CN100374570C - 一种将穿梭质粒导入黄色短杆菌的电转化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种能在大肠杆菌和黄色短杆菌中穿梭表达的重组质粒电转化导入黄色短杆菌的快速有效的方法。本发明通过对携带重组质粒的大肠杆菌DH5α在一种特殊的培养基进行培养过程中，将黄色短杆菌菌进行休眠态处理工艺。克服了在大肠杆菌和黄色短杆菌中穿梭表达的重组质粒电转化导入黄色短杆菌的过程中，以大肠杆菌DH5α为宿主菌获得的重组质粒过程中，减少大肠杆菌对穿梭质粒的甲基化修饰作用，以及黄色短杆菌对穿梭质粒的限制性酶切作用，使该穿梭质粒能够通过电转化方法高效地导入黄色短杆菌中，并能稳定复制和传递，电转化效率达到2.0×103。

Description

一种将穿梭质粒导入黄色短杆菌的电转化方法
技术领域
本发明涉及一种生物材料导入已知微生物宿主菌载体获得重组质粒的方法，具体涉及到一种将重组穿梭质粒导入黄色短杆菌的高效电转化方法。
背景技术
黄色短杆菌，属于短杆菌属，常用于发酵生产各种氨基酸。由于其革兰氏染色阳性，无法通过制作感受态导入外源DNA，因而必须通过电转化等方法，将外源DNA导入黄色短杆菌，以构建重组菌。日常，人们在将一种能在大肠杆菌和黄色短杆菌中穿梭表达的重组质粒电转化导入黄色短杆菌的过程中发现，以大肠杆菌DH5α为宿主菌获得的重组质粒，由于受到甲基化修饰作用，在导入某些黄色短杆菌菌种后，会被这些菌体内的限制性内切酶识别并切割成片段，因而很难获得含有完整重组质粒的菌株。为了克服这些困难，人们亟待需要发明一种有效的方法，可以减少大肠杆菌对穿梭质粒的甲基化修饰作用，以及黄色短杆菌对穿梭质粒的限制性酶切作用，使该穿梭质粒能够通过电转化方法高效地导入黄色短杆菌中，实现稳定复制和传递。
发明内容
针对目前在大肠杆菌和黄色短杆菌中穿梭表达的重组质粒电转化导入黄色短杆菌的过程中，以大肠杆菌DH5α为宿主菌获得的重组质粒，由于受到甲基化修饰作用，在导入某些黄色短杆菌菌种后，会被这些菌体内的限制性内切酶识别并切割成片段，因而很难获得含有重组质粒的问题。
本发明研究并掌握将一种能在大肠杆菌和黄色短杆菌中穿梭表达的重组质粒电转化导入黄色短杆菌的快速有效的方法。即
本发明提供一种特殊的培养基。
本发明提供一种将黄色短杆菌菌进行处理的方法。
本发明提供一种特殊的培养基，培养基配方：
硫酸铵            1.8～2.2g/l
磷酸二氢钾        13～14g/l
七水合硫酸亚铁    0.45～0.65mg/l
七水合硫酸镁      0.2～0.3g/l
在对携带重组质粒的大肠杆菌DH5α进行培养的过程中，减少大肠杆菌对穿梭质粒的甲基化修饰作用。
本发明还提供一种将黄色短杆菌菌体进行适当处理的方法，即利用0.5～2μg/ml氨苄青霉素和0.1～1.5％吐温80对黄色短杆菌的菌体进行处理，可在菌体细胞壁和细胞膜上形成小孔，引起细胞内物质外流，因而细胞正常的生长和代谢受到影响，使其处于休眠态，以减少黄色短杆菌对穿梭质粒的限制性酶切作用。使该穿梭质粒能够通过电转化方法高效地导入黄色短杆菌中，并能稳定复制和传递。
通过以上技术发明，可达到如下效果：
1、通过采用本发明提供的特殊培养基对携带重组质粒的大肠杆菌DH5α进行培养，可明显减少大肠杆菌对穿梭质粒的甲基化修饰作用。同时，使待转化黄色短杆菌处于休眠态。
2、使该穿梭质粒能够通过电转化方法高效地导入黄色短杆菌中，并能稳定复制和传递。电转化效率达到2.0×103。而采用一般的电转化方法很难获得含有重组质粒的菌株。
附图说明
略
具体实施方式
为实现上述技术效果，本发明的具体实施方式：
1、本发明选用的重组穿梭质粒pECA1含有质粒pBL1和pUC18的复制起点以及外源基因片段，可在黄色短杆菌和大肠杆菌DH5α中穿梭复制和表达。当采用丰富培养基对携带穿梭质粒的大肠杆菌DH5α进行培养时，质粒DNA由于受到甲基化修饰作用，在导入某些黄色短杆菌菌种后，会被这些菌体内的限制性内切酶识别并切割成片段，因而很难获得含有完整重组质粒的菌株。
本发明通过采用下述培养基对携带重组质粒的大肠杆菌DH5α进行培养，可明显减少大肠杆菌对穿梭质粒的甲基化修饰作用。
培养基配方：
硫酸铵         2g/l
磷酸二氢钾     13.6g/l
七水合硫酸亚铁 0.5mg/l
七水合硫酸镁   0.25g/l
2、将上述培养基用氢氧化钾调pH值为7.0，分装成小瓶灭菌，接种前加入无菌的葡萄糖溶液至终浓度为2g/l；加入无菌的盐酸硫胺素溶液至终浓度为0.5mg/l；加入氯霉素溶液至终浓度为20μg/ml。
3、将携带pECA1大肠杆菌DH5α接种在培养基中振荡培养12～14小时，收获细胞，碱解法提取质粒DNA，氯化铯-溴化乙锭平衡梯度离心法纯化质粒DNA，并溶于适量的无菌水中使DNA浓度为8～10μg/ml。
4、待转化黄色短杆菌C-12的准备。该菌种可通过中国微生物管理委员会普通微生物保藏中心购置，也可通过市场购置，只要对大肠杆菌DH5α来源的质粒DNA具有强的限制性酶切作用的菌种即可。
5、将装有菌体的三角瓶在冰上放置10分钟，倒入预冷的离心管中4℃下6000转离心10分钟，小心倒去上清液，10％甘油洗涤4次，将菌体溶于300μl10％甘油备用。
6、采用Bio-Rad MicroPulserTM型电击仪，0.2cm电击杯，吸取20μl新鲜制备的菌悬液，加入1～2μl的质粒DNA，混匀后加入预冷的电击杯内。调节电击仪，使用Ec2标准程序，启动电脉冲，仪器应显示出6ms内具有12.5kV/cm的电场强度。
7、取出电击杯，吸出混悬液，加入1ml SOC培养液，30℃轻柔振荡培养2小时。
8、吸取200μl电击转化细胞，铺于含有20μg/ml氯霉素的LB琼脂板，30℃倒置培养3～5天，可见转化克隆出现。
实施例一：培养基配方一：
硫酸铵         2g/l
磷酸二氢钾     13.6g/l
七水合硫酸亚铁 0.5mg/l
七水合硫酸镁   0.25g/l
利用上述培养基，通过对携带重组质粒的大肠杆菌DH5α进行培养，达到减少大肠杆菌对穿梭质粒的甲基化修饰作用，使待转化黄色短杆菌处于休眠态，将穿梭质粒能够通过电转化方法高效地导入黄色短杆菌中，并能实现稳定复制和传递。
实施例二：培养基配方二：
硫酸铵          1.8g/l
磷酸二氢钾      13g/l
七水合硫酸亚铁  0.45mg/l
七水合硫酸镁    0.2g/l
利用上述培养基，通过对携带重组质粒的大肠杆菌DH5α进行培养，达到减少大肠杆菌对穿梭质粒的甲基化修饰作用，使待转化黄色短杆菌处于体眠态，将穿梭质粒能够通过电转化方法高效地导入黄色短杆菌中，并能实现稳定复制和传递。
实施例三：培养基配方三：
硫酸铵         2.1g/l
磷酸二氢钾     13.9g/l
七水合硫酸亚铁 0.64mg/l
七水合硫酸镁   0.3g/l
利用上述培养基，通过对携带重组质粒的大肠杆菌DH5α进行培养，达到减少大肠杆菌对穿梭质粒的甲基化修饰作用，使待转化黄色短杆菌处于休眠态，将穿梭质粒能够通过电转化方法高效地导入黄色短杆菌中，并能实现稳定复制和传递。
实施例四：待转化黄色短杆菌C-12的制备
待转化黄色短杆菌C-12可通过中国微生物管理委员会普通微生物保藏中心购置，也可通过市场购置，只要对大肠杆菌DH5α来源的质粒DNA具有强的限制性酶切作用的菌种即可。
将6日内新活化的菌种先接种在10ml液体LB培养基中，30℃培养8小时，其O.D.550约为0.2左右，取1ml接种于内装100ml液体LB的500ml三角烧瓶中30℃继续培养至O.D.550约为1.0。加入终浓度为0.5μg/ml的氨苄青霉素和终浓度为1.5％的吐温80，轻微振荡1小时。氨苄青霉素和吐温80均对黄色短杆菌的细胞壁具有一定的破坏作用，可在菌体细胞壁和细胞膜上形成小孔，引起细胞内物质外流，因而细胞正常的生长和代谢受到影响，但细菌并未死亡，而是处于一种休眠态，待条件适宜时，可以继续生长繁殖。

Claims (1)

1.一种将在大肠杆菌和黄色短杆菌中穿梭表达的重组质粒电转化导入黄色短杆菌的方法，其特征在于，
a.设计由1.8～2.2g/l硫酸铵、13～14g/l磷酸二氢钾、0.45～0.65mg/l七水合硫酸亚铁、0.2～0.3g/l七水合硫酸镁组成的培养基；
b.用步骤a所述的培养基对携带重组质粒的大肠杆菌DH5α进行培养，减少大肠杆菌对穿梭质粒的甲基化修饰作用；
c.将黄色短杆菌进行休眠态处理，即用终浓度0.5～2μg/ml的氨苄青霉素和0.1～1.5％吐温80对黄色短杆菌的细胞壁破坏处理，在菌体细胞壁和细胞膜上形成小孔，引起细胞内物质外流，使细胞正常的生长和代谢受到影响，使其处于休眠态，以减少黄色短杆菌对穿梭质粒的限制性酶切，使该穿梭质粒通过电转化方法导入黄色短杆菌中，并能稳定复制和传递。
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