CN101148646A - 一种高活力壳聚糖酶制剂的生产方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提出了一种利用枯草芽孢杆菌TQS6,采用UV(紫外线诱变)和NTG(亚硝基胍诱变)复合诱变,诱导培养能高效表达壳聚糖酶TQK菌株及其发酵生产高活力壳聚糖酶的生产方法,对该菌株进行斜面培养,一级培养后进行发酵培养,并且在发酵过程中通入富氧空气增加溶氧,保证发酵液溶氧浓度为30%-80%;培养18-24小时,平均酶活力达到718μ/ml。在优化产酶条件下可发酵得到高活力壳聚糖酶。通过本技术生产出的酶具有产酶量高,产酶稳定,酶活力高,使用本发明的高活力壳聚糖酶能高效经济地转化壳聚糖生产壳寡糖。
Description
技术领域;
本发明涉及微生物发酵技术和酶工程技术,特别是一种高效表达壳聚糖酶的芽孢杆菌TQK菌株和高活力壳聚糖酶制剂的生产方法。
背景技术
目前,国内外降解制备壳寡糖的方法大致可分为酶降解法、氧化降解法和酸降解法三大类。利用生物酶降解制备壳寡糖的过程明显优于另两种化学降解法,这是由于酶法降解过程使降解产物的分子量分布更容易被控制,能对降解过程进行监控,生产出有效(2-10糖)含量较高的壳寡糖,且降解条件比较温和,无需加入大量的反应试剂,对环境污染较少。热点论坛第6卷第2期报道了李风平等(2003)筛选到1株产壳聚糖的腐皮镰孢菌(Fusariumsolani)菌株,摇瓶表明,产酶要84小时,酶活力45mu/ml;逢玉娟等(2005)筛选到产酶能力强的菌株,72小时菌株YJ102发酵液中壳聚糖酶活力达到17.04u/ml;吴健等筛选到一株半纤维A1号菌株,发酵酶活力达到300u/ml。壳聚糖酶数量众多,但普遍存在酶活性低,酶解底物浓度低(3-10%),酶解时间长,能耗高等问题。
发明内容
本发明的目的是利用TQS6菌株,通过UV(紫外线诱变)和NTG(亚硝基胍诱变)复合诱变,诱导培养能高效表达壳聚糖酶的芽孢杆菌TQk菌株,及其发酵生产高活力壳聚糖酶的生产方法,从而能高效经济地转化生产壳寡糖。
使用的微生物:本发明涉及的芽孢杆菌TQK,它具有高效表达壳聚糖酶的特性,该菌株于2007年8月14日在中国典型培养物保藏中心保藏,地址.中国.武汉.武汉大学,保藏号为CCTCC No:M207129(以下简称TQK)。
芽孢杆菌TQK菌株的菌学特性:
a、形态特征:单个细胞0.7~0.8×2~3微米、着色均匀。无荚膜,周生鞭毛,能运动。革兰氏阳性菌,芽孢0.6~0.9×1.0~1.5微米,椭圆到柱状,位于菌体中央或稍偏,芽孢形成后菌体不膨大。
b、生理生化特征:菌落表面粗糙不透明,污白色或微黄色、在液体培养基中生长时,形成皱醭;需氧菌;可利用蛋白质、多种糖及淀粉。在壳聚糖的诱导下产生壳聚糖酶,在壳寡糖的生产上起到关键作用。广泛分布在土壤及腐败的有机物中,易在枯草浸汁中繁殖。
本发明是这样实现的。从CCTCC(中国典型培养物保藏中心保藏)取得的TQS6菌株为基础,通过UV(紫外线诱变)和NTG(亚硝基胍诱变)复合诱变,紫外诱变的条件是:紫外灯功率15~30w,照射距离20~50cm,照射时间1~8min。NTG诱变的条件是:NTG浓度1~3mg/ml,在pH6.0的tris缓冲液中,处理90~120min。将菌种接种在含有0.1~0.5%的刚果红平板培养基中,30~35℃,诱导培养24~48小时,可见透明水解圈。培养基配方按质量百分比计为:1.5~2.5%琼脂,壳聚糖1~3%,胰蛋白胨0.5~2%,酵母浸粉0.5~2%,NaCl0.1~0.5%,刚果红0.1~0.5%。
选取水解圈直径H/C菌落直径比值大的菌株,进行摇瓶复筛,通过DNS法测定酶活。平均酶活力达到518μ/ml。
选取优良菌株进行稳定传代3代。最后得到高产壳聚糖酶斜面菌株。并将该菌株命名为TQK,于4℃冰箱中保存。并送中国典型培养物保藏中心保藏,保藏号为CCTCC No:M207129(简称TQK)
发酵产酶工艺包括如下步骤:
(1)一级液体培养:即从斜面到1000ml三角瓶的放大培养,接种量为TQK斜面菌一环,在30~35℃,200~300r/min,PH6.0~7.0条件下,在液体培养基中培养12~24小时。培养基配方按质量百分比计:壳聚糖0~0.5%,胰蛋白胨0.5~2%,酵母浸粉0.5~2%,NaCl 0~0.5%.
(2)7L小罐发酵产酶
以3-5%的接种量接种,培养条件:35-37℃,300-500r/min,培养基配方为壳聚糖1.5-2.5%,无机盐复合成份(Na2HPO4·12H2O 1~3%,KH2PO4 0.1~0.5%,NaCl 0.1~0.5%,NH4Cl 0.1~0.5%,KCL 0.01~0.05%),4.5-5.0%,酶母浸粉1.0-1.5%,胰蛋白胨1.0-1.5%,玉米渣1-5%,最佳培养条件:35±1℃,500r/min,最佳配方为壳糖聚1.5%,无机盐复合成份4.5%,酶母浸粉1.0%,胰蛋白胨1.0%,玉米渣3%,通入压缩空气,旺盛时补加纯氧,组成富氧空气,保证发酵液溶氧浓度为30%-80%;培养18-24小时,最佳培养22小时;DNS法测定酶液的活力,平均酶活力达到718μ/ml。
(4)酶的纯化
发酵完成后,用大容量低温高速离心机以6000r/min将发酵液中培养基残余物及部分菌体除去。用0.1μm的微滤膜对酶液进行纯化处理,进一步除去残存的微量的菌体,用6000分子量的超滤膜对稀酶进行处理,浓缩除去部分水和无机盐类物质,酶的得率≥80%。
(5)高活力壳聚糖酶酶液低温下(0~4℃)贮存。
本发明与现有技术相比具有以下突出特点:
1、高效产酶菌株
目前,一般菌株发酵产壳聚糖酶的较快周期在72小时(参阅热点论坛第6卷第2期“酶法制备壳寡糖研究现状”一文),本发明采用的菌株则是通过诱变、诱导、筛选出的高效菌株,发酵仅需18-24小时,产酶效率大大提高。
2、酶的活性大大提高
现有壳聚糖的酶活性仅为300u/ml,而本发明提供的酶是高活性的酶,酶活性可达718u/ml。(酶活性测定用DNS法测定)
3、酶解工艺效率高
一般壳聚糖酶发酵水解工艺中,水解底物浓度为3%-10%,需72小时。而将本发明应用于水解工艺中,底物可达20%,水解时间仅需4-6小时。
具体实施方式
下面结合实施例,对本发明做进一步地详细说明。
实施例1高效表达壳聚糖酶的TQK菌株选育.
从CCTCC(中国典型培养物保藏中心保藏)取得的TQS6菌株为基础,通过UV(紫外线诱变)和NTG(亚硝基胍诱变)复合诱变,紫外诱变的条件是:紫外灯功率15~30w,照射距离20~50cm,照射时间1~8min。NTG诱变的条件是:NTG浓度1~3mg/ml,在pH6.0的tris缓冲液中,处理90~120min。将菌种接种在含有0.3%的刚果红平板培养基中,35℃诱导培养30小时,可见透明水解圈。培养基配方按质量百分比计为:2%琼脂,壳聚糖0.5%,胰蛋白胨1%,酵母浸粉1%,NaCl 0.5%,刚果红0.3%。
选取水解圈直径H/C菌落直径比值大的菌株,进行摇瓶复筛,通过DNS法测定酶活。平均酶活力达到518μ/ml。选取优良菌株进行稳定传代3代,最后得到高产壳聚糖酶斜面菌株,于4℃冰箱中保存。将该菌株命名为TQK,保藏号为CCTCC No:M207129。
实施例2 发酵生产壳聚糖酶
1):将TQK菌株(保藏号为CCTCC No:M207129)用划线接种在含酵母浸粉1%,胰蛋白胨1%,氯化钠0.5%,壳聚糖0.5%,琼脂2%的平面培养基上,33℃温度下培养24小时使用。
2)一级液体培养:用1000ml的三角瓶装200ml含酵母浸粉1%,胰蛋白胨1%,氯化钠0.5%,壳聚糖0.5%的液体培养基,10磅灭菌20分钟,接种一环,34℃摇床上震荡(260r/min)培养27小时。
3)用7升发酵罐装5升含酵母浸粉,胰蛋白胨,壳糖聚,无机盐复合成份,玉米渣 组成的液体培养基,同上灭菌后接摇瓶种子200mL于35℃下通气搅拌18-24小时出罐。
4)低温离心分离酶液:用大容量低温高速离心机以6000r/min的转速在4℃条件下离心15-20分钟,除去菌体等残存物,取出上清液得本发明所诉的酶液,置0-4℃低温保存备用。
酶活的测定,采用DNS法测定酶液的活力
1、DNS法测酶活:以1%冰乙酸溶液配置浓度为1%的壳聚糖浓度,49℃水浴保温反应10min,加入DNS试剂,沸水浴中显色10min,用纯水稀释定容到25ml。用721分光光度计,在520nm处进行比色。通过测定OD值求出对应的还原糖含量,再用酶活公式计算求出酶活力。酶活力定义为:在49℃、pH6.0条件下,每分钟生成1μmol相当于壳寡糖的还原糖所需的酶量为一个酶活力单位.
2、酶活计算公式为
公式X=A×1ml/V×F×1/T×1000/180
式中:X-酶活力μmol/ml A-壳寡糖生成量mg。
Claims (2)
1.一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtill)TQK,其保藏号为CCTCCNo:M207129
2.按权利要求1所述的枯草芽孢杆菌CCTCC M207129生产高活力壳聚糖酶的方法,其特征在于包括以下步骤:
(1)一级液体培养:即从斜面到250ml三角瓶的放大培养,接种量为TQK斜面菌一环,在30~35℃,200~300r/min,PH6.0~7.0条件下,在液体培养基中培养12~24小时,培养基配方按质量百分比计:壳聚糖0.5~1%,胰蛋白胨0.5~2%,酵母浸粉0.5~2%,
(2)7L小罐发酵产酶以3-5%的接种量接种,培养条件:35--37℃,300--500r/min,培养基配方为壳聚糖1.5-2%,复合成份4.5-5%,酶母浸粉1.0-1.5%,胰蛋白胨1.0-1.5%玉米渣1-5%最佳培养条件:35±1℃,420r/min,最佳配方为壳聚糖1.5%,无机盐复合成份4.5%,酶母浸粉1.0%,胰蛋白胨1%,玉米渣3%通入压缩空气,旺盛时补加纯氧,组成富氧空气,保证发酵液溶氧浓度为30%-80%;培养18-24小时,最佳培养22小时;DNS法测定酶液的活力,平均酶活力达到718μ/ml,
(3)酶的纯化发酵完成后,用大容量低温高速离心机以6000r/min的转速将发酵液中培养基残余物及部分菌体除去,用0.1μm的微滤膜对酶液进行纯化处理,进一步除去残存的微量的菌体,用6000分子量的超滤膜对稀酶进行处理,浓缩除去部分水和无机盐类物质,酶的得率≥80%,
(4)高活力壳聚糖酶酶液低温下(0~4℃)贮存。
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