CN1884508A - 一种突变的木糖异构酶及其基因 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种突变的木糖异构酶及其基因。该突变的木糖异构酶来自嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)，其氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。该突变的木糖异构酶在没有改变原有热稳定性的基础上，提高了对底物D－木糖的特异性。该突变的木糖异构酶可以用于木糖、葡萄糖等混合液中专一地检测木糖的含量，本发明所提供的突变木糖异构酶的基因可用于构建利用木糖的重组菌。
Description
技术领域
本发明属于酶的基因工程和酶生化工程领域。具体地说，本发明涉及一种突变的木糖异构酶，这种突变的木糖异构酶能将D-木糖异构化为D-木酮糖，而不能催化D-葡萄糖生成D-果糖。本发明还涉及编码该突变木糖异构酶的基因。
背景技术
木糖异构酶(Xylose Isomerase，XI)(EC 5.3.1.5)又称葡萄糖异构酶，可以催化D-木糖到D-木酮糖及D-葡萄糖到D-果糖的异构化反应，在微生物体内的糖代谢过程中起着重要的作用，是工业上生产高果糖浆的关键酶。
根据序列同源性，木糖异构酶可以分为两大类，第一类约由390个氨基酸残基组成，第二类约由440个氨基酸残基组成。木糖异构酶需要Mg2+、Mn2+或Co2+作为辅因子；其活性中心主要包括与两个金属离子配位的残基和底物结合残基。
自然界微生物体内对于木糖的利用主要有两条途径，一个是通过木糖还原酶和木糖醇脱氢酶的两步作用将木糖转化为木酮糖；另外一条途径是通过木糖异构酶直接将木糖转化为木酮糖；近年来，随着环境污染与能源危机的日益加剧，构建能够发酵木糖生产乙醇的重组酿酒酵母成为研究热点。木糖异构酶途径因不需要辅酶，成为构建木糖发酵菌种的首选便利途径。最近，国内在发酵木糖生产乙醇重组酵母构建方面也取得了可喜的进展，通过在酿酒酵母工业菌株中表达Thermus thermophilus木糖异构酶，建立了木糖代谢途径(WANG Y.，SHI W.L.，LIU X.Y.，et al.Biotechnology Letters，2004，26(11)：885-890)，但由于木糖异构酶活性较低使得重组菌对木糖的利用并不理想。
美国专利(US6475768)报道通过对Thermus thermophilus的木糖异构酶F163，E372，V379位置上的氨基酸进行突变，提高了该酶在低温下的活性。虽然有大量文献报道，通过定向进化或定点突变方法提高了来源于Thermoanaerobacteriumthermosulfurigenes、Thermotoga neapolitana、Thermotoga neapolitana等菌种中木糖异构酶对底物D-葡萄糖的催化活性，但对于提高木糖异构酶对底物D-木糖特异性的研究较少。
发明内容
本发明的目的是提供一种突变的木糖异构酶，该突变的木糖异构酶来自Thermusthermophilus，在没有改变原始酶热稳定性的基础上，提高对底物D-木糖的专一性，不能催化D-葡萄糖生成D-果糖的反应。
本发明另一个目的是提供编码上述突变木糖异构酶的基因(核苷酸序列)，该基因可用于构建利用木糖的重组菌。
本发明的目的可以通过下列措施来达到：
一种突变的木糖异构酶，其氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。该序列表示原木糖异构酶氨基酸序列(即野生型Thermus thermophilus xylA基因所表达的氨基酸序列)的91位的残基被天冬氨酸残基取代。
编码权利要求1所述的木糖异构酶的核苷酸序列(即对应于野生型木糖异构酶氨基酸序列91位的密码子发生突变为表达天冬氨酸的密码子)，如SEQ ID NO.1所述。
含有上述核苷酸序列的表达载体。如质粒、噬菌体等。
用上述表达载体转化的细菌或酵母菌。所述的细菌常用的为大肠杆菌。
本发明所提供的突变木糖异构酶可以用于含有木糖的混合液(如木糖、葡萄糖等混合液)中专一地检测木糖的含量。
进一步将详细解释本发明：
(1)突变XI和突变xylA基因
已知91位的天冬酰胺残基位于木糖异构酶活性中心附近。用天冬氨酸取代对应于91位的天冬酰胺残基，导致具有高热稳定性的以D-木糖为最适底物的突变蛋白的表达。
可以通过常规技术将Thermus thermophilus HB8木糖异构酶基因中编码Asn91的密码子突变为编码Asp的密码子，而获得突变的xylA基因。
在本发明中“对应于91位的氨基酸残基”表示对应于SEQ ID NO.2的氨基酸序列中的91位氨基酸残基。氨基酸残基的位置可以改变。例如，如果在N端***氨基酸残基，本来位于91位的氨基酸残基成为92位。在这种情况下，对应于原来的91位的氨基酸残基被指定为本发明的91位的氨基酸残基。
本发明的有益效果：
本发明提供了一种突变型的木糖异构酶及基因序列，该突变的木糖异构酶在没有改变原始酶热稳定性的基础上，提高了其对底物D-木糖的特异性，使其不能将D-葡萄糖异构化为D-果糖。本发明所提供的基因序列可用于构建利用木糖的重组菌。本发明所提供的突变木糖异构酶也可以用于木糖、葡萄糖等混合液中专一地检测木糖的含量。
附图说明
图1是表达重组质粒构建图。
图2是表达产物的SDS-PAGE分析。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明作进一步的阐述，但不限制本发明。
实施例1：Thermus thermophilus xylA基因的克隆及Asn91位点的突变Thermus thermophilus HB8购自美国菌种保藏中心(ATCC)ATCC27634。
培养基制备：酵母粉4g/L，蛋白胨8g/L，NaCl 2.0g/L，将pH调至7.0，高压蒸气灭菌121℃，15min。
将Thermus thermophilus HB8接种于上述培养基中，置75℃摇床，200rpm，培养12-16小时。8000rpm，4℃，离心15min，收集菌体。
运用基因组提取试剂盒(上海华舜生物工程有限公司)，提取Thermus Thermophilus基因组。以该基因组为模板，使用如下PCR引物(上海博亚公司合成)：
正向引物5’-GGAATTCCATATGTACGAGCCCAAACCGGAGCACAGG-3’(SEQ IDNO.3)
反向引物5’-AAGGAAAAAAGCGGCCGCTCACCCCCGCACCCCCAG-3’(SEQ IDNO.4)
PCR扩增木糖异构酶基因xylA。PCR循环参数为：95℃，2min；94℃，30s；70℃，50s；68℃，1.5min，共进行35个循环。
用DNA回收试剂盒(Takara公司)对扩增出的基因进行回收纯化。将纯化的基因与T-Vector进行常规的连接反应，将连接液转化DH5α菌株进行质粒的扩增。运用质粒提取试剂盒(上海博亚公司)，提取质粒。运用上述的PCR引物进行扩增鉴定确定***xylA基因，得到阳性重组T-vector-xylA质粒。
根据多点突变试剂盒(QuikChangeMulti Site-Directed Mutagenesis Kit，购自STRATAGENE公司)的要求，设计如下引物，5’-ATGGTCACCGCC
GACCTCTTCTCCGAC-3’(SEQ ID NO.7)，以T-vector-xylA质粒为模板进行PCR，将Asn91突变为Asp91。用限制性内切酶Dpn I消化原始质粒模板，将PCR产物转化高效率的感受态细胞，培养后提取质粒进行测序，即可得到含有突变基因(SEQ ID NO.1)的质粒。
实施例2：表达重组质粒的构建、筛选与鉴定
用正向引物5′-CCATATGTACGAACCAAAACCGGAACATCGCTTTACCTTT-3′(SEQ ID NO.5)
反向引物5′-AAGGAAAAAAGCGGCCGCTCAACCACGCACACCCAGGAG-3′(SEQ ID NO.6)
从实施例1中含突变基因的质粒上PCR扩增突变基因xylA，用限制性内切酶NdeI和NotI双酶切突变基因xylA和载体pET-22b(+)，回收后将上述双酶切过的突变基因xylA及pET-22b(+)载体连接，运用常规基因工程技术将连接液转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞，提取质粒。运用上述引物进行扩增鉴定突变基因xylA确定连接到表达载体pET-22b(+)上。
实施例3：Thermus thermophilus木糖异构酶在大肠杆菌Rosetta中的表达
将含有突变基因xylA的pET-22b(+)-xylA重组质粒转化到经过商业化的表达宿主大肠杆菌Rosetta(DE3)中，挑取单菌落到含75μg/mL氨苄青霉素和34μg/ml氯霉素的LB培养液，37℃振荡培养过夜，然后按2％(v/v)接种量接种到含有75μg/mL氨苄青霉素和34μg/mL氯霉素的LB培养液中，37℃培养至OD600约为0.6时，加入IPTG至终浓度0.9mM，诱导表达7h，取一定体积菌液8000rpm，4℃，离心15min收集菌体。
实施例4：木糖异构酶活性测定方法
1.粗酶液制备
取10mL诱导后培养液8000rpm，4℃，离心15min收集菌体，用无菌水洗涤两次后，菌体重悬于0.5mL pH7.5 50mM Tris-HCl缓冲液中，冰浴中超声破碎细胞，12,000rpm，4℃离心10min取上清即为粗酶液。将粗酶液置于80℃水浴，加热40min，12,000rpm，4℃离心10min可去除绝大部分蛋白。取上清后，再通过常规蛋白纯化方法进行纯化。(纯化产品经鉴定其序列符合SEQ ID NO.2)。
2.酶活力测定
木糖异构酶活力测定采用两步法，第一步：取纯化的突变木糖异构酶50μL，0.1M D-木糖50μL，10mM MgCl2 50μL，85℃，反应15min，冰浴终止反应；第二步：取10μL上述反应液，加入1uL(0.08U/μL)山梨醇脱氢酶，3μL 25mM NADH，186μL pH7.550mM Tris-HCl缓冲液，加入96孔微培养板。使用酶标仪在25℃下检测OD340的光吸收变化。酶活力单位(U)定义为每分钟催化产生1μmol木酮糖所需的酶量。通过ΔA340/min的变化根据标准曲线方程y＝2805.81357X(其中Y：mΔA340/min；X：木酮糖的浓度，单位mol/L)确定木糖异构酶的活力。结果显示，在上述反应条件下木糖异构酶比活约为160U/mg。
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<160>7
<210>1
<211>1164
<212>DNA
<213>artificial
<220>
<223>突变的木糖异构酶核苷酸序列
<400>
gtg tac gag ccc aaa ccg gag cac agg ttt acc ttt ggc ctt tgg 45
Met Tyr Glu Pro Lys Pro Glu His Arg Phe Thr Phe Gly Leu Trp
1 5 10 15
act gtg ggc aat gtg ggc cgt gat ccc ttc ggg gac gcg gtt cgg 90
Thr Val Gly Asn Val Gly Arg Asp Pro Phe Gly Asp Ala Val Arg
20 25 30
gag agg ctg gac ccg gtt tac gtg gtt cat aag ctg gcg gag ctt 135
Glu Arg Leu Asp Pro Val Tyr Val Val His Lys Leu Ala Glu Leu
35 40 45
ggg gcc tac ggg gta aac ctt cac gac gag gac ctg atc ccg cgg 180
Gly Ala Tyr Gly Val Asn Leu His Asp Glu Asp Leu Ile Pro Arg
50 55 60
ggc acg cct cct cag gag cgg gac cag atc gtg agg cgc ttc aag 225
Gly Thr Pro Pro Gln Glu Arg Asp Gln Ile Val Arg Arg Phe Lys
65 70 75
aag gct ctc gat gaa acc ggc ctc aag gtc ccc atg gtc acc gcc 270
Lys Ala Leu Asp Glu Thr Gly Leu Lys Val Pro Met Val Thr Ala
80 85 90
gac ctc ttc tcc gac cct gct ttc aag gac ggg gcc ttc acg agc 315
Asp Leu Phe Ser Asp Pro Ala Phe Lys Asp Gly Ala Phe Thr Ser
95 100 105
ccg gac cct tgg gtt cgg gcc tat gcc ttg cgg aag agc ctg gag 360
Pro Asp Pro Trp Val Arg Ala Tyr Ala Leu Arg Lys Ser Leu Glu
110 115 120
acc atg gac ctg ggg gca gag ctt ggg gcc gag atc tac gtg gtc 405
Thr Met Asp Leu Gly Ala Glu Leu Gly Ala Glu Ile Tyr Val Val
125 130 135
tgg ccg ggc cgg gag gga gct gag gtg gag gcc acg ggc aag gcc 450
Trp Pro Gly Arg Glu Gly Ala Glu Val Glu Ala Thr Gly Lys Ala
140 145 150
cgg aag gtc tgg gac tgg gtg cgg gag gcg ctg aac ttc atg gcc 495
Arg Lys Val Trp Asp Trp Val Arg Glu Ala Leu Asn Phe Met Ala
155 160 165
gcc tac gcc gag gac cag gga tac ggg tac cgg ttt gcc ctc gag 540
Ala Tyr Ala Glu Asp Gln Gly Tyr Gly Tyr Arg Phe Ala Leu Glu
170 175 180
ccc aag cct aac gag ccc cgg ggg gac att tac ttc gcc acc gtg 585
Pro Lys Pro Asn Glu Pro Arg Gly Asp Ile Tyr Phe Ala Thr Val
185 190 195
ggg agc atg ctc gcc ttt att cat acc ctg gac cgg ccc gag cgc 630
Gly Ser Met Leu Ala Phe Ile His Thr Leu Asp Arg Pro Glu Arg
200 205 210
ttc ggc ctg aac ccc gag ttc gcc cac gag acc atg gcc ggg ctt 675
Phe Gly Leu Asn Pro Glu Phe Ala His Glu Thr Met Ala Gly Leu
215 220 225
aac ttt gtc cac gcc gtg gcc cag gct ctc gac gcc ggg aag ctt 720
Asn Phe Val His Ala Val Ala Gln Ala Leu Asp Ala Gly Lys Leu
230 235 240
ttc cac att gac ctc aac gac caa cgg atg agc cgg ttt gac cag 765
Phe His Ile Asp Leu Asn Asp Gln Arg Met Ser Arg Phe Asp Gln
245 250 255
gac ctc cgc ttc ggc tcg gag aac ctc aag gcg gcc ttt ttc ctg 810
Asp Leu Arg Phe Gly Ser Glu Asn Leu Lys Ala Ala Phe Phe Leu
260 265 270
gtg gac ctc ctg gaa agc tcc ggc tac cag ggc ccc cgc cac ttt 855
Val Asp Leu Leu Glu Ser Ser Gly Tyr Gln Gly Pro Arg His Phe
275 280 285
gac gcc cac gcc ctg cgt acc gag gac gaa gaa ggg gtt tgg gcc 900
Asp Ala His Ala Leu Arg Thr Glu Asp Glu Glu Gly Val Trp Ala
290 295 300
ttc gcc cga ggc tgc atg cgt acc tac ctg atc tta aag gaa agg 945
Phe Ala Arg Gly Cys Met Arg Thr Tyr Leu Ile Leu Lys Glu Arg
305 310 315
gct gaa gcc ttc cgc gag gat ccc gag gtc aag gag ctt ctt gcc 990
Ala Glu Ala Phe Arg Glu Asp Pro Glu Val Lys Glu Leu Leu Ala
320 325 330
gct tac tat caa gaa gat cct gcg gcc ttg gcc ctt ttg ggc ccc 1035
Ala Tyr Tyr Gln Glu Asp Pro Ala Ala Leu Ala Leu Leu Gly Pro
335 340 345
tac tcc cgc gag aag gcc gaa gcc ctc aag cgg gcg gag ctt ccc 1080
Tyr Ser Arg Glu Lys Ala Glu Ala Leu Lys Arg Ala Glu Leu Pro
350 355 360
ctc gag gcc aag cgg cgc cgg ggt tat gcc ctg gaa cgc ctg gac 1125
Leu Glu Ala Lys Arg Arg Arg Gly Tyr Ala Leu Glu Arg Leu Asp
365 370 375
cag ctg gcg gtg gag tac ctc ctg ggg gtg cgg ggg tga 1164
Gln Leu Ala Val Glu Tyr Leu Leu Gly Val Arg Gly
380 385
<210>2
<211>387
<212>PRT
<213>artificial
<220>
<223>突变的木糖异构酶氨基酸序列
<400>
Met Tyr Glu Pro Lys Pro Glu His Arg Phe Thr Phe Gly Leu Trp
1 5 10 15
Thr Val Gly Asn Val Gly Arg Asp Pro Phe Gly Asp Ala Val Arg
20 25 30
Glu Arg Leu Asp Pro Val Tyr Val Val His Lys Leu Ala Glu Leu
35 40 45
Gly Ala Tyr Gly Val Asn Leu His Asp Glu Asp Leu Ile Pro Arg
50 55 60
Gly Thr Pro Pro Gln Glu Arg Asp Gln Ile Val Arg Arg Phe Lys
65 70 75
Lys Ala Leu Asp Glu Thr Gly Leu Lys Val Pro Met Val Thr Ala
80 85 90
Asp Leu Phe Ser Asp Pro Ala Phe Lys Asp Gly Ala Phe Thr Ser
95 100 105
Pro Asp Pro Trp Val Arg Ala Tyr Ala Leu Arg Lys Ser Leu Glu
110 115 120
Thr Met Asp Leu Gly Ala Glu Leu Gly Ala Glu Ile Tyr Val Val
125 130 135
Trp Pro Gly Arg Glu Gly Ala Glu Val Glu Ala Thr Gly Lys Ala
140 145 150
Arg Lys Val Trp Asp Trp Val Arg Glu Ala Leu Asn Phe Met Ala
155 160 165
Ala Tyr Ala Glu Asp Gln Gly Tyr Gly Tyr Arg Phe Ala Leu Glu
170 175 180
Pro Lys Pro Asn Glu Pro Arg Gly Asp Ile Tyr Phe Ala Thr Val
185 190 195
Gly Ser Met Leu Ala Phe Ile His Thr Leu Asp Arg Pro Glu Arg
200 205 210
Phe Gly Leu Asn Pro Glu Phe Ala His Glu Thr Met Ala Gly Leu
215 220 225
Asn Phe Val His Ala Val Ala Gln Ala Leu Asp Ala Gly Lys Leu
230 235 240
Phe His Ile Asp Leu Asn Asp Gln Arg Met Ser Arg Phe Asp Gln
245 250 255
Asp Leu Arg Phe Gly Ser Glu Asn Leu Lys Ala Ala Phe Phe Leu
260 265 270
Val Asp Leu Leu Glu Ser Ser Gly Tyr Gln Gly Pro Arg His Phe
275 280 285
Asp Ala His Ala Leu Arg Thr Glu Asp Glu Glu Gly Val Trp Ala
290 295 300
Phe Ala Arg Gly Cys Met Arg Thr Tyr Leu Ile Leu Lys Glu Arg
305 310 315
Ala Glu Ala Phe Arg Glu Asp Pro Glu Val Lys Glu Leu Leu Ala
320 325 330
Ala Tyr Tyr Gln Glu Asp Pro Ala Ala Leu Ala Leu Leu Gly Pro
335 340 345
Tyr Ser Arg Glu Lys Ala Glu Ala Leu Lys Arg Ala Glu Leu Pro
350 355 360
Leu Glu Ala Lys Arg Arg Arg Gly Tyr Ala Leu Glu Arg Leu Asp
365 370 375
Gln Leu Ala Val Glu Tyr Leu Leu Gly Val Arg Gly
380 385
<210>3
<211>37
<212>DNA
<213>artificial
<220>
<223>上游引物
<400>
ggaattccat atgtacgagc ccaaaccgga gcacagg 37
<210>4
<211>36
<212>DNA
<213>artificial
<220>
<223>下游引物
<400>
aaggaaaaaa gcggccgctc acccccgcac ccccag 36
<210>5
<211>40
<212>DNA
<213>artificial
<220>
<223>上游引物
<400>
ccatatgtac gaaccaaaac cggaacatcg ctttaccttt 40
<210>6
<211>39
<212>DNA
<213>artificial
<220>
<223>下游引物
<400>
aaggaaaaaa gcggccgctc aaccacgcac acccaggag 39
<210>7
<211>27
<212>DNA
<213>artificial
<220>
<223>人工引物
<400>
atggtcaccg ccgacctctt ctccgac 27
Claims (6)
1、一种突变的木糖异构酶，其氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。
2、编码权利要求1所述的木糖异构酶的核苷酸序列。
3、根据权利要求2所述的核苷酸序列，如SEQ ID NO.1所述。
4、含有权利要求2所述核苷酸序列的表达载体。
5、用权利要求4所述表达载体转化的细菌或酵母菌。
6、权利要求1所述的木糖异构酶在检测含有木糖的混合液中木糖含量的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN200610085762.1A CN1884508A (zh) | 2006-06-29 | 2006-06-29 | 一种突变的木糖异构酶及其基因 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN200610085762.1A CN1884508A (zh) | 2006-06-29 | 2006-06-29 | 一种突变的木糖异构酶及其基因 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN1884508A true CN1884508A (zh) | 2006-12-27 |
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ID=37582814
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
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| CN (1) | CN1884508A (zh) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN100445376C (zh) * | 2006-11-27 | 2008-12-24 | 南京工业大学 | 突变的木糖异构酶及其基因和用途 |
| CN102399804A (zh) * | 2010-09-15 | 2012-04-04 | 中国农业科学院作物科学研究所 | 木糖异构酶基因的功能及其应用 |
| CN109468305A (zh) * | 2017-12-29 | 2019-03-15 | 吉林中粮生化有限公司 | 木糖异构酶突变体、编码该酶的dna分子、导入该dna分子的重组菌株及它们的应用 |
| CN110055184A (zh) * | 2018-12-28 | 2019-07-26 | 吉林中粮生化有限公司 | 酿酒酵母、包含其的微生物制剂及使用其生产乙醇的方法 |
-
2006
- 2006-06-29 CN CN200610085762.1A patent/CN1884508A/zh active Pending
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| CN100445376C (zh) * | 2006-11-27 | 2008-12-24 | 南京工业大学 | 突变的木糖异构酶及其基因和用途 |
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| CN109468305A (zh) * | 2017-12-29 | 2019-03-15 | 吉林中粮生化有限公司 | 木糖异构酶突变体、编码该酶的dna分子、导入该dna分子的重组菌株及它们的应用 |
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