡核苷酸，其通过与互补序列杂交转换成双链，或者通过将单链用作模板使用DNA聚合酶聚合转化为双链DNA。本领域的技术人员应该认识到，DNA的化学合成可限于约100或更多碱基的序列，更长的序列可通过较短序列的连接获得。
重组体表达盒
本发明还进一步提供了包含本发明核酸的重组体表达盒。本发明的核酸序列，例如编码本发明Ig衍生蛋白或特定部分或变体的cDNA或基因组DNA，可被用于构建重组体表达盒，所述表达盒能被引入至少一种所需的宿主细胞中。重组体表达盒典型地包含本发明的多核苷酸，其与转录起始调控序列有效连接，所述转录起始调控序列在预期的宿主细胞中指导多核苷酸的转录。异源和非异源(即内源的)启动子都可用于指导本发明核酸的表达。
在一些实施方案中，为了上调或下调本发明多核苷酸的表达，可在本发明多核苷酸非异源形式的合适位点(上游、下游或在内含子中)引入分离核苷酸，作为启动子、增强子或其它的元件。例如，在体内或体外通过突变、缺失和/或置换可改变内源启动子。
本发明的多核苷酸可按需要以有义或反义方向表达。可理解的是，控制基因以有义或反义方向表达可直接影响到可见特征。
另一种抑制的方法为有义抑制。引入以有义方向构建的核苷酸显示为有效的阻断靶基因转录的方法。
各种在本发明多核苷酸上产生悬吊基团(pendant group)的交联剂、烷化剂和残基可用于结合、标记、检测和/或裂解核苷酸。Knorre等，Biochimie 67：785-789(1985)；Vlassov等，Nucleic Acids Res.14：4065-4076(1986)；Iverson and Dervan，J.Am.Chem.Soc.109：1241-1243(1987)；Meyer等，J.Am.Chem.Soc.111：8517-8519(1989)；Lee等，Biochemistry 27：3197-3203(1988)；Home等，J.Am.Chem.Soc.112：2435-2437(1990)；Webb和Matteucci，J.Am.Chem.Soc.108：2764-2765(1986)；Nucleic Acids Res.14：7661-7674(1986)；Feteritz等，J.Am.Chem.Soc.113：4000(1991)。用于结合、检测、标记和/或裂解核酸的各种化合物为本领域已知。参见例如美国专利第5,543,507号、第5,672,593号、第5,484,908号、第5,256,648号和第5,681,941号，每个都通过引用整体结合到本文中。
载体和宿主细胞
本发明也涉及包括本发明分离核酸分子的载体、用重组载体遗传工程改造的宿主细胞和通过重组技术生产至少一种IL-23p40 Ig衍生蛋白或特定部分或变体，如本领域所熟知。参见例如Sambrook等，supra；Ausubel等，supra，每一个通过引用整体结合到本文中。
多核苷酸可任选连接到载体上，所述载体含有用于在宿主细胞中繁殖的选择标记。通常，将质粒载体引入沉淀物如磷酸钙沉淀物，或者引入带有电荷脂类的复合物中。假如载体为病毒，可在体外使用合适的包装细胞株进行包装，然后转导入宿主细胞。
DNA***物应当有效连接到合适的启动子。表达构建物还进一步含有转录起始和终止的位点，在转录区中含有用于翻译的核糖体结合位点。由构建物表达的成熟转录物的编码部分优选包括位于待翻译mRNA起始的翻译起始密码子，以及适当位于mRNA末端的终止密码子(例如UAA、UGA或UAG)，对于哺乳动物或真核细胞表达优选为UAA和UAG。
表达载体优选但任选包括至少一种选择标记。这种标记包括，例如但不限于氨甲蝶呤(MTX)、二氢叶酸还原酶(DHFR，美国专利第4,399,216号、第4,634,665号、第4,656,134号、第4,956,288号、第5,149,636号、第5,179,017号)、氨苄西林、新霉素(G418)、霉酚酸、或谷氨酰胺合成酶(GS，美国专利第5,122,464号、第5,770,359号、第5,827,739号)抗性用于真核细胞培养，四环素或氨苄西林抗性基因用于大肠杆菌或其它细菌或原核生物培养(上述专利通过引用整体结合到本文中)。上述宿主细胞的合适培养基和培养条件为本领域已知。对熟练技术人员而言适合的载体是显而易见的。通过磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、阳离子脂类介导的转染、电穿孔、转导、感染或其它已知的方法，可将载体构建物引入宿主细胞。这种方法描述于本领域，如Sambrook，supra，1-4章和16-18章；Ausubel，supra，第1、9、13、15、16章。
至少一种本发明Ig衍生蛋白或特定部分或变体可表达为修饰形式，如融合蛋白，可不仅包括分泌信号，而且包括另外的异源功能区。例如，附加的氨基酸，特别是带电荷的氨基酸区，可被添加到Ig衍生蛋白或特定部分或变体的N端，以在宿主细胞中、在纯化期间、在随后的治疗和贮藏期间增加稳定性和持久性。也可向本发明的Ig衍生蛋白或特定部分或变体添加肽部分，以便于纯化。在最终制备Ig衍生蛋白或至少它的一个片段之前，可除去这种区域。许多标准实验室手册中描述了这种方法，如Sambrook，supra，第17.29-17.42和18.1-18.74章；Ausubel，supra，第16、17和18章。
本领域普通技术人员熟知许多表达***可用于表达编码本发明蛋白的核酸。
或者，通过在宿主细胞中打开(通过操作)可在宿主细胞中表达本发明核苷酸，所述宿主细胞含有编码本发明Ig衍生蛋白或特定部分或变体的内源DNA。这种方法为本领域所熟知，例如，美国专利第5,580,734号、第5,641,670号、第5,733,746号和第5,733,761号中所描述的，通过引用整体结合到本文中。
用于生产Ig衍生蛋白或其特定部分或变体的细胞培养物的例证为哺乳动物细胞。哺乳动物细胞***通常为单层细胞的形式，尽管也可使用哺乳动物细胞悬浮液或生物反应器。本领域中已经开发了许多能够表达完整糖基化蛋白的合适宿主细胞系，包括COS-1(如ATCC CRL 1650)、COS-7(如ATCC CRL-1651)、HEK293、BHK21(如ATCC CRL10)、CHO(如ATCC CRL 1610)和BSC-1(如ATCCCRL-26)细胞系、Cos-7细胞、CHO细胞、hep G2细胞、P3X63Ag8.653、SP2/0-Ag14,293细胞、HeLa细胞等，这些都可容易的从例如美国典型培养物中心(American Type Culture Collection，Manassas，Va)获得。优选的宿主细胞包括淋巴来源的细胞如骨髓瘤和淋巴瘤细胞。特别优选的宿主细胞为P3X63Ag8.653细胞(ATCC登录号CRL-1580)和SP2/0-Ag14细胞(ATCC登录号CRL-1851)。在一个具体的优选实施方案中，重组细胞为P3X63Ab8.653或SP2/0-Ag14细胞。
用于这些细胞的表达载体可包括一种或多种下列表达控制序列，例如但不限于复制起点；启动子(如SV40后期或早期启动子、CMV启动子(美国专利第5,168,062号、第5,385,839号)、HSV tk启动子、pgk(磷酸甘油酸激酶)启动子、EF-1α启动子(美国专利第5,266,491号)、至少一种人Ig衍生蛋白启动子)；增强子和/或加工信息位点，如核糖体结合位点、RNA剪切位点、多腺苷酸化位点(如SV40大T Ag多腺苷酸添加位点)和转录终止序列。参见例如Ausubel等，supra；Sambrook等，supra。其它用于生产本发明核酸或蛋白的细胞是已知和/或可获得的，例如来自ATCC的细胞系和杂交瘤目录(www.atcc.org)或其它已知或商业化的来源。
当使用真核宿主细胞时，载体中典型地掺入了多聚腺苷酸或转录终止序列。终止子序列的一个实例为来源于牛生长激素基因的多腺苷酸化序列。也可包括用于精确剪接转录物的序列。剪接序列的一个实例为来源于SV40的VP1内含子(Sprague等，J.Virol.45：773-781(1983))。此外，也可将在宿主细胞中控制复制的基因序列掺入到载体中，如本领域已知。
纯化Ig衍生蛋白或其特定部分或变体
通过熟知的方法，可从重组细胞培养物中回收和纯化IL-23p40 Ig衍生蛋白或特定部分或变体，所述方法包括但不限于A蛋白纯化、硫酸铵或乙醇沉淀、酸萃取、阴离子或阳离子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水相互作用层析、亲合层析、羟基磷灰石层析和凝集素层析。也可使用高效液相色谱(“HPLC”)进行纯化。参见例如Colligan，Current Protocols in Immunology，或Current Protocols in Protein Science，John Wiley & Sons，NY，NY，(1997-2003)，例如第1、4、6、8、9、10章，每个通过引用整体结合到本文中。
本发明的Ig衍生蛋白或特定部分或变体包括天然的纯化产物、化学合成方法的产物和通过重组技术从真核细胞产生的产物，所述真核细胞包括例如酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞。根据在重组产生方法中使用的宿主，可糖基化或不糖基化本发明Ig衍生蛋白或特定部分或变体，优选糖基化。许多标准实验室手册中描述了这种方法，如Sambrook，supra，17.37-17.42节；Ausubel，supra，第10、12、13、16、18和20章；Colligan，Protein Science，supra，第12-1章，所有通过引用整体结合到本文中。
IL-23p40 Ig衍生蛋白、片段和/或变体
本发明的分离Ig衍生蛋白包括任何由本发明多核苷酸编码的Ig衍生蛋白或特定部分或变体，如本文更完全讨论的，或任何分离的或制备的Ig衍生蛋白或它的特定部分或变体。
优选人Ig衍生蛋白或抗原结合片段结合人IL-23p40蛋白或片段，因此实际上中和了蛋白的生物活性。Ig衍生蛋白或它的特定部分或变体可结合蛋白和片段，实际上部分或优选基本中和至少一种IL-23p40蛋白或片段的至少一种生物活性，因此抑制了通过IL-23p40结合至少一种IL-23p40受体或通过其它IL-23p40依赖或介导机制介导的活性。本文使用术语“中和Ig衍生蛋白”是指根据测定，Ig衍生蛋白可抑制约20％-120％的人p40或p19蛋白或片段相关依赖性活性，优选抑制至少约60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100％或更多。抗人IL-23p40 Ig衍生蛋白或特定部分或变体抑制人IL-23p40相关依赖性活性的容量，优选通过至少一种合适的IL-23p40 Ig衍生蛋白或蛋白测定进行评价，如本文所描述和/或本领域已知的。本发明的人Ig衍生蛋白或特定部分或变体可为任何种类(IgG、IgA、IgM、IgE、IgD等)或同种型，可包含κ轻链和λ轻链。在一个实施方案中，人Ig衍生蛋白或特定部分或变体包含IgG重链或确定的片段，例如至少一种同种型IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。这类Ig衍生蛋白可通过使用转基因小鼠或其它转基因非人哺乳动物制备，所述转基因动物包含至少一种人轻链(如IgG、IgA和IgM(如γ1、γ2、γ3、γ4))转基因，如本文所述和/或本领域已知。在另一个实施方案中，抗人IL-23p40 Ig衍生蛋白或其特定部分或变体包含IgG1重链和IgG1轻链。
至少一种本发明Ig衍生蛋白或特定部分或变体结合至少一种IL-23p40蛋白、亚基、片段、部分或它们组合特异的至少一种特定表位。此至少一种表位包含至少一种Ig衍生蛋白结合域，其组成至少一部分所述蛋白，所述表位优选由所述蛋白的至少一种细胞外、可溶、亲水的、胞外或胞质部分组成。作为非限制性实例，IL-23p40 Ig衍生蛋白或特定部分或变体特异性结合至少一种表位，其中包含至少1-3个至完整氨基酸序列，该序列选自人IL-23的至少一种p40亚基。此至少一种特定表位可包含人IL-23 p40亚基的至少一个氨基酸的任何组合，例如但不限于SEQ ID NO：1的至少一种以下片段的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个氨基酸：1-10、10-20、20-30、30-40，40-50、50-60、60-70、70-80、80-90、90-100、100-110、110-120、120-130、130-140、140-150、150-160、160-170、170-180、180-190、190-200、200-210、210-220、220-230、230-240、240-250、250-260、260-270、280-290、290-300、300-306、1-7、14-21、29-52、56-73、83-93、96-105、156-175、194-204、208-246、254-273、279-281或289-300。
通常，本发明的人Ig衍生蛋白或抗原结合片段将包含抗原结合域，其中包含至少一种重链可变区的至少一种人互补决定区(CDR1、CDR2和CDR3)或变体，以及至少一种轻链可变区的至少一种人互补决定区(CDR1、CDR2和CDR3)或变体。作为一个非限制性实例，Ig衍生蛋白或抗原结合部分或变体可包含至少一种重链CDR3和/或轻链CDR3。在一个具体的实施方案中，Ig衍生蛋白或抗原结合片段可具有抗原结合域，其中包含至少一种重链CDR(如CDR1、CDR2和/或CDR3)的具有相应CDR1、2和/或3氨基酸序列的至少一部分。在另外一个具体实施方案中，Ig衍生蛋白或抗原结合部分或变体可具有抗原结合域，其包含至少一种轻链CDR(如CDR1、CDR2和/或CDR3)的具有相应CDRs1、2和/或3氨基酸序列的至少一部分。这种Ig衍生蛋白可使用常规的技术化学连接Ig衍生蛋白各部分(如CDR、构架)来制备，或使用重组DNA技术常规的方法制备和表达(一种或多种)编码Ig衍生蛋白的核酸分子来制备，或通过其它任何合适的方法制备。
该抗IL-23p40 Ig衍生蛋白可包含至少一种具有确定氨基酸序列的重链或轻链可变区。例如，在一个优选的实施方案中，抗IL-23p40Ig衍生蛋白包含至少一种重链可变区和/或至少一种轻链可变区中的至少一种。使用合适的方法如噬菌体展示技术(Katsube，Y.，等，Int JMol Med，1(5)：863-868(1998))或使用转基因动物的方法，可制备结合人IL-23p40蛋白或片段且包含确定的重链或轻链可变区的人Ig衍生蛋白，如本领域已知或本文描述。例如，可用人IL-23p40蛋白或其片段免疫转基因小鼠以生产Ig衍生蛋白，该转基因小鼠中包含功能重排的人免疫球蛋白重链转基因和包含来源于人免疫球蛋白轻链基因座(能经历功能重排)的DNA的转基因。假如需要，可如本文所描述的和/或本领域已知的，分离Ig衍生蛋白的生产细胞，制备杂交瘤或其它无限增殖的Ig衍生蛋白生产细胞。或者，在合适的宿主细胞中使用编码核酸或其部分，可表达Ig衍生蛋白、特定部分或变体。
本发明也涉及Ig衍生蛋白、抗原结合片段、免疫球蛋白链和包含氨基酸序列的CDR，所述序列基本与本文描述的氨基酸序列相同。优选这种Ig衍生蛋白或抗原结合片段和包含这种链或CDR的Ig衍生蛋白可高亲和力(如KD小于或等于约10-9M)结合人IL-23p40蛋白或片段。与本文描述的序列基本相同的氨基酸序列包括包含保守氨基酸置换的序列，以及包含氨基酸缺失和/或***的序列。保守氨基酸置换是指用第二种氨基酸代替第一种氨基酸，第二种氨基酸的化学和/或物理性质(如电荷、结构、极性、疏水性/亲水性)与第一个氨基酸相似。保守置换包括一组氨基酸中的一种被相同组氨基酸中的另一种代替，氨基酸组如下：赖氨酸(K)、精氨酸(R)和组氨酸(H)；天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)；天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、酪氨酸(Y)、K、R、H、D和E；丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、脯氨酸(P)、苯丙氨酸(F)、色氨酸(W)、甲硫氨酸(M)、半胱氨酸(C)和甘氨酸(G)；F、W和Y；C、S和T。
氨基酸码
通常缩写组成本发明IL-23p40 Ig衍生蛋白或特定部分或变体的氨基酸。通过单字母代码、三字母代码、名称或三核苷酸密码子命名氨基酸而指明氨基酸名称为本领域所熟知(参见Alberts，B.等，Molecular Biology of The Cell，Third Ed.，Garland Publishing，Inc.，NewYork，1994)：
单字母代码 三字母代码   名称 三核苷酸密码子
    A     Ala   丙氨酸 GCA、GCC、GCG、GCU
    D     Cys   半胱氨酸 UGC、UGU
    C     Asp   天冬氨酸 GAC、GAU
    E     Glu   谷氨酸 GAA、GAG
    F     Phe   苯丙氨酸 UUC、UUU
    G     Gly   甘氨酸 GGA、GGC、GGG、GGU
    H     His   组氨酸 CAC、CAU
    I     Ile   异亮氨酸 AUA、AUC、AUU
    K     Lys   赖氨酸 AAA、AAG
    L     Leu   亮氨酸 UUA、UUG、CUA、CUC、CUG、CUU
    M     Met   甲硫氨酸 AUG
    N     Asn   天冬酰胺 AAC、AAU
    P     Pro   脯氨酸 CCA、CCC、CCG、CCU
    Q     Gln   谷氨酰胺 CAA、CAG
    R     Arg   精氨酸 AGA、AGG、CGA、CGC、CGG、CGU
    S     Ser   丝氨酸 AGC、AGU、UCA、UCC、UCG、UCU
    T     Thr   苏氨酸 ACA、ACC、ACG、ACU
    V     Val   缬氨酸 GUA、GUC、GUG、GUU
    W     Trp   色氨酸 UGG
    Y     Tyr   酪氨酸 UAC、UAU
本发明的IL-23p40 Ig衍生蛋白或特定部分或变体可包括一个或多个氨基酸置换、缺失或***，无论是来源于自然突变或人工治疗，如本文详细说明的。
当然，技术人员置换氨基酸的数目取决于许多因素，包括上述因素。通常而言，对任何特定的IL-23p40多肽，置换、***或缺失的氨基酸数目不超过40、30、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1，例如1-30或任何其中的范围和值，如本文说明的。
本发明IL-23p40 Ig衍生蛋白或特定部分或变体中的功能必须氨基酸可通过本领域已知的方法鉴定，例如定向突变或丙氨酸-扫描(alanine-scanning)突变(例如Ausubel，supra，Chapters 8，15；Cunninghamand Wells，Science 244：1081-1085(1989))。后一方法在分子中的每个残基引入单丙氨酸突变。然后检测结果所得突变分子的生物活性，例如但不限于至少一种IL-23p40中和活性。对于Ig衍生蛋白或特定部分或变体结合重要的位点也可经结构分析进行鉴定，所述结构分析如结晶、核磁共振或光亲和标记(Smith等，J.Mol.Biol.224：899-904(1992)和de Vos等，Science 255：306-312(1992))。
本发明的Ig衍生蛋白或特定部分或变体或它们的特定变体可包含任何数目的来源于本发明Ig衍生蛋白或特定部分或变体的连续氨基酸残基，其中数目可为选自IL-23p40 Ig衍生蛋白或特定部分或变体中连续残基数目的10-100％的整数。任选这种连续氨基酸子序列长度至少约为10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250或更多氨基酸，或任何其中的范围和值。而且，这种子序列的数目可为选自1-20的任何整数，如至少2、3、4、或5。
技术人员可理解的是，本发明包括至少一种本发明的生物活性Ig衍生蛋白或特定部分或变体。生物活性Ig衍生蛋白或特定部分或变体具有的比活性至少为天然(非合成)内源性或相关和已知的Ig衍生蛋白或特定部分或变体的20％、30％或40％，优选为至少50％、60％或70％，最优选为至少80％、90％或95％-1000％。测定和定量酶活和底物特异性的方法为本领域技术人员所熟知。
另一方面，本发明涉及本文所述的人Ig衍生蛋白和抗原结合片段，其可通过共价连接有机部分进行修饰。这种修饰产生具有改进药物代谢动力学性质的Ig衍生蛋白或抗原结合片段(如在体内血清半衰期增加)。有机部分可是线性或分支的亲水性多聚物基团、脂肪酸基团或脂肪酸酯基团。在具体的实施方案中，亲水性多聚物基团的分子量约为800至约120,000道尔顿，可为聚亚烷基二醇(如聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PPG))、碳水化合物聚合物、氨基酸聚合物或聚乙烯吡咯烷酮，脂肪酸或脂肪酸酯基团可包含约8至约40个碳原子。
本发明修饰的Ig衍生蛋白和抗原结合片段可包含一个或多个有机部分，其直接或间接共价结合到Ig衍生蛋白或特定部分或变体上。结合到本发明Ig衍生蛋白或抗原结合片段的每个有机部分可独立为亲水聚合物基团、脂肪酸基团或脂肪酸酯基团。本文使用的术语“脂肪酸”包括一元羧酸和二元羧酸。本文使用的术语“亲水聚合物基团”是指在水中比在辛烷中更易溶解的有机聚合物。例如，聚赖氨酸在水中比在辛烷中更易溶解。因此，本发明包括由聚赖氨酸共价连接修饰的Ig衍生蛋白。适合修饰本发明Ig衍生蛋白的亲水聚合物可为线性的或分支的，例如聚亚烷基二醇(如PEG、单甲氧基聚乙二醇(mPEG)、PPG等)、碳水化合物(如葡聚糖、纤维素、低聚糖、多糖等)、亲水性氨基酸的聚合物(如聚赖氨酸、聚精氨酸、聚天冬氨酸等)、聚亚烷基氧化物(如聚氧乙烯、聚氧丙稀等)和聚乙烯吡咯烷酮。优选修饰本发明Ig衍生蛋白的亲水聚合物作为独立分子实体的分子量约为800至约为150,000道尔顿。例如，可使用PEG5000和PEG20,000，其中下标为聚合物的平均分子量(道尔顿)。
可用1至约6个烷基、脂肪酸或脂肪酸酯基团取代亲水聚合物基团。可使用合适的方法制备用脂肪酸和脂肪酸酯基团取代的亲水聚合物。例如，包含胺基的聚合物可连接到脂肪酸或脂肪酸酯的羧酸根或羧酸酯上，脂肪酸或脂肪酸酯上有活性的羧酸根或酯(例如用N，N-羰基二咪唑活化)可连接聚合物上的羟基。
适合修饰本发明Ig衍生蛋白的脂肪酸和脂肪酸酯可为饱和的，或可包含一个或多个不饱和单位。适合修饰本发明Ig衍生蛋白的脂肪酸包括例如正十二酸(C12，月桂酸)、正十四酸(C14，肉豆蔻酸)、正十八酸(C18，硬脂酸)、正二十酸(C20，花生酸)、正二十二烷酸(C22，山嵛酸盐)、正三十烷酸盐(C30)、正四十烷酸盐(C40)、顺-Δ9-十八酸(C18，油酸)、所有的顺-Δ5，8，11，14-二十碳四烯酸(C20，花生四烯酸)、辛二酸、十四烷二酸、十八烷二酸、二十二烷二酸等。合适的脂肪酸酯包括包含线性或分支低级烷基的二酸单酯。低级烷基可包含1至约12个碳原子，优选为1至约6个。
使用合适的方法，如通过与一种或多种修饰剂反应，可制备修饰的人Ig衍生蛋白和抗体结合片段。本文使用的术语“修饰剂”是指包含活化基团的合适有机物(如亲水聚合物、脂肪酸、脂肪酸酯)。“活化基团”为化学部分或官能团，在合适条件下能与第二种化学基团反应，因此在修饰剂和第二种化学基团之间形成了共价结合。例如，胺反应活化基团包括亲电子基团如甲苯磺酸酯、甲磺酸酯、卤素(氯、溴、氟、碘)、N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS)等。能与硫醇反应的活化基团包括，例如，马来酰亚胺、碘代乙酰基、丙烯酰基(acrylolyl)、二硫代吡啶基、5-巯基-2-硝基苯甲酸巯基(TNB-巯基)等。醛官能团可被连接到含有胺或酰肼的分子，叠氮基可与三价磷基团反应形成氨基磷酸酯或磷酰亚胺连接。将活化基团引入分子的合适方法为本领域所已知(参见，例如，Hermanson，G.T.，BioconjugateTechniques，Academic Press：San Diego，CA(1 996))。活化基团可直接结合到有机基(如亲水聚合物、脂肪酸、脂肪酸酯)，或通过接头部分例如二价C1-C12基团连接，C1-C12基团中一个或多个碳原子可被杂原子如氧、氮或硫取代。合适的接头部分包括例如四甘醇、-(CH2)3-、-NH-(CH2)6-NH-、-(CH2)2-NH-和-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH-NH-。例如通过使单Boc-烷基二胺(如单Boc-乙二胺、单Boc-二氨基己烷)与脂肪酸在1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺(EDC)存在下进行反应，在游离胺和脂肪酸羧酸根之间形成酰胺键，可生产包含接头部分的修饰剂。可通过用三氟乙酸(TFA)治疗从产物中去除Boc保护基团，而暴露出另一个伯胺，其能与所述羧酸根反应，或者能与马来酸酐反应，所得产物环化从而产生活化的脂肪酸马来酰亚胺衍生物。(参见例如Thompson等，WO 92/16221，其全部教导通过引用结合到本文中)。
通过使人Ig衍生蛋白或抗体结合片段与修饰剂反应，可生产本发明修饰的Ig衍生蛋白。例如，通过使用胺反应性修饰剂如PEG的NHS酯，可将有机部分以非位点特异性方式结合到人Ig衍生蛋白。修饰的人Ig衍生蛋白或抗体结合片段也可通过还原Ig衍生蛋白或抗体结合片段的二硫键(如链内部的二硫键)制备。然后还原的Ig衍生蛋白或抗体结合片段可与巯基反应性修饰剂反应而产生本发明修饰的Ig衍生蛋白。可使用合适的方法如逆蛋白水解作用(Fisch等，Bioconjugate Chem.，3：147-153(1992)；Werlen等，Bioconjugate Chem.，5：411-417(1994)；Kumaran等，Protein Sci.6(10)：2233-2241(1997)；Itoh等，Bioorg.Chem，24(1)：59-68(1996)；Capellas等，Biotechnol.Bioeng.，56(4)：456-463(1997))，以及在Hermanson，G.T.，BiocotajugateTechniques，Academic Press：San Diego，CA(1996)中描述的方法，制备包含有机部分的修饰人Ig衍生蛋白和抗体结合片段，其中有机部分结合到本发明Ig衍生蛋白或特定部分或变体的特定位点。
IL-23p40 Ig衍生蛋白或特定部分或变体的组合物
本发明也提供至少一种IL-23p40 Ig衍生蛋白或特定部分或变体的组合物，包含至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种或更多的IL-23p40 Ig衍生蛋白或其特定部分或变体，本文描述和/或为本领域已知的是以非天然存在组合物、混合物或形式提供。这种组合物包含非天然存在的组合物，其包含至少一种或两种IL-23p40 Ig衍生蛋白氨基酸序列或其特定片段、域或变体的全长、C-和/或N-末端缺失变体、域、片段或特定变体。这种组合物的百分比按重量、体积、浓度、摩尔或质量摩尔计算，为液体或无水溶液、混合物、悬浮液、乳浊液和胶体，为本领域已知或本文所描述。
本发明的IL-23p40 Ig衍生蛋白或特定部分或变体的组合物还进一步包含至少一种任何合适的辅助剂，例如但不限于稀释剂、粘合剂、稳定剂、缓冲剂、盐、亲脂溶剂、防腐剂、赋形剂等。优选药物可接受的辅助剂。制备这种无菌溶液的非限制性实例和方法为本领域所熟知，例如但不限于Gennaro，Ed.，Remington′s PharmaceuticalSciences，18th Edition，Mack Publishing Co.(Easton，PA)1990。可按常规选择适合IL-23p40组合给药模式、溶解度和/或稳定性的药物可接受载体，如本领域熟知或本文所描述。
用于本发明组合物的药用赋形剂和添加剂包括但不限于蛋白、肽、氨基酸、脂质和碳水化合物(如糖，包括单糖、二糖、三糖、四糖和寡糖；衍生糖如糖醇、醛糖酸、酯化糖等；多糖或糖聚合物)，其可单独或组合存在，包含其自身或在组合物中包含1-99.99％(重量或体积)。示例性蛋白赋形剂包括血清白蛋白如人血清白蛋白(HSA)、重组人血白蛋白(rHA)、明胶、酪蛋白等。代表性氨基酸/Ig衍生蛋白或特定部分或变体的元件(其在缓冲容量中也有功能)包括丙氨酸、甘氨酸、精氨酸、甜菜碱、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、阿司帕坦等。一种优选的氨基酸为甘氨酸。
适合用于本发明的碳水化合物赋形剂包括，例如，单糖如果糖、麦芽糖、半乳糖、葡萄糖、D-甘露糖、山梨糖等；二糖如乳糖、蔗糖、海藻糖、纤维二糖等；多糖如棉子糖、松三糖、麦芽糊精、葡聚糖、淀粉等；糖醇如甘露醇、木糖醇、麦芽糖醇、乳糖醇、木糖醇、山梨糖醇(山梨醇)、肌醇等。优选用于本发明的碳水化合物赋形剂为甘露醇、海藻糖和棉子糖。
IL-23p40 Ig衍生蛋白组合物也可包括缓冲剂或pH调节剂；典型地，缓冲剂为从有机酸或有机碱制备的盐。代表性的缓冲剂包括有机酸盐如柠檬酸盐、抗坏血酸盐、葡糖酸盐、碳酸盐、酒石酸盐、琥珀酸盐、乙酸盐或邻苯二甲酸盐；Tris、盐酸氨基丁三醇或磷酸盐缓冲液。优选用于本发明的缓冲剂为有机酸盐如柠檬酸盐。
此外，本发明IL-23p40 Ig衍生蛋白或特定部分或变体的组合物可包含多聚物赋形剂/添加剂如聚乙烯吡咯烷酮、聚蔗糖(聚合的蔗糖)、葡聚糖结合剂(例如环糊精如2-羟丙基-β-环糊精)、聚乙二醇、调味剂、抗微生物剂、增甜剂、抗氧化剂、抗静电剂、表面活性剂(例如聚山梨醇酯如“吐温20”和“吐温80”)、脂类(如磷脂和脂肪酸)、类固醇(如胆固醇)和螯合剂(如EDTA)。
适合用于本发明IL-23p40组合物的这些和另外已知的药物赋形剂和/或添加剂为本领域已知，例如列于“Remington：The Science &Practice of Pharmacy”，19th ed.，Williams & Williams，(1995)和“Physician′s Desk Reference”，52nd ed.，Medical Economics，Montvale，NJ(1998)，其公开的内容通过引用整体结合到本文中。优选的载体或赋形材料为碳水化合物(如糖和糖醇)和缓冲剂(如柠檬酸盐)或多聚物。
制剂
如上所述，本发明提供了稳定的制剂，其中优选包含具有盐或所选盐的磷酸盐缓冲液、防腐溶液和含有防腐剂的制剂，以及适合药学或兽医使用的多次防腐制剂，它们在药物可接受制剂中包含至少一种IL-23p40 Ig衍生蛋白或特定部分或变体。防腐制剂在水稀释剂中含有至少一种已知的防腐剂或任选选自以下的防腐剂：苯酚、间甲酚、对甲酚、邻甲酚、氯甲酚、苯甲醇、硝酸苯汞、苯氧基乙醇、甲醛、氯丁醇、氯化镁(如六水合物)、对羟基苯甲酸烷基酯(如甲酯、乙酯、丙酯、丁酯等)、苯扎氯铵、苯索氯铵、脱氢乙酸钠、硫柳汞或它们的混合物。可使用本领域已知的任何合适的浓度或混合物，例如0.001-5％或其间的任何范围或值，例如但不限于0.001、0.003、0.005、0.009、0.01、0.02、0.03、0.05、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.3、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9或其间的任何范围或值。非限制性实例包括不含防腐剂、0.1-2％间甲酚(如0.2、0.3、0.4、0.5、0.9、1.0％)、0.1-3％苯甲醇(如0.5、0.9、1.1、1.5、1.9、2.0、2.5％)、0.001-0.5％硫柳汞(如0.005、0.01)、0.001-2.0％苯酚(如0.05、0.25、0.28、0.5、0.9、1.0％)、0.0005-1.0％对羟基苯甲酸烷基酯(如0.00075、0.0009、0.001、0.002、0.005、0.0075、0.009、0.01、0.02、0.05、0.075、0.09、0.1、0.2、0.3、0.5、0.75、0.9、1.0％)等。
如上所述，本发明提供了制品，包括包装材料和至少一种小瓶，其中包含至少一种IL-23p40 Ig衍生蛋白或特定部分或变体的溶液和前述缓冲剂和/或防腐剂，任选在水稀释液中，其中所述包装材料包括了指明能继续保留这种溶液时间的标签，所述时间为1、2、3、4、5、6、9、12、18、20、24、30、36、40、48、54、60、66、72小时或更长时间。本发明还进一步包含制品，包括包装材料、包含冻干的至少一种IL-23p40 Ig衍生蛋白或特定部分或变体的第一个小瓶、以及包含规定缓冲剂或防腐剂的水稀释液的第二个小瓶，其中所述包装材料包括标签，可指导患者将至少一种IL-23p40 Ig衍生蛋白或特定部分或变体在水稀释液中复原形成溶液，此溶液可继续保留24小时或更长时间。
至少一种本发明的IL-23p40 Ig衍生蛋白或特定部分或变体可通过重组方法生产，包括从哺乳动物细胞或转基因制品中生产，或者从其它的生物源中纯化，如本文所描述或本领域已知。
本发明的产品中，至少一种IL-23p40 Ig衍生蛋白或特定部分或变体的范围包括复原产生的量，如果在湿/干***中，浓度从约1.0μg/ml至约1000mg/ml，尽管更低浓度或更高浓度是可操作的，且取决于预期的传递工具，例如，溶液制剂不同于透皮片、肺、透粘膜、渗透泵或微量泵方法。
优选水稀释液还任选包含药物可接受防腐剂。优选的防腐剂包括选自以下的防腐剂：苯酚、间甲酚、对甲酚、邻甲酚、氯甲酚、苯甲醇、对羟基苯甲酸烷基酯(如甲酯、乙酯、丙酯、丁酯等)、苯扎氯铵、苯索氯铵、脱氢乙酸钠、硫柳汞或它们的混合物。用于制剂的防腐剂的浓度为足够产生抗微生物效果的浓度。这种浓度取决于所选择的防腐剂，容易为技术人员确定。
其它的赋形剂，如等渗剂、缓冲剂、抗氧化剂和防腐增强剂，可被任选和优选加入到稀释剂中。等渗剂如甘油，在已知浓度普遍使用。优选加入生理学耐受的缓冲液以改善pH控制。制剂可覆盖大范围的pH，如约pH4至约pH10，优选的范围为约pH5至约pH9，最优选的范围为约6.0至约8.0。本发明制剂的pH优选在约6.8至约7.8之间。优选的缓冲液包括磷酸盐缓冲液，最优选为磷酸钠，尤其是磷酸盐缓冲盐水(PBS)。
其它的添加剂，例如药物可接受增溶剂如吐温20(聚氧乙烯(20)失水山梨醇单月桂酸酯)、吐温40(聚氧乙烯(20)失水山梨醇单棕榈酸酯)、吐温80(聚氧乙烯(20)失水山梨糖醇单油酸酯)、Pluronic F68(聚氧乙烯聚氧丙烯嵌段共聚物)和PEG(聚乙二醇)；或非离子型表面活性剂如聚山梨醇酯20或80或泊洛沙姆184或188，Pluronicpolyls、其它嵌段共聚物；和螯合剂如EDTA和EGTA，可任选添加到制剂或组合物中以降低聚集。如果泵或塑料容器用于制剂的给药，这些添加剂就特别有用。药物可接受表面活性剂的存在减轻了蛋白聚集的倾向。
通过在水稀释液中将至少一种IL-23p40 Ig衍生蛋白或特定部分或变体同防腐剂混和，可制备本发明的制剂，防腐剂选自苯酚、间甲酚、对甲酚、邻甲酚、氯甲酚、苯甲醇、对羟基苯甲酸烷基酯(如甲酯、乙酯、丙酯、丁酯等)、苯扎氯铵、苯索氯铵、脱氢乙酸钠、硫柳汞或它们的混合物。使用常规的溶解和混和步骤，可在水稀释液中将至少一种IL-23p40 Ig衍生蛋白或特定部分或变体与防腐剂混和。为制备合适的制剂，例如将溶于缓冲液的定量的至少一种IL-23p40Ig衍生蛋白或特定部分或变体与溶于缓冲溶液的足量所需防腐剂组合，以提供在需要浓度的蛋白和防腐剂。本领域普通技术人员可了解这种方法的变化。例如，添加成分的顺序、是否使用另外的添加剂、制备制剂的温度和pH都是可优化的因素，以适应所使用的给药浓度和方法。
该要求保护的制剂可作为澄清溶液或作为双瓶提供给患者，双瓶中包含一瓶冻干的(至少一种)IL-23p40 Ig衍生蛋白或特定部分或变体，使用第二瓶重新配制，第二瓶中含有水、防腐剂和/或赋形剂，优选在水稀释液中的磷酸盐缓冲液和/或盐水和所选盐。单溶液瓶或需要重新配制的双瓶都可重复使用多次，且可满足患者治疗的单个或多个周期，因此提供了比现有更便利的治疗方法。
本发明要求保护的制品可用于在立即至24小时或更长时间内给药。相应地，本发明要求保护的制品给患者提供了显著的优点。本发明的制剂可任选在约2℃至约40℃之间的温度下安全贮存，且长时间保持蛋白的生物活性，因此允许包装标签指示溶液可在6、12、18、24、36、48、72或96小时或更长时间内保留和/或使用。如果使用防腐的稀释剂，这种标签可包括最多在1-12个月、半年、一年半和/或两年内使用。
可制备本发明中至少一种IL-23p40 Ig衍生蛋白或特定部分或变体的溶液，其方法包括将至少一种Ig衍生蛋白或特定部分或变体混和在水稀释液中。使用常规的溶解和混和步骤进行混和。为制备合适的稀释液，例如，将溶于水中或缓冲液中的定量的至少一种Ig衍生蛋白或特定部分或变体以足量组合，以提供需要浓度的蛋白和任选的防腐剂或缓冲液。本领域普通技术人员可了解这种方法的变化。例如，添加成分的顺序、是否使用另外的添加剂、制备制剂的温度和pH都是可优化的因素，用于适应所使用的给药浓度和方法。
该要求保护的产品可作为澄清溶液或作为双瓶提供给患者，双瓶中包含一瓶冻干的(至少一种)IL-23p40 Ig衍生蛋白或特定部分或变体，用含有水稀释液的第二瓶重新配制。单溶液瓶或需要复原的双瓶都可重复使用多次，且可满足患者治疗的单个或多个周期，因此提供了比现有更便利的治疗方法。
通过提供给药房、诊所、或其它这种机构和设施，本发明要求保护的产品可给患者间接提供澄清溶液或双瓶，双瓶中包含一瓶冻干的(至少一种)IL-23p40 Ig衍生蛋白或特定部分或变体，使用含有水稀释液的第二瓶配制。在这种情况中的澄清溶液大小最多可为1升或更大容量，前提条件是从大的容器中可一次或多次获得较小部分的至少一种Ig衍生蛋白或特定部分或变体，转入较小的瓶，由药房或诊所提供给它们的顾客和/或患者。
公认的包含这些单瓶***的装置包括那些用于传递溶液的笔式注射器装置，例如BD Pens、BD Autojector、Humajects NovoPen、B-DPen、AutoPen、和OptiPen、GenotropinPen、Genotronorm Pen、Humatro Pen、Reco-Peno、Roferon Pen、Biojector、Iject、J-tipNeedle-Free Injector、Intrajece、Medi-Ject，例如由Becton Dickenson(Franklin Lakes，NJ，www.bectondickenson.com)、Disetronic(Burgdorf，Switzerland，www.disetronic.com)；Bioject，Portland，Oregon(www.bioject.com)；National Medical Products、Weston Medical(Peterborough，UK，www.weston-medical.com)、Medi-Ject Corp(Minneapolis，MN，www.mediject.com)所制备或开发。公认的包含双瓶***的装置包括用于将冻干药物复原于药筒中以传递复原溶液的笔式注射器***，例如HumatroPen。
本发明要求保护的产品包括包装材料。包装材料除了提供管理机构要求的信息外，还提供可使用产品的条件。对于双瓶、湿/干产品而言，本发明的包装材料可指导患者在水稀释液中将至少一种IL-23p40 Ig衍生蛋白或特定部分或变体重新复原成溶液，并在2-24小时或更长时间内使用此溶液。对于单瓶溶液产品，标签指明可在2-24小时或更长时间内使用这种溶液。本发明要求保护的产品用于人类药物用途。
通过包括将至少一种IL-23p40 Ig衍生蛋白或特定部分或变体与所选缓冲液混和的方法，可制备本发明的制剂，所述缓冲液优选为含有盐水和所选盐的磷酸盐缓冲液。使用常规的溶解和混和方法，可将至少一种Ig衍生蛋白或特定部分或变体与缓冲剂在稀释液中混和。为制备合适的制剂，例如将水或缓冲液中的定量的至少一种IL-23p40 Ig衍生蛋白或特定部分或变体，与足量水中的所需缓冲剂组合，以获得需要浓度的蛋白和缓冲液。本领域普通技术人员可了解这种方法的变化。例如，添加成分的顺序、是否使用另外的添加剂、制备制剂的温度和pH都是可优化的因素，用于适应所使用的给药浓度和方法。
该要求保护的稳定或防腐制剂可作为澄清溶液或双瓶提供给患者，双瓶中包含一瓶冻干的至少一种IL-23p40 Ig衍生蛋白或特定部分或变体，其可用第二瓶重新配制，第二瓶中含有溶于水稀释液的防腐剂或缓冲液和赋形剂。单溶液瓶或需要复原的双瓶都可多次重复使用，且满足患者治疗的单个或多个周期，因此提供比现有更便利的治疗方法。
本文描述的稳定或防腐制剂或溶液中的至少一种IL-23p40 Ig衍生蛋白或特定部分或变体可依据本发明经各种传递方法给予患者，所述方法包括SC或IM注射；透皮、肺、透粘膜、植入、渗透泵、药筒、微量泵或其它技术人员了解的方法，如本领域所熟知的。
治疗应用
本发明也提供在细胞、组织、器官、动物或患者中用于调整或治疗IL-23p40相关病症或疾病的方法，所述疾病或病症包括但不限于至少一种以下疾病：类风湿性关节炎、青少年类风湿性关节炎、青少年类风湿性关节炎全身性发病、牛皮癣性关节炎、强直性关节炎、胃溃疡、血清阴性关节病、骨关节炎、炎性肠病、溃疡性结肠炎、***性红斑狼疮、抗磷脂综合症、虹膜睫状体炎/眼色素层炎/视神经炎、特发性肺纤维变性、全身性血管炎/韦格纳肉芽肿病、肉样瘤病、***/输精管切除逆转过程、过敏性/特异反应性疾病、哮喘、过敏性鼻炎、湿疹、过敏性接触性皮炎、变应性结膜炎、过敏性肺炎、移植、器官移植排斥、移植物抗宿主疾病、全身炎症反应综合症、脓毒病综合症、革兰氏阳性脓毒症、革兰氏阴性脓毒症、培养阴性脓毒症、真菌脓毒症、中性白细胞缺乏性发热、尿脓毒症、脑膜炎球菌血症、创伤/出血、烧伤、电离射线照射、急性胰腺炎、成人呼吸窘迫综合症、类风湿性关节炎、酒精诱导的肝炎、慢性炎性病变、肉样瘤病、节段性回肠炎、镰状细胞性贫血、糖尿病、肾病、特异反应性疾病、过敏性反应、过敏性鼻炎、枯草热、全年性鼻炎、结膜炎、子宫内膜异位、哮喘、荨麻疹、全身性过敏性反应、皮炎、恶性贫血、溶血性疾病、血小板减少、任何器官和组织的移植排斥、肾脏移植排斥、心脏移植排斥、肝脏移植排斥、胰腺移植排斥、肺移植排斥、骨髓移植(BMT)排斥、同种移植皮片排异反应、软骨移植排斥、骨移植物排斥、小肠移植排斥、胎儿胸腺植入排斥、甲状旁腺移植排斥、任何器官和组织的异种移植排斥、同种异体移植排斥、抗受体超敏反应、格拉夫斯症、雷诺病、B型胰岛素抗性糖尿病、哮喘、重症肌无力、抗体介导的细胞毒、III型超敏反应、***性红斑狼疮、POEMS综合症(多发性神经病、器官巨大症、内分泌疾病、单克隆丙种球蛋白病和皮肤变化综合症)、多发性神经病、器官巨大症、内分泌疾病、单克隆丙种球蛋白病、皮肤变化综合症、抗磷脂综合症、天疱疮、硬皮病、混合型***病、自发性阿狄森病、糖尿病、慢性活动性肝炎、原发性胆汁性肝硬化、白癜风、血管炎、MI心切开术后综合症、IV型超敏反应、接触性皮炎、过敏性肺炎、同种异体移植物排斥、细胞内生物引起的肉芽肿、药物敏感性、代谢/自发性疾病、威尔逊氏病、血色素沉着症、α1抗胰蛋白酶缺乏症、糖尿病视网膜病、桥本氏甲状腺炎、骨质疏松症、下丘脑-垂体-肾上腺轴评价、原发性胆汁性肝硬化、甲状腺炎、脑脊髓炎、恶病质、囊性纤维化、新生儿慢性肺病、肺慢性阻塞性疾病(COPD)、家族性噬红细胞性淋巴组织细胞增生症、皮肤疾病、牛皮癣、脱毛症、肾病综合症、肾炎、肾小球肾炎、急性肾功能衰竭、血液特析、***、中毒、先兆子痫、okt3治疗、抗cd3治疗、细胞因子疗法、化疗、放疗(如包括但不限于虚弱、贫血、恶质病等)、慢性水杨酸酯中毒、急性或慢性细菌感染、急性或慢性寄生或感染过程(包括细菌、病毒或真菌感染)、HIV感染/HIV神经病变、脑膜炎、肝炎(如甲型、乙型或丙型等)、脓毒性关节炎、腹膜炎、肺炎、会厌炎、大肠杆菌0157:h7、溶血性尿毒综合症/血栓溶解性血小板减少性紫癜、疟疾、登革出血热、利什曼病、麻风病、中毒性休克综合症、链球菌肌炎、气性坏疽病、结核分支杆菌、鸟分支杆菌细胞内水肿、卡氏肺囊虫性肺炎、***症性疾病、***/***、军团菌、莱姆病、A型流感、EB病毒、与生命有关的噬血细胞综合症、致命脑炎/无菌性脑膜炎、神经变性疾病、多发性硬化症、偏头痛、艾滋病痴呆综合症、脱髓鞘性病如多发性硬化症和急性横贯性脊髓炎；锥体外和小脑疾病如皮质脊髓***损伤；基底核紊乱或小脑紊乱；运动机能亢进的运功失调如亨廷顿舞蹈症和老年性舞蹈病；药物引起的运动失调如由阻断中枢神经***多巴胺受体的药物诱导的疾病；运动机能减退的运动失调如帕金森病；进行性核上麻痹；小脑结构性损伤；脊髓小脑变性如脊髓性共济失调、弗里德赖希共济失调、小脑皮质变性、多重***退化(Mencel，Dejerine-Thomas，Shi-Drager，and Machado-Joseph)；***紊乱(多神经炎型遗传性运动失调、血β脂蛋白缺乏症、共济失调、毛细血管扩张和线粒体多***疾病)；脱髓鞘核紊乱如多发性硬化症、急性横贯性脊髓炎；运动单位紊乱如神经原性肌肉萎缩(前角细胞变性，如肌萎缩性脊髓侧索硬化、婴儿型脊髓性肌萎缩和青少年脊髓性肌萎缩)；阿尔茨海默氏病；中年期唐氏综合症；弥漫性Lewy体疾病；Lewy体型老年痴呆症；韦尼克-科尔萨科夫综合症；慢性酒精中毒；克雅氏病；亚急性硬化性全脑炎、哈-斯病；拳击员痴呆、神经外伤性损伤(例如但不限于脊髓损伤、脑损伤、震荡和重复性震荡)、疼痛、炎性痛、自闭症、抑郁、中风、认知功能紊乱、癫痫等。这种方法任选包括给予需要这种调节、治疗或治疗的细胞、组织、器官、动物或患者有效量的至少一种组合物或药物组合物，其中包含至少一种IL-23p40 Ig衍生蛋白或特定部分或变体。
本发明的任何方法可包括给予需要这种调节、治疗或治疗的细胞、组织、器官、动物或患者有效量的组合物或药物组合物，其中包含至少一种IL-23p40 Ig衍生蛋白或特定部分或变体。这种方法还可任选包括共同给药或联合治疗以治疗这种免疫疾病，其中给予所述至少一种IL-23p40 Ig衍生蛋白、其特定部分或变体在给予选自以下的至少一种药物之前、同时和/或之后：多发性硬化症治疗剂(包括但不限于β干扰素1a和β干扰素1b(如AvonexTM、RebifTM、BetaseonTM)、格拉默乙酸盐(如Copaxone)、环磷酰胺、硫唑嘌呤、糖皮质激素、氨甲蝶呤、紫杉醇、2-氯脱氧腺苷、米托蒽醌、IL-10、TGBb、CD4、CD52、antegren、CD11、CD18、TNFα、IL-1、IL-2和/或CD4抗体或抗体受体融合物、α干扰素、免疫球蛋白、Lismide(RequinimaxTM)、***-1(IGF-1)、elprodil、吡非尼酮、口服髓磷脂或者作用于以下一种或多种的化合物：髓磷脂破坏性自身免疫抑制、免疫调节、激活、增殖、T细胞的迁移和/或细胞功能抑制、抑制T细胞受体/肽/MHC-II相互作用、诱导T细胞无反应性、自反应T细胞消除、跨血脑屏障运输减少、促炎症反应(Th1)和免疫调节(Th2)细胞因子平衡的变化、基质金属蛋白酶抑制剂的抑制、神经蛋白、减缓神经胶质增生、促进髓磷脂再生)、TNF拮抗剂(例如但不限于TNF Ig衍生蛋白或片段、可溶性TNF受体或片段、它们的融合蛋白或小分子TNF拮抗剂)、抗风湿剂、肌肉松弛剂、***、非甾体抗炎药(NSAID)、止痛剂、麻醉剂、镇静剂、局部麻醉剂、神经肌肉阻滞剂、抗微生物剂(例如氨基糖苷类、抗真菌药、抗寄生虫药、抗病毒药、碳青霉烯、头孢菌素、氟喹诺酮、大环内酯、青霉素、磺胺、四环素、其它抗微生物剂)、抗牛皮癣剂、皮质类固醇、同化类固醇、IL-23p40药物、矿物质、营养剂、甲状腺剂、维生素、钙相关的激素、止泻剂、镇咳剂、止吐剂、抗溃疡药、缓泻药、抗凝血剂、***(如α***)、非格司亭(如G-CS，Neupogen)、沙格司亭(GM-CSF，Leukine)、免疫接种、免疫球蛋白、免疫抑制剂(如巴利昔单抗、环孢菌素A、达珠单抗)、生长激素、激素替代药物、***受体调节剂、扩瞳药、睫状肌麻痹剂、烷化剂、抗代谢药、有丝***抑制剂、放射药物、抗抑郁药、抗躁狂剂、抗精神病药、抗焦虑剂、***、拟交感神经药、***、多奈哌齐、他克林、哮喘药、β激动剂、吸入类固醇、白三烯抑制剂、甲基黄嘌呤、色甘酸钠、肾上腺素或其类似物、链球菌DNA酶α(Pulmozyme)、细胞因子或细胞因子拮抗剂。适合的剂量为本领域所熟知。参见例如Wells等，eds.，Pharmacotherapy Handbook，2nd Edition，Appleton andLange，Stamford，CT(2000)；PDR Pharmacopoeia，Tarascon PocketPharmacopoeia 2000，Deluxe Edition，Tarascon Publishing，Loma Linda，CA(2000)，每个参考文献都通过引用整体结合到本文中。
适合本发明组合物、联合治疗、同时给药、装置和/或方法(还包含至少一种本发明的抗体、其特定部分和变体)的TNF拮抗剂包括但不限于抗TNF Ig衍生蛋白、它的抗原结合片段、特异性结合TNF的受体分子；阻止和/或抑制TNF合成、释放和其作用于靶细胞的化合物如沙立度胺、替尼达普，磷酸二酯酶抑制剂(如己酮可可豆碱和咯利普兰)，A2b腺苷受体激动剂和A2b腺苷受体增强剂；阻止和/抑制TNF受体信号转导的化合物，如有丝***原激活蛋白(MAP)激酶抑制剂；阻断和/或抑制膜TNF裂解的化合物，如金属蛋白酶抑制剂；阻断和/或抑制TNF活性的化合物，如血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂(如卡托普利)；和阻断和/或抑制TNF产生和/或合成的化合物如MAP激酶抑制剂。
本文所使用的“肿瘤坏死因子Ig衍生蛋白”、“TNF Ig衍生蛋白”、“TNFαIg衍生蛋白”或片段等，在体外、原位和/或优选在体内降低、阻断、抑制、消除或干扰TNFα的活性。例如，合适的本发明TNF人Ig衍生蛋白可结合TNFα，包括抗TNF Ig衍生蛋白、它的抗原结合片段和与TNFα特异性结合的特定突变体或域。适合的TNF抗体或片段也可降低、阻断、消除、干扰、阻止和/或抑制TNFRNA、DNA和蛋白的合成、TNF的释放、TNF受体的信号转导、TNF膜裂解、TNF活性、TNF产生和/或合成。
嵌合体Ig衍生蛋白cA2由高亲和力中和小鼠抗人TNFα IgG1 Ig衍生蛋白的抗原结合可变区、指定的A2、人IgG1的恒定区、κ免疫球蛋白组成。人IgG1 Fc区改善了同种Ig衍生蛋白效应子作用，增加了循环血清半衰期，降低了Ig衍生蛋白的免疫原性。嵌合Ig衍生蛋白cA2的亲合力和表位特异性来源于鼠类Ig衍生蛋白A2的可变区。在一个具体实施方案中，编码鼠类Ig衍生蛋白A2可变区的核苷酸优选的来源为A2杂交瘤细胞系。
嵌合体A2(cA2)以剂量依赖方式中和了天然和重组人TNFα的细胞毒性效应。从嵌合Ig衍生蛋白cA2和重组人TNFα的结合测定中，计算嵌合Ig衍生蛋白cA2的亲合常数为1.04×1010M-1。通过竞争性抑制用于测定单克隆Ig衍生蛋白特异性和亲和力的优选方法可发现于以下：Harlow等，Ig derived protein：A Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York，1988；Colligan等，eds.，Current Protocols in Immunology，Greene PublishingAssoc.and Wiley Interscience，New York，(1992-2003)；Kozbor等，Immunol Today，4：72-79(1983)；Ausubel等，eds.Current Protocols inMolecular Biology，Wiley Interscience，New York(1987-2003)；和Muller，Meth.Enzymol.，92：589-601(1983)，参考文献通过引用整体结合到本文中。
在一个具体实施方案中，鼠类单克隆Ig衍生蛋白A2由称为c134A的细胞系产生。嵌合Ig衍生蛋白cA2由称为c168A的细胞系产生。
可用于本发明的单克隆抗TNF Ig衍生蛋白的其它实例在本领域有所描述(参见例如美国专利第5,231,024号；Mller，A.等，Cytokine2(3)：162-169(1990)；美国专利申请第07/943,852号(1992年9月11日提交)；Rathjen等，国际公开号WO 91/02078(1991年2月21日公开)；Rubin等，欧洲专利公告号第0 218 868(1987年4月22日公开)；Yone等，欧洲专利公告号第0 288 088(1988年10月26日)；Liang，等，Bioclaern.Biophys.Res.Comm.137：847-854(1986)；Meager，等，Hybridoma 6：305-311(1987)；Fendly等，Hybridoma 6：359-369(1987)；Bringman，等，Hybridoma 6：489-507(1987)；和Hirai等，J.ImmunoLMeth 96：57-62(1987)，参考文献通过引用整体结合到本文中)。
TNF受体分子
用于本发明的优选TNF受体分子是以高亲合力结合TNFα(参见例如Feldmann等，国际公开号WO 92/07076(1992年4月30日公开)；Schall等，Cell 61：361-370(1990)；和Loetscher等，Cell 61：351-359(1990)，参考文献通过引用整体结合到本文中)，并且任选具有低免疫原性的受体分子。具体而言，55kDa(p55 TNF-R)和75kDa(p75TNF-R)TNF细胞表面受体用于本发明。这些受体的截短形式，包括受体的胞外域(ECD)或它们的功能部分(参见例如Corcoran等，Eur.J.Biochem.223：831-840(1994))也用于本发明。包含ECD的TNF截短形式作为30kDa和40kDa TNFα抑制性结合蛋白已在尿和血清中被检测到(Engelmann，H.等，J.Biol.Chem.265：1531-1536(1990))。TNF受体多聚体分子和TNF免疫受体融合分子，以及它们的衍生物和片段或部分，为用于本发明方法和组合物的TNF受体分子的其它实例。可用于本发明的TNF受体分子其特征为能够长期治疗患者，能极好缓和症状且低毒。低免疫原性和/或高亲和力，以及其它未定义的性质，可有助于达到治疗效果。
用于本发明的TNF受体多聚体分子包含两个或更多TNF受体ECD的全部或功能部分，经一个或多个多肽联结子或其它非肽联结子如聚乙二醇(PEG)连接。多聚体分子可进一步包含分泌蛋白的信号肽以指导多聚体分子的表达。这些多聚分子和它们的生产方法已描述于美国申请第08/437,533(1995年5月9日提交)，其内容通过引用整体结合到本文中。
用于本发明方法和组合物的TNF免疫受体融合分子包含一种或多种免疫球蛋白分子的至少一部分和一种或多种TNF受体的全部或功能部分。可将这些免疫受体融合分子装配为单体、异源多聚体或同源多聚体。免疫受体融合分子也可是单价或多价。这种TNF免疫受体融合分子的实例是TNF受体/IgG融合蛋白。TNF免疫受体融合分子和它们的生产方法已描述于本领域中(Lesslauer等，Eur.J.Immunol.21：2883-2886(1991)；Ashkenazi等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA88：10535-10539(1991)；Peppel等，J.Exp.Med.174：1483-1489(1991)；Kolls等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：215-219(1994)；Butler等，Cytokine 6(6)：616-623(1994)；Baker等，Eur.J.Immunol.24：2040-2048(1994)；Beutler等，美国专利第5,447,851号；和美国专利申请第08/442,133(1995年5月16日提交)，每篇参考文献通过引用整体结合到本文中)。用于生产免疫受体融合分子的方法也可发现于Capon等，美国专利第5,116,964号；Capon等，美国专利第5,225,538号；和Capon等，Nature 337：525-531(1989)，参考文献通过引用整体结合到本文中。
TNF受体分子的功能等价物、衍生物、片段或区是指部分TNF受体分子或部分编码TNF受体分子的TNF受体分子序列，其具有足够的大小和序列，在功能上类似用于本发明的TNF受体分子(例如以高亲和力结合TNFα且具有低免疫原性)。TNF受体分子的功能等价物也包括修饰的TNF受体分子，其在功能上类似用于本发明的TNF受体分子(例如以高亲和力结合TNFα且具有低免疫原性)。例如，TNF受体分子的功能等价物可含有“沉默”密码子或一个或多个氨基酸置换、缺失或添加(如一个氨基酸置换另一个氨基酸，或一个编码相同或不同疏水性氨基酸的密码子置换另一个编码疏水性氨基酸的密码子)。参见Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology，GreenePublishing Assoc.and Wiley-Interscience，New York(1987-2003)。
细胞因子包括任何已知的细胞因子。参见例如CopewithCytokines.com。细胞因子拮抗剂包括但不限于任何Ig衍生蛋白、片段或模拟物、任何可溶性受体、片段或模拟物、任何小分子拮抗剂，或任何它们的组合。
治疗治疗
本发明的任何方法可包括用于治疗IL-23p40介导的疾病的方法，包括给予需要这种调节、治疗或治疗的细胞、组织、器官、动物或患者有效量的组合物或药物组合物，其中包含至少一种IL-23p40Ig衍生蛋白或特定部分或变体。
典型地，病变疾病的治疗通过给予有效量或剂量的至少一种IL-23p40 Ig相关蛋白组合物来进行，所给予的平均总量范围为每千克患者体重每剂至少约0.01-500mg至少一种IL-23p40 Ig衍生蛋白或特定部分或变体，优选每千克患者体重至少约0.1-100mg Ig衍生蛋白或特定部分或变体，单次或多次给药，这取决于组合物中含有的Ig蛋白的比活性。或者，有效血清浓度包括0.1-5000μg/ml血清浓度，单次或多次给药。合适的剂量为医药从业者所已知，当然取决于具体的疾病状态、所给予的组合物的比活性和经受治疗的具体患者。在某些情况中，为得到所需治疗量，必须提供重复给药，即重复具体监控或确定剂量的单次给药，直到获得需要的日剂量或效果。
优选的剂量可任选包括：0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99和/或100mg/kg/次给药，或其间的任何范围、值或部分，或者单次或多次给药获得的血清浓度为：0.1、0.5、0.9、1.0、1.1、1.2、1.5、1.9、2.0、2.5、2.9、3.0、3.5、3.9、4.0、4.5、4.9、5.0、5.5、5.9、6.0、6.5、6.9、7.0、7.5、7.9、8.0、8.5、8.9、9.0、9.5、9.9、10、10.5、10.9、11、11.5、11.9、20、12.5、12.9、13.0、13.5、13.9、14.0、14.5、4.9、5.0、5.5、5.9、6.0、6.5、6.9、7.0、7.5、7.9、8.0、8.5、8.9、9.0、9.5、9.9、10、10.5、10.9、11、11.5、11.9、12、12.5、12.9、13.0、13.5、1 3.9、14、14.5、15、15.5、15.9、16、16.5、16.9、17、17.5、17.9、18、18.5、18.9、19、19.5、19.9、20、20.5、20.9、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、96、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500和/或5000μg/ml血清浓度，或其间的任何范围、值或部分。
或者，依据已知的因素可改变给予的剂量，所述因素例如具体药物的药动学特征和给药模式和途径；受者的年龄、健康状况和体重；症状的性质和程度、合并治疗的类型、治疗频率和所需效果。通常，活性有效成分的剂量可为每千克体重约0.1-100mg。通常，每次给予每千克体重0.1-50mg、优选为0.1-10mg，或以缓释形式，可有效获得所需结果。
作为非限制性实例，通过单次或周期性给予0.1-100mg/kg本发明至少一种Ig衍生蛋白或特定部分或变体，提供人或动物的治疗，例如每天0.5、0.9、1.0、1.1、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、1 3、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、45、50、60、70、80、90或100mg/kg，在至少以下天的之一：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40，或者，择一或此外，至少以下周的之一：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51或52，或者，择一或此外，至少以下年的之一：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20年，或者其中的任何组合，使用单次、输液或重复给药。
适合内部给药的剂型(组合物)通常每单位或容器含有约0.1mg至约500mg活性成分。在这些药物组合物中，活性成分通常占整个组合物总重量的约0.5-99.999％。
对于肠胃外给药，可将Ig衍生蛋白或特定部分或变体制成溶液、混悬液、乳液或冻干粉末，与药物可接受肠胃外载体联合或单独提供。这种载体的实例为水、盐水、林格氏溶液、葡萄糖溶液和1-10％人血清白蛋白。也可使用脂质体和非水载体，如不挥发油。载体或冻干粉末中可含有添加剂，其维持等渗性(如氯化钠、甘露醇)和化学稳定性(如缓冲液和防腐剂)。制剂通过已知的或合适的方法灭菌。
合适的药用载体描述于最新版的Remington′s PharmaceuticalSciences，A.Osol，本领域的标准参考文献。
其它给药方式
依据本发明可使用许多已知和已开发的方式，用于给予药学有效量的至少一种本发明的IL-23p40 Ig衍生蛋白或特定部分或变体。而肺部给药在下列的描述中使用，依据本发明可使用其它给药模式获得合适的结果。
本发明的IL-23p40 Ig衍生蛋白可在载体内，作为溶液、乳液、乳胶体或悬浮液或干粉，使用任何适合给药的各种装置和方法，经吸入或本文描述或本领域内已知的其它方式传递。
肠胃外制剂和给药
用于肠胃外给药的制剂可含有作为普通赋形剂的无菌水或盐水、聚亚烷基二醇如聚乙二醇、植物来源油脂、氢化萘等。用于注射的水性或油性悬浮液可通过使用适当的乳化剂或湿润剂和悬浮剂依据已知方法制备。用于注射的药物是无毒、可非口服给药的稀释剂，如水溶液或溶剂中的无菌可注射溶液或悬浮液。允许可用载体或溶剂、水、林格氏溶液、等渗盐水等；可使用普通溶剂或悬浮溶剂、无菌不挥发性油。为达到这些目的，可使用各种不挥发性油和脂肪酸，包括天然或合成或半合成脂肪油或脂肪酸；天然或合成或半合成甘油单酯或甘油二酯或甘油三酯。肠胃外给药为本领域已知，包括但不限于常规的注射方法、美国专利第5,851,198号所描述的气压无针头注射装置、美国专利第5,839,446中描述的激光穿孔装置，它们通过引用整体结合到本文中。
其它传递方式
本发明还进一步涉及通过以下方式给予至少一种IL-23p40 Ig衍生蛋白或特定部分或变体：肠胃外、皮下、肌内、静脉内、推注、***、直肠、口腔、舌下、鼻内或透皮方式。可制备抗IL-23p40 Ig衍生蛋白或特定部分或变体的组合物，用于肠胃外(皮下、肌内或静脉内)给药，尤其以液体溶液或悬浮液形式；用于***或直肠内给药，尤其以半固体形式，如乳膏和栓剂；用于口腔或舌下给药，尤其以片剂或胶囊形式；或鼻内给药，尤其以粉末、滴鼻或气溶胶或某些介质形式；或透皮，尤其以凝胶、软膏、洗剂、悬浮液或贴剂传递***形式，贴剂具有化学增强剂如二甲亚砜，以改变皮肤结构或增加透皮贴剂中的药物浓度(Junginger等，在″Drug PermeationEnhancement″中；Hsieh，D.S.，Eds.，pp.59-90(Marcel Dekker，Inc.NewYork 1994，通过引用整体结合到本文中)，或具有氧化剂以允许在皮肤表面施用含有蛋白和多肽的制剂(WO 98/53847)，或应用电场以产生短暂转运途径(例如电穿孔)或增强带电荷药物穿过皮肤的移动性(如离子电渗疗法)，或应用超声波例如超声促渗(美国专利第4,309,989号和第4,767,402号)(上述出版物或专利通过引用整体结合到本文中)。
肺/鼻给药
对于肺部给药，优选至少一种IL-23p40 Ig衍生蛋白或特定部分或变体的组合物以有效到达肺下气道或窦道的颗粒大小传递。依据本发明，至少一种IL-23p40 Ig衍生蛋白或特定部分或变体可经任何各种本领域已知的吸入或鼻装置传递，用于经吸入给予治疗剂。能在患者窦腔和肺泡中沉积雾化制剂的这些装置包括定量吸入器、喷雾器、干粉发生器、喷射器等。其它适合指导肺部或鼻给予Ig衍生蛋白或特定部分或变体的装置也为本领域已知。所有这些装置都可使用适合于Ig衍生蛋白或特定部分或变体分散在气溶胶内给药的制剂。这种气溶胶可由溶液(水性或非水)或固体颗粒组成。定量吸入器，如Ventolino定量吸入器，典型使用抛射气体且需要在吸入时驱动(参见例如WO 94/16970、WO 98/35888)。干粉吸入器如TurbuhalerTM(Astra)、Rotahaler(Glaxo)、Disks(Glaxo)、由Inhale Therapeutics推入市场的装置SpirosTM吸入器(Dura)和Spinhaler干粉吸入器(Fisons)运用呼吸驱动混合粉末(US 4668218 Astra、EP 237507 Astra、WO 97/25086 Glaxo、WO 94/08552 Dura、US 5458135 Inhale、WO94/06498 Fisons，通过引用整体结合到本文中)。喷雾器如AERxTMAradigm、Ultravene喷雾器(Mallinckrodt)和Acorn II喷雾器(MarquestMedical Products)(US 5404871 Aradigm、WO 97/22376)(上述参考文献通过引用整体结合到本文中)，从溶液中产生气溶胶，而定量吸入器、干粉吸入器等产生了小颗粒气溶胶。这些商业可获得的吸入装置的具体实施例被确定为适合实施本发明的代表性具体装置，但不限制本发明的范围。优选包含至少一种IL-23p40 Ig衍生蛋白或特定部分或变体的组合物经干粉吸入器或喷射器传递。用于给予至少一种本发明Ig衍生蛋白或特定部分或变体的吸入装置具有某些所需特征。例如，通过吸入装置传递可靠、可重复和精确。吸入装置可任选传递小的干燥颗粒，例如对于良好的呼吸，小于约10μm，优选约1-5μm。
喷射给予IL-23p40 Ig衍生蛋白或特定部分或变体的组合物
通过向至少一种IL-23p40 Ig衍生蛋白或特定部分或变体的悬浮液或溶液施加压力，在压力下使其通过喷嘴，可产生包含IL-23p40 Ig衍生蛋白或特定部分或变体组合物蛋白的喷雾。可选择喷嘴大小、构型、应用压力和液体加料速度，以获得所需输出和颗粒大小。例如，通过将电场结合毛细管或喷嘴加料，可产生电喷射。有利的是，经喷射器传递的至少一种IL-23p40 Ig衍生蛋白或特定部分或变体组合物的蛋白，其颗粒的大小小于约10μm，优选在约1μm至约5μm的范围内，最优选为约2μm至约3μm。
适合使用喷射器的至少一种IL-23p40 Ig衍生蛋白或特定部分或变体组合物蛋白制剂，典型包括含水溶液中的Ig衍生蛋白或特定部分或变体组合物蛋白，浓度为每毫升溶液或mg/gm约0.1mg至约100mg至少一种IL-23p40 Ig衍生蛋白或特定部分或变体组合物蛋白，或其间的任何范围或值，例如但不限于0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、45、50、60、70、80、90或100mg/ml或mg/gm。此制剂可包含添加剂如赋形剂、缓冲液、等渗剂、防腐剂、表面活性剂，且优选锌。此制剂也可包含用于稳定Ig衍生蛋白或特定部分或变体组合蛋白的赋形剂或试剂，如缓冲剂、还原剂、填充蛋白或碳水化合物。用于配制Ig衍生蛋白或特定部分或变体组合物蛋白的填充蛋白包括白蛋白、精蛋白等。典型的用于配制Ig衍生蛋白或特定部分或变体组合物蛋白的碳水化合物包括蔗糖、甘露醇、乳糖、海藻糖、葡萄糖等。Ig衍生蛋白或特定部分或变体组合物蛋白制剂也可包含表面活性剂，其能降低或阻止Ig衍生蛋白或特定部分或变体组合物蛋白的表面诱导聚集，此聚集由气溶胶形成中溶液雾化引起。可使用各种常规表面活性剂，如聚氧乙烯脂肪酸酯和醇，以及聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯。量通常在制剂重量0.001-14％之间的范围内。特别优选用于本发明的表面活性剂为聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯、聚山梨酯80、聚山梨酯20等。本领域已知的用于蛋白制剂的其它试剂可包含在本发明制剂内，所述蛋白如IL-23p40 Ig衍生蛋白或特定部分或变体。
通过喷雾器给予IL-23p40 Ig衍生蛋白或特定部分或变体的组合物
通过喷雾器如喷气喷雾器或超声波喷雾器，可给予Ig衍生蛋白或特定部分或变体组合物蛋白。典型的是，在喷气喷雾器中，压缩气源用于穿过喷孔产生高速空气喷射。当气体膨胀超过喷嘴时，产生低压区，其驱使Ig衍生蛋白或特定部分或变体组合物蛋白的溶液穿过与贮液器相联的毛细管。来自毛细管的液流被剪切成不稳定丝和小滴，当离开毛细管时产生了气溶胶。可使用一定范围的构型、流速和挡板类型，以从特定喷气喷雾器获得所需性能特征。在超声波喷雾器中，使用高频电能产生震动、机械能，典型使用压电换能器。这种能量直接或者通过偶联流体传送到Ig衍生蛋白或特定部分或变体组合物蛋白制剂中，产生包含Ig衍生蛋白或特定部分或变体组合物蛋白的气溶胶。有利的是，通过喷雾器传递的Ig衍生蛋白或特定部分或变体组合物蛋白其颗粒大小小于10μm，优选在约1μm至约5μm的范围内，最优选为约2μm至约3μm。
适合使用喷雾器的至少一种IL-23p40 Ig衍生蛋白或特定部分或变体的制剂，无论是喷气或是超声，典型包含浓度为每毫升溶液约0.1mg至约100mg至少一种IL-23p40 Ig衍生蛋白或特定部分或变体蛋白。此制剂可包括试剂如赋形剂、缓冲剂、等渗剂、防腐剂、表面活性剂，优选锌。制剂还可包含用于稳定至少一种IL-23p40 Ig衍生蛋白或特定部分或变体组合物蛋白的赋形剂或试剂，如缓冲剂、还原剂、填充蛋白或碳水化合物。用于配制至少一种Ig衍生蛋白或特定部分或变体组合物蛋白的填充蛋白包括白蛋白、精蛋白等。典型的用于配制至少一种Ig衍生蛋白或特定部分或变体组合物蛋白的碳水化合物包括蔗糖、甘露醇、乳糖、海藻糖、葡萄糖等。该至少一种Ig衍生蛋白或特定部分或变体制剂也可包含表面活性剂，其可降低或阻止至少一种Ig衍生蛋白或特定部分或变体的表面诱导聚集，此聚集由气溶胶形成中溶液雾化引起。可使用各种常规表面活性剂，如聚氧乙烯脂肪酸酯和醇，以及聚氧乙烯脱水山梨醇脂肪酸酯。量通常在制剂重量的0.001和4％之间。特别优选用于本发明目的的表面活性剂为脱水山梨醇单油酸酯、聚山梨酯80、聚山梨酯20等。本领域已知的用于蛋白制剂的其它试剂可包含在本发明制剂内，所述蛋白如Ig衍生蛋白或特定部分或变体。
通过定量吸入器给予IL-23p40 Ig衍生蛋白或特定部分或变体组合物
在定量吸入器(MDI)中，抛射剂、至少一种IL-23p40 Ig衍生蛋白或特定部分或变体和任何赋形剂或其它添加剂都包含在罐中，作为包含液化压缩气体的混合物。开动计量阀释放作为气溶胶的混合物，其中优选含有尺寸范围小于10μm的颗粒，优选约1μm至约5μm，最优选为约2μm至约3μm。通过本领域技术人员已知的各种方法，包括喷气磨、喷雾干燥、临界点浓集等，产生Ig衍生蛋白或特定部分或变体组合物蛋白的制剂，使用此制剂可获得所需气溶胶颗粒尺寸。优选的定量吸入器包括由3M或Glaxo制备和使用氢氟烃抛射剂的定量吸入器。
使用定量吸入器装置的至少一种IL-23p40 Ig衍生蛋白或特定部分或变体的制剂通常包含含有至少一种IL-23p40 Ig衍生蛋白或特定部分或变体的细微粉末，作为非水介质中的悬浮液，例如，在表面活性剂帮助下悬浮于抛射剂中。抛射剂可为任何用于此目的的常规材料，如含氯氟烃、氢氯氟烃、氢氟烃或烃，包括三氯氟甲烷、二氯二氟甲烷、二氯四氟乙醇和1，1，1，2-四氟乙烷、HFA-134a(氢氟烷-134a)、HFA-227(氢氟烷-227)等。抛射剂优选为氢氟烃。可选择表面活性剂以稳定该至少一种IL-23p40 Ig衍生蛋白或特定部分或变体作为悬浮液悬浮于抛射剂中，以保护活性药物免于化学降解等。适合的表面活性剂包括失水山梨醇三油酸酯、大豆卵磷脂、油酸等。在某些情况中，溶液气雾剂优选使用溶剂如乙醇。本领域已知的用于蛋白制剂的其它试剂也包含在本发明制剂中。
本领域普通技术人员应认识到，通过本文未描述的装置，通过肺部给予至少一种IL-23p40 Ig衍生蛋白或特定部分或变体组合物，可完成本发明的方法。
口服制剂和给药
口服给药的制剂依赖于同时给予辅料(例如间苯二酚和非离子表面活性剂如聚氧乙烯油基醚和正十六烷基聚乙烯醚)以人为增加肠壁的通透性，以及依赖于同时给予酶抑制剂(例如胰腺胰蛋白酶抑制剂、二异丙基氟磷酸酯(DFF)和抑肽酶)以抑制酶降解。用于口服给药的固态剂型的活性组分化合物可与至少一种添加剂混合，包括蔗糖、乳糖、纤维素、甘露醇、海藻糖、棉子糖、麦芽糖醇、葡聚糖、淀粉、琼脂、精氨酸盐(arginate)、壳多糖、壳聚糖、果胶、西黄蓍胶、***胶、明胶、胶原、酪蛋白、白蛋白、合成或半合成聚合物和甘油酯。这些剂型也可包含其它类型的添加剂，例如惰性稀释剂、润滑剂如硬脂酸镁、对羟基苯甲酸酯、防腐剂如山梨酸、抗坏血酸、α生育酚、抗氧化剂如半胱氨酸、崩解剂、粘合剂、增稠剂、缓冲剂、甜味剂、调味剂、芳香剂等等。
可进一步将片剂和丸剂加工成包肠溶衣的制剂。用于口服给药的液体制剂包括允许用于医疗用途的乳剂、糖浆剂、酏剂、悬浮液和溶液剂。这些制剂可含有常用于所述领域的惰性稀释剂例如水。也已经描述了脂质体作为给药体系用于胰岛素和肝素(美国专利第4,239,754号)。最近，混合氨基酸的人工聚合物(类蛋白)微球已被用于传递药物(美国专利第4,925,673号)。此外，美国专利第5,879,681号和美国专利第5,5,871,753号描述的载体化合物用于口服传递生物活性药物，它们为本领域已知。
粘膜制剂和给药
对于经粘膜表面吸收，给予至少一种IL-23p40 Ig衍生蛋白或特定部分或变体的组合物和方法包含乳剂，其中含有许多亚微米颗粒、粘膜粘着性高分子、生物活性肽和水连续相，通过乳剂颗粒的粘膜粘附促进了经粘膜表面吸收(美国专利第5,514,670号)。适合施用本发明乳剂的粘膜表面包括角膜、结膜、口腔、舌下、鼻、***、肺、胃、肠和直肠给药途径。用于***或直肠给药的制剂，例如栓剂，可含有例如聚亚烷基二醇、凡士林、可可豆脂等作为赋形剂。用于鼻内给药的制剂可为固体，含有例如乳糖作为赋形剂，或可为水或油溶液滴鼻剂。用于***给药的赋形剂包括蔗糖、硬脂酸钙、硬脂酸镁、预胶化的淀粉等(美国专利第5,849,695)。
透皮制剂和给药
对于透皮给药，将至少一种IL-23p40 Ig衍生蛋白或特定部分或变体包入传递装置，如脂质体或聚合物纳米颗粒、微粒、微囊或微球(全部称为微粒，除非另有说明)。已知许多合适的装置，包括由合成聚合物和天然聚合物制备的微粒，合成聚合物如多羟基酸(如聚乳酸、聚乙醇酸和它们的共聚物)、聚原酸酯、聚酐和聚磷腈，所述天然聚合物如胶原、多聚氨基酸、白蛋白和其它蛋白、藻酸盐和其它多糖及它们的组合(美国专利第5,814,599)。
延时给药和制剂
有时希望长时间将本发明化合物传递给患者，例如单次给药释放一周至一年。可使用各种缓释、储库或植入剂型。例如，剂型可含有药物可接受的无毒化合物盐，此化合物盐在体液中溶解度低，例如(a)多元酸的酸加成盐，如磷酸、硫酸、柠檬酸、酒石酸、鞣酸、双羟萘酸、藻酸、聚谷氨酸、萘磺酸或萘二磺酸、聚半乳糖醛酸等的盐；(b)多价金属阳离子的盐，如锌、钙、铋、钡、镁、铝、铜、钴、镍、镉等的盐，或来自例如N，N’-二苄基乙二胺或乙二胺的有机阳离子的盐；或(a)和(b)的复合物(c)，例如鞣酸锌盐。此外，本发明的化合物，或者优选相对不溶性盐如上述盐，可被制成适合注射的凝胶，例如用芝麻油配制的单硬脂酸铝凝胶。特别优选的盐为锌盐、鞣酸锌盐、双羟萘酸盐等。用于注射的另外类型的缓释存储制剂含有分散包入缓慢降解的无毒非抗原性聚合物中的化合物或盐，聚合物例如聚乳酸/聚乙醇酸，例如描述于美国专利第3,773,919号。化合物，或优选相对不溶性盐如上述盐，也可被制成在胆固醇基质的硅橡胶丸中，尤其用于动物。其它缓释、储库或植入制剂，如气体或液体脂质体，为本领域已知(美国专利第5,770,222号，和″Sustained andControlled Release Drug Delivery Systems″，R.Robinson ed.，MarcelDekker，Inc.，N.Y.，1978)。
由于已在本发明中大体描述，通过参考以下实施例可更容易理解本发明，实施例以说明方式提供而不是限制本发明。
                    发明实施例
实施例1：在哺乳动物细胞中产生、克隆和表达抗IL-23p40免疫球蛋白衍生蛋白
使用已知的方法产生抗IL-23p40 Ig衍生蛋白，例如使用人IL-23免疫接种表达人抗体的鼠类或转基因小鼠，并使用已知方法和测定分离、克隆B细胞，选择对IL-23有特异性和抑制活性的B细胞(优选很小或不抑制IL-12活性)，例如本领域已知或本文描述的方法和测定(参见例如 www.copewithcytokines.de，在IL-23和IL-12下对IL-23蛋白、IL-23测定和IL-12测定的描述和参考，通过引用整体结合到本文中，如本领域已知的)。或者，克隆部分IL-12β1受体，并与抗体片段融合，产生能阻断IL-23与其受体结合，但不抑制IL-12结合其受体的融合蛋白，如本领域已知。
选择表达IL-23p40特异性抗体或融合蛋白的克隆，如本发明的抗IL-23p40 Ig衍生蛋白，它们能中和或抑制至少一种IL-23的活性，且基本上不抑制至少一种IL-12的活性。
克隆重链、轻链CDR、可变区或可变和恒定区，并置入合适的表达载体。典型的哺乳动物表达载体含有至少一种启动子元件，其介导mRNA转录开始，也包含Ig衍生蛋白或特定部分或变体编码序列以及转录终止和转录物聚腺苷酸化所需的信号。其它元件包括增强子、Kozak序列、侧面为RNA剪接供体和受***点的***序列。使用来源于SV40的早期和晚期启动子、来源于逆转录病毒(Retrovirus)的长末端重复(LTRS)如RSV、HTLVI、HIVI和巨细胞病毒(CMV)的早期启动子，可获得高效转录。然而，也可使用细胞元件(如人肌动蛋白启动子)。用于实施本发明的合适表达载体包括如下的载体：pIRESlneo、pRetro-Off、pRetro-On、PLXSN或pLNCX(Clonetech Labs，Palo Alto，CA)、pcDNA3.1(+/-)、pcDNA/Zeo(+/-)或pcDNA3.1/Hygro(+/-)(Invitrogen)、PSVL和PMSG(Pharmacia，Uppsala，Sweden)、pRSVcat(ATCC 37152)、pSV2dhfr(ATCC 37146)和pBC12MI(ATCC67109)。可使用的哺乳动物宿主细胞包括人HeLa293、H9和Jurkat细胞、小鼠NIH3T3和C127细胞、Cos1、Cos7和CV1、鹌鹑QC1-3细胞、小鼠L细胞和中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
或者，此基因能表达于稳定的细胞系中，其中含有***染色体的基因。使用选择标记如dhfr、gpt、新霉素或潮霉素共转染，允许鉴定和分离转染细胞。
也可扩增转染的基因，以大量表达编码的Ig衍生蛋白或特定部分或变体。DHFR(二氢叶酸还原酶)标记可用于发育的细胞系，其携带了几百个、甚至是几千个目标基因的拷贝。另一个有用的选择标记是谷氨酰胺合酶(GS)(Murphy等，Biochem.J.227：277-279(1991)；Bebbington等，Bio/Technology 10：169-175(1992))。使用这些标记，将哺乳动物细胞培养于选择培养基，选择具有最高抗性的细胞。这些细胞含有***染色体的扩增基因。中国仓鼠卵巢细胞(CHO)和NSO细胞经常被用于产生Ig衍生蛋白或特定部分或变体。
在CHO细胞中的克隆和表达
载体pC4用于表达IL-23p40 Ig衍生蛋白或特定部分或变体。质粒pC4是质粒pSV2-dhfr(ATCC Accession No.37 146)的衍生物。此质粒含有在SV40早期启动子控制下的小鼠DHFR基因。用这些质粒转染缺乏二氢叶酸活性的中国仓鼠卵巢细胞和其它细胞，通过在添加有化疗剂氨甲蝶呤的选择培养基(例如alpha minus MEM，LifeTechnologies，Gaithersburg，MD)中生长细胞进行选择。现已很好的证明，细胞中DHFR基因的扩增能抵抗氨甲蝶呤(MTX)(参见例如F.W.Alt等，J.Biol.Chem.253：1357-1370(1978)；J.L.Hamlin and C.Ma，Biochem.et Biophys.Acta 1097：107-143(1990)；和M.J.Page and M.A.Sydenham，Biotechnology 9：64-68(1991))。细胞于增加浓度的MTX中生长，通过过量产生目标酶DHFR发展对药物的抗性，这是DHFR基因扩增的结果。如果第二个基因与DHFR基因相连，通常可共同扩增和过量表达。本领域已知的是，这种方法可用于开发携带超过1000个扩增基因拷贝的细胞系。随后，当撤去氨甲蝶呤时，获得的细胞系含有***宿主细胞一个或多个染色体的扩增基因。
质粒pC4(也称为pC1)含有用于表达目标基因的强启动子，其为劳斯肉瘤病毒(Rous Sarcoma Virus)长末端重复(LTR)的强启动子(Cullen等，Molec.Cell.Biol.5：438-447(1985))外加从人巨细胞病毒(CMV)立即早期基因增强子分离到的片段(Boshart等，Cell 41：521-530(1985))。启动子下游为允许基因整合的BamHI、XbaI和Asp718限制性酶切位点；该多克隆位点便于目标基因的克隆。在这些克隆位点之后，质粒含有3′内含子和多腺苷酸化位点，以及大鼠前胰岛素原基因的终止信号。也可使用其它高效启动子用于表达，例如人b-肌动蛋白启动子、SV40早期或晚期启动子或源于其它逆转录病毒的长末端重复如HIV和HTLVI。可使用Clontech的Tet-On/Tet-On基因表达***和相似的***，在哺乳动物细胞中以调控方式表达IL-23p40(M.Gossen和H.Bujard，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：5547-5551(1992))。对于mRNA多腺苷酸化，也可使用其它信号如源于人生长激素或珠蛋白基因的信号。也可使用选择标记如gpt、G418或潮霉素，选择携带有***染色体的目标基因的稳定细胞系。有利的是，在开始时使用超过一个选择标记，例如G418加氨甲蝶呤。
通过本领域已知的方法，用限制性内切酶消化质粒pC4，然后使用牛小肠碱性磷酸酶去磷酸化。然后从1％琼脂糖凝胶中分离载体。
依据已知的方法步骤，用编码完整IL-23p40 Ig衍生蛋白或特定部分或变体的DNA序列，其对应于本发明IL-23p40 Ig衍生蛋白的HC和LC可变区。分离的编码合适人恒定区(即HC和LC区)的核苷酸也可用于该构建物(如载体p1351所提供)。
然后用T4 DNA连接酶将分离的可变区和恒定区编码DNA与去磷酸化的载体连接起来。然后转化大肠杆菌HB101或XL-1 Blue细胞，使用例如限制性内切酶分析鉴定含有***质粒pC4的片段的细菌。
使用缺乏活性DHFR基因的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞进行转染。利用脂质转染法，共转染5μg表达质粒pC4和0.5μg质粒pSV2-neo。质粒pSV2neo含有显性选择标记neo基因，其来源于Tn5，编码的酶赋予了对一组包括G418的抗生素的抗性。将细胞接种于加入1μg/ml G418的alpha minus MEM中。2天之后，用胰蛋白酶作用细胞，将细胞接种于alpha minus MEM中的杂交瘤克隆平板中，alpha minusMEM中加入了10、25或50ng/ml氨甲蝶呤加上1μg/ml G418。约10-14天后，用胰蛋白酶作用单个克隆，然后接种于6孔培养皿或10ml烧瓶，使用不同浓度的氨甲蝶呤(50nM、100nM、200nM、400nM、800nM)。然后将在最高浓度氨甲蝶呤下生长的克隆转入新的含有更高浓度氨甲蝶呤(1mM、2mM、5mM、10mM、20mM)的6孔培养皿。重复相同的步骤，直到获得能生长于100-200mM浓度的克隆。例如通过SDS-PAGE和蛋白质印迹或反相HPLC分析，分析所需基因产物的表达。
进一步鉴定完整的人抗IL-23p40蛋白Ig衍生蛋白。希望某些产生的Ig衍生蛋白的亲和常数在1×109和9×1012之间。这些完整的人单克隆Ig衍生蛋白的这种高亲和力使得它们适合应用于IL-23p40蛋白依赖性疾病、病变或相关疾病的治疗。
实施例2：在鼠类实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)中比较抗IL-12p35和抗IL-12/23p40抗体的治疗效果
概述：进行这组研究以观察小鼠模型中IL-12或IL-12/23特异中和对多发性硬化症、实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)的治疗效果。在疾病诱导之前、疾病开始之前或疾病开始之后给予中和性大鼠抗小鼠单克隆抗体(mAb)，其特异性作用于IL-12的p35亚基或IL-12和IL-23共享的p40亚基。在所有的情况中，只有抗p40抗体表现出治疗潜力。这些数据表明，在自身免疫性模型中，IL-23为疾病发病的主要因素。
缩写：
IL                   白细胞介素
mAb                  单克隆抗体
EAE                  实验性自身免疫性脑脊髓炎
Th                   T辅助细胞
IFNγ                γ干扰素
cs                   临床评分
MBP                  髓鞘碱性蛋白
PK                   药代动力学
介绍：生物活性IL-12以异源二聚体存在，由2个共价结合的35(p35)和40(p40)千道尔顿亚基组成。某些证据证明IL-12能诱导强烈的Th1免疫反应，其特征为从CD4+T细胞产生IFNγ和IL-2。不适当的Th1反应和因此的IL-12表达据信与许多免疫介导的炎性疾病相关，例如多发性硬化症、类风湿关节炎、炎性肠病、胰岛素依赖型糖尿病和眼色素层炎。在动物模型中，IL-12的中和显示出改善了自身免疫疾病。然而，这些研究通过IL-12的p40亚基中和IL-12。对共有p40亚基的异源二聚细胞因子IL-23的描述使得需要确定先前的发现归因于IL-12或IL-23的活性。因此，在自身免疫、实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)的小鼠模型中，比较了p35和p40的特异性中和作用。特异性作用于IL-12p35的中和抗体对EAE的进展没有任何影响。相反，无论是在Th1分化之前或之后给予抗体，用抗p40 mAb中和IL-12和IL-23两者抑制了EAE的临床体征。我们的数据表明在EAE中抗p40治疗的活性仅基于IL-23的中和作用。
方法和材料
小鼠：
使用雌性C3H/HEB/FEJ小鼠(Jackson Laboratories，Bar Harbor，ME)进行药物代谢动力学分析。对EAE研究，雌性B10.PL(H-2u)小鼠从Jackson Laboratories获得，在6-8周龄使用。所有的动物都在认可的方案下依据IACUC指导饲养。
抗体：
由Dr.Giorgio Trinchieri和Wistar Institute(Philadelphia，PA)提供C17.8(大鼠抗小鼠IL-12/23p40，IgG2a)和C18.2(大鼠抗小鼠IL-12p35，IgG2a)杂交瘤。在Harlan Bioproducts(Indianapolis，IN)产生腹水，并通过G蛋白亲和纯化。
大鼠抗小鼠抗体的血清药代动力学：
雌性C3H/HEB/FEJ小鼠大约20-25g，逐个称重，并将I125标记抗体(C17.8、C18.2)单次5mg/kg腹膜内给予，恒定的体积/小鼠剂量为10mL/kg。在30分钟、6和24小时、4、7、11和18天从麻醉小鼠眶后取血。允许血样置于室温至少30分钟，但不长于1小时，在约2500-3500rpm下离心10-15分钟。使用LKB Compugamma 1282计数器(Wallac，Gaithersburg，MD)计数各个血清样品约50μL等分的I125。并且计数注射液的10ml等分。计算各个时间点注入量的平均分数，乘以注入抗体的总毫克数，确定各个时间点残留在血清中的总毫克数。每组中具有5-10只动物，数据显示为血清平均mAb毫克数+/-标准差。
EAE诱导和评分：
对EAE诱导，在雌性B1 0.PL小鼠背部4个点皮下注射共100μLCFA(含有200μg结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)牙买加菌株)结合200μg豚鼠MBP(Sigma)。在小鼠免疫接种时和48小时之后，对小鼠腹腔注射0.2 ml PBS中的200ng百日咳毒素(List Biological，Campbell，CA)。在标明的天数，对小鼠腹腔注射C17.8(抗IL-12p40)或C18.2(抗IL-12p35)单克隆抗体，抗体在PBS中稀释至100mg/kg(C18.2)或20mg/kg(C17.8)。对照小鼠注射PBS或PBS中的20mg/kg大鼠IgG(Biosource)。
表现临床体征(cs)的动物按照以下进行评分：尾巴无力或蹒跚步态伴有尾巴紧张1，蹒跚步态伴有尾巴无力(共济失调)2，共济失调伴有局部肢体麻痹2.5，一条肢体全部麻痹3，一条肢体全部麻痹伴有第二条肢体局部麻痹3.5，两条肢全部麻痹4，濒死4.5，死亡5。评为5分的动物不包括在剩余实验的平均每日cs分析中。平均各组每日cs，描述平均发生率、发病日、最高急性cs、累积cs、cs/天、复发数和复发严重性±sem。通过平均单个动物每日临床评分的和，计算每组的平均累积cs。通过将累积cs除以动物保留在试验中的天数，计算cs/天。为了确定发病的平均日，没有发展为EAE的动物不包括在分析内。为确定平均最高cs，没有发展为EAE的小鼠指定为“0”值，且包括在分析中。复发定义为临床评分整点下降维持至少2个观察日后，临床评分整点上升维持至少2个观察日。
结果和讨论：抗p35和抗p40抗体具有相同的药代动力学
为了确定抗p40和抗p35抗体的清除率，正常小鼠单次注射5mg/kg剂量的I125标记抗体，在给予抗体之后11天测量循环水平。抗p35和抗p40具有重叠的药代动力学，证明在正常小鼠中清除率相同(2)。各mAb的预期清除率大约为7-10天。尽管这只是单次给药的PK研究，这些数据支持在体内试验中每周给药一次。
仅在EAE诱导前的抗p40治疗有保护作用
为确定IL-12和IL-23在自身免疫性疾病中的相关作用，使用多发性硬化症、复发性实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)的鼠类模型。用赋形剂中的髓鞘碱性蛋白(MBP)进行EAE诱导，B10.PL小鼠典型地显示出开始产生麻痹(急性病)，然后部分或完全恢复，并发展为多次复发和/或慢性EAE。已经长期假定EAE依赖于IL-12表达，因为IL-12被认为是Th0至Th1分化的主要介质。然而，为了辨别IL-23在EAE诱导中的潜在作用，在免疫接种以形成EAE之前1天(-1天)，建立中和浓度的抗p40(IL-12和IL-23)或抗p35(只有IL-12)抗体。各种动物之间疾病发病可有所不同；因此，在7天和14天之后重复治疗，以保证在Th1分化期间存在抗p35和IL-p40抗体。某些体外中和研究证明，抗40mAb中和IL-12比抗p35 mAb的效率高5倍(数据未显示)。因此，在所有EAE实验中，抗p35 mAb的剂量被调整为比抗p40高5倍。在两个分开的实验中，用大鼠IgG同种型对照抗体(20mg/kg)或抗p35(100mg/kg)治疗的小鼠没有显示免于疾病发生的保护作用。需要重点指出的是，与患有EAE的未经治疗小鼠相比，外周给予非特异性对照抗体(大鼠IgG)并不改变疾病的临床过程。在这两个研究中，用抗p40 mAb(20mg/kg)治疗的小鼠清楚的显示出完全抑制EAE的临床体征。值得注意的是，疾病抑制的延续超出了预期的抗体清除率，直到EAE诱导后70天。在每个实验中，只有一只用抗p40治疗的动物显示出连续两日的EAE临床体征，且各自表现出延迟发病和显著较低的急性临床评分、累积临床评分，并在疾病中无复发(表1)。这些结果证明，通过共有的p40亚基中和IL-12和IL-23，提供了几乎完全的EAE保护作用。相反，只通过抗p35特异性中和IL-12是无效的。这些数据强烈表明EAE不是由IL-12介导。
仅疾病发病前抗p40治疗有保护作用
尽管预防治疗完全保护小鼠免于EAE，但仍然需要确定一旦在体内建立了Th1群，IL-12特异性中和作用是否具有保护作用。因此，在一组单独的实验中，在EAE诱导之后10天，但在疾病发病之前，使用对照抗体(大鼠IgG)、抗p35或抗p40单克隆抗体治疗小鼠。因为典型的免疫反应发生在7天内，这个时间点应有效反映抗IL-12或抗IL-23单克隆抗体对已分化Th1细胞的效果。在不同动物之间EAE发病有所不同；因此，7天和14天后重复治疗以保证在疾病发病期间存在抗p35和抗p40抗体。在两个单独的实验中，与未治疗EAE小鼠相比，使用同种型对照抗体(20mg/kg)或抗p35(100mg/kg)治疗的小鼠未被保护免受疾病。然而，使用抗p40mAb(20mg/kg)治疗的小鼠显著地受到保护免于EAE。如前述研究中所显示的，观察到疾病的抑制远超过清除外周给予抗体所需的时间，直到EAE诱导后第70天。考虑到直到Th1分化后(第10天)才给予抗体，在任何组中疾病的发病率、发病开始日、急性EAE期间最高临床评分有所不同，这并不令人惊讶(表2)。然而，在这2个实验中，接受抗p40的小鼠显示出显著地较低累积临床评分、每日临床评分和复发严重性。
在已确定的EAE期间仅抗p40治疗有保护作用
最困难但临床相关的治疗障碍是抑制已确定的疾病。因此，进行了另外一组实验，其中免疫小鼠形成EAE，然后一旦疾病开始将小鼠分成各治疗组。大约在EAE诱导后30天，小鼠发展入疾病的急性期。这时，将动物分为具有可比较累积和每日临床评分的组。7天和14天后重复治疗，以保证在急性到慢性或缓和-复发疾病转换期间抗体具有中和浓度。与使用同种型对照抗体(20mg/kg)或抗p35(100mg/kg)相比，只有抗p40治疗(20mg/kg)改善疾病。观察疾病的抑制，直到EAE诱导后第80天。在全部2个实验中，从治疗第一天至第80天的分析证明，接受抗p40的小鼠显示出较低的临床累积评分、每日临床评分以及治疗后最少的最高临床评分。这些数据表明不仅IL-23可能介导Th1分化(表1)和EAE诱导(表2)，而且IL-23也有助于慢性自身免疫反应的效应期(表3)。因此，抗p40治疗可在自身免疫疾病发展中的任何时间提供治疗作用。
一旦EAE确立(大约第30天)，将小鼠分为具有可比较疾病严重性的3个治疗组。从治疗第一天至EAE诱导后80天，分析临床评分。数据显示为每组平均值±s.e.m。
结论
IL-12在免疫功能中作用的了解基于对IL-12 p40亚基的研究。因此，在自身免疫疾病的动物模型中，对IL-12特异p35亚基和IL-12和IL-23共有p40亚基的中和作用进行了并列对比。当任何时间点给予mAb，经抗p40的中和作用显著抑制了EAE。然而，IL-12特异性中和作用完全无效。因此，我们的数据表明IL-12对这种自身免疫性模型只部分起作用，IL-23被认为是自身免疫T细胞反应的更主要介质。
实施例3：IL-23介导实验性自身免疫性脑脊索炎
材料和方法
动物：
使用6-8周龄雌性C3Heb/FeJ和B10.PL小鼠(Jackson Laboratories，Bar Harbor，ME)和雌性C57BL/6小鼠(Charles River Laboratories，Raleigh NC)，在认可的方案下依据IACUC指导饲养。
抗体
在Centocor(Malvern，PA)开发抗小鼠IL-23的大鼠单克隆抗体。使用阴性大鼠IgG(来源于Biosource，Camarillo，CA)作为对照。Dr.Giorgio Trinchieri和Wistar Institute(Philadelphia，PA)提供中和性大鼠抗小鼠p40(C17.8)和大鼠抗小鼠IL-12(C1 8.2)抗体。在HarlanBioproducts(Indianapolis，IN)产生腹水，经G蛋白亲和层析纯化抗体。
细胞因子
重组鼠类IL-12获自R&D Systems(Minneapolis，MN)。重组hIFN-γ和人IL-2获自Peprotech(Rocky Hill，NJ)。使用瞬时转染技术和固定化金属亲和层析(IMAC)产生鼠IL-23。简要而言，按照厂家说明书使用Lipofectamine 2000(Invitrogen，Carlsbad，CA)将分离的鼠p40和鼠p19-His的表达构建物共转染入HEK 293E细胞。或者，如描述产生相连的IL-23构建物，进行HEK 293E细胞转染。转染后24小时，使用无血清293 SFMII(Invitrogen)代替生长培养基，使其适应5天。然后去除培养基，离心，用TALON树脂(BD Biosciences，Palo Alto，CA)经IMAC治疗。用150mM EDTA洗脱His标记蛋白，然后用PBS透析，浓缩，过滤，存贮于-80℃。通过如下描述的脾细胞IL-17蛋白产生，确证共转染和相连IL-23的生物活性。
IL-12和IL-23 ELISA
在PBS中，将鼠IL-12和鼠IL-23(1μg/ml)包被在Nunc Maxisorp平板上过夜。然后洗涤和封闭平板，滴加大鼠抗小鼠p40、大鼠抗小鼠IL-12、大鼠抗小鼠IL-23抗体，允许结合2小时。使用1∶10,000HRP缀合的山羊抗大鼠IgG抗体(来源于Jackson Immuno Research，WestGrove，PA)，然后加入底物，检测结合的蛋白。数据显示为重复孔的平均光密度。
IL-12中和作用
在完全RPMI-1640(Invitrogen)中与5μg/ml PHA(凝集素，菜豆(phaseolus vulgaris)，Sigma，St.Louis，MO)一起培养非粘附人外周血单核细胞(PBMC)4天，培养液中含有10％热灭活胎牛血清(JRH，Lenexa，KS)、1％L-谷氨酰胺(JRH)、100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素(Invitrogen)。收获细胞，洗涤，然后在鼠IL-12(1ng/ml)存在下与rhIL-2(10单位/ml)一起培养，单独培养或与受试抗体预培养22小时。使用Centocor生产的抗IFNγ抗体，通过荧光免疫分析法分析上清液的人IFNγ蛋白水平。
IL-23中和作用
从C57BL/6小鼠脾脏中制备单细胞悬液。在具有10U/ml rhIL-2(Peprotech)和1ng/ml小鼠IL-23的完全RPMI中培养2×106细胞/ml，单独培养或与受试抗体预培养3天。收集上清，通过ELISA(R&DSystems)按厂家说明书分析IL-17蛋白。
EAE分析
雌性B10.PL小鼠在背部4个位点皮下注射总量为100μl的完全弗氏佐剂(CFA)，其结合200μg豚鼠髓鞘碱性蛋白(MBP)(Sigma)。在小鼠免疫接种时和48小时之后，对小鼠腹腔注射0.2ml PBS中的200μg百日咳毒素(List Biological，Campbell，CA)。在指定的天数，小鼠腹腔注射抗p40、抗IL-12或抗IL-23的单克隆抗体，抗体在PBS中稀释至100mg/kg(抗IL-12)、20mg/kg(抗p40，抗IL-23)或50mg/kg(抗IL-23)。对照小鼠不治疗，或者注射PBS中的20mg/kg的大鼠IgG(Biosource，Camarillo，CA)。
表现临床体征(cs)的动物按以下评分：尾巴无力或蹒跚步态伴有尾巴紧张1，蹒跚步态伴有尾巴无力(共济失调)2，共济失调伴有局部肢体麻痹2.5，一条肢体全部麻痹3，一条肢体全部麻痹伴有第二条肢体局部麻痹3.5，两条肢体全部麻痹4，濒死4.5，死亡5。被处死或被评为5分的动物不包括在用于剩余实验的平均每日cs分析中。平均各组每日cs，描述发病率、死亡率、发病天数、最高急性cs、累积cs、cs/天、复发数和复发严重性±sem。通过平均单个动物每日临床评分的总和，计算每组的平均累积cs。通过将累积cs除以动物保留在研究中的天数，计算cs/天。为了确定平均发病天数，没有发展为EAE的动物不包括在分析内。为确定平均最高cs，未发展为EAE的小鼠指定为“0”值，且包括在各组平均值中。复发被定义为临床评分整点下降维持至少2个观察日后，临床评分整点上升维持至少2个观察日。为了确定每组平均复发数，没有表现所定义复发的小鼠指定为“0”值，包括在组平均值中。为了确定平均的复发严重性，平均各复发事件的最高临床评分，没有复发的动物不包括在分析中。
对于体外EAE分析，在EAE诱导后10天、17天、24天或32天从各个动物中收集脾脏和外周***(腹股沟、腋窝、臂和颈)。从个体动物制备单细胞悬浮液(5×105/孔)，洗涤2次，然后体外在完全RPMI中与40μg/ml MBP、5μg/ml ConA或单独培养液培养72小时，使用ATPLite(Perkin Elmer，Boston，MA)测量增殖。数据表示为刺激指数，其为对MBP的平均增殖除以单独使用培养基的平均增殖。在4×106细胞/ml将脾细胞和***细胞与40μg/ml MBP或单独培养基培养48小时，依据厂家说明书(R&D Systems)通过ELISA测试上清的IFNγ、IL-17、IL-4、IL-5和IL-10蛋白。纵使在只有培养基的培养物中，也可测定到最低细胞因子水平，将这些值从MBP刺激培养物中发现的水平中减去，得到的数据只代表抗原特异性细胞因子产生。
对于组织病理学检查和等级评定，将小鼠脑和脊柱通过浸泡固定在10％缓冲***中。固定后，将大脑沿冠状面切成4块。脊柱在5％EDTA中脱钙，然后沿矢状面切成5块。使用常规方法治疗组织并包埋在石蜡中。组织块被切成5μm，使用苏木精和伊红(H&E)或Luxol Blue-Cresyl Echt Violet(Poly Scientific，Bay Shore，NJ)进行染色。对另外的切片进行免疫组化染色，测定神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)(BioGenex，San Ramon，CA)。盲审各片，基于炎症程度排序。单独分析大脑和脊髓。
结果
IL-23特异性中和作用改善了EAE
为了证实只有IL-23的中和作用为EAE提供有效治疗，产生了针对小鼠IL-23的单克隆抗体。如图1A所示，鉴定了特异性作用于小鼠IL-23的抗体证实不与小鼠IL-12发生反应。后来的研究显示抗IL-12和抗IL-23抗体不能进行交叉反应，即使当存在100ng/ml相反的细胞因子时。如图1B所示，抗IL-23特异性抗体结合IL-23的p40亚基，而不结合p19亚基。相应地，其为IL-23p40特异性。
既然最近显示IL-23能诱导IL-17产生，可测定这些抗体中和IL-23生物活性的能力。如图1C所示，IL-23特异性抗体抑制IL-17的产生，具有与抗p40相似的效能。相反，抗IL-12抗体对IL-17水平没有影响。最后，为了证实抗IL-23抗体不干扰IL-12的功能，测试了抗体在T细胞培养物中抑制IFNγ产生的能力。如先前所证明的，抗IL-12和抗p40抑制了IFNγ产生，然而，抗IL-23抗体对IFNγ水平没有影响(图1D)。因此，已经开发了中和性抗小鼠IL-23抗体，其不结合IL-12或抑制IL-12介导的反应。对比了抗IL-23和抗p40抗体在体外的EAE抑制作用。在2个单独的实验中，在EAE诱导后10天但在发病之前使用对照抗体、抗p40或抗IL-23治疗小鼠。与抗p40治疗的小鼠相比，抗IL-23治疗的小鼠表现出EAE的临床抑制(图1E)。接受抗p40或抗IL-23的小鼠显示了发病日更迟、急性疾病和随后复发的严重度降低，以及更低的每日临床评分(表4)。这些结果证实，即使在没有经过遗传操作的小鼠中，是IL-23而不是IL-12对EAE起作用。
IL-23中和作用预防CNS中EAE病变
EAE表现为上行下肢麻痹，因此通过运动机能缺陷评定严重度。然而，只能通过评价大脑和脊柱内病变来观察这种损伤的原因。因此，进行了单独的研究，其中将小鼠免疫形成EAE，然后使用对照大鼠IgG、抗IL-12、抗p40或抗IL-23抗体在10天和17天治疗，17天和24天通过心肌灌注处死。通过H&E分析大脑和脊柱的细胞浸润，并通过Luxol Fast Blue脱髓鞘。盲审各片，按严重程度最轻到最重排序，然后与处死日时动物的临床评分相联系。
如图2A所示，脊髓病变的严重度与临床评分严重度相关，而大脑病变不相关。这并不令人惊讶，因为临床评分由运动能力定义，其主要衡量脊髓的功能。然后将组织病理学等级细分到治疗组中，以评估在2次体内抗体治疗(24天)后的差别。所有的治疗组，包括抗IL-12，比大鼠IgG治疗的对照动物有较低的病理等级(图2B)。然而，要重点指出的是，在EAE诱导10天后就开始治疗的范例，使用抗p40或抗IL-23的临床保护作用直到30天后或更晚才被观察到(图1D)。无论如何，当对比大鼠IgG对照和抗IL-23组时，在脊髓炎症、脱髓鞘和星形细胞神经胶质增生中存在显著差异。这些数据进一步证实抗IL-23治疗后观察到的临床保护是局部保护免于CNS病变的结果。
如上所讨论的，对于EAE诱导后10天开始的治疗范例，使用抗p40或抗IL-23的临床保护直到30天或更晚才被观察到(图1D)。因此，对于检测治疗组之间CNS病变的差异，第24天可能过早。无论如何，当对比大鼠IgG对照和抗IL-23组时，在脊髓炎症和脱髓鞘中存在显著差异。这些数据进一步证实抗IL-23治疗后观察到的临床保护是局部保护免于CNS病变的结果。
IL-23中和作用不改变后来的抗原特异性T细胞反应
在所有抗p40和抗IL-23 EAE研究中，疾病抑制维持了远超过清除外周给予抗体所需的时间。这表明给予抗体诱导了对T细胞应答抗原髓鞘碱性蛋白(MBP)的长期影响。因此，在体内给予EAE小鼠抗体后，进行体外分析以评估抗原特异性T细胞的功能。在大鼠IgG和抗IL-12治疗的动物中，体内MBP的增殖与时间是一致的。然而，尽管EAE临床体征减少，抗p40和IL-23治疗动物中的***细胞证明，在开始使用抗体治疗(第31天)后3周，MBP(图3A)或ConA 3的增殖都有轻微的增长。这些数据表明体内给予抗体的治疗效果不降低T细胞特异性或非特异性增殖的能力。
为了评估体内给予抗体治疗之后应答抗原的细胞因子的可能变化，测量了MBP刺激的脾细胞和***细胞培养物的IFNγ、IL-17、IL-4、IL-5、IL-10、IL-12和IL-23蛋白水平。在任何脾细胞和***细胞培养物上清中都不能检测到IL-12或IL23蛋白(未公布数据)；然而，这些培养物没有在APC刺激条件下受试。当与大鼠IgG或抗IL-12治疗组相比时(图3B)，随着时间在***细胞培养物中观察到稳定的IFNγ水平，除了抗p40和抗IL-23治疗小鼠的第31天培养物中水平稍微低。当与其它所有的治疗组相比时(图3C)，对各组之间IL-17得到了相似的观察结果，除了抗p40治疗的动物在31天维持较低的IL-17水平。在MBP刺激后，不能检测到IL-4水平(数据未公布)，IL-5水平没有表现出一致的治疗或时间相关性变化(图3D)。有趣的是，抗p40和抗IL-23治疗动物的***细胞不能表现出IL-10产量的时间依赖性增长(图3E)。然而，尽管缺乏抗IL-12治疗后典型地观察到的EAE临床体征保护作用，但抗IL-12治疗小鼠的培养物在第31天具有相似的水平(表4)。总而言之，增殖和细胞因子分析证明，当再次体外接触抗原时，体内IL-12或IL-23的中和作用并不会偏转T细胞细胞因子反应或增殖强度。确实，抗IL-23治疗动物与大鼠IgG治疗小鼠相比，在它们的增殖和细胞因子方面没有不同。因此，疾病保护的机制似乎并不通过传统T细胞缺失或免疫耐受机制介导。
很显然，除了在前面描述和实施例中具体描述的之外，还可以其它方式实施本发明。依据上述教导可能有许多本发明的修改和变化，因此，它们在后附权利要求书的范围之内。
表1.在Th1分化前用IL-12和IL-23中和的EAE临床评分
  组                                最高急  复发严重性
  发生率   死亡率  发病天数  性csa  累积csb   cs/天   复发数
  P-2001-060大鼠IgG抗p35抗p40P-2001-079未治疗大鼠IgG抗p35抗p40a临床评分(cs)b累积cs 13/1311/131/136/79/910/101/10 4/138/130/130/72/91/100/10 30.5±3.229.6±3.440.024.7±2.729.1±2.930.0±2.661.0 3.6±0.33.5±0.50.13.2±0.63.8±0.23.9±0.20.3 71.4±14.145.5±11.51.2±0.5110.4±20.490.6±10.194.9±17.81.6±1.1 1.2±0.20.8±0.20.0±0.01.7±0.31.5±0.11.4±0.20.0±0.0 1.3±0.21.2±0.10.0±0.01.0±0.40.3±0.20.7±0.30.0±0.0 3.6±0.24.0±0.30.0±0.03.8±0.14.7±0.33.9±0.20.0±0.0
小鼠如描述治疗，在EAE诱导后0天至70天分析临床评分。数据显示为每组平均值±s.e.m。
                       表1说明
EAE的临床体征评分如下：0，没有临床体征；0.5，冷漠，食欲不振，步型改变而没有共济失调；1.0，嗜睡和/或食欲缺乏；2.0，共济失调，感觉丧失/失明；2.5，半侧或下肢轻瘫；3.0，半侧或下身麻痹；4.0，四肢麻痹；5.0，由于EAE自发死亡。在给药日确定体重作为替代疾病标记。在实验期间最大减轻体重表示为起始体重的百分数。从免疫接种(a.i.)之日起14天后治疗小鼠，当EAE评分达到3.0或研究周期结束(86天a.i.)时处死小鼠。获得并评分了T1-w(前后对照)和T2-w的MRI数据集，如材料和方法中所描述。一旦一只动物达到了EAE评分2.0(共济失调)，进行MRI，而不管第二只猴子的临床条件。因为在Mi-032和Mi-043中疾病的急性发病，在获得体内MRI数据之前因为伦理原因要对两只动物进行安乐死。因此，Mi-026和Mi-023的体内MRI在55天时得到记录a.i.n.d.：未做完。使用免疫组化定量大脑中的浸润数。每个切片的浸润数评分为：-，不浸润；+，1-3个浸润；++，4-10个浸润；+++，大于10个浸润。结果表示两个切片的平均值。两个切片中发现的最大浸润尺寸按以下评分：+，小(小于30个细胞)；++，中等(大于30个细胞)；+++，大(大于100个细胞)。脊髓中的炎症指数(Infl.Index)被定量为每个脊髓横切面(10-15切片)发炎血管的平均数。而且，使用单型网格在10-15个脊髓横切片上定量脱髓鞘的表面积(Demyel(％))。大脑中的炎症和脱髓鞘表示为存在(+)或不存在(-)。
表2.Th1分化后用IL-12和IL-23中和的EAE临床评分
组 发生率    死亡率     发病天数 最高急性csa   累积csb   cs/天 复发数 复发严重性
P-2001-037未治疗大鼠IgG抗p35抗p40P-2001-053未治疗大鼠IgG抗p35抗p40a临床评分(cs)b累积cs 7/89/109/106/78/99/1010/1010/10 0/80/100/100/72/94/101/102/10 30.6±2.725.9±2.725.8±2.634.7±6.315.8±2.220.0±2.516.5±1.113.6±1.1 3.2±0.52.7±0.52.5±0.41.6±0.52.1±0.63.8±0.53.2±0.32.7±0.5 51.5±14.474.7±15.858.8±15.614.9±7.556.4±19.170.1±17.793.8±15.723.2±7.9 0.8±0.21.2±0.21.0±0.20.2±0.10.9±0.31.3±0.21.4±0.20.4±0.1 0.3±0.20.6±0.20.7±0.30.3±0.20.6±0.30.3±0.20.8±0.20.4±0.3 3.3±0.83.7±0.43.2±0.31.5±0.53.3±0.54.2±0.43.2±0.32.0±0.4
在10、17和24天治疗小鼠，在EAE诱导后0天至70天分析临床评分。数据显示为每组平均值±s.e.m。
表3在确定EAE期间用IL-12和IL-23中和的EAE临床评分
  组 每日csb 死亡率   累积csa   cs/天   最高cs   最低cs   复发数 复发严重性
  P-2002-01未治疗抗p35抗p40P-2002-093未治疗抗p35抗p40a治疗(Tx)b临床评分(cs)c累积cs 2.7±0.62.3±0.72.0±0.21.7±0.81.9±0.72.4±0.8 1/51/51/61/51/50/5 132.9±29.3135.9±16.575.6±16.187.7±16.498.2±9.771.7±21.6 3.3±0.32.7±0.31.9±0.32.1±0.22.2±0.11.5±0.4 4.1±0.23.8±0.42.8±0.53.7±0.43.7±0.42.9±0.6 2.4±0.51.8±0.31.0±0.41.2±0.51.4±0.40.8±0.5 0.6±0.42.0±0.40.7±0.31.5±0.51.5±0.31.3±0.3 3.7±0.03.7±0.32.5±1.03.8±1.03.3±0.22.7±0.6
表4 EAE临床评分分析
    组 发病率a    死亡率b 开始天数 最高急性cs  累计csc  Cs/天d 复发数  复发严重性
大鼠IgG抗IL-23(20mg/kg)抗IL-23(50mg/kg抗IL-12抗IL-23(20mg/kg)抗IL-23(50mg/kg  Exp 19/99/97/9Exp 210/109/96/9 7/93/91/94/101/91/9 18.2±0.628.0±4.629.9±4.624.2±2.035.1±3.130.7±3.3 4.7±0.13.4±0.52.8±0.63.9±0.42.8±0.51.7±0.4 47.5±15.646.1±14.457.3±16.999.9±18.960.3±16.938.1±11.2 1.1±0.10.8±0.20.9±0.21.6±0.30.9±0.20.6±0.2 0.1±0.00.4±0.20.3±0.20.7±0.30.00.6±0.3 5.0±0.02.8±0.43.7±0.23.4±0.60.01.9±0.4
在EAE免疫接种后第10天起，每周给予小鼠大鼠IgG和抗IL-23一次，给予3周。如材料和方法中描述的，在EAE诱导后70天内分析临床评分。数据显示为每组平均值±s.e.m。
a发生率
b死亡率
c累积临床评分
d每日临床评分。
                           序列表
<110>Centocor，Inc.
     Jacqueline Benson
     Mark Cunningham
<120>IL-23p40特异性免疫球蛋白衍生蛋白、组合物、方法和用途
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<211>306
<212>PRT
<213>智人(Home sapiens)
<400>1
Ile Trp Glu Leu Lys Lys Asp Val Tyr Val Val Glu Leu Asp Trp Tyr
1               5                   10                  15
Pro Asp Ala Pro Gly Glu Met Val Val Leu Thr Cys Asp Thr Pro Glu
            20                  25                  30
Glu Asp Gly Ile Thr Trp Thr Leu Asp Gln Ser Ser Glu Val Leu Gly
        35                  40                  45
Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile Gln Val Lys Glu Phe Gly Asp Ala Gly
    50                  55                  60
Gln Tyr Thr Cys His Lys Gly Gly Glu Val Leu Ser His Ser Leu Leu
65                  70                  75                  80
Leu Leu His Lys Lys Glu Asp Gly Ile Trp Ser Thr Asp Ile Leu Lys
                85                  90                  95
Asp Gln Lys Glu Pro Lys Asn Lys Thr Phe Leu Arg Cys Glu Ala Lys
            100                 105                 110
Asn Tyr Ser Gly Arg Phe Thr Cys Trp Trp Leu Thr Thr Ile Ser Thr
        115                 120                 125
Asp Leu Thr Phe Ser Val Lys Ser Ser Arg Gly Ser Ser Asp Pro Gln
    130                 135                 140
Gly Val Thr Cys Gly Ala Ala Thr Leu Ser Ala Glu Arg Val Arg Gly
145                 150                 155                 160
Asp Asn Lys Glu Tyr Glu Tyr Ser Val Glu Cys Gln Glu Asp Ser Ala
                165                 170                 175
Cys Pro Ala Ala Glu Glu Ser Leu Pro Ile Glu Val Met Val Asp Ala
            180                 185                 190
Val His Lys Leu Lys Tyr Glu Asn Tyr Thr Ser Ser Phe Phe Ile Arg
        195                 200                 205
Asp Ile Ile Lys Pro Asp Pro Pro Lys Asn Leu Gln Leu Lys Pro Leu
    210                 215                 220
Lys Asn Ser Arg Gln Val Glu Val Ser Trp Glu Tyr Pro Asp Thr Trp
225                 230                 235                 240
Ser Thr Pro His Ser Tyr Phe Ser Leu Thr Phe Cys Val Gln Val Gln
                245                 250                 255
Gly Lys Ser Lys Arg Glu Lys Lys Asp Arg Val Phe Thr Asp Lys Thr
            260                 265                 270
Ser Ala Thr Val Ile Cys Arg Lys Asn Ala Ser Ile Ser Val Arg Ala
        275                 280                 285
Gln Asp Arg Tyr Tyr Ser Ser Ser Trp Ser Glu Trp Ala Ser Val Pro
    290                 295                 300
Cys Ser
305

Claims (30)

1.一种分离的抗IL-23p40 Ig衍生蛋白，所述蛋白包含至少一个CDR，其中所述Ig衍生蛋白结合至少一种IL-23p40的表位，并且所述IL-23p40衍生蛋白不与IL-12的p40亚基结合。
2.权利要求1的分离的抗IL-23p40 Ig衍生蛋白，其中所述Ig衍生蛋白在至少一种以下细胞中抑制IL-23的活性：抗原呈递细胞(APC)、淋巴细胞、自身反应性T细胞、神经细胞和髓鞘细胞。
3.权利要求2的分离的抗IL-23p40 Ig衍生蛋白，其中所述APC或淋巴细胞位于中枢神经***内组织中。
4.权利要求2的分离的抗IL-23p40Ig衍生蛋白，其中所述APC或淋巴细胞位于中枢神经***外组织中。
5.权利要求2的分离的抗IL-23p40 Ig衍生蛋白，其中所述APC选自以下细胞的至少一种：巨噬细胞、小神经胶质细胞、朗格罕氏细胞、枯否氏细胞、树突细胞、B细胞、肺泡巨噬细胞、血单核细胞、干细胞前体和滑膜A细胞。
6.权利要求1的分离的抗IL-23p40 Ig衍生蛋白，其中所述表位包含至少1-3个氨基酸，所述氨基酸选自SEQ ID NO：1的至少一种以下片段的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个氨基酸：氨基酸1-10、10-20、20-30、30-40、40-50、50-60、60-70、70-80、80-90、90-100、100-110、110-120、120-130、130-140、140-150、150-160、160-170、170-180、180-190、190-200、200-210、210-220、220-230、230-240、240-250、250-260、260-270、280-290、290-300、300-306、1-7、14-21、29-52、56-73、83-93、96-105、156-175、194-204、208-246、254-273、279-281和289-300。
7.权利要求1的抗IL-23p40 Ig衍生蛋白，其中所述Ig衍生蛋白结合IL-23p40的亲和力选自至少以下一种：至少10-9M、至少10-10M、至少10-11M和至少10-12M。
8.权利要求1的抗IL-23p40 Ig衍生蛋白，其中所述Ig衍生蛋白基本中和至少一种IL-23蛋白的活性。
9.一种分离的核酸分子，所述核酸分子编码权利要求1的分离抗IL-23p40 Ig衍生蛋白。
10.一种分离的核酸载体，所述载体包含权利要求9的分离核酸分子。
11.一种原核或真核宿主细胞，所述细胞包含权利要求9的分离核酸分子。
12.权利要求11的宿主细胞，其中所述宿主细胞为至少一种选自以下的细胞：COS-1、COS-7、HEK293、BHK21、CHO、BSC-1、HepG2,653、SP2/0、293、HeLa、骨髓瘤和淋巴瘤细胞，或它们的任何衍生细胞、无限增殖化细胞或转化细胞。
13.一种产生抗IL-23p40 Ig衍生蛋白的方法，所述方法包括在体外、体内或原位条件下翻译权利要求9的核酸分子，其中所述抗IL-23p40 Ig衍生蛋白以可检测或可回收的量表达。
14.一种组合物，所述组合物包含权利要求1的抗IL-23p40 Ig衍生蛋白和至少一种药物可接受载体或稀释剂。
15.权利要求14的组合物，所述组合物还包含有效量的至少一种化合物或蛋白，所述化合物或蛋白选自以下的至少一种：可检测标记或报告物、免疫治疗剂、抗感染药物、心血管(CV)***药物、中枢神经***(CNS)药物、自主神经***(ANS)药物、呼吸道药物、胃肠(GI)道药物、激素药物、体液或电解质平衡药物、血液学药物、抗肿瘤药物、免疫调节药物、眼科用药、耳鼻药物、局部用药、营养药物等、TNF拮抗剂、抗风湿药、肌肉松弛药、***、非甾体抗炎药(NSAID)、止痛剂、麻醉剂、镇静剂、局部***、神经肌肉阻滞剂、抗微生物剂、抗牛皮癣剂、皮质类固醇、同化类固醇、***、免疫接种、免疫球蛋白、免疫抑制剂、生长激素、激素替代药物、放射药物、抗抑郁药、抗精神病药、***、哮喘药、β激动剂、吸入类固醇、肾上腺素或其类似物、细胞因子或细胞因子拮抗剂。
16.一种诊断或治疗细胞、组织、器官或动物中IL-23p40相关疾病的方法，所述方法包括：
使包含调整有效量的权利要求1的抗IL23p40 Ig衍生蛋白接触或将其给予所述细胞、组织、器官或动物。
17.权利要求16的方法，其中所述有效量为每千克所述细胞、组织、器官或动物约0.001-50mg。
18.权利要求16的方法，其中所述接触或给予是通过至少一种模式进行，所述模式选自肠胃外、皮下、肌内、静脉内、关节内、支气管内、腹内、囊内、软骨内、腔内、体腔内、小脑内、脑室内、结肠内、颈内、胃内、肝内、心肌内、骨内、骨盆内、心包内、腹膜内、胸膜内、***内、肺内、直肠内、肾内、视网膜内、脊髓内、滑膜内、胸腔内、子宫内、膀胱内、推注(bolus)、***、直肠、口腔、舌下、鼻内或透皮。
19.权利要求16的方法，所述方法还包括在所述接触或给药之前、同时或之后给予至少一种选自以下的药物：免疫治疗剂、TNF拮抗剂、抗风湿剂、肌肉松弛药、***、非甾体抗炎药(NSAID)、止痛剂、麻醉剂、镇静剂、局部***、神经肌肉阻滞剂、抗微生物剂、抗牛皮癣剂、皮质类固醇、同化类固醇、IL-23p40药物、矿物质、营养剂、甲状腺剂、维生素、钙有关的激素、止泻剂、镇咳剂、止吐剂、抗溃疡药、缓泻药、抗凝血剂、***、非格司亭、沙格司亭、免疫接种、免疫球蛋白、免疫抑制剂、生长激素、激素替代药物、***受体调节剂、扩瞳药、睫状肌麻痹剂、烷化剂、抗代谢药、有丝***抑制剂、放射药物、抗抑郁药、抗躁狂剂、抗精神病药、抗焦虑剂、***、拟交感神经药、***、多奈哌齐、他克林、哮喘药、β激动剂、吸入类固醇、白三烯抑制剂、甲基黄嘌呤、色甘酸钠、肾上腺素或其类似物、链球菌DNA酶α、细胞因子或细胞因子拮抗剂。
20.权利要求19的方法，其中所述免疫治疗剂选自以下至少一种：β干扰素1a、β干扰素1b、醋酸glutiramer、环磷酰胺、硫唑嘌呤、糖皮质激素、氨甲蝶呤、紫杉醇、2-氯脱氧腺苷、米托蒽醌、IL-10、TGBβ、CD4、CD52、antegren、CD11、CD18、α-TNF、IL-1、IL-2和/或CD4抗体或抗体受体融合蛋白、α-干扰素、免疫球蛋白、lismide、胰岛素样生长激素-1(IGF-1)、elprodil、吡啡尼酮和口服髓磷脂。
21.权利要求19的方法，其中所述免疫相关治疗剂选自至少一种化合物或蛋白，所述化合物或蛋白作用于以下至少一种：髓鞘破坏的免疫抑制；免疫调节；T细胞细胞功能的激活、增殖、迁移和/或抑制；T细胞受体/肽/MHC-II相互作用的抑制；T细胞无反应性的诱导；自身反应性T细胞的缺失；跨血脑屏障运输的减少；促炎(Th1)或免疫调制(Th2)细胞因子的平衡变化；基质金属蛋白酶抑制剂的抑制；神经保护；神经胶质增生减少和髓鞘再生的促进。
22.权利要求16的方法，其中所述IL-23p40相关疾病选自以下疾病的至少一种：牛皮癣、多发性硬化症、节段性回肠炎、牛皮癣性关节炎、肉样瘤病、I型糖尿病、***性红斑狼疮和眼色素层炎。
23.一种医学装置，所述装置包含权利要求1的抗IL-23p40 Ig衍生蛋白，其中所述装置适合于通过至少一种选自以下的模式接触或给予抗IL-23p40 Ig衍生蛋白：肠胃外、皮下、肌内、静脉内、关节内、支气管内、腹内、囊内、软骨内、腔内、体腔内、小脑内、脑室内、结肠内、颈内、胃内、肝内、心肌内、骨内、骨盆内、心包内、腹膜内、胸膜内、***内、肺内、直肠内、肾内、视网膜内、脊髓内、滑膜腔内、胸腔内、子宫内、膀胱内、推注、***、直肠、口腔、舌下、鼻内或透皮。
24.一种人药用制品，所述制品包括包装材料和含有权利要求1的抗IL-23p40 Ig衍生蛋白溶液或冻干形式的容器。
25.权利要求24的制品，其中所述容器为下列传递装置或***的元件：肠胃外、皮下、肌内、静脉内、关节内、支气管内、腹内、囊内、软骨内、腔内、体腔内、小脑内、脑室内、结肠内、颈内、胃内、肝内、心肌内、骨内、骨盆内、心包内、腹膜内、胸膜内、***内、肺内、直肠内、肾内、视网膜、脊髓内、滑膜腔内、胸腔内、子宫内、膀胱内、推注、***、直肠、口腔、舌下、鼻内或透皮装置或***。
26.一种产生权利要求1的抗IL-23p40Ig衍生蛋白的方法，所述方法包括提供能表达可回收量的所述Ig衍生蛋白的宿主细胞、转基因动物、转基因植物或植物细胞。
27.一种抗IL-23p40 Ig衍生蛋白，所述蛋白由权利要求26的方法生产。
28.一种抗个体基因型的抗体或片段，所述抗体或片段特异性与权利要求1的Ig衍生蛋白结合。
29.一种Ig衍生蛋白，所述蛋白竞争性抑制权利要求1的Ig衍生蛋白与配体结合。
30.本文描述的任何发明。
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