JP2005512522A - Il−13ムテインタンパク質、抗体、組成物、方法および使用 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、引用により全部、本明細書に編入する2001年10月26日に出願された特許文献1に一部基づき、そしてその優先権を主張する。
インターロイキン−4はB細胞、T細胞および単球、内皮細胞および繊維芽細胞を含む多くの非−リンパ系細胞に多岐にわたる生物学的効果を持つ、T細胞およびマスト細胞に由来する多面的サイトカインである。これはマウスB細胞によるIgG1およびIgEの、そしてヒトB細胞によるIgG4およびIgEの分泌を誘導する。IgEおよび恐らくはIgG1およびIgG4のIL4−依存的生産は、IL4が誘導するアイソタイプのスイッチングによる。ヒトではIL4はこの特性をIL13と共有する。IL4の3次元構造は、NMRおよびX−線結晶学により決定された。これは大部分が疎水性のコアである緻密な球状構造を有する。2本の逆平行?−シートを含む2つのオーバーハンド連結により左回りの逆平行の束に配列されたヘリックスを有する4つの?−ヘリックスの束が、分子のほとんどを形成する。この構造はGM−CSF、M−CSFおよびIL3に類似している。
本発明は、当該技術分野で既知である事柄と組み合わせて本明細書に記載し、そして可能とされる、単離されたヒト、霊長類、齧歯類、哺乳動物、キメラまたはヒトMut−IL−13タンパク質、抗体、免疫グロブリン、それらの開裂産物および他の特定部分および変異体、ならびにMut−IL−13タンパク質または抗体組成物、コードするまたは相補的核酸、ベクター、宿主細胞、組成物、製剤、デバイス、トランスジェニック動物、トランスジェニック植物およびそれらの作成および使用方法を提供する。
(a)有効量の本発明の少なくとも1つの単離された哺乳動物Mut−IL−13抗体を含んでなる組成物を、細胞、組織、器官または動物に接触または投与することを含んで成る。この方法は場合によりさらに、有効量の0.0001〜50mg/(キログラムの細胞、組織、器官または動物)を使用することを含んでなることができる。この方法は場合によりさらに、非経口、皮下、筋肉内、静脈内、関節内、気管支内、腹内、嚢内、軟骨内、窩内、腔体内、小脳内、脳室内、結腸内、頸内、胃内、肝臓内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内、胸膜腔内、前立腺内、肺内、直腸内、腎臓内、網膜内、脊椎内、滑液包内、胸内、子宮内、膀胱内、ボーラス、膣、直腸、頬、舌下、鼻内または経皮から選択される少なくとも1つの様式による接触または投与を使用することを含んでなることができる。この方法場合により、(a)少なくとも1つの検出可能な標識もしくはレポーター、TNFアンタゴニスト、抗リウマチ薬、筋弛緩剤、睡眠薬、抗−炎症薬、非−ステロイド系炎症薬(NTHE)、鎮痛薬、麻酔薬、鎮静薬、局所麻酔薬、神経筋遮断剤、抗菌剤、止痒薬、コルチコステロイド、タンパク質同化ステロイド、エリトロポエチン、免疫感作、免疫グロブリン、免疫抑制剤、ホルモン、ホルモン代用薬、放射性薬品、抗鬱薬、抗精神薬、刺激物、喘息薬、ベータアゴニスト、吸入型ステロイド、エピネフリンもしくは類似体、サイトカインもしくはサインカインアンタゴニストから選択される有効量の少なくとも1つの化合物またはタンパク質を含んで成る少なくとも1つの組成物を接触または投与する前に、と同時にまたは後に投与することをさらに含んでなることができる。
発明の説明
本発明は単離された、組換えおよび/または合成Mut−IL−13ヒト、霊長類、齧歯類、哺乳類、キメラ、ヒト化またはCDR−移植化抗体、およびそれに対するMut−IL−13抗−イディオタイプ抗体、ならびに組成物および少なくとも1つのMut−IL−13抗体または抗−イディオタイプ抗体をコードする少なくとも1つのポリヌクレオチドを含んで成るコード核酸分子を提供する。さらに本発明は限定するわけではないが、診断用および治療用組成物、方法およびデバイスを含むそのような核酸および抗体および抗−イディオタイプ抗体の作成方法および使用方法を含む。
用途
本発明の単離された核酸は、少なくともMut−IL−13抗体またはそれらの特定した変異体の生産に使用することができ、これは限定するわけではないが少なくとも1つの免疫障害または疾患、心血管障害または疾患、感染、悪性および/または神経障害もしく疾患、または他の知られているまたは特定のMut−IL−13関連状態から選択される少なくとも1つのMut−IL−13状態を診断、監視、調節、処置、緩和、発生の防止を助け、または症状を減らすために、細胞、組織、器官または動物(哺乳動物およびヒトを含む)を測定し、またはそれらに効果を及ぼすために使用することができる。
引用
本明細書に引用するすべての刊行物または特許は全部、それらが本発明のこの時点の技術の状況を示し、かつ/または本発明の説明および可能性(enablement)を提供するので参考により本明細書に編入する。刊行物とは任意の科学的もしくは特許公報、またはすべての記録された、電子的または印刷形式を含む任意の媒体形式で入手できる任意の他の情報を称する。以下の技術文献は引用により全部、本明細書に編入する:Ausbel,et al.,分子生物学の現在のプロトコール(Current Protocols in Molecular Biology)、ジョン ウィリー&サンズ社、ニューヨーク、ニューヨーク州(1987−2001):Sambrook,et al.、モレキュラークローニング:ア ラボラトリーマニュアル(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)、第2版、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク州(1989);Harlow and Lane、抗体(antibodies)、ア ラボラトリーマニュアル、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク州(1989);Colligan,et al.編集、免疫学の現在のプロトコール(Current Protocols in Immunolgy)、ジョン ウィリー&サンズ社、ニューヨーク州(1994−2001);Colligan,et al.,タンパク質科学の現在のプロトコール(Current Protocols in Protein Science)、ジョン ウィリー&サンズ社、ニューヨーク、ニューヨーク州(1997−2001)。
核酸分子
少なくとも1つの配列番号1、特定したフラグメント、それらの変異体もしくは共通配列の連続するアミノ酸の少なくとも70〜100%をコードするヌクレオチド配列、またはこれらの配列の少なくとも1つを含んでなる寄託されたベクターのような本明細書に提供する情報を使用して、少なくとも1つのMut−IL−13抗体をコードする本発明の核酸分子を、本明細書に記載する方法または当該技術分野で既知の方法を使用して得ることができる。
本明細書に記載するポリヌクレオチドと選択的にハイブリダイズするポリヌクレオチド
本発明は選択的なハイブリダイゼーション条件下で、本明細書に開示するポリヌクレオチドとハイブリダイズする単離された核酸を提供する。すなわち本態様のポリヌクレオチドは、そのようなポリヌクレオチドを含んで成る核酸を単離し、検出し、かつ/または定量するために使用することができる。例えば本発明のポリヌクレオチドを使用して、寄託されたライブラリー中の部分的または完全長クローンを同定し、単離し、または増幅することができる。幾つかの態様ではポリヌクレオチドは単離されたゲノムまたはcDNA配列であり、そうでければヒトまたは哺乳動物核酸ライブラリーに由来するcDNAに相補的である。
核酸の構築
本発明の単離された核酸は、当該技術分野で周知な(a)組換え法、(b)合成法、(c)精製法、またはそれらの組み合わせを使用して作成することができる。
核酸を構築するための組換え法
RNA、cDNA、ゲノムDNAまたはそれらの組み合わせのような本発明の単離された核酸組成物は、当業者に既知な多数のクローニング法を使用して生物起源から得ることができる。幾つかの態様では、cDNAまたはゲノムDNAライブラリー中の所望する配列を同定するために、ストリンジェントな条件下で本発明のポリヌクレオチドと選択的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブを使用する。RNAの単離、およびcDNAおよびゲノムライブラリーの構築は、当業者には周知である(例えばAusubel、同上;またはSambrook、同上を参照にされたい)。
核酸スクリーニングおよび単離法
cDNAまたはゲノムライブラリーは、本明細書に開示するような本発明のポリヌクレオチドの配列に基づくプローブを使用してスクリーニングすることができる。プローブは同じまたは異なる生物中のホモロガスな遺伝子を単離するために、ゲノムDNAまたはcDNA配列とハイブリダイズさせるために使用することができる。当業者は様々な程度のストリンジェンシーのハイブリダイゼーションをアッセイに使用することができ;そしてハイブリダイゼーションまたは洗浄媒質のいずれかがストリンジェントであることができると考える。ハイブリダイゼーション条件がよりストリンジェントになると、2本鎖形成が起こるためにプローブと標的との間の相補性の程度がより大きくならなければならない。ストリンジェンシーの程度は、温度、イオン強度、pHおよびホルムアミドのような部分的変性溶媒の存在の1以上により制御することができる。例えばハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、例えば0%〜50%の範囲内でホルムアミドの濃度の操作を通して反応溶液の極性を変えることにより都合よく変動させる。検出可能な結合に必要な相補性(配列同一性)の程度は、ハイブリダイゼーション媒質および/または洗浄媒質のストリンジェンシーに従い変動するだろう。相補性の程度は最適には100%または70〜100%、あるいはその中の任意の範囲となろう。しかしプローブおよびプライマー中のわずかな配列の変化は、ハイブリダイゼーションおよび/または洗浄媒質のストリンジェンシーを下げることにより補うことができると理解すべきである。
核酸を構築するための合成法
本発明の単離された核酸は、既知の方法により直接的な化学合成により調製することができる(例えばAusubel、同上を参照にされたい)。化学合成は一般に1本鎖オリゴヌクレオチドを生成し、これを相補的配列とのハイブリダイゼーションにより、または1本鎖を鋳型として使用してDNAポリメラーゼによる重合化により2本鎖DNAに転換することができる。当業者はDNAの化学合成は約100塩基強の配列に限定され得るが、より長い配列は短い配列の連結により得ることができると認識するだろう。
組換え発現カセット
本発明はさらに、本発明の核酸を含んで成る組換え発現カセットを提供する。本発明の核酸配列、例えば本発明の抗体をコードするcDNAまたはゲノム配列は、少なくとも1つの所望する宿主細胞に導入することができる組換え発現カセットを構築するために使用することができる。組換え発現カセットは典型的には、意図する宿主細胞でポリヌクレオチドの転写を支配する転写開始調節配列に操作可能に連結された本発明のポリヌクレオチドを含んで成る。ヘテロロガスおよび非ヘテロロガス(すなわち内因性)の両方のプロモーターを使用して、本発明の核酸の発現を支配することができる。
本発明はまた、本発明の単離された核酸分子を包含するベクター、該組換えベクターで遺伝子的に工作された宿主細胞、および当該技術分野で公知であるところの組換え技術による少なくとも1つのMut−IL−13抗体の製造にも関する。例えば、Sambrookら、上記;Ausubelら、上記(それぞれそっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる)を参照されたい。
Mut−IL−13抗体は、限定されるものでないがプロテインA精製、硫酸アンモニウムもしくはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンもしくは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを挙げることができる公知の方法により組換え細胞培養物から回収かつ精製し得る。高速液体クロマトグラフィー(「HPLC」)もまた精製に使用可能である。例えば、Colligan、Current Protocols in Immunology、もしくはCurrent Protocols in Protein Science、ジョン ワイリー アンド サンズ(John Wiley & Sons)、ニューヨーク州ニューヨーク、(1997−2001)、例えば第1、4、6、8、9、10章(それぞれそっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる)を参照されたい。
本発明の単離されたタンパク質および抗体は、いずれかの適するポリヌクレオチドによりコードされる本明細書で開示もしくは記述される少なくとも1つのタンパク質および/もしくは抗体アミノ酸配列、または少なくとも1つの単離されたもしくは製造されたタンパク質抗体を含んでなる。好ましくは、該少なくとも1つのタンパク質は少なくとも1つのMut−IL−13活性を有し、かつ、該少なくとも1つの抗体はヒトMut−IL−13を結合し、そしてそれにより少なくとも1つのMut−IL−13タンパク質の少なくとも1つの構造的もしくは生物学的活性を部分的にもしくは実質的に調節する。
本発明のMut−IL−13抗体を構成するアミノ酸はしばしば略記される。アミノ酸の呼称は、当該技術分野で十分に理解されるところのその1文字記号、その3文字記号、名称もしくは3ヌクレオチドコドン(1種もしくは複数)により該アミノ酸を呼称することにより示しうる(Alberts,B.ら、Molecular Biology of The Cell、第3版、ガーランド パブリッシング インク(Garland Publishing,Inc.)、ニューヨーク、1994を参照されたい)。
モノクローナルもしくはキメラMut−IL−13抗体に加え、本発明はまた本発明のこうした抗体に特異的なイディオタイプ(Id)抗体にも向けられる。抗Id抗体は別の抗体の抗原結合領域と一般に関連する独特の決定子を認識する抗体である。Idは、Id抗体の供給源としての同一種および遺伝子型(例えばマウス系統)の動物を該抗体もしくはそのCDR含有領域で免疫することにより製造可能である。免疫した動物は免疫抗体のイディオタイプ決定子を認識かつそれに対し応答しそして抗Id抗体を生産することができる。抗Id抗体はまたなお別の動物において免疫応答を誘導するための「免疫原」としても使用していわゆる抗Id抗体を産生させるかもしれない。
本発明はまた、天然に存在しない組成物、混合物もしくは形態で提供される本明細書に記述されるところのかつ/もしくは当該技術分野で既知のところの少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6もしくはそれ以上のMut−IL−13抗体もしくはそれらのタンパク質を含んでなる少なくとも1つのMut−IL−13抗体もしくはタンパク質組成物も提供する。こうした組成物は、配列番号1の連続するアミノ酸の5〜100%よりなる群から選択される少なくとも1もしくは2つのMut−IL−13抗体もしくはタンパク質のアミノ酸配列またはそれらの指定されたフラグメント、ドメインもしくは変異体を含んでなる天然に存在しない組成物を含んでなる。好ましいMut−IL−13抗体組成物は、Mut−IL−13抗体配列の少なくとも1つのCDR含有部分として少なくとも1もしくは2つの完全長、フラグメント、ドメインもしくは変異体を包含する。さらに好ましい組成物は配列番号1の70〜100%の少なくとも1つの40〜99%またはそれらの指定されたフラグメント、ドメインもしくは変異体を含んでなる。こうした組成物のパーセントは、当該技術分野で既知のとおりもしくは本明細書に記述されるとおり液体もしくは乾燥溶液、混合物、懸濁剤、乳剤もしくはコロイド剤として重量、容量、濃度、容積モル濃度もしくは重量モル濃度である。
上で示されたとおり、本発明は、製薬学的に許容され得る製剤中に少なくとも1つのMut−IL−13抗体もしくはタンパク質を含んでなる製薬学的もしくは家畜の使用に適する、好ましくは生理的食塩水もしくは選ばれた塩を含むリン酸緩衝液ならびに保存剤を含有する保存される溶液および製剤ならびに多使用の保存される製剤である安定な製剤を提供する。保存される製剤は、水性希釈剤中に少なくとも1つの既知のまたは少なくとも1つのフェノール、m−クレゾール、p−クレゾール、o−クレゾール、クロロクレゾール、ベンジルアルコール、亜硝酸フェニル水銀、フェノキシエタノール、ホルムアルデヒド、クロロブタノール、塩化マグネシウム(例えば六水和物)、アルキルパラベン(メチル、エチル、プロピル、ブチルなど)、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、デヒドロ酢酸ナトリウムおよびチメロサールもしくはそれらの混合物よりなる群から場合によっては選択される保存剤を含有する。限定されるものでないが0.001、0.003、0.005、0.009、0.01、0.02、0.03、0.05、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.3、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、またはその中のいずれかの範囲もしくは値を挙げることができる0.001〜5%またはその中のいずれかの範囲もしくは値のようないずれかの適する濃度もしくは混合物を当該技術分野で既知のとおり使用し得る。制限しない例は、保存剤なし、0.1〜2%m−クレゾール(例えば0.2、0.3、0.4、0.5、0.9、1.0%)、0.1〜3%ベンジルアルコール(例えば0.5、0.9、1.1、1.5、1.9、2.0、2.5%)、0.001〜0.5%チメロサール(例えば0.005、0.01)、0.001〜2.0%フェノール(例えば0.05、0.25、0.28、0.5、0.9、1.0%)、0.0005〜1.0%アルキルパラベン(1種もしくは複数)(例えば0.00075、0.0009、0.001、0.002、0.005、0.0075、0.009、0.01、0.02、0.05、0.075、0.09、0.1、0.2、0.3、0.5、0.75、0.9、1.0%)などを包含する。
本発明は、本発明の少なくとも1つの抗体もしくはタンパク質を使用する当該技術分野で既知のところのもしくは本明細書に記述されるところの細胞、組織、器官、動物もしくは患者における少なくとも1つのMut−IL−13関連疾患の調節もしくは治療方法もまた提供する。
本発明で有用な好ましいTNF受容体分子は、高親和性でTNFαを結合し(例えばFeldmannら、国際特許公開第WO 92/07076号明細書(1992年4月30日公開);Schallら、Cell 61:361−370(1990);およびLoetscherら、Cell 61:351−359(1990)(これらの参考文献はそっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる)を参照されたい)かつ場合によっては低い免疫原性を有するものである。とりわけ55kDa(p55 TNF−R)および75kDa(p75 TNF−R)のTNF細胞表面受容体が本発明で有用である。該受容体もしくはその機能的部分の細胞外ドメイン(ECD)を含んでなるこれらの受容体の短縮された形態(例えばCorcoranら、Eur.J.Biochem.223:831−840(1994)を参照されたい)もまた本発明で有用である。ECDを含んでなるTNF受容体の短縮された形態は30kDaおよび40kDaのTNFα阻害性結合タンパク質として尿および血清中で検出されている(Engelmann,H.ら、J.Biol.Chem.265:1531−1536(1990))。TNF受容体の多量体分子およびTNF免疫受容体融合分子、ならびにそれらの誘導体およびフラグメントもしくは部分は本発明の方法および組成物で有用であるTNF受容体分子の付加的な例である。本発明で使用し得るTNF受容体分子は、症状の良好ないし優れた緩和および低毒性を伴い延長された期間患者を治療するそれらの能力を特徴とする。低免疫原性および/もしくは高親和性ならびに他の未定義の特性が、達成される治療結果に寄与し得る。
典型的には、病理学的状態の処置は、組成物中に含有されるの比活性に依存して投与あたり患者1キログラムあたり全体で平均して最低約0.001ngから500ミリグラムまでの少なくとも1つのMut−IL−13タンパク質、および好ましくは単一もしくは複数投与あたり最低約0.1ngから100ミリグラムまでの抗体/患者1キログラムの範囲になる、少なくとも1つのMut−IL−13タンパク質組成物の有効量もしくは投薬量を投与することにより遂げられる。あるいは、有効血清濃度は単一もしくは複数投与あたり0.0001ng〜0.05mg/mlの血清濃度を含みうる。適する投薬量は医学実務家に既知であり、そしてもちろん特定の疾患状態、投与されている組成物の比活性および治療を受けている特定の患者に依存することができる。いくつかの例において、所望の治療量を達成するために反復投与、すなわち特定の監視されたもしくは計量された用量の反復される個別の投与を提供することが必要となり得、ここで該個別の投与は所望の1日用量もしくは効果が達成されるまで反復する。
典型的には、病理学的状態の処置は、組成物中に含有されるの比活性に依存して、投与あたり患者1キログラムあたり全体で平均して最低約0.001ngから500ミリグラムまでの少なくとも1つのMut−IL−13抗体、および好ましくは単一もしくは複数投与あたり最低約0.1ngから100ミリグラムまでの抗体/患者1キログラムの範囲になる、少なくとも1つのMut−IL−13抗体組成物の有効量もしくは投薬量を投与することにより遂げられる。あるいは、有効血清濃度は単一もしくは複数投与あたり0.0001ng〜0.05mg/mlの血清濃度を含みうる。適する投薬量は医学実務家に既知であり、そしてもちろん特定の疾患状態、投与されている組成物の比活性および治療を受けている特定の患者に依存することができる。いくつかの例において所望の治療量を達成するために、反復投与すなわち特定の監視されたもしくは計量された用量の反復される個別の投与を提供することが必要となり得、ここで該個別の投与は所望の1日用量もしくは効果が達成されるまで反復する。
非経口投与のためには、抗体もしくはタンパク質を製薬学的に許容され得る非経口ベヒクルと連合した溶液、懸濁剤、乳剤もしくは凍結乾燥された粉末として処方し得るか、または別個に提供し得る。こうしたベヒクルの例は、水、生理的食塩水、リンゲル液、D−ブドウ糖溶液および1〜10%ヒト血清アルブミンである。リポソームおよび不揮発性油のような非水性ベヒクルもまた使用し得る。ベヒクルもしくは凍結乾燥された粉末は、当張性(例えば塩化ナトリウム、マンニトール)ならびに化学的安定性(例えば緩衝剤および保存剤)を維持する添加物を含有しうる。製剤は既知のもしくは適する技術により滅菌する。
多くの既知かつ開発された様式を、本発明の少なくとも1つのMut−IL−13抗体の治療上有効な量を投与するために本発明により使用し得る。以下の記述で肺投与を使用する一方、他の投与様式を、適する結果を伴い本発明により使用可能である。
非経口投与のための製剤は、普遍的賦形剤として滅菌水もしくは生理的食塩水、ポリエチレングリコールのようなポリアルキレングリコール、植物起源の油、硬化ナフタレンなどを含有しうる。注入のための水性もしくは油性懸濁剤は適切な乳化剤もしくは保湿剤および懸濁化剤を使用することにより既知の方法に従って製造し得る。注入のための作用物質は、水性溶液または溶媒中の無菌の注入可能な溶液もしくは懸濁剤のような非毒性の非経口で投与可能な希釈剤であり得る。使用可能なベヒクルもしくは溶媒として水、リンゲル液、等張生理的食塩水などが許容され;通常の溶媒もしくは懸濁化溶媒として滅菌の不揮発性油を使用し得る。これらの目的上、天然または合成もしくは半合成の脂肪油もしくは脂肪酸;天然または合成もしくは半合成のモノもしくはジもしくはトリグリセリドを包含するいかなる種類の不揮発性油および脂肪酸も使用し得る。非経口投与は当該技術分野で既知でありかつ限定されるものでないが慣習的注入手段、米国特許第5,851,198号明細書に記述されるところのガス加圧式針なし注入デバイスおよび米国特許第5,839,446号明細書に記述されるところのレーザー穿孔器装置(そっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる)を挙げることができる。
本発明はさらに、非経口、皮下、筋肉内、静脈内、動脈内、気管支内、腹内、嚢内、軟骨内、窩内、腔体内、小脳内、脳室内、結腸内、頸内、胃内、肝内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内、胸膜腔内、前立腺内、肺内、直腸内、腎内、網膜内、脊椎内、滑液包内、胸内、子宮内、膀胱内、ボーラス、膣、直腸、頬、舌下、鼻内もしくは経皮手段による少なくとも1つのMut−IL−13抗体の投与に関する。少なくとも1つのMut−IL−13抗体組成物は、とりわけ液体の溶液もしくは懸濁剤の形態で非経口(皮下、筋肉内もしくは静脈内)またはいずれかの他の投与のための使用に;とりわけ限定されるものでないがクリーム剤および坐剤を挙げることができる半固形の形態での膣もしくは直腸投与での使用に;限定されるものでないが錠剤もしくはカプセル剤の形態でを挙げることができる頬もしくは舌下投与のため;あるいは限定されるものでないが散剤、点鼻薬もしくはエアゾルまたはある種の作用物質の形態を挙げることができる鼻内で;あるいは、皮膚構造を改変するかもしくは経皮貼付剤中の薬物濃度を増大させるかのいずれかのためのジメチルスルホキシドのような化学的増強物質(Jungingerら、“Drug Permeation Enhancement”中、Hsieh,D.S.編、pp.59−90(マルセル デッカー インク(Marcel Dekker,Inc.)、ニューヨーク、1994(そっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる))、あるいは皮膚上へのタンパク質およびペプチドを含有する製剤の適用(第WO 98/53847号明細書)または電気穿孔法のような一過性の輸送経路を創製するため、もしくはイオントフォレーシスのような皮膚を通る荷電した薬物の移動性を増大させるための電場の適用、またはソノフォレーシスのような超音波の適用(米国特許第4,309,989号および同第4,767,402号明細書)(上の特許公開および特許はそっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる)を可能にする酸化剤を含む、限定されるものでないがゲル剤、軟膏剤、ローション剤、懸濁剤もしくは貼付物送達系を挙げることができる経皮的な使用のために製造可能である。
肺投与のためには、好ましくは少なくとも1つのMut−IL−13抗体組成物は肺もしくは洞の下部気道に達するのに有効な粒子系で送達する。本発明によれば、少なくとも1つのMut−IL−13抗体は吸入による治療薬の投与のための当該技術分野で既知の多様な吸入もしくは鼻デバイスのいずれかにより送達可能である。患者の洞腔もしくは肺胞中にエアゾル化された製剤を沈着させることが可能なこれらのデバイスは、定量噴霧式吸入器、ネブライザー、乾燥粉末生成装置、噴霧器などを包含する。抗体の肺もしくは鼻投与を指図するのに適する他のデバイスもまた当該技術分野で既知である。全部のこうした装置はエアゾル剤中の抗体の分注のための投与に適する製剤を利用し得る。こうしたエアゾル剤は溶液(水性および非水性双方)もしくは固体粒子のいずれかから構成されうる。ベントリン[Ventolin](R)定量噴霧式吸入器のような定量噴霧式吸入器は、典型的には噴射剤ガスを使用しそして吸気の間に起動を必要とする(例えば第WO 94/16970号、第WO 98/35888号明細書を参照されたい)。ターブヘラー[Turbuhaler]TM(アストラ(Astra))、ロタヘラー[Rotahaler](R)(グラクソ(Glaxo))、ディスカス[Diskus](R)(グラクソ(Glaxo))、インヘール セラピューティックス(Inhale Therapeutics)により市販されるスパイロス[Spiros]TM吸入器(デュラ(Dura))デバイス、およびスピンヘラー[Spinhaler](R)粉末吸入器(ファイソンズ(Fisons))のような乾燥粉末吸入器は、混合された粉末の呼吸起動を使用する(米国特許第4668218号 アストラ(Astra)、欧州特許第237507号 アストラ(Astra)、第WO 97/25086号 グラクソ(Glaxo)、第WO 94/08552号 デュラ(Dura)、米国特許第5458135号 インヘール(Inhale)、第WO 94/06498号明細書 ファイソンズ(Fisons)(そっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる))。エアレックス[AERx]TMアラダイム(Aradigm)、ウルトラベント[Ultravent](R)ネブライザー(マリンクロット(Mallinckrodt)、およびエイコーン II[Acorn II](R)ネブライザー(マルクェスト メディカル プロダクツ(Marquest Medical Products))(米国特許第5404871号 アラダイム(Aradigm)、第WO 97/23476号明細書)(上の参考文献はそっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる)のようなネブライザーは溶液からエアゾルを生じる一方、定量噴霧式吸入器、乾燥粉末吸入器などは小粒子エアゾルを生成させる。商業的に入手可能な吸入デバイスのこれらの特定の例は本発明の実務に適する特定のデバイスを代表することを意図しており、そして本発明の範囲を制限するように意図していない。好ましくは、少なくとも1つのMut−IL−13抗体を含んでなる組成物は乾燥粉末吸入器もしくは噴霧器により送達される。本発明の少なくとも1つの抗体を投与するための吸入デバイスのいくつかの望ましい特徴が存在する。例えば、吸入デバイスによる送達は、有利には信頼性があり、再現可能かつ正確である。吸入デバイスは、場合によっては良好な呼吸可能性のために小型乾燥粒子、例えば約10μm未満、好ましくは約1〜5μmを送達し得る。
Mut−IL−13抗体組成物を包含するスプレー剤は、少なくとも1つのMut−IL−13抗体の懸濁剤もしくは溶液を加圧下にノズルを通させることにより製造可能である。ノズルの大きさおよび形状、適用される圧ならびに液体フィード速度は、所望の出力および粒子径を達成するように選びうる。電気スプレーは例えば毛細管もしくはノズルフィードとともに電場により生じさせうる。有利には、噴霧器により送達される少なくとも1つのMut−IL−13抗体組成物の粒子は約10μm未満、好ましくは約1μmないし約5μmの範囲、および最も好ましくは約2μmないし約3μmの粒子径を有する。
抗体組成物はジェットネブライザーもしくは超音波ネブライザーのようなネブライザーにより投与可能である。典型的には、ジェットネブライザーにおいて、圧縮空気源を使用してオリフィスを通る高速度空気ジェットを創製する。気体がノズルを越えて膨張する際に低圧領域が創製され、これが液貯めに接続された毛細管を通って抗体組成物の溶液を引き出す。毛細管からの液体流はそれが管を出る際に不安定な細糸および液滴に剪断されてエアゾルを創製する。ある範囲の形状、流速およびバッフル型を使用して所定のジェットネブライザーからの所望の性能特性を達成し得る。超音波ネブライザーにおいては、高周波数の電気エネルギーを使用して典型的には圧電変換器を使用して振動の機械的エネルギーを創製する。このエネルギーが直接もしくはカップリング液を通ってのいずれかで抗体組成物の製剤に伝播されて抗体組成物を包含するエアゾルを創製する。有利には、ネブライザーにより送達される抗体組成物の粒子は約10μm未満、好ましくは約1μmないし約5μmの範囲、および最も好ましくは約2μmないし約3μmの粒子径を有する。
定量噴霧式吸入器(MDI)において、噴射剤、少なくとも1つのMut−IL−13抗体およびいずれかの賦形剤もしくは他の添加物が液化圧縮気体を包含する混合物としてキャニスター中に含有される。計量バルブの起動は、好ましくは約10μm未満、好ましくは約1μmないし約5μmおよび最も好ましくは約2μmないし約3μmの大きさ範囲の粒子を含有するエアゾルとして混合物を放出する。所望のエアゾル粒子径はジェットミル粉砕、噴霧乾燥、臨界点凝結などを包含する当業者に既知の多様な方法により製造される抗体組成物の製剤を使用することにより得ることができる。好ましい定量噴霧式吸入器は3Mおよびグラクソ(Glaxo)により製造されかつヒドロフルオロカーボン噴射剤を使用するものを包含する。
経口のための製剤は、腸壁の浸透性を人工的に増大させるための補助物質(例えばレゾルシノールならびにポリオキシエチレンオレイルエーテルおよびn−ヘキサデシルポリエチレンエーテルのような非イオン性界面活性剤)の共投与、ならびに酵素的分解を阻害するための酵素阻害剤(例えば膵トリプシンインヒビター、ジイソプロピルフルオロホスフェート(DFF)およびトラシロール)の共投与に頼る。経口投与のための固体型投薬形態の有効構成成分は、ショ糖、乳糖、セルロース、マンニトール、トレハロース、ラフィノース、マルチトール、デキストラン、デンプン、寒天、アルギン酸塩、キチン、キトサン、ペクチン、トラガカントガム、アラビアゴム、ゼラチン、コラーゲン、カゼイン、アルブミン、合成もしくは半合成のポリマーおよびグリセリドを包含する少なくとも1つの添加物と混合しうる。これらの投薬形態は他の型(1種もしくは複数)の添加物、例えば不活性希釈剤、ステアリン酸マグネシウムのような滑沢剤、パラベン、ソルビン酸、アスコルビン酸、α−トコフェロールのような保存剤、システインのような抗酸化剤、崩壊剤、結合剤、増粘剤、緩衝剤、甘味料、着香料、香料などもまた含有しうる。
粘膜表面を通る吸収のために、少なくとも1つのMut−IL−13抗体の組成物および投与方法は、複数のミクロン以下の粒子、粘膜付着性巨大分子、生物活性ペプチドおよび水性の連続相を含んでなる乳剤を包含し、これは乳剤粒子の粘膜付着を達成することにより粘膜表面を通る吸収を促進する(米国特許第5,514,670号明細書)。本発明の乳剤の適用に適する粘膜表面は、角膜、結膜、頬、舌下、鼻、膣、肺、胃、腸および直腸投与経路を包含しうる。膣もしくは直腸投与のための製剤、例えば坐剤は賦形剤として例えばポリアルキレングリコール、ワセリン、カカオバターなどを含有しうる。鼻内投与のための製剤は固体であり得そして賦形剤として例えば乳糖を含有しうるか、または点鼻薬の水性もしくは油性溶液であり得る。頬投与のためには、賦形剤は糖、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、湖化済デンプンなどを包含する(米国特許第5,849,695号明細書)。
経皮投与のためには、少なくとも1つのMut−IL−13抗体はリポソームもしくはポリマー性ナノ粒子、微小粒子、マイクロカプセルまたはミクロスフェア(別の方法で述べられない限り集合的に微小粒子と称される)のような送達デバイス中に被包化される。ポリ乳酸、ポリグリコール酸およびそれらのコポリマーのようなポリヒドロキシ酸、ポリオルトエステル、ポリ無水物およびポリホスファゼンのような合成ポリマー、ならびにコラーゲン、ポリアミノ酸、アルブミンおよび他のタンパク質、アルギン酸塩および他の多糖のような天然のポリマー、ならびにそれらの組合せから作成された微小粒子を包含する多数の適するデバイスが既知である(米国特許第5,814,599号明細書)。
本発明の化合物を、単一投与から長期の期間、例えば1週間ないし1年の期間にわたって被験体に送達することがときに望ましい可能性がある。多様な遅延放出、デポーもしくは埋込物の投薬形態を利用し得る。例えば、投薬形態は、体液中で低い程度の溶解性を有する化合物の製薬学的に許容され得る非毒性の塩、例えば(a)リン酸、硫酸、クエン酸、酒石酸、タンニン酸、パモン酸、アルギン酸、ポリグルタミン酸、ナフタレンモノもしくはジスルホン酸、ポリガラクツロン酸などのような多塩基酸との酸付加塩;(b)亜鉛、カルシウム、ビスマス、バリウム、マグネシウム、アルミニウム、銅、コバルト、ニッケル、カドミウムなどのような多価金属陽イオン、または例えばN,N’−ジベンジルエチレンジアミンもしくはエチレンジアミンから形成される有機陽イオンとの塩;あるいは(c)(a)および(b)の組合せ、例えばタンニン酸亜鉛塩を含有しうる。加えて、本発明の化合物もしくは好ましくはたった今記述されたもののような比較的不溶性の塩は、ゲル、例えば注入に適する例えばゴマ油を含むモノステアリン酸アルミニウムゲル中で処方し得る。とりわけ好ましい塩は亜鉛塩、タンニン酸亜鉛塩、パモン酸塩などである。注入のための別の型の遅延放出デポー製剤は、例えば米国特許第3,773,919号明細書に記述されるところのポリ乳酸/ポリグリコール酸ポリマーのようなゆっくり分解する非毒性の非抗原性ポリマー中に被包化されるために分散された化合物もしくは塩を含有することができる。化合物、もしくは好ましくは上述されたもののような比較的不溶性の塩はまたとりわけ動物での使用のためにコレステロールマトリックスのシラスティックペレット中でも処方し得る。付加的な遅延放出、デポーもしくは埋込物製剤、例えば気体もしくは液体リポソームは文献中で既知である(米国特許第5,770,222号明細書、および“Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems”、J.R.Robinson編、マルセル デッカー インク(Marcel Dekker,Inc.)、ニューヨーク、1978)。
典型的な哺乳動物発現ベクターは、mRNAすなわち抗体コーディング配列の転写の開始を媒介する少なくとも1つのプロモーター要素ならびに転写の終止および転写物のポリアデニル化に必要とされるシグナルを含有する。付加的な要素はエンハンサー、コザック配列およびRNAスプライシングのためのドナーおよびアクセプター部位により隣接される介在配列を包含する。高度に効率的な転写はSV40からの初期および後期プロモーター、レトロウイルス例えばRSV、HTLVI、HIVIからの末端反復配列(LTR)ならびにサイトメガロウイルス(CMV)の初期プロモーターで達成可能である。しかしながら細胞要素もまた使用されうる(例えばヒトアクチンプロモーター)。本発明の実施での使用に適する発現ベクターは例えばpIRES1neo、pRetro−Off、pRetro−On、PLXSNもしくはpLNCX(クロンテック ラブス(Clontech Labs)、カリフォルニア州パロアルト)、pcDNA3.1(+/−)、pcDNA/Zeo(+/−)もしくはpcDNA3.1/Hygro(+/−)(インヴィトロジェン(Invitrogen))、PSVLおよびPMSG(ファルマシア(Pharmacia)、スウェーデン・ウプサラ)、pRSVcat(ATCC 37152)、pSV2dhfr(ATCC 37146)ならびにpBC12MI(ATCC 67109)のようなベクターを包含する。使用し得る哺乳動物宿主細胞は、ヒトHela 293、H9およびJurkat細胞、マウスNIH3T3およびC127細胞、Cos 1、Cos7およびCV1、ウズラQC1−3細胞、マウスL細胞ならびにチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞を包含する。
ベクターpC4を例えば配列番号1の少なくとも1つのコーディング配列を使用するMut−IL−13抗体もしくはタンパク質の発現に使用する。プラスミドpC4はプラスミドpSV2−dhfr(ATCC受託番号37146)の誘導体である。該プラスミドはSV40初期プロモーターの制御下にマウスDHFR遺伝子を含有する。これらのプラスミドでトランスフェクトされるジヒドロ葉酸活性を欠くチャイニーズハムスター卵巣もしくは他の細胞は、化学療法剤メトトレキセートで補充された選択培地(例えばαマイナスMEM、ライフ テクノロジーズ(Life Technologies)、メリーランド州ゲイタースバーグ)中で細胞を成長させることにより選択し得る。メトトレキセート(MTX)に耐性の細胞中でのDHFR遺伝子の増幅は十分に報告されている(例えばF.W.Altら、J.Biol.Chem.253:1357−1370(1978);J.L.HamlinとC.Ma、Biochem.et Biophys.Acta 1097:107−143(1990);およびM.J.PageとM.A.Sydenham、Biotechnology 9:64−68(1991)を参照されたい)。増大する濃度のMTX中で成長される細胞はDHFR遺伝子の増幅の結果として標的酵素DHFRを過剰生産することにより該薬物に対する耐性を発生する。第二の遺伝子がDHFR遺伝子に連結される場合、それは通常共増幅かつ過剰発現される。このアプローチを使用して1,000コピー以上の増幅された遺伝子(1種もしくは複数)を運搬する細胞系を発生させ得ることが当該技術分野で既知である。その後、メトトレキセートを取り除くと宿主細胞の1つもしくはそれ以上の染色体中に組込まれた増幅された遺伝子を含有する細胞系が得られる。
要約
1種またはそれ以上のMut−IL−13媒介疾患の治療のためにMut−IL−13の作用を阻害するため治療的に使用できる高親和性、完全ヒト性のモノクローナル抗体を生成するためにヒト重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子を含むトランスジェニックマウスを使用した。重鎖および軽鎖の双方のためのヒト可変および定常領域抗体導入遺伝子を含む(CBA/JxC57/BL6/J)F2 ハイブリッドマウスをヒト組換えMut−IL−13を用いて免疫化した(テイラーら(Taylor et al., Intl.Immunol.6:579−591(1993))、ロンバーグら(Lonberg,et al.,Nature 368:856−859(1994))、ノイバーガー(Neuberger,M.,Nature Biotech.14:826(1996))、フィシュワイルドら(Fishwild et al.,Nature Biotechnology 14:845−851(1996)))。数回の融合で、完全ヒトMut−IL−13反応性IgGモノクローナル抗体の1種またはそれ以上のパネルを生成する。完全ヒトMut−IL−13抗体をさらに特性検討した。全てIgG1κである。このような抗体は、1x109 〜9x1012の間のいずれかの親和定数を有することが認められる。それらの完全ヒトモノクローナル抗体の高い親和性は、それらをMut−IL−13関連疾患 病理または障害における治療適用のために適する候補とする。
BSA−ウシ血清アルブミン
CO2 −二酸化炭素
DMSO−ジメチルスルホキシド
EIA−酵素免疫アッセイ
FBS−ウシ胎児血清
H2 O2 −過酸化水素
HRP−セイヨウワサビペルオキシダーゼ
ID−皮内
Ig−免疫グロブリン
Mut−IL−13−インターロイキン−13変異タンパク質
IP−腹腔内
IV−静脈内
Mab−モノクローナル抗体
OD−光学密度
OPD−o−フェニレンジアミン二塩酸
PEG−ポリエチレングリコール
PSA−ペニシリン、ストレプトマイシン、アンホテリシン
RT−室温
SQ−皮下
v/v−体積/体積
w/v−重量/体積
材料および方法
動物
ヒト抗体を発現できるトランスジェニックマウスは、当該分野では公知でありそして商業的に入手でき(例えばジェンファーム・インターナショナル(GenPharm International,San Jose,CA)、アブジェニックス(Abgenix,Freemont,CA)など)、これらはヒト免疫グロブリンを発現するがマウスIgMまたはIgκは発現しない。例えば、このようなトランスジェニックマウスは、V(D)J結合、重鎖クラス切り替え、および体細胞変異を受けるヒト配列導入遺伝子を含み、ヒト配列免疫グロブリンのレパートリーを生成する(ロンバーグら(Lonberg,et al.,Nature 368:856−859(1994)))。軽鎖導入遺伝子は、例えば、生殖細胞系ヒトVκ領域の半分近くを含む酵母人工染色体クローンより一部分を誘導できる。その上、重鎖導入遺伝子は、ヒトμおよびヒトγ1の双方(フィシュワイルドら(Fishwild et al.,Nature Biotechnology 14:845−851(1996)))および/またはγ3定常領域をコードできる。適当な遺伝子型系統より誘導されたマウスは、Mut−IL−13への完全ヒトモノクローナル抗体を生成するための免疫化および融合プロセスに使用できる。
免疫化
既知の方法(例えば実施例1に記載のもの)に従って生成された免疫原として少なくとも1個のMut−IL−13タンパク質を用いる1種またはそれ以上の免疫化スケジュールは、Mut−IL−13ヒトハイブリドーマを生成するために使用できる。最初の数回の融合は、以下に例示する免疫化プロトコールに従って実行できるが、他の類似した既知プロトコールも使用できる。数匹の14〜20週齢メスおよび/または外科的に去勢されたトランスジェニックマウスを、等体積のTITERMAXまたは完全フロイントアジュバントを用いて最終容積100〜400μl(例えば200)にエマルション化した組換えヒトMut−IL−13タンパク質1〜1000μgを用いてIPおよび/またはID免疫化した。それぞれのマウスは、場合により2箇所のSQ部位のそれぞれに100μL生理食塩水中の1〜10μgを受けることもできる。次いで、マウスは1−7、5−12、10−18、17−25および/または21−34日後に、等体積のTITERMAXまたは不完全フロイントアジュバントを用いてエマルション化したMut−IL−13を用いて、IP(1−400μg)およびSQ(1−400μgx2)で免疫化できる。マウスは12−25および25−40日後に凝固剤を用いないで眼後(retro−orbital)穿刺により放血できる。次いで血液を室温で1時間で凝固させそして血清を集めそして既知方法に従ってMut−IL−13 EIAアッセイを用いて力価検定する。反復注入が力価を増加させなくなった時点で融合を実行する。その際、100μL生理食塩水中で希釈した1−400μgのMut−IL−13の最終IVブースター注入をマウスに与えることができる。3日後に、頸部脱臼によりマウスを安楽死させそして脾臓を無菌状態で取り出しそして100U/mLペニシリン、100μg/mLストレプトマイシン、および0.25μg/mLアンホテリシンB(PSA)を含む冷リン酸緩衝食塩水(PBS)10mL中に浸漬する。PSA−PBSを用いて脾臓を滅菌灌流して脾細胞を採取する。細胞を冷PSA−PBS中で1回洗浄し、トリパンブルー染料排除を用いて計数しそして25mM Hepesを含むRPM1 1640培地中に再懸濁する。
細胞融合
融合は、既知の方法、例えば当該分野で公知の方法に従って、ネズミ骨髄腫細胞を生存可能な脾細胞に1:1〜1:10の割合で行うことができる。非限定の例として、脾細胞と骨髄腫細胞とを一緒にペレット化できる。次いでペレットを50%(w/v)PEG/PBS溶液(PEG分子量1,450、シグマ(Sigma))1mL中に37℃で30秒以上かけてゆっくりと再懸濁できる。次いで25mMのHepesを含むRPMI 1640培地10.5mLを37℃、1分間でゆっくりと加えて融合を停止できる。融合細胞を5分間、500−1500rpmで遠心分離する。次いで細胞をHAT培地(25mM Hepes、10%胎児クローンI血清(ハイクロン(Hyclone))、1mMピルビン酸ナトリウム、4mM L−グルタミン、10μg/mLゲンタマイシン、2.5%オリジェン(Origen)培養サプリメント(フィシャー(Fisher))、10%653−条件調整RPMI 1640/Hepes培地、50μM 2−メルカプトエタノール、100μMヒポキサンチン、0.4μMアミノプテリン、および16μMチミジンを含むRPMI 1640培地)中に再懸濁し、次いで15枚の96ウエル平底組織培養プレート中に200μL/ウエルでプレーティングする。次いで5%CO2 および95%空気を含む湿潤化37℃インキュベーター中にプレートを7〜14日間配置する。
マウス血清中のヒトIgG Mut−IL−13抗体の検出
ヒトMut−IL−13タンパク質に特異性のヒトIgG抗体についてマウス血清をスクリーニングするために固相EIAが使用できる。要約すると、一晩、PBS中の2μg/mLのMut−IL−13タンパク質を用いてプレートをコーティングできる。0.02%(v/v)ツイーン(Tween)20を含む0.15M生理食塩水中で洗浄した後、PBS中の1%(w/v)BSAを200μL/ウエルで1時間、室温でウエルをブロックできる。プレートは直ちに使用するかまたは以後の使用のために−20℃で冷凍される。マウス血清希釈液を50μL/ウエルでMut−IL−13コーティングプレート上、室温で1時間インキュベーションする。プレートを洗浄し次いで1%BSA−PBS中で1/30,000希釈した50μL/ウエルのHRP標識ヤギヒトIgG(Fc特異的)で1時間、室温でプローブする。プレートを再度洗浄しそしてクエン酸−リン酸基質溶液(0.1Mクエン酸および0.2Mリン酸ナトリウム、0.01%H2 O2 および1mg/mL OPD)の100μL/ウエルを15分間、室温で加える。次いで停止溶液(4N硫酸)を25μL/ウエルで加えそしてODを490nmにおいて自動化プレート分光光度計で読み取る。
ハイブリドーマ上清中の完全ヒト免疫グロブリンの検出
完全ヒト免疫グロブリンを分泌する成長陽性ハイブリドーマは、適合するEIAを用いて検出できる。要約すると、96ウエルポップアウトプレート(VWR、610744)を炭酸ナトリウム緩衝液中のヤギヒトIgG Fc10μg/mLを用い一晩、4℃でコーティングできる。プレートを洗浄しそして1%BSA−PBSを用いて1時間、37℃でブロックしそして直ちに使用するかまたは−20℃に冷凍する。未希釈ハイブリドーマ上清をプレート上、1時間、37℃でインキュベーションする。プレートを洗浄しそして1%BSA−PBS中に1:10,000に希釈したHRP標識ヤギヒトカッパを用いて、1時間、37℃でプローブする。次いでプレートを上記のように基質溶液を用いてインキュベーションする。
完全ヒトMut−IL−13反応性の決定
ハイブリドーマは、上記のように適当なRIAアッセイまたは他のアッセイを用いてMut−IL−13に対する反応性を同時にアッセイできる。例えば、上清を上記のヤギヒトIgG Fcプレート上でインキュベーションし、洗浄し次いでウエルあたりに適当なカウントを有する放射能標識Mut−IL−13を1時間、室温でプローブする。ウエルを2回、PBSを用いて洗浄しそして結合している放射能標識Mut−IL−13を適当なカウンターを用いて定量する。
アイソタイプ決定
抗体のアイソタイプ決定は、特定の力価についてマウス免疫血清をスクリーニングするために使用されるものと同様のフォーマットでEIAを用いて達成できる。Mut−IL−13タンパク質は、上記のように96ウエルプレート上にコーティングできそして精製された2mg/mLの抗体を1時間、室温でプレート上でインキュベーションできる。プレートを洗浄しそして1%BSA−PBS中で1:4000に希釈したHRP標識ヤギヒトIgG1 またはHRP標識ヤギヒトIgG3 を用いて1時間、室温でプローブする。プレートを再度洗浄しそして上記のようにして基質溶液と一緒にインキュベーションする。
ヒトヒトMut−IL−13抗体とヒトMut−IL−13との結合キネティクス
抗体への結合特性は、例えばMut−IL−13捕そくEIAおよびBIAcore技術を用いて適当に評価できる。精製したヒトMut−IL−13抗体の段階濃度は、上記のようなアッセイにおいてMut−IL−13の2μg/mLをコーティングしたEIAプレートへの結合で評価できる。次いでODは、相対結合効率を示す片対数グラフとして表せる。
結果および考察
ヒトMut−IL−13モノクローナル抗体の生成
数回の融合を行いそしてそれぞれの融合物を15プレート中に接種し(1440ウエル/融合)これはヒトMut−IL−13タンパク質に特異性の数ダースの抗体を生成する。これらの中から、一部はヒトおよびマウスIg鎖の組み合わせより成ることが見いだされる。残りのハイブリドーマはヒト重鎖および軽鎖のみから成るMut−IL−13抗体を分泌する。ヒトハイブリドーマではすべてがIgG1κであると期待される。
ヒトヒトMut−IL−13抗体の結合キネティクス
ELISA分析は、これらのハイブリドーマの大部分またはすべてよりの精製抗体が濃度依存性の様式でMut−IL−13タンパク質を結合することを確認する。図1〜2は、それらの抗体の相対結合効率の結果を示す。この場合に、その同族体抗原(エピトープ)に対する抗体の結合活性を測定する。EIAプレートへ直接の結合Mut−IL−13はタンパク質の変性を起こすことができそして見かけの結合親和性は変性タンパク質への結合を反映できないことが認められるであろう。ある濃度範囲で50%結合が見いだされる。
結論
ヒトMut−IL−13を用いて免疫化されたヒト可変および定常領域抗体導入遺伝子を含むハイブリッドマウスよりの脾細胞を用いて数回の融合を実行した。IgG1κアイソタイプの数種の完全ヒトMut−IL−13反応性IgGモノクローナル抗体の一組が生成される。完全ヒトMut−IL−13抗体をさらに特性検討する。生成した抗体の数種は1x108 と9x1012との間の内の親和定数を有する。それらの完全ヒトモノクローナル抗体の予想外に高い親和性は、Mut−IL−13依存性疾患、病理または関連病状への治療適用に適合させる。
IL−13
PPSTALRELI EELVNITQNQ KAPLCNGSMV WSINLTAGMY CAALESLVNV SGCSAIEKTQ RMLSGFCPHK VSAGQFSSLH VRDTKIEVAE FVKDIILHIK KLYREGRFN
ここで下線をつけたアミノ酸は置換を示す。
FR_SIDE FR_AREA
−−−−−−−
1PRO1 0.51 0.69
2PRO2 0.12 0.45
3SER3 0.73 0.50
4THR4 1.11 0.93
5ALA5 0.39 0.30
6LEU6 0.06 0.07
7ARG7 0.79 0.66
8GLU8 0.76 0.54
9LEU9 0.03 0.02
10ILE10 0.20 0.15
11GLU11 0.84 0.72
12GLU12 0.33 0.32
13LEU13 0.00 0.03
14VAL14 0.28 0.19
15ASN15 0.73 0.53
16ILE16 0.16.0.14
17THR17 0.00 0.03
18GLN18 0.64 0.60
19ASN19 0.88 0.73
20GLN20 0.60 0.60
21LYS21 0.75 0.60
22ALA22 0.98 0.75
23PRO23 0.21 0.17
24LEU24 0.32 0.23
25CYS25 0.70 0.49
26ASN26 0.69 0.50
27GLY27 − 0.27
28SER28 0.12 0.12
29MET29 0.31 0.24
FR_SIDE FR_AREA
−−−−−−−
30VAL30 0.21 0.14
31TRP31 0.21 0.17
32SER32 0.53 0.44
33ILE33 0.44 0.47
34ASN24 0.30 0.36
35LEU35 0.23 0.21
36THR36 0.72 0.78
37ALA37 1.07 0.91
38GLY38 − 0.32
39MET39 0.71 0.57
40TYR40 0.40 0.38
41CYS41 0.54 0.41
42ALA42 0.41 0.22
43ALA43 0.23 0.14
44LEU44 0.07 0.05
45GLU45 0.14 0.10
46SER46 0.15 0.09
47LEU47 0.03 0.02
48ILE48 0.08 0.06
49ASN49 0.34 0.24
50VAL50 0.06 0.05
51SER51 0.00 0.00
52GLY52 − 0.00
53CYS53 0.34 0.33
54SER54 0.24 0.54
55ALA55 0.51 0.50
56ILE56 0.03 0.12
57GLU57 1.29 1.10
58LYS58 0.62 0.47
FR_SIDE FR_AREA
−−−−−−−
59THR59 0.41 0.41
60GLN60 0.91 0.77
61ARG61 0.61 0.50
62MET62 0.08 0.13
63LEU63 0.00 0.00
64SER64 0.13 0.16
65GLY65 − 0.53
66PHE66 0.04 0.04
67CYS67 0.16 0.17
68PRO68 0.76 0.66
69HIS69 0.01 0.01
70LYS70 0.25 0.25
71VAL71 0.82 0.72
72SER72 0.04 0.03
73ALA73 0.02 0.01
74GLY74 − 0.40
75GLN75 0.67 0.75
76PHE76 0.34 0.35
77SER77 0.00 0.01
78SER78 0.73 0.74
79LEU79 0.82 0.78
80HIS80 0.85 0.65
81VAL81 0.46 0.43
82ARG82 0.39 0.33
83ASP83 0.95 0.69
84THR84 0.29 0.36
FR_SIDE FR_AREA
−−−−−−−−−
85LYS85 0.71 0.57
86ILE86 0.94 0.89
87GLU87 0.09 0.12
88VAL88 0.69 0.50
89ALA89 0.91 0.58
90GLN90 0.02 0.04
91PHE91 0.79 0.61
92VAL92 0.01 0.01
93LYS93 0.35 0.28
94ASP94 0.91 0.62
95LEU95 0.00 0.01
96LEU96 0.00 0.00
97LEU97 0.42 0.31
98HIS98 0.44 0.32
99LEU99 0.03 0.03
100LYS100 0.34 0.27
101LYS101 0.65 0.51
102LEU102 0.51 0.38
103PHE103 0.01 0.01
104ARG104 0.63 0.52
105GLU105 0.93 0.69
106GLY106 − 0.28
107ARG107 0.37 0.35
108PHE108 0.67 0.71
109ASN109 0.77 1.06
変更できた内部残基
FR_SIDE FR_TOTAL 可能な エネルギー
−−−−− 置換 増加
(ベースは1725.421
kcal/mol)
6LEU6 0.06 0.07
9LEU9 0.03 0.02
13LEU13 0.00 0.03
17THR17 0.00 0.03 Ser 1987.449
44LEU44 0.07 0.05
47LRU47 0.03 0.02
48ILE48 0.08 0.06 Val 1722.283
50VAL50 0.06 0.05 Ile 1841.982
51SER51 0.00 0.00 Thr 2080.486
52GLY52 − 0.00
63LEU63 0.00 0.00
66PHE66 0.04 0.04 Tyr/His 1995.898/
1766.541
69HIS69 0.01 0.01
72SER72 0.04 0.03
73ALA73 0.02 0.01
77SER77 0.00 0.01
90GLN90 0.02 0.04 Glu 1730.812
92VAL92 0.01 0.01 Ile 9159.549
95LEU95 0.00 0.01 Ile 1631.393
96LEU96 0.00 0.00 Ile 1619.286
99LEU99 0.03 0.03 Ile 1628.907
103PHE103 0.01 0.01 Tyr 1624.121
Phe66に対してTyrは高いエネルギーを有するが、良好な置換であるように考えられる。より高いエネルギーは、より高いヒドロキシルのファンデルワールス相互作用による。
初期モデル構造
結合伸縮エネルギー:290.164
変角エネルギー:390.042
ねじれエネルギー:388.721
面外変角エネルギー:30.217
1−4ファンデルワールスエネルギー:286.329
ファンデルワールスエネルギー:210.384
1−4静電エネルギー:27.906
静電エネルギー:−1.547
全エネルギー:1622.216kcal/mol
Val48、Glu90、Ile95、Ile96、Ile99、Tyr103
結合伸縮エネルギー:288.604
変角エネルギー:383.273
ねじれエネルギー:384.452
面外変角エネルギー:29.889
1−4ファンデルワールスエネルギー:284.920
ファンデルワールスエネルギー:228.808
1−4静電エネルギー:27.989
静電エネルギー:−1.594
全エネルギー:1626.342kcal/mol
結合伸縮エネルギー、変角エネルギー、1−4ファンデルワールスおよびファンデルワールスエネルギーに低下があり、一方ねじれエネルギーおよび結合伸縮エネルギーに増加がある。これらの後者の増加は、新規に配置されたIle側鎖の再配置により低下できた。
変更構造
分子のエネルギー:インターロイキン−13モデル1(理論モデル)
結合伸縮エネルギー:49.661
変角エネルギー:297.149
ねじれエネルギー:328.222
面外変角エネルギー:8.774
1−4ファンデルワールスエネルギー:189.249
ファンデルワールスエネルギー:8.139
1−4静電エネルギー:28.271
静電エネルギー:−1.556
全エネルギー:907.908kcal/mol
ファンデルワールスの平均数+静電気対=5677
1−4ファンデルワールスの平均数+静電気対=3415
スケールした(scaled)ファンデルワールスの平均数+静電気対=248
数 CPU時間(秒) 全体に対する%
非結合再構築 2 0.08 1.08
エネルギー評価 64 7.33 98.92
初期構造
分子のエネルギー:インターロイキン−13モデル1(理論モデル)
分子のエネルギー:インターロイキン−13モデル1(理論モデル)
結合伸縮エネルギー:48.807
変角エネルギー:300.150
ねじれエネルギー:331.002
面外変角エネルギー:8.945
1−4ファンデルワールスエネルギー:192.067
ファンデルワールスエネルギー:8.307
1−4静電エネルギー:28.178
静電エネルギー:−1.503
全エネルギー:915.954kcal/mol
ファンデルワールスの平均数+静電気対=5715
1−4ファンデルワールスの平均数+静電気対=3426
スケールしたファンデルワールスの平均数+静電気対=247
数 CPU時間(秒) 全体に対する%
非結合再構築 2 0.08 1.07
エネルギー評価 64 7.41 98.93
わずかな最小化の後の変更構造のより低いエネルギーは、この構造が親配列よりもさらに安定であることを示唆する。
Claims (29)
- 配列番号1のアミノ酸配列をコードする少なくとも1つのポリヌクレオチドを含んでなるか、またはそれに相補的な少なくとも1つのMUT−IL−13核酸。
- 配列番号1の少なくとも15個の連続するアミノ酸を含んでなる、少なくとも1つのMUT−IL−13ポリペプチドをコードする少なくとも1つのポリヌクレオチドを含んでなる少なくとも1つのMUT−IL−13核酸。
- 配列番号1の少なくとも1つの細胞外、膜貫通または細胞質ドメインを含んでなる、少なくとも1つのMUT−IL−13ポリペプチドをコードする少なくとも1つのポリヌクレオチドを含んでなる少なくとも1つのMUT−IL−13核酸。
- 配列番号1のすべての連続するアミノ酸を含んでなるアミノ酸配列に、少なくとも90〜99%の同一性を有する少なくとも1つのポリペプチドを含んでなる、少なくとも1つのMUT−IL−13ポリペプチドをコードする少なくとも1つのポリヌクレオチドを含んでなる少なくとも1つのMUT−IL−13核酸。
- 配列番号1のすべての連続するアミノ酸を含んでなる少なくとも1つのMUT−IL−13ポリペプチド。
- 配列番号1の少なくとも15個の連続するアミノ酸を含んでなる少なくとも1つのMUT−IL−13ポリペプチド。
- 配列番号1の少なくとも1つの細胞外、膜貫通または細胞質ドメインを含んでなる、少なくとも1つのMUT−IL−13ポリペプチド。
- 配列番号1のすべての連続するアミノ酸を含んでなるアミノ酸配列に、少なくとも90〜99%の同一性を有する少なくとも1つのポリペプチドを含んでなる少なくとも1つのMUT−IL−13ポリペプチド。
- 上記ポリペプチドが少なくとも1つのMUT−IL−13ポリペプチドの少なくとも1つの活性を有する、請求項1ないし8のいずれかに記載のMUT−IL−13核酸またはMUT−IL−13ポリペプチド。
- 請求項1ないし8のいずれかに記載の少なくとも1つのMUT−IL−13ポリペプチドに特異的に結合するモノクローナルもしくはポリクローナル抗体、融合タンパク質またはそれらのフラグメントを含んでなるMUT−IL−13抗体。
- 請求項1ないし10のいずれかに記載の少なくとも1つのMUT−IL−13ポリペプチドまたはMUT−IL−13抗体をコードするMUT−IL−13核酸。
- 請求項1ないし4のいずれかに記載の少なくとも1つの単離された核酸、または請求項4ないし8のいずれかに記載のMUT−IL−13をコードするか、もしくはそれをコードするそのような核酸に対して相補的な少なくとも1つの単離された核酸を含んでなるMUT−IL−13ベクター。
- 請求項12に記載の単離された核酸を含んでなるMUT−IL−13宿主細胞。
- 上記宿主細胞が、COS−1、COS−7、HEK293、BHK21、CHO、BSC−1、Hep G2、653、SP2/0、293、NSO、DG44CHO、CHO K1、HeLa、骨髄腫もしくはリンパ腫細胞、またはそれらの任意の誘導体、不死化もしくは形質転換した細胞から選択される少なくとも1つである、請求項13に記載のMUT−IL−13宿主細胞。
- MUT−IL−13ポリペプチドが検出可能または回収可能な量で発現されるように、請求項11に記載の核酸をin vitro、in vivoまたはin situの条件下で翻訳することを含んで成る、少なくとも1つのMUT−IL−13ポリペプチドまたはMUT−IL−13抗体の生産方法。
- 請求項1ないし10のいずれかに記載の少なくとも1つのMUT−IL−13核酸、MUT−IL−13ポリペプチドまたはMUT−IL−13抗体を含んでなる組成物。
- 上記組成物がさらに少なくとも1つの製薬学的に許容され得る担体または希釈剤を含んでなる、請求項16に記載の組成物。
- 少なくとも1つの検出可能な標識もしくはレポーター、TNFアンタゴニスト、抗感染薬、心血管(CV)系薬、中枢神経系(CNS)薬、自律神経系(ANS)薬、気道薬、胃腸(GI)管薬、ホルモン薬、流体もしくは電解質バランスに関する薬剤、血液剤、抗腫瘍薬、免疫抑制剤、眼、耳もしくは鼻の薬剤、局所薬、栄養剤、サイトカインまたはサイトカインアンタゴニストから選択される少なくとも1つの化合物、組成物またはポリペプチドの治療に有効な量を含んで成る少なくとも1つの組成物をさらに含んで成る、請求項16に記載の組成物。
- 液体、ガスまたは乾燥、溶液、混合物、懸濁液、乳液またはコロイド、凍結乾燥調製物、粉末から選択される少なくとも1つの形態である、請求項16に記載の組成物。
- 細胞、組織、器官または動物のMUT−IL−13関連状態を診断または処置する方法であって
(a)請求項1ないし10のいずれかに記載の少なくとも1つのMUT−IL−13核酸、ポリペプチドまたは抗体の有効量を含んで成る組成物を、該細胞、組織、器官または動物に接触または投与することを含んで成る上記方法。 - 上記の有効量が、該細胞、組織、器官または動物1キログラムあたり、0.001〜50mgのMUT−IL−13抗体;0.000001〜500mgの該MUT−IL−13;または0.0001〜100μgの該MUT−IL−13核酸である、請求項20に記載の方法。
- 上記の接触または上記の投与が、非経口、皮下、筋肉内、静脈内、関節内、気管支内、腹内、嚢内、軟骨内、窩内、腔体内、小脳内、脳室内、結腸内、頸内、胃内、肝臓内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内、胸膜腔内、前立腺内、肺内、直腸内、腎臓内、網膜内、脊椎内、滑液包内、胸内、子宮内、膀胱内、損傷内、ボーラス、膣、直腸、頬、舌下、鼻内または経皮から選択される少なくとも1つの様式による、請求項20に記載の方法。
- さらに上記(a)の接触または投与の前、同時または後に、少なくとも1つの検出可能な標識もしくはレポーター、TNFアンタゴニスト、抗感染薬、心血管(CV)系薬、中枢神経系(CNS)薬、自律神経系(ANS)薬、気道薬、胃腸(GI)管薬、ホルモン薬、流体もしくは電解質バランスに関する薬剤、血液剤、抗腫瘍剤、免疫抑制薬、眼、耳もしくは鼻の薬剤、局所薬、栄養剤、サイトカインまたはサイトカインアンタゴニストから選択される少なくとも1つの化合物またはポリペプチドの有効量を含んで成る少なくとも1つの組成物を投与することを含んで成る、請求項20に記載の方法。
- 請求項1ないし10のいずれかに記載の少なくとも1つの単離されたMUT−IL−13ポリペプチド、抗体または核酸を含んで成るデバイスであって、非経口、皮下、筋肉内、静脈内、関節内、気管支内、腹内、嚢内、軟骨内、窩内、腔体内、小脳内、脳室内、結腸内、頸内、胃内、肝臓内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内、胸膜腔内、前立腺内、肺内、直腸内、腎臓内、網膜内、脊椎内、滑液包内、胸内、子宮内、膀胱内、損傷内、ボーラス、膣、直腸、頬、舌下、鼻内または経皮から選択される少なくとも1つの様式により、上記の少なくとも1つの該MUT−IL−13ポリペプチド、抗体または核酸を接触または投与するのに適した、上記デバイス。
- 包装材料および請求項1ないし10のいずれかに記載の少なくとも1つの単離されたMUT−IL−13ポリペプチド、抗体または核酸を含んでなる容器を含んでなる、製薬学的または診断的にヒトに使用するための製品。
- 請求項25の製品であって、上記容器が非経口、皮下、筋肉内、静脈内、関節内、気管支内、腹内、嚢内、軟骨内、窩内、腔体内、小脳内、脳室内、結腸内、頸内、胃内、肝臓内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内、胸膜腔内、前立腺内、肺内、直腸内、腎臓内、網膜内、脊椎内、滑液包内、胸内、子宮内、膀胱内、損傷内、ボーラス、膣、直腸、頬、舌下、鼻内もしくは経皮送達デバイスまたはシステムの構成要素である請求項25に記載の製品。
- 請求項1ないし10のいずれかに記載の少なくとも1つの単離されたMUT−IL−13ポリペプチド、抗体または核酸の生産方法であって、検出可能もしくは回収可能な量で該ポリペプチド、抗体または核酸を発現することができる少なくとも1つの宿主細胞、トランスジェニック動物、トランスジェニック植物、植物細胞を提供することを含んで成る上記方法。
- 請求項27に記載された方法により生産された少なくとも1つのMUT−IL−13ポリペプチド、抗体または核酸。
- 本明細書に記載の発明。
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