CN101014330A - 2,5－二羟基苯磺酸在制备可应用于治疗血管依赖型疾病诸如癌症和银屑病的药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及2，5－二羟基苯磺酸在生产用于治疗血管依赖型疾病的药物中的应用。更具体地，本发明涉及上述化合物，具体地，其钙或钾盐的用于治疗两种血管依赖型疾病的应用，所述血管依赖型疾病即癌症和银屑病，表现为程序性细胞死亡的减少。本发明还公开所述化合物家族在非休眠细胞中的抗增殖、抗迁移、抗生血管和前调亡能力。另外，本发明详述所述化合物在***和特别是神经胶质瘤中对已知细胞生长抑制药物的增强作用。本发明还涉及所述化合物在治疗慢性银屑病斑块中的治疗功效，其基于所述化合物的联合的抗增殖、抗生血管和前调亡能力。

Description

2，5-二羟基苯磺酸在制备可应用于治疗血管依赖型疾病诸如癌症和银屑病的药物中的应用
发明范围
本发明涉及包含2，5-二羟基苯磺酸的药物组合物，及其在制备药物中的应用，所述药物用于治疗以强烈的细胞增殖、血管化为特征的疾病(血管依赖型疾病)和更具体地还具有程序性细胞死亡减少的血管依赖型疾病，如其在例如癌症或银屑病中的情形。
发明背景
恶性肿瘤的特征，除了不受控制的细胞增殖外，在于它们侵入正常的肿瘤周围(peritumoral)组织的能力。肿瘤侵入是复杂的过程，其按照下述连续的阶段发展：a)肿瘤细胞附着到细胞外基质的蛋白上；b)细胞外基质的蛋白通过蛋白水解酶降解，这产生细胞外空间，肿瘤细胞利用所述空间以，c)通过动力学和复杂的机制进行迁移，所述机制需要合成新的细胞质膜部分并且再组织细胞骨架(Giese A，Westphal M.Neurosurgery1996；39：235-252)。从肿瘤块侵入正常的肿瘤周围组织的细胞使得它们的细胞死亡的遗传程序失去能力，并且因此，迁移以侵入肿瘤周围完好的组织的肿瘤细胞避免了程序性细胞死亡(Mariani I等，Clin Cancer Res7：2480-2489，2001)。当聚集的肿瘤细胞达到2-3mm3体积时，肿瘤细胞合成大量的生血管因子以抵消该原发肿瘤的低含氧量状况(Folkman J.N.Engl J Med285：1182-1186，1971；Carmeliet P，Jain RK.Nature407：249-257，2000；Yancopoulos GD等.Nature407：242-248，2000)，其激活肿瘤周围的血管，致使它们形成新的血管(血管发生)，所述新的血管侵入肿瘤以供给氧和养分并消除来自肿瘤分解代谢的产物。肿瘤侵入的过程中发生的相同的细胞过程(游动性和程序性细胞死亡的缺乏)集中(centripetally)发生在肿瘤血管发生的过程中。因此，抑制肿瘤细胞和内皮细胞的侵入能力应该通过抑制肿瘤扩散、减少血管发生和促进程序性细胞死亡而在肿瘤生长中产生延迟。因此，有效的抗癌治疗应该抑制迁移、血管发生并增加程序性细胞死亡而不会在正常细胞中产生这些效果。
在肿瘤学临床开发的不同阶段有许多抗肿瘤和抗血管形成药剂(Brem S.Cancer Control 6：436-458，1999)，其中显著数目的药剂是身体用来抵消血管发生的正调节剂作用的肽(Hagerdom M，Bikfalvi A.Crit RevOnc Hemat 34：89-110，2000)。然而，当这些肽与具有显著更低的分子量的化合物相比较时，它们的药理学不便之处就变得明显起来。在另一方面，已证明在它们的分子结构中含有芳香环并作用为由生长因子诱导的促有丝***活性的抑制剂的不同的合成化合物，对休眠的或非肿瘤细胞具有细胞毒性(Lozano RM J Mol Biol 281：899-9115，1998)。因此，还需要发现具有抗肿瘤、抗血管发生和前调亡(proapoptotic)活性并且对完整的、休眠的、非肿瘤细胞具有低毒性的化合物。目前存在对于为老药物寻找新的治疗启示的极大兴趣。在这种背景下，近来已经证明不同的抗生素除了它们的抗微生物活性外，还具有抗增殖的作用，如在雷帕霉素的情形中(MoriceMC等.N Engl J Med 346：1773-1780，2002)，或在新霉素的情形中(CuevasP.等.Neurol Res 224：389-391，2002)；或有效用作抗焦虑药的，诸如诺氟沙星(氟喹诺酮)(Johnstone TB等.Nat Med 10；31-32，2004)。
银屑病是一种血管依赖型的慢性疾病，其影响2-3％的世界人口，并且其特征在于表皮超常增生、炎症细胞和T淋巴细胞的真皮-表皮浸润，和非常明显的血管化的发展，以及由程序性细胞死亡引起的细胞死亡的减少(Kocak M等.Int J Dermatol 42：789-793，2003)。目前，对银屑病还没有有疗效的治疗。抗银屑病的治疗可以是局部的或全身性的，其取决于疾病的扩展和严重性。主要应用的抗银屑病局部治疗由不同类型的皮质激素类组成，然而，这些化合物的长期使用与皮肤萎缩、牵张痕(strech marks)和毛细管扩张相关(Baker BS，Fry L. Cutis 1999；64：315-318)。使用免疫抑制药物的全身性治疗与非常严重的副作用相关(Wolina V.等.ClinRheumatol 2001：20：406-410)。例如，使用环胞菌素用于治疗银屑病可以产生肾毒性(间质纤维样变性和管状萎缩)、高血压、高镁血症、高钙血症和肝功能紊乱(Travis L，Weinberg JM.Drugs of Today 2002；38：847-865)。另一种用于治疗银屑病的免疫抑制剂药物，他克莫司，的持续应用可以产生高血压、肾毒性和免疫抑制(Jegasothy BV等.Arch Dermatol 1992；128：781-785)。最近已描述他克莫司免疫抑制剂的局部应用(topic application)加速鼠皮肤中的癌发生(Niwa Y，Terashima T，Sumi H.B J Dermatol 2003；149：960-967)。因此，存在对于新的抗银屑病化合物的需要，所述化合物证明是有效的，而不产生明显的副作用诸如与最常用的抗银屑病化合物相关的那些。
2，5-二羟基苯磺酸是2，5-二羟基苯甲酸的衍生物，其在药理学上以提供稳定性的不同的盐的形式(主要是钙、钾和镁)开处方。所述的2，5-二羟基苯磺酸从70年代起就已经被用作口服亲血管(vasculotropic)药物。
在患有糖尿病性视网膜病的患者中，2，5-二羟基苯磺酸抑制血小板聚集，毛细管(capilar)渗透性和血液黏度的增加(Bayer J.等.Dtsch.ModWschr 1980；46：160-1608；Banarroch I.S.等.Ophthalmic Res 1985；17；131-138；Michal M，Giessinger N.Thromb Res 1988；51：593-605)。自从1974年，已知所述化合物在人中的新陈代谢和药物代谢动力学(Benakis A.等.Thérapie 1974；29：211-219)。近来的实验已证明，2，5-二羟基苯磺酸增加大鼠内皮细胞中的氧化氮合酶内皮同工型[内皮氧化氮合酶(eNOS)]的活性，而没有产生细胞毒性作用(Suscheck C.等.Bt J Pharmacol 1997；122：1502-1508)。另外，2，5-二羟基苯磺酸加强人***动脉的体外舒张(AnguloJ等.BrJ Pharmacol 2003；139：854-862)。有实验证据表明2，5-二羟基苯磺酸(作为钙或镁盐配制)具有体外抗氧化剂活性(Brunet J等.FundamClin Pharmacol 12：205-212，1998)。
本发明基于这样的发现，即2，5-二羟基苯磺酸和/或其盐的与它们在非休眠细胞中的抗增殖、抗迁移、抗血管发生和前调亡能力相关的新活性，组合的活性证明它们用作治疗血管依赖型疾病诸如癌症病例的有用的化合物的应用，而不会引起对非肿瘤的完整或休眠细胞的毒性，所述血管依赖型疾病的特征在于过度增殖、细胞入侵及过量的血管发生、以及由于程序性细胞死亡引起的细胞死亡的缺陷。由于神经胶质瘤是具有显著的生血管能力和显著的程序性细胞死亡缺陷的非常具有侵入性的肿瘤，已经将神经胶质瘤细胞用于实验中(Merzak A，Pilkington GJ.Cancer Metastasis Rev16：155-177，1997)。
本发明还基于已证明的事实，即2，5-二羟基苯磺酸和/或其盐以组合的形式具有抗增殖、抗血管发生、和前调亡作用，并且因此，其治疗功效已经在慢性银屑病斑块中进行了评价，所述慢性银屑病斑块的特征在于表皮过度增生、急性真皮血管发生和程序性细胞死亡缺陷(Karasek MA，Cutis64：319-322，1999)。
接着，本发明涉及寻找用于癌症和其它血管依赖型疾病的新疗法，并且其基于这样的事实，即2，5-二羟基苯磺酸和/或其盐已证明它们在体外肿瘤细胞中抑制生长和迁移并诱导程序性细胞死亡的能力，以及抑制由成纤维细胞生长因子(FGF)诱导的体内血管发生的能力。因此，由于这些能力的组合，所提及的化合物对于治疗恶性肿瘤和血液肿瘤性转化疾病以及治疗其它严重的血管化相关的病理(pathology)(血管依赖型疾病)是有用的。
发明描述
以盐的形式配制的2，5-二羟基苯磺酸是一种商业产品(例如，钾盐可以获得于Merck Farma y Química SA，Mollet del Vallés，Barcelona)，其具有下面的分子式：
Figure A20058000518700071
其中Met＝金属(Metal)，n是该盐中所用的金属化合价的函数(function)。一般地，对于盐的金属阳离子模型，一价的(K)或二价的(CaóMg)，n01或2。
因为以任何盐配制的2，5-二羟基苯磺酸在抑制细胞增殖、迁移和血管发生中具有相似的作用，2，5-二羟基苯磺酸的新的生物活性不依赖键合到苯环上的阳离子。本发明只描述配制成钾和钙盐的2，5-二羟基苯磺酸的活性，但是不要忘记该化合物的任何药用盐都是在本发明范围内。术语“药用盐”包括可用在药物形式中的金属盐或加成盐。2，5-二羟基苯磺酸的药用盐可以从有机或无机酸或碱通过常规方法获得，其通过使适宜的酸或碱与该化合物反应而进行。
含有2，5-二羟基苯磺酸的药物组合物可以以任何适当的给药形式，例如，全身性的、口服的、肠胃外的、尿道的、直肠的或局部给药形式存在，对于此必要的药用赋形剂将被包含在内以用于配制所需的给药形式。
下面的实施例举例说明并支持本发明，并且其不应该被认为是对本发明范围的限制。
实施例1：2，5-二羟基苯磺酸的抗增殖能力的例证性测定.
该体外研究使用大鼠神经胶质瘤细胞(C6品系)在3个不同的三次重复实验中进行。将所述细胞在由DMEM Dulbecco’改进的Eagle’培养基(Gibco.Paisley UK)、7，5％的胎儿血清(Gibco)、10单位/ml的青霉素(Gibco)和10μg/ml的链霉素(Gibco)形成的培养基中培养。将所述培养物放置在37℃的湿润的氛围中。为评估2，5-二羟基苯磺酸对细胞增殖的影响，在24孔(15mm的直径)板中接种每孔2×104个C6细胞。将实验的培养物在48小时的时间内用不同微摩尔浓度(μM)的该化合物(2，5-二羟基苯磺酸的钙或钾盐)处理。对照培养物生长48小时，而不加入该化合物。48小时后，应用倒置显微镜拍取培养物的照片，然后，将培养物用结晶紫(Merck Farma y Química SA.Mollet del Vallés，Barcelona)着色，并进行处理以使用分光光度方法测定每孔细胞数目。如图1所示，用不同浓度的化合物处理产生细胞增殖的剂量-依赖型抑制，使用浓度为100μM的2，5-二羟基苯磺酸的钙盐获得88％的抑制(A)。使用相同浓度的2，5-二羟基苯磺酸的钾盐，获得74％的抑制(B)。IC50对钙盐接近25μM，对钾盐在40-50μM之间。比较图1A和图1B，观察到为了获得与使用该化合物的钙盐处理后对细胞增殖的相同百分比的抑制，需要使用双倍浓度的钾盐以获得同样的效果。这是由于该化合物的钙盐在水溶液中含有从盐上分离出来的2个有效成分摩尔(2，5-二羟基苯磺酸)的事实。图2显示未经处理的48小时后C6细胞培养物的图像(A)，另一张图像对应使用浓度为50μM的2，5-二羟基苯磺酸的钙盐处理48小时的C6细胞培养物(B)，和第三张图像对应使用100μM的该酸的钾盐在48小时过程中处理的C6细胞的培养物(C)。该研究表明使用该化合物的处理抑制肿瘤性转化细胞中的增殖，并且确证了该化合物在被促有丝***因子体外刺激的正常血管平滑肌细胞中观察到的抗增殖作用(Parés-Herbute N等.Int J Angiol8：S5-S10，1999)。为了辨别2，5-二羟基苯磺酸的抗增殖活性是由细胞毒性还是由前调亡作用所调节，我们进行了不同的实验，其在下面的实施例中详细描述：
实施例2：2，5-二羟基苯磺酸的前调亡能力的例证性测定.
该测定使用C6细胞按照实施例1中所描述的方法进行。为了证明所分析的化合物的前调亡作用，我们使用了检测细胞内DNA断裂和调亡核团的2种不同的方法。
细胞内DNA断裂的检测
可以认为量化与组蛋白相关的DNA片段的酶免疫测定方法适合于测定程序性细胞死亡的发作(Aragane Y等.J Cell Biol 1998；140：171-182)。该方法允许区分由于坏死引起的死亡和由于程序性细胞死亡引起的死亡，由于在坏死中，细胞质膜是成碎片的并且DNA出现在培养基中，而在程序性细胞死亡中，因为质膜保持完整，断裂的DNA仍保留在细胞内部(Aragane Y等.J Cell Biol 140：171-182，1998)。
按照生产者的说明书使用细胞死亡检测ELISAPlus试剂盒(BoehringerMannheim，Mannheim，Germany)，我们已测定了在4，16，24和48小时的C6(2×103)细胞培养物中的DNA断裂。对照的培养物没有受到任何处理，而在实验培养物中添加50-200μM(图3A)的2，5-二羟基苯磺酸的钾盐。还进行了添加25-100μM的2，5-二羟基苯磺酸的钙盐的实验(图3B)。所有的实验都在3个不同的实验中进行3次重复。
图3A和3B表明下述：a)2，5-二羟基苯磺酸的抗增殖作用主要由前调亡活性介导；b)由于使用所述化合物的钙盐或钾盐的前调亡作用是相似的，键合到所述分子上的阳离子不决定所述化合物的活性；c)最高前调亡作用在使用所述化合物在48小时的过程中处理的细胞中获得；d)最大作用在使用浓度为25μM的钙盐和50μM的钾盐时获得，这与细胞增殖研究中的IC50一致。一旦证明2，5-二羟基苯磺酸的抗增殖机制参与由程序性细胞死亡引起的细胞死亡，我们就通过对神经胶质瘤细胞的显微镜研究定量地评估了这种作用，其应用下述技术：
调亡核团的原位检测(TUNEL技术)
实行3个独立的实验，重复3次。将来自对照培养物的C6细胞和来自使用(分别为50μM和100μM的钙盐和钾盐)在24小时过程中处理的培养物的那些附着到玻璃载玻片上，并用4％低聚甲醛缓冲溶液(pH7.4)在实验室温度下固定1小时。然后，洗涤所述细胞并用0.1％的Triton X-100溶液渗透。然后在应用TUNEL技术[(末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)-调控的dUTP切口和标记(Gavrieli Y，Sherman Y，Bensasson SA.J Cell Biol 119：493-501，1992)前洗涤所述细胞。使用用于调亡核团的原位检测的试剂盒(In situCell Death Detection Kit Boehringer Mannheim，Mannheim，德国)。按照试剂盒生产者的说明书遵循所述技术的不同的步骤。最后，将细胞用绿光(Fluka，AG，Switzerland)着色。TUNEL反应只出现在调亡核团中。
尽管使用本发明目标化合物的钙和钾盐获得了非常相似的结果，但是仅仅显示了使用所述化合物的钾盐获得的结果。在12块载玻片的6个不同的视野计数细胞，所述载玻片附着了来自6个对照培养物和6个使用2，5-二羟基苯磺酸(100μM)处理的培养物的细胞。非调亡和调亡细胞的全部数目如下：
C6细胞 调亡核团 正常核团
对照细胞 138 5954
处理的细胞 3846 354
由于所述化合物的抗增殖作用，处理的细胞的总数低于对照细胞的总数。
图4的图像显示对照培养物的(A和B)和使用所述化合物处理的另一种培养物(C和D)的实验区域，在其中利用了TUNEL技术。如在图像中所示，在对照细胞上只观察到2个调亡核团，而在使用本发明目标化合物处理的细胞中有107个调亡核团且只有8个正常核团(非调亡的)。
这些数据显示2，5-二羟基苯磺酸是一种具有重要的前调亡活性的化合物，所述前调亡活性用于诱导肿瘤程序性细胞死亡。假设已经证明2，5-二羟基苯磺酸在正常的人细胞中抑制调亡(Braber R，Farine JC，Lora GA.Apoptosis4：4111-49，1998)，那么该化合物是治疗癌症的强分子候选物。
涉及化学疗法和放疗的治疗失败中的机制之一是这些治疗诱导由程序性细胞死亡引起的细胞死亡的无效性，主要是由于肿瘤细胞中抗调亡蛋白的超表达(Sellers WR，Fisher DE.J Clin Invest104：1655-1661，1999；Branch P.等.Oncogene19：3138-3145，2000)。因此，所述前调亡化合物可以作为化学疗法和放疗治疗中的佐剂具有很大的临床应用。
一旦证明了2，5-二羟基苯磺酸的前调亡作用，我们对该化合物增加不同的细胞生长抑制药物的抗增殖作用的能力进行了评估。下述实施例证明2，5-二羟基苯磺酸怎样能够增加用于肿瘤学的不同的细胞生长抑制化合物的治疗功效，所述的细胞生长抑制化合物诸如顺铂、长春新碱、紫杉醇和5-氟尿嘧啶。
实施例3：2，5-二羟基苯磺酸在增强化学疗法中的能力的例证性测定
对于该研究，我们使用在实施例1所描述的同样条件下体外培养的C6细胞。在24孔板中每孔培养1×103个细胞。进行3种类型的处理：a)接种后24小时，将所述细胞分别用每一种下述药物处理：顺铂(5μg/ml)、长春新碱(0，1μg/ml)、紫杉醇(5μg/ml)和5-氟尿嘧啶(100μg/ml)；b)接种后24小时，将所述细胞用2，5-二羟基苯磺酸(钾盐，100μM)和下述药物的每一种进行联合处理；顺铂(5μg/ml)长春新碱(0，1μg/ml)、紫杉醇(5μg/ml)和5-氟尿嘧啶(100μg/ml)；c)在接种时(第0日)，将所述细胞用2，5-二羟基苯磺酸(钾盐，100μM)进行预处理。次日还将培养物用下述药物中的每一种进行处理：顺铂(5μg/ml)、长春新碱(0，1μg/ml)、紫杉醇(5μg/ml)和5-氟尿嘧啶(100μg/ml)。对照培养物不受处理达2天。48小时后(第2日)，将形态与实施例1中所用的细胞相同的细胞在所有培养物中进行评估。该研究在重复3次的三次重复(triplicate)的独立的实验中进行。
图5(A，B，C和D)显示为评估2，5-二羟基苯磺酸在增强不同的细胞生长抑制药物中的作用而进行的实验的柱状图。使用顺铂、长春新碱和5-氟尿嘧啶的处理在C6细胞的增殖中产生50％的抑制，而使用紫杉醇的处理获得对细胞增殖的67％的抑制。2，5-二羟基苯磺酸+细胞生长抑制药物(顺铂、长春新碱和5-氟尿嘧啶)的联合处理在细胞增殖中产生84％的抑制。2，5-二羟基苯磺酸+紫杉醇的联合处理在细胞增殖中产生86％的抑制。当细胞培养物用2，5-二羟基苯磺酸进行预处理然后使用下述细胞生长抑制药物：顺铂、长春新碱和5-氟尿嘧啶，在细胞增殖中获得90％的抑制。当使用紫杉醇时，细胞增殖中的抑制达到多至92％。
上述提到的结果证明2，5-二羟基苯磺酸与所述化疗剂的同时治疗增加了它们的治疗功效，并且除此之外，当所述细胞使用2，5-二羟基苯磺酸进行预处理时，化学增强作用更高。这些数据支持将2，5-二羟基苯磺酸作为佐剂用在与化学治疗和放疗相关的治疗中的应用。
实施例4：2，5-二羟基苯磺酸的抗迁移能力的例证性测定
该测定在3个不同的三次重复实验中进行。为了评估2，5-二羟基苯磺酸在抑制细胞迁移中的能力，使用在20mm板上体外培养的C6 2×105个细胞。用无菌的微吸管在对照培养物和使用100μM的2，5-二羟基苯磺酸的钾盐处理的培养物中形成纵向损害(第0日)。使用与发光显微镜相连接的照相***拍摄数码照片，并应用计算机化的形态度量程序(Moticam.Motic.Barcelona)对损害的区域进行划界。24小时后再次拍摄照片，并且标记出损害的边界，将最初的2张照片(第0日)与24小时后获得的那些重叠，以计算被迁移细胞覆盖的损害区域的百分比。这些值代表用所述处理获得的再次产生的百分比。图6显示对照实验(A)和其中所述细胞用本发明的目标化合物在24小时过程中处理的另一个实验(B)的典型实例。如在该图中所观察到的，未处理的细胞完全再次产生了所述损害(图6A)，而用所述化合物处理的细胞不能迁移并覆盖损害的全部区域(图6B)。代表所有实验的百分比数据的图7显示2，5-二羟基苯磺酸抑制肿瘤细胞的迁移多至64％。
实施例5：2，5-二羟基苯磺酸的抗生血管能力的例证性测定
对于该测定，我们使用鸡胚的尿囊绒膜用于测试体内抗生血管物质的活性(Zilberberg L.等.J Biol Chem2003；278：35564-35573)。我们使用前生血管化合物，成纤维生长因子的基本形式(bFGF)(Meghna U等.Blood2003；102：2108-2114)。
将受精的鸡蛋放置在具有80％湿度的37℃培养箱中。4天后，在蛋壳的最窄端开一个洞，以收集1ml清蛋白。然后，将洞用石蜡膜(Parafilm MLaboratory Film Chicago IL.USA)覆盖。该步骤允许产生一个气室，其防止胚胎附着到壳的上部。在孵化的第13日，在气室水平上将壳裂开，以进行处理。将20个胚胎用浸湿在硝酸纤维素纸圆片中的5μl的3μg bFGF+0.1％肝素的溶液处理。然后，用石蜡膜将壳密封。次日，在一半胚胎(n＝10)中，将壳打开，从而再一次将所述硝酸纤维素纸圆片用100μM溶解在生理盐水(5μl)中的2，5-二羟基苯磺酸的钾盐浸湿。然后将壳中的洞再一次用石蜡膜覆盖。在第17日，实验结束，拍摄硝酸纤维素片的照片用于比较研究。
图8表示对应于用3μg bFGF+0,1％肝素处理的胚胎(A)和次日被添加100μM的2，5-二羟基苯磺酸的钾盐溶液的另一胚胎(B)的两张图像。图像A显示硝酸纤维素圆片怎样被血管侵入，而图像B显示在所述圆片中很少有血管侵入。应用计算机化***(Moticam Motic.Barcelona)对硝酸纤维素圆片图像的形态度量量化显示所述化合物的抗生血管作用(在用bFGF+肝素处理的胚胎中被血管覆盖的圆片面积＝35±8.6％对比在用bFGF+肝素+2，5-二羟基苯磺酸的钾盐处理的胚胎中被血管覆盖的圆片面积＝2±1，5％；p＜0,0001；不成双的斯氏t-检验)。使用50μM的所述化合物的钙盐获得了相似的效果。该实验表明本发明的化合物目标具有能够中和由bFGF诱导的生血管作用的抗生血管活性。
实施例6：对银屑病病变的测定
对于该研究，我们使用配制成2，5和5％的霜剂的2，5-二羟基苯磺酸的钾盐，原因在于这种类型的制剂是用于皮肤病局部治疗的常用方法。2，5-二羟基苯磺酸盐的选定浓度在用于治疗糖尿病性视网膜病的浓度范围内：每日6片的500mg的2，5-二羟基苯磺酸的钙盐(Benakis A等Thérapie1974；29：211-219)。我们使用蒸馏水作为霜剂的水相。脂相可以由软脂醇、硬脂醇或凡士林构成。司盘(span)在霜剂制备中是一种有效的乳化剂。尽管产品的两种制剂(2，5和5％)都显示为临床有效的，但是最好的治疗益处是使用5％的浓度获得的。因此，我们给出使用以5％的霜剂配制的所述酸而获得的结果。下述实施例举例说明用于银屑病局部治疗的有效霜剂的配制，其通过实施例的方式，但并不限制本发明的范围。
I.-活性部分(5，6％的2，5-二羟基苯磺酸的钾盐)
II.-非活性部分(作为赋形剂的软脂醇(2，5％)、硬脂醇(2，5％)、液态凡士林(30％)、白色软石蜡(20％)、油酸山梨坦(5％)和蒸馏水(c.s.p.100g))。
治疗的临床功效按照量化脱皮体征(D)、红斑(E)和浸润(I)的指标进行评估，对于其，指定下列评估：(0)缺乏；(1)轻微；(2)中等和(3)严重(Freeman AK等.J Am.Acad Dermat2003；48：564-568)。图9显示3幅图像：治疗前，使用5％的2，5-二羟基苯磺酸的钾盐治疗的位于左肘伸展区域的相同慢性银屑病斑块在治疗6天和13天后。如可以观察到的，使用含有2，5-二羟基苯磺酸的钾盐的霜剂每日两次的局部治疗产生早期(6日)非常明显的斑块“清除”，其中角化过度症几乎完全消失。所述霜剂的治疗功效在治疗的第二周的末期更加明显。所述治疗产生DEI指标的总值(globalvalue)的显著的减少(治疗前DEI总值＝6±1,57对比治疗后DEI总值＝1±0,58；p＜0,0001；不成双的斯氏t-检验)。
附图说明
1.显示在C6细胞培养物中使用不同浓度的2，5-二羟基苯磺酸的(A)钙盐和(B)钾盐处理在处理48小时后的抗增殖作用的柱状图。纵坐标：595nm处的吸光度；横坐标：浓度：μM。
2.图A显示48小时后的C6细胞对照培养物的外观。图B显示使用50μM2，5-二羟基苯磺酸(钙盐)在48小时过程中处理的C6细胞培养物的图像。图C显示使用100μM的2，5-二羟基苯磺酸的钾盐在48小时过程中处理的C6的培养物。
3.在其中观察到2，5-二羟基苯磺酸的抗增殖作用不是由于坏死引起(白色柱状图)而是由于程序性细胞死亡引起(线条柱状图)的代表性柱状图。A：使用2，5-二羟基苯磺酸的钙盐处理。B：使用2，5-二羟基苯磺酸的钾盐处理。纵坐标：405nm处的吸光度；横坐标：以小时计算的时间。
4.使用用于原位检测调亡细胞的TUNEL技术处理的神经胶质瘤C6细胞的图像。调亡核团显示为暗色，并且非调亡细胞的细胞核和细胞质显示为亮色。箭头指示调亡核团。A和B对照细胞，C和D用2，5-二羟基苯磺酸处理的细胞。照片B和D分别对应于A和C照片的长方形框的放大。
5.证明2，5-二羟基苯磺酸与不同的细胞生长抑制化合物A)顺铂(5μg/ml)；B)长春新碱(0.1μl/ml)；C)紫杉醇(5Ug/ml)和D)5-氟尿嘧啶(100μg/ml)对化学治疗的加强作用(评估为抗增殖作用)的柱状图。纵坐标：595nm处的吸光度；横坐标：白色柱状图(对照)；点图(细胞生长抑制剂，第1日)；线条柱状图(2，5-二羟基苯磺酸+细胞生长抑制剂；第1日)；平方柱状图(2，5-二羟基苯磺酸(第0日)+细胞生长抑制剂；第1日)。
6.对照实验和使用2，5-二羟基苯磺酸处理细胞的其它实验(B)中的细胞迁移照相图像。对照细胞完全再次产生了在培养过程中形成的损害，而使用2，5-二羟基苯磺酸处理的细胞的细胞迁移不能够完全覆盖培养物的受影响区。水平线划定在培养物中形成的最初的纵向损害的界限。
7.代表在对照培养物(白色柱状图)和使用2，5-二羟基苯磺酸处理的培养物(黑色柱状图)中的C6细胞的迁移能力的柱状图。将迁移能力表示为再次产生的百分比(培养物中形成的纵向损害被覆盖的面积的百分比)(纵坐标)。
8.孵化17日的2个鸡胚的图像。图A对应于使用3μg的bFGF+0，1％肝素处理的胚胎。图B显示使用3μg bFGF+0.1％肝素+100μM的2，5-二羟基苯磺酸的钾盐处理的胚胎的外观。图A显示由于用作物质释放载体的硝酸纤维素圆片几乎没有出现任何血管，2，5-二羟基苯磺酸的抗生血管作用。
9.位于左肘后部的角化过度性银屑病斑块的图像。图像A表示在开始治疗前的银屑病斑块的外观。图像B是使用5％的霜剂治疗6日后的相同斑块的外观，所述霜剂包含2，5-二羟基苯磺酸的钾盐作活性成分。图像C显示使用以5％配制的2，5-二羟基苯磺酸的钾盐治疗2周后的银屑病斑块的外观。图像中显示的数字对应照片拍摄的日期。

Claims (14)

1.-2，5-二羟基苯磺酸或其药用盐的任一种用于制备可应用于治疗血管依赖型疾病的药物的应用。
2.-按照权利要求1的应用，其中所述血管依赖型疾病还表现为程序性细胞死亡的减少。
3.-按照权利要求1或2任一项的应用，其中所述制备的药物用于癌症治疗中的应用。
4.-按照权利要求3的应用，其特征在于所述制备的药物用于增加细胞生长抑制药物在癌症治疗中的抗增殖作用。
5.-按照权利要求1-4任一项的应用，其特征在于优选用于制备所述药物的盐是2，5-二羟基苯磺酸的钾盐。
6.-按照权利要求1-4任一项的应用，其特征在于优选用于生产所述药物的盐是2，5-二羟基苯磺酸的钙盐。
7.-按照上述权利要求1-6任一项的应用，其中所述制备的药物还包括足够量的至少一种药用赋形剂。
8.-按照权利要求1的应用，其中所述制备的药物用于在银屑病治疗中的应用。
9.-按照权利要求8的应用，其特征在于优选用于生产所述药物的盐是2，5-二羟基苯磺酸的钾盐。
10.-按照权利要求8的应用，其特征在于优选用于制备所述药物的盐是2，5-二羟基苯磺酸的钙盐。
11.-按照上述权利要求8-10任一项的应用，其中所述制备的药物还包括足够量的至少一种药用赋形剂。
12.-按照权利要求8-11的任一项的应用，其特征在于所述药物由局部应用的制剂组成(consist on)。
13.-按照权利要求12的应用，其特征在于所述药物是霜剂或软膏剂，其组成包括：
·药用有效量的2，5-二羟基苯磺酸或其药用盐的任一种；
·药用量的至少一种醇；
·药用量的至少一种乳化剂；
·药用量的至少一种赋形剂；
·药用量的至少一种赋形剂，其包括脂质相，特别是凡士林；
·蒸馏水。
14.-按照权利要求13的应用，其特征在于所述药物是霜剂或软膏剂，其代表包括下列各项的组合物：
·5％的2，5-二羟基苯磺酸的钾盐；
·2，5％的软脂醇；
·2，5％的硬脂醇；
·30％的液态凡士林；
·30％的白色软石蜡；
·5％的司盘(油酸山梨坦)
·足量100g蒸馏水。
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