CN100347294C

CN100347294C - 一种热稳定海藻糖合成酶及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN100347294C
Application number: CNB2004100738835A
Authority: CN
Inventors: 向华; 任媛媛; 刘景芳; 周坚; 谭华荣
Original assignee: Institute of Microbiology of CAS
Current assignee: Institute of Microbiology of CAS
Priority date: 2004-09-07
Filing date: 2004-09-07
Publication date: 2007-11-07
Anticipated expiration: 2024-09-07
Also published as: CN1746299A

Abstract

本发明公开了海藻糖合成酶及其编码基因与应用，其目的是提供一种热稳定的海藻糖合成酶及其编码基因与该海藻糖合成酶的表达方法，和利用该海藻糖合成酶生产海藻糖的方法。本发明所提供的海藻糖合成酶，是具有序列表中的SEQ ID №：2的氨基酸残基序列的蛋白质或是将序列表中SEQ ID №：2的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且可催化海藻糖合成的蛋白质。本发明的海藻糖合成酶可以葡萄糖和α-1-磷酸葡萄糖为反应底物，催化合成海藻糖，为工业化酶法生产海藻糖提供了一条新的途径。

Description

一种热稳定海藻糖合成酶及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及生物工程和酶工程领域中一种热稳定海藻糖合成酶及其编码基因与应用，特别涉及一种热稳定海藻糖合成酶及其编码基因与该海藻糖合成酶的表达方法，和利用该海藻糖合成酶生产海藻糖的方法。

背景技术

海藻糖是一种由两个葡萄糖分子以α-1，1糖苷键连接的非还原性双糖，它广泛分布于微生物，植物及昆虫中，通常在环境胁迫条件下海藻糖作为一种相溶性介质对生物大分子乃至生物体起保护作用。研究表明海藻糖是一种有效的保护剂，可以保护酶、活性蛋白、生物膜、医药产品甚至待移植的器官，因此海藻糖生物合成途径的研究和利用已成为目前的研究热点。在微生物中海藻糖主要有三条生物合成途径，即由UDP-葡萄糖和α-葡萄糖-6-磷酸合成海藻糖的OtsA-OtsB途径，由1，4糖苷键连接的寡聚糖在分子内转糖基酶的作用下转变为1，1糖苷键并进而水解生成海藻糖的TreY-TreZ途径，以及由麦芽糖转变为海藻糖的TreS途径。

腾冲嗜热厌氧菌(Thermoanaerobacter tengcongensis)是生活在我国云南省腾冲地区热泉中的一种微生物，是一种嗜热的真细菌，最适生长温度为75℃，厌氧生长，革兰氏染色呈阴性。它是由中国科学院微生物研究所首先发现并进行了分类学上的研究(Int.J.Syst.Evol.Microbiol.2001，51：1335-1341)，并已保存在中国微生物保存中心(Thermoanaerobacter tengcongensis AS1.2430T)。该菌的全基因组序列的Genbank保存号为AE008691。

发明内容

本发明的目的是提供一种海藻糖合成酶及其编码基因。

本发明所提供的海藻糖合成酶，名称为TreP，是一种可催化海藻糖分解和合成可逆反应的磷酸化酶，但其主要功能是催化以1-磷酸葡萄糖和葡萄糖为底物的海藻糖生物合成，其合成效率约是分解效率的70倍以上。该酶来源于腾冲嗜热厌氧菌(Thermoanaerobacter tengcongensis)，是具有序列表中的SEQ ID№：2的氨基酸残基序列的蛋白质或是将序列表中SEQ ID №：2的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且可催化海藻糖合成的蛋白质。

序列表中的SEQ ID№：2由781个氨基酸残基组成。

自序列表中序列2的氨基端第335位-第714位氨基酸残基为糖苷水解酶家族65所具有的保守区。

上述海藻糖合成酶的编码基因也属于本发明的保护范围。

上述海藻糖合成酶的编码基因，可具有下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID№：1的DNA序列；

2)与序列表中SEQ ID№：1限定的DNA序列具有95％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；

3)在高度严谨条件下可与序列表中的序列1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；

4)与序列表中的序列1限定的DNA序列具有70％以上的同源性的简并序列。

所述高度严谨条件为杂交后用含0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液在65℃下洗膜。

序列表中的SEQ ID №：1由2346个碱基组成，其编码序列为自5’端第1到第2346位碱基。

含有本发明基因的表达载体、细胞系及工程菌均属于本发明的保护范围，如表达载体pTreP，含有pTreP的工程菌-大肠杆菌BL21DE3(pLysS)/pTreP。

扩增上述海藻糖合成酶编码基因中任一片段的引物对也在本发明的保护范围之内。

本发明的第二个目的是提供一种表达上述海藻糖合成酶的方法。

本发明所提供的表达海藻糖合成酶的方法，是将含有上述海藻糖合成酶编码基因的重组表达载体导入宿主细胞中得到重组宿主细胞，培养所述重组宿主细胞，表达得到海藻糖合成酶。

用于培养所述重组细胞的培养基可为培养宿主细胞的培养基，并添加载体要求的抗生素(如pTreP对应的氨苄青霉素等)。

在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市场销售的各种质粒、粘粒、噬菌体及反转录病毒等作为出发载体。可以将上述海藻糖合成酶编码基因直接地连接于表达载体中表达调控序列下游，从而形成含有上述海藻糖合成酶编码基因的重组表达载体。所述表达载体含有复制起始点和表达调控序列，启动子，还可能含有增强子和必要的加工信息位点。表达载体还必须含有可供选择的标记基因，如具有抗生素或其它毒性物质(氨苄青霉素，卡那霉素，氨甲蝶呤等)抗性的蛋白质的编码基因，或互补营养缺陷型的蛋白质的编码基因或提供复合培养基中没有的必需营养成分的蛋白质的编码基因。各种不同宿主的合适标记基因是本领域中所熟知或生产厂商说明书注明的。这些重组表达载体可以用本领域技术人员所公知的重组DNA技术制备，如可参考Sambrook等人的做法(分子克隆实验指南1989)等。

所述重组表达载体可为pTreP。

可根据具体采用的重组表达载体选择相应的表达条件。

所述宿主细胞包括原核细胞和真核细胞。常用的原核细胞包括大肠杆菌，枯草杆菌等。常用的真核细胞包括酵母细胞和各种动植物细胞。

所述宿主细胞优选为大肠杆菌，所述重组宿主细胞可为含有pTreP的工程菌-大肠杆菌BL21DE3(pLysS)/pTreP细胞。

重组表达载体可以用本领域熟知的方法引入宿主细胞，这些方法包括：电转化法，氯化钙法，基因枪法等。

表达的蛋白可通过本领域所熟知的蛋白分离技术，如柱层析等得到所需纯度的蛋白质。纯度可以用任何合适的方法进行测量，如柱层析，PAGE或HPLC法测量多肽的纯度。

本发明的第三个目的是提供一种生产海藻糖的方法。

本发明所提供的生产海藻糖的方法，是以葡萄糖和α-1-磷酸葡萄糖为反应底物，利用上述海藻糖合成酶催化合成海藻糖。

所述葡萄糖、α-1-磷酸葡萄糖与所述海藻糖合成酶的摩尔比可为3-5∶1∶10^-5，优选为3∶1∶10^-5。

所述海藻糖合成酶催化合成海藻糖的适宜催化pH范围为5.5-6.5，适宜催化温度范围为60-70℃。

所述葡萄糖和α-1-磷酸葡萄糖可由廉价的淀粉或蔗糖经葡萄糖基磷酸化酶催化得到。

实验证明，本发明的海藻糖合成酶可以葡萄糖和α-1-磷酸葡萄糖为反应底物，催化合成海藻糖，还可以催化海藻糖分解为葡萄糖和α-1-磷酸葡萄糖，但其主要功能是催化海藻糖合成反应。

本发明的海藻糖合成酶催化合成海藻糖的最适pH为6.0，最适温度为70℃。热稳定性实验表明，该酶性质比较稳定，在70℃下温育5小时还能保持80％以上的活性，是一个新的热稳定海藻糖合成酶。该酶为工业化酶法生产海藻糖提供了一条新的途径。

下面结合实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

附图说明

图1为海藻糖合成酶表达工程菌BL21DE3(pLysS)/pTreP的构建示意图

图2为大肠杆菌中表达的TreP的SDS-PAGE电泳图谱

图3A为海藻糖合成酶催化的海藻糖合成反应开始时(0min)和反应30min后(30min)的HPLC图谱

图3B为海藻糖合成酶催化的海藻糖分解反应开始时(0min)和反应30min后(30min)的HPLC图谱

图4A为海藻糖合成酶催化海藻糖分解反应的pH-稳定性曲线

图4B为海藻糖合成酶催化海藻糖合成反应的pH-稳定性曲线

图4C为海藻糖合成酶催化海藻糖分解反应的温度-稳定性曲线

图4D为海藻糖合成酶催化海藻糖合成反应的温度-稳定性曲线

图5为海藻糖合成酶催化海藻糖合成反应的热稳定性曲线

具体实施方式

实施例1、TreP的表达

1、TreP基因的获得及表达工程菌的构建

对腾冲嗜热杆菌的全基因组信息(GenBankNC-003869)进行分析，找到了可能的海藻糖合成酶基因(SEQ ID NO.1)。根据推测的海藻糖合成酶的基因序列，设计如下引物：引物1：5’-AT GGATCCGGTGAAAAAGACGAAGAA-3’(划线部分碱基为BamHI识别序列)和引物2：5’-TG GTCGACATTTTCTCCTGACTTTAT-3’(划线部分碱基为SalI识别序列)，以腾冲嗜热杆菌总DNA为模板，采用PCR技术扩增，反应条件为：94℃3min预变性，然后94℃45s、52℃ 45s、72℃3min进行25个循环，最后72℃延伸10min。扩增产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳，结果得到一条2400bp左右的条带。扩增条带经回收后连接入pGEM-T载体进行测序，结果表明扩增得到的海藻糖合成酶具有序列表中SEQ ID NO：1的核苷酸序列，与预测的序列一致，编码序列表中SEQ ID NO：2的氨基酸残基序列。自序列表中序列2的氨基端第335位氨基酸残基到第714位氨基酸残基为糖苷水解酶家族65所具有的保守区。

将测序验证的PCR产物(已克隆在pGEM-T载体上)，经过BamHI和SalI酶切，酶切产物用T₄连接酶连接到同样酶切后的表达载体pET23b上，得到海藻糖合成酶表达质粒pTreP(图1)；将其转化到大肠杆菌BL21DE3(pLysS)中，经氨苄青霉素抗性培养基筛选得阳性克隆并用BamHI和SalI等进行酶切鉴定，结果得到工程菌大肠杆菌BL21DE3(pLysS)/pTreP。

2、TreP的表达

(1)TreP的表达

将BL21DE3(pLysS)/pTreP和BL21DE3(pLysS)/pET23b(只转空载体pET23b的阴性对照菌)在含有氨苄青霉素(50mg/L)的LB液体培养基中37℃培养12小时，转接入装有相同培养基发酵罐中，当菌体浓度的OD₆₅₀值达到0.6-1.0时，加入IPTG至1mM诱导该海藻糖合成酶过量表达，诱导5h后收集菌体，超声破碎，离心，取上清，进行10％SDS-PAGE电泳，结果如图2所示，表明在约90KD处有一特异性的目的蛋白表达条带，与重组TreP分子量的理论值相符。图2中，M为蛋白分子量；1为阴性对照菌BL21DE3(pLysS)/pET23b诱导后表达的总蛋白；2为工程菌BL21DE3(pLysS)/pTreP诱导后表达的总蛋白。凝胶扫描分析测定表明，海藻糖合成酶的表达量占菌体总蛋白的15％。

(2)TreP的纯化

将上述步骤经超声破碎的工程菌诱导表达的总蛋白(其中海藻糖合成酶的表达量占菌体总蛋白的15％左右)于75℃热处理30分钟，大部分大肠杆菌蛋白变性，离心可去除变性的大肠杆菌杂蛋白，而热稳定的海藻糖合成酶仍在上清中，这样即可得到海藻糖合成酶占50％以上的粗酶；粗酶经Sephadex G100柱层析，柱用50mmol/L的Tris-HCl缓冲液(pH8.0)洗脱，收集有海藻糖合成酶活性部分，进行纯度鉴定，获得纯度可达电泳检测为单一条带热稳定的海藻糖合成酶。

实施例2、TreP的活性测定及其最适反应温度和pH

1、TreP的海藻糖合成与分解活性鉴定

将10μg纯化的TreP酶与25mM的α-1-磷酸葡萄糖和125 mM的葡萄糖在50mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.0)37℃条件下保温30分钟，将反应混合物在100℃沸水浴中加热5分终止反应，反应产生的海藻糖通过高效液相色谱(HPLC)检测，结果如图3A所示，有明显的海藻糖合成。与此相比较，当用等蛋白量的对照菌BL21DE3(pLysS)/pET23b的超声破碎物与上述底物温育时，则没有海藻糖合成。结果表明该treP基因编码的TreP蛋白确实具有明显的海藻糖合成活性。将10μgTreP酶和250mM的海藻糖在50mM磷酸缓冲液(pH 7.0)中于37℃温育30分钟，反应产生的葡萄糖和α-1-磷酸葡萄糖通过高效液相色谱(HPLC)检测，结果如图3B所示，表明反应30分钟后，有葡萄糖和α-1-磷酸葡萄糖生成，说明TreP也具有一定的海藻糖分解酶活性。以上结果说明TreP已在大肠杆菌中成功表达。图3A和图3B中，Glc-1-P表示α-1-磷酸葡萄糖；Glc表示葡萄糖。

2、TreP的最适反应温度和pH

酶的相对活性用分解反应产生的葡萄糖(Glucose)的量和合成反应产生的海藻糖(Trehalose)的量进行表示。根据对酶活性的分析来研究温度和pH对该酶活性和稳定性的影响。

(1)海藻糖分解反应的最适pH

将10μg TreP酶和250mM的海藻糖在50mM磷酸缓冲液(pH分别为4.0，5.0，6.0，7.0，8.0和9.0)在37℃条件下保温30分钟，将反应混合物在100℃沸水浴中加热5分终止反应，反应产生的葡萄糖通过高效液相色谱(HPLC)检测，结果如图4A所示，表明在37℃保温30分钟时，该酶催化分解海藻糖的最适pH为6.0-8.0。

(2)海藻糖合成反应的最适pH

将10 μ g纯化的TreP酶与25mM的α-1-磷酸葡萄糖和125mM的葡萄糖在50mMTris-HCl缓冲液(pH分别为4.0，5.0，6.0，7.0，8.0和9.0)在37℃保温30分钟，将反应混合物在100℃沸水浴中加热5分终止反应，通过HPLC测定生成的海藻糖的量，获得pH-稳定性曲线(图4B)，表明在37℃保温30分钟时，该酶催化合成海藻糖的最适pH为6.0。

(3)海藻糖分解反应的最适温度

将10μg TreP酶和250mM的海藻糖在50mM磷酸缓冲液(pH7.0)分别在37、50、60、70、80和90℃保温30分钟，将反应混合物在100℃沸水浴中加热5分终止反应，反应产生的葡萄糖通过高效液相色谱(HPLC)检测，结果如图4C所示，表明在pH 7.0反应30分钟时，该酶催化分解海藻糖的最适温度为50-80℃。

(4)海藻糖合成反应的最适温度

将10μg纯化的TreP酶与25mM的α-1-磷酸葡萄糖和125mM的葡萄糖在50mM Tris-HCl缓冲液(pH 6.0)分别在37、50、60、70、80和90℃保温30分钟，将反应混合物在100℃沸水浴中加热5分终止反应，通过HPLC测定生成的海藻糖的量，获得pH-稳定性曲线(图4D)，表明在pH 6.0反应30分钟时，该酶催化合成海藻糖的最适温度为70℃。

(5)TreP催化海藻糖合成和分解效率的比较

在合成反应的最适条件(pH 7.0和70℃反应30分钟)，10μg TreP催化25mMα-1-磷酸葡萄糖与125mM的葡萄糖反应生成11.5mM，转化率达46％；而同样酶在其最适条件(pH 7.0和70℃反应30分钟)下仅催化250mM海藻糖分解产生1.5mM葡萄糖，转化率仅0.6％；因此该实验条件下，TreP催化海藻糖合成的效率约为分解效率的77倍，是一种海藻糖合成酶。

实施例3、海藻糖合成酶TreP催化合成海藻糖的热稳定性实验

将10μg TreP酶分别在50、60、70和80℃热处理1-7小时，然后在适宜条件下(70℃，pH6.0)测定残余酶活性，将热处理前的酶活性定为100％，残余酶相对活性如图5表示，结果表明，70℃热处理5小时后该海藻糖合成酶还保持80％以上活性，50-60℃热处理7小时后该海藻糖合成酶还保持75％以上活性。说明该TreP是一种热稳定海藻糖合成酶。

序列表

<160>2

<210>1

<211>2346

<212>DNA

<213>腾冲嗜热厌氧菌(Thermoanaerobacter tengcongensis)

<400>1

atggtgaaaa agacgaagaa gcccatttac ccttttgaag attggacaat aagggagaca 60

gagtttagca tagaaacaaa ctatagaaat gagacaattt ttgctcaggc gaatggatat 120

atgggaatga gaggaaattt tgaagaaggg tattcaggac ctgacggtac ttccttaaaa 180

gggacttata ttaatgggtt ttatgaaata cacgatatca tctaccctga agggggatac 240

ggttttgcga aaacagggca gaccatgtta aatgtggctg acagcaaaat aatagaattg 300

tacgtaggag aagaaaaatt tgacctttta aaaggtaaaa tccactttta tgaaagagta 360

cttgatatga aaaaaggttg tgtagaaaga aagataaagt gggagtctcc ttcaggaaag 420

attgtaaatg taaaaataaa gagaattgtt tcattgcaaa ggcaacattt agcagtaatt 480

tctttttctg tagaacctat taattttacg ggaaatataa aatttgtatc tgctattgat 540

ggagatgtga ggaacattac tgagagcgaa gatgtaagag tgggttcaaa tctgaagggg 600

agagttttag agactgttga aagaggagca aatgactttg agggatggat ttctcaaaaa 660

acacaaaaaa gcaacctttc atatacttgc gcaatgaaaa atgaactcat tgggacagaa 720

aaatacgagg ttttgaacaa cgtaaaagaa gatagggtag aggttgcagt agcttttaaa 780

gctgagaaga acagggtata cattctgaat aaatttatat cttattatac ctcaaaagat 840

tgcgacaaaa gtgaaacaat gaaattggcc ttagaagaag tgagaagagc acaagaagat 900

ggattttgca aaatagaaaa agagcaggaa gaatttttgc aatctttttg ggaagatgcc 960

gatgtagtaa tagaaggaga taaggctctg cagcagggta taagatttaa tatgtttcac 1020

cttttgcagt ctgtcggtag agacggaaaa actaatattg cagcaaaggg acttactggg 1080

gaagggtatg aaggccatta cttttgggat tctgatattt atatattgcc ttttttcctt 1140

tacacgaagc cagaaattgc aaaagcttta ataatgtata gatataacct cttagatgct 1200

gcgagaaata gggctaaaga gttggggcat aaaggagctt tatacccctg gaggacaatt 1260

gatggacctg aatgttctgc atactttcct gctggaactg ctcaatatca cataaatgct 1320

gatatagttt atgctttaaa aaggtatgtg gaggccacga atgatttgga ttttctctat 1380

gactacggct gtgaaatagt gtttgaaact gcaaggtttt gggaagattt aggagcgtat 1440

attcctctta aaggaaataa attctgtata aacactgtca ctggtcctga tgagtatacg 1500

gcattggttg ataataacgc atatacaaat tatatggcaa aaatgaattt ggaatacgcc 1560

tatgatattg caaacaaaat gaaaaaggaa gtgcctgaaa agtatcaaaa ggtcgcttca 1620

aaactaaatc taaaagatga agagattgct tcgtggaaaa gggcagctga caatatgtac 1680

cttccttact cggaagagct tgatattata ccacaggatg acagtttttt gtataaagaa 1740

aggataacag tggatgaaat accggaagat caatttccgt tattgcttca ctggcactac 1800

ctcaacattt acaggtatca gatctgcaaa cagcctgatg tgttgctttt gatgttttta 1860

cagagagaaa aatttactat agaacagctt aaaaagaatt ttgattatta tgaacctatt 1920

actactcacg actcttccct gtcgccagca atatttagta tacttgccaa tgaaataggg 1980

tatactgaca aagcatataa atactttatg atgactgcaa ggatggactt ggatgattac 2040

aatgacaatg taaaagatgg aattcatgct gcagcaatgg cagggtcctg gagtgccgtt 2100

gtaaatggtt ttggaggaat gagagtttat acagatgaac tgcactttac tccaagactg 2160

cctgagggat ggaagatgct ctcttttaat gtaaagtaca aagggaggaa gataaatgta 2220

aaattaactc atgaagaatc agtatttacc cttttggaag gagaacctat agaaattttc 2280

tattttgaca gaagagtgtt aataaagtca ggagaaaata tactaaaagg gtatgaggag 2340

aagtga 2346

<210>2

<211>781

<212>PRT

<213>腾冲嗜热厌氧菌(Thermoanaerobacter tengcongensis)

<400>2

Met Val Lys Lys Thr Lys Lys Pro Ile Tyr Pro Phe Glu Asp Trp Thr

1 5 10 15

Ile Arg Glu Thr Glu Phe Ser Ile Glu Thr Asn Tyr Arg Asn Glu Thr

20 25 30

Ile Phe Ala Gln Ala Asn Gly Tyr Met Gly Met Arg Gly Asn Phe Glu

35 40 45

Glu Gly Tyr Ser Gly Pro Asp Gly Thr Ser Leu Lys Gly Thr Tyr Ile

50 55 60

Asn Gly Phe Tyr Glu Ile His Asp Ile Ile Tyr Pro Glu Gly Gly Tyr

65 70 75 80

Gly Phe Ala Lys Thr Gly Gln Thr Met Leu Asn Val Ala Asp Ser Lys

85 90 95

Ile Ile Glu Leu Tyr Val Gly Glu Glu Lys Phe Asp Leu Leu Lys Gly

100 105 110

Lys Ile His Phe Tyr Glu Arg Val Leu Asp Met Lys Lys Gly Cys Val

115 120 125

Glu Arg Lys Ile Lys Trp Glu Ser Pro Ser Gly Lys Ile Val Asn Val

130 135 140

Lys Ile Lys Arg Ile Val Ser Leu Gln Arg Gln His Leu Ala Val Ile

145 150 155 160

Ser Phe Ser Val Glu Pro Ile Asn Phe Thr Gly Asn Ile Lys Phe Val

165 170 175

Ser Ala Ile Asp Gly Asp Val Arg Asn Ile Thr Glu Ser Glu Asp Val

180 185 190

Arg Val Gly Ser Asn Leu Lys Gly Arg Val Leu Glu Thr Val Glu Arg

195 200 205

Gly Ala Asn Asp Phe Glu Gly Trp Ile Ser Gln Lys Thr Gln Lys Ser

210 215 220

Asn Leu Ser Tyr Thr Cys Ala Met Lys Asn Glu Leu Ile Gly Thr Glu

225 230 235 240

Lys Tyr Glu Val Leu Asn Asn Val Lys Glu Asp Arg Val Glu Val Ala

245 250 255

Val Ala Phe Lys Ala Glu Lys Asn Arg Val Tyr Ile Leu Asn Lys Phe

260 265 270

Ile Ser Tyr Tyr Thr Ser Lys Asp Cys Asp Lys Ser Glu Thr Met Lys

275 280 285

Leu Ala Leu Glu Glu Val Arg Arg Ala Gln Glu Asp Gly Phe Cys Lys

290 295 300

Ile Glu Lys Glu Gln Glu Glu Phe Leu Gln Ser Phe Trp Glu Asp Ala

305 310 315 320

Asp Val Val Ile Glu Gly Asp Lys Ala Leu Gln Gln Gly Ile Arg Phe

325 330 335

Asn Met Phe His Leu Leu Gln Ser Val Gly Arg Asp Gly Lys Thr Asn

340 345 350

Ile Ala Ala Lys Gly Leu Thr Gly Glu Gly Tyr Glu Gly His Tyr Phe

355 360 365

Trp Asp Ser Asp Ile Tyr Ile Leu Pro Phe Phe Leu Tyr Thr Lys Pro

370 375 380

Glu Ile Ala Lys Ala Leu Ile Met Tyr Arg Tyr Asn Leu Leu Asp Ala

385 390 395 400

Ala Arg Asn Arg Ala Lys Glu Leu Gly His Lys Gly Ala Leu Tyr Pro

405 410 415

Trp Arg Thr Ile Asp Gly Pro Glu Cys Ser Ala Tyr Phe Pro Ala Gly

420 425 430

Thr Ala Gln Tyr His Ile Asn Ala Asp Ile Val Tyr Ala Leu Lys Arg

435 440 445

Tyr Val Glu Ala Thr Asn Asp Leu Asp Phe Leu Tyr Asp Tyr Gly Cys

450 455 460

Glu Ile Val Phe Glu Thr Ala Arg Phe Trp Glu Asp Leu Gly Ala Tyr

465 470 475 480

Ile Pro Leu Lys Gly Asn Lys Phe Cys Ile Asn Thr Val Thr Gly Pro

485 490 495

Asp Glu Tyr Thr Ala Leu Val Asp Asn Asn Ala Tyr Thr Asn Tyr Met

500 505 510

Ala Lys Met Asn Leu Glu Tyr Ala Tyr Asp Ile Ala Asn Lys Met Lys

515 520 525

Lys Glu Val Pro Glu Lys Tyr Gln Lys Val Ala Ser Lys Leu Asn Leu

530 535 540

Lys Asp Glu Glu Ile Ala Ser Trp Lys Arg Ala Ala Asp Asn Met Tyr

545 550 555 560

Leu Pro Tyr Ser Glu Glu Leu Asp Ile Ile Pro Gln Asp Asp Ser Phe

565 570 575

Leu Tyr Lys Glu Arg Ile Thr Val Asp Glu Ile Pro Glu Asp Gln Phe

580 585 590

Pro Leu Leu Leu His Trp His Tyr Leu Asn Ile Tyr Arg Tyr Gln Ile

595 600 605

Cys Lys Gln Pro Asp Val Leu Leu Leu Met Phe Leu Gln Arg Glu Lys

610 615 620

Phe Thr Ile Glu Gln Leu Lys Lys Asn Phe Asp Tyr Tyr Glu Pro Ile

625 630 635 640

Thr Thr His Asp Ser Ser Leu Ser Pro Ala Ile Phe Ser Ile Leu Ala

645 650 655

Asn Glu Ile Gly Tyr Thr Asp Lys Ala Tyr Lys Tyr Phe Met Met Thr

660 665 670

Ala Arg Met Asp Leu Asp Asp Tyr Asn Asp Asn Val Lys Asp Gly Ile

675 680 685

His Ala Ala Ala Met Ala Gly Ser Trp Ser Ala Val Val Asn Gly Phe

690 695 700

Gly Gly Met Arg Val Tyr Thr Asp Glu Leu His Phe Thr Pro Arg Leu

705 710 715 720

Pro Glu Gly Trp Lys Met Leu Ser Phe Asn Val Lys Tyr Lys Gly Arg

725 730 735

Lys Ile Asn Val Lys Leu Thr His Glu Glu Ser Val Phe Thr Leu Leu

740 745 750

Glu Gly Glu Pro Ile Glu Ile Phe Tyr Phe Asp Arg Arg Val Leu Ile

755 760 765

Lys Ser Gly Glu Asn Ile Leu Lys Gly Tyr Glu Glu Lys

770 775 780

Claims

1、一种生产海藻糖的方法，是以葡萄糖和α-1-磷酸葡萄糖为反应底物，利用海藻糖合成酶催化合成海藻糖；所述海藻糖合成酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

2、根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述海藻糖合成酶编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

3、根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述葡萄糖、α-1-磷酸葡萄糖与所述海藻糖合成酶的摩尔比为3-5∶1∶10^-5。

4、根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述葡萄糖、α-1-磷酸葡萄糖与所述海藻糖合成酶的摩尔比为3∶1∶10^-5。

5、根据权利要求1或2或3或4所述的方法，其特征在于：所述海藻糖合成酶催化合成海藻糖的催化pH为5.5-6.5，催化温度为60-70℃。