CN1371423A - 编码环状脂肽酰基转移酶的基因及其表达 - Google Patents
编码环状脂肽酰基转移酶的基因及其表达 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及环状脂肽酰基转移酶编码区的核苷酸序列的测定、以及所述酰基转移酶全氨基酸序列的测定、含有编码所述酶的基因的表达载体、以及提供通过在宿主细胞中表达所述表达载体而制备环状脂肽酰基转移酶的方法。按照本发明,通过应用通过遗传工程获得的、具有与从前培养环状脂肽酰基转移酶生产菌得到的酰基转移酶活性相同的转化体,可以缩短培养所需的时间(亦即酰基转移酶生产所需的时间)。
Description
技术领域
本发明涉及使环状脂肽物质的酰基侧链脱酰的酶(以下称为环状脂肽酰基转移酶)、编码所述酶的基因、通过应用所述基因的基因工程生产环状脂肽酰基转移酶的方法以及将环状脂肽物质的酰基侧链脱酰的方法。
背景技术
关于使环状脂肽物质例如FR901379物质及其类似物的酰基侧链脱酰的酶,已经报道了属于链霉菌属(Streptomyces)的细菌(例如环圈链霉菌(Streptomyces anulatus)4811号菌株、环圈链霉菌8703号菌株、链霉菌(Streptomyces sp.)6907号菌株)生产的酶(WO97/32975号公报)。另外,在WO97/47738号公报中,报道了Oidiodendron tenuissimumIFO 6798菌株、Oidiodendron echinulatum IFO 31963菌株、Oidiodendrontruncatum IFO 9951菌株、Oidiodendron truncatum IFO 31812菌株、树粉孢(Oidiodendron sp.)30084号菌株、轮枝孢(Verticillium sp.)30085号菌株生产的酶。
人们一直在寻求大量生产所述酶或者缩短生产时间。
发明的公开
本发明的目的在于更有效地获取环状脂肽酰基转移酶。更具体地讲,本发明的目的在于提供所述环状脂肽酰基转移酶氨基酸序列的测定、编码所述酶的基因的测定、通过应用所述基因的基因工程生产所述酶的方法以及将环状脂肽物质的酰基侧链脱酰的方法。
本发明者们为达到上述目的进行了深入的研究,结果成功地克隆了环状脂肽酰基转移酶的编码区,完成了本发明。而且,本发明者们将含有所述DNA的表达载体导入宿主细胞,使之表达所述环状脂肽酰基转移酶的活性。
也就是说,本发明有以下方面。
(1)含有全部或部分以下(a)、(b)或(c)的编码环状脂肽酰基转移酶的基因。
(a)由序列表序列标识号1所示核苷酸序列组成的DNA
(b)能够在严格条件下与上述(a)的DNA杂交的DNA
(c)与序列表序列标识号1所示核苷酸序列有至少(1)60%同一
性、(2)70%同一性、(3)80%同一性、(4)90%同一性、或(5)
95%同一性的DNA
(2)对以下(a)或(b)的蛋白质或其一部分进行编码的基因。
(a)由序列表序列标识号2所示氨基酸序列组成的蛋白质
(b)由在氨基酸序列(a)中缺失、置换或添加一个或多个氨基酸
的氨基酸序列组成、并且具有环状脂肽酰基转移酶活性的蛋
白质
(3)含有上述(1)或(2)中所述基因的重组载体。
(4)功能性地含有上述(1)或(2)中所述基因的表达载体。
(5)通过用上述(3)或(4)中所述载体转化宿主细胞而得到的转化体。
(6)生产环状脂肽酰基转移酶的方法,所述方法包括在培养基中培养用上述(4)中所述表达载体转化的宿主细胞,从所得到的培养物中收集环状脂肽酰基转移酶,该环状脂肽酰基转移酶能够催化环状脂肽物质的侧链酰基氨基脱酰为氨基的反应。
(7)按照上述(6)中所述的生产方法生产的环状脂肽酰基转移酶。
(8)含有全部或部分以下(a)、(b)或(c)的编码环状脂肽酰基转移酶的基因。
(a)由序列表序列标识号1所示核苷酸序列中核苷酸序号1065-
3359所示的核苷酸序列组成的DNA
(b)能够在严格条件下与上述(a)的DNA杂交的DNA
(c)与序列表序列标识号1所示核苷酸序列中核苷酸序号1065-
3359所示的核苷酸序列至少有(1)60%同一性、(2)70%同一
性、(3)80%同一性、(4)90%同一性、或(5)95%同一性的DNA
(9)编码以下(a)或(b)的蛋白质的基因。
(a)由序列表序列标识号2所示氨基酸序列中氨基酸序号-1或
1-765组成的蛋白质
(b)由在氨基酸序列(a)中缺失、置换或添加一个或多个氨基酸的
氨基酸序列组成、并且具有环状脂肽酰基转移酶活性的蛋白
质
(10)含有上述(8)或(9)中所述基因的重组载体。
(11)功能性地含有上述(8)或(9)中所述基因的表达载体。
(12)通过用上述(10)或(11)中所述载体转化宿主细胞而得到的转化体。
(13)生产环状脂肽酰基转移酶的方法,所述方法包括在培养基中培养用上述(11)中所述表达载体转化的宿主细胞,从所得到的培养物中收集环状脂肽酰基转移酶,该环状脂肽酰基转移酶能够催化环状脂肽物质的侧链酰基氨基脱酰为氨基的反应。
(14)按照上述(13)中所述的生产方法生产的环状脂肽酰基转移酶。
(15)环状脂肽酰基转移酶,所述环状脂肽酰基转移酶由序列表序列标识号1所示核苷酸序列中核苷酸序号1065-3359所示的核苷酸序列组成的DNA所编码。
(16)环状脂肽酰基转移酶,所述环状脂肽酰基转移酶由这样的DNA所编码,即所述DNA与序列表序列标识号1所示核苷酸序列中核苷酸序号1065-3359所示的核苷酸序列有至少(1)60%同一性、(2)70%同一性、(3)80%同一性、(4)90%同一性、或(5)95%同一性。
(17)以下(a)或(b)的蛋白质。
(a)由序列表序列标识号2所示氨基酸序列中氨基酸序号-1或
1-200的氨基酸序列组成的蛋白质
(b)由在上述(a)的氨基酸序列中缺失、置换或添加一个或多个
氨基酸的氨基酸序列组成、并且与下述(18)中所述蛋白质形
成复合体而显示出环状脂肽酰基转移酶活性的蛋白质
(18)以下(c)或(d)的蛋白质
(c)由序列表序列标识号2所示氨基酸序列中氨基酸序号201-
765的氨基酸序列组成的蛋白质
(d)由在上述(c)的氨基酸序列中缺失、置换或添加一个或多个
氨基酸的氨基酸序列组成、并且与上述(17)中所述蛋白质形
成复合体而显示出环状脂肽酰基转移酶活性的蛋白质
(19)编码上述(17)中所述蛋白质的DNA
(20)编码上述(18)中所述蛋白质的DNA
(21)至少含有上述(19)和(20)其中之一的重组载体。
(22)至少含有上述(19)和(20)其中之一的表达载体。
(23)用上述(21)或(22)中所述载体转化宿主细胞而得到的转化
体。
(24)生产环状脂肽酰基转移酶的方法,所述方法包括在培养基中培养用上述(22)中所述表达载体转化的宿主细胞,从所得到的培养物中收集环状脂肽酰基转移酶,该环状脂肽酰基转移酶能够催化环状脂肽物质的侧链酰基氨基脱酰为氨基的反应。
(25)按照上述(24)中所述的生产方法生产的环状脂肽酰基转移酶。
(26)使环状脂肽物质的侧链酰基氨基脱酰为氨基的方法,所述方法包括以下步骤:在培养基中培养用上述(4)、(11)、(22)中所述表达载体转化的宿主细胞,使环状脂肽物质与所得到的培养物或其处理物接触。
附图简述
图1表示环状脂肽酰基转移酶小亚基的一部分的N末端氨基酸序列的测定结果。
图2表示环状脂肽酰基转移酶大亚基的一部分的N末端氨基酸序列的测定结果。
图3是浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)1326/pIJ702-SB的基因图谱。
发明详述
在本发明中,所谓环状脂肽酰基转移酶是将例如FR901379物质及其类似物或者棘白菌素B之类相关物质的酰基侧链脱酰的酶。
本发明的环状脂肽酰基转移酶由大小两个亚基组成,各亚基分别具有以下特征。各亚基形成复合体,表现出所述环状脂肽酰基转移酶活性。
大亚基:
①分子量:约61kDa(SDS-PAGE)
②氨基酸分析:
N末端氨基酸序列为Ser-Asn-Ala-Val-Ala-Phe-Asp-Gly-Ser-Thr-Thr-Val-Asn-Gly-Arg-Gly-Leu-Leu-Leu-Gly(序列表序列标识号3)或者在该氨基酸序列中缺失、置换或者添加一个或多个氨基酸的氨基酸序列。
③由以下DNA所编码的蛋白质:序列表序列标识号1所示核苷酸序列中核苷酸序号1665-3359所示核苷酸序列组成的DNA、或者能够在严格条件下与该DNA杂交的DNA、或者与该核苷酸序列有至少(1)60%同一性、(2)70%同一性、(3)80%同一性、(4)90%同一性、或(5)95%同一性的DNA。
④由序列表序列标识号2所示氨基酸序列中氨基酸序号201-765的氨基酸序列组成的蛋白质、或者由在所述氨基酸序列中缺失、置换或添加一个或多个氨基酸的氨基酸序列组成并且通过与下述小亚基形成复合体而表现出环状脂肽酰基转移酶活性的蛋白质。
小亚基:
①分子量:约19kDa(SDS-PAGE)
②氨基酸分析:
N末端氨基酸序列为Gly-Ser-Gly-Leu-Ser-Ala-Val-Ile-Arg-Tyr-Thr-Glu-Tyr-Gly-Ile-Pro-His-Ile-Val-Ala(序列表序列标识号4)或者在该氨基酸序列中缺失、置换或者添加一个或多个氨基酸的氨基酸序列。
③由以下DNA所编码的蛋白质:序列表序列标识号1所示核苷酸序列中核苷酸序号1065-1664所示核苷酸序列组成的DNA、或者能够在严格条件下与该DNA杂交的DNA、或者与该核苷酸序列有至少(1)60%同一性、(2)70%同一性、(3)80%同一性、(4)90%同一性、或(5)95%同一性的DNA。
④由序列表序列标识号2所示氨基酸序列中氨基酸序号-1或1-200的氨酸序列组成的蛋白质、或者由在所述氨基酸序列中缺失、置换或添加一个或多个氨基酸的氨基酸序列组成并且通过与上述大亚基形成复合体而表现出环状脂肽酰基转移酶活性的蛋白质。
本发明的环状脂肽酰基转移酶对于其来源并没有特别的限制,只要具有上述特征,则来源于天然存在的生物的所述酶,天然或人工突变体、或者变种即由通过导入外来的环状脂肽酰基转移酶基因而得到的转化体得到的所述酶也全都包括在内。
关于人工突变体的制备方法,例如有位点特异性诱变。具体地说,通过用该方法在序列表序列标识号1所示的核苷酸序列中引进随机突变,可以获得突变的环状脂肽酰基转移酶。如此获得的突变的环状脂肽酰基转移酶具有上述特征。
本发明的环状脂肽酰基转移酶可以适当地采用以下已知方法获得:(1)用产生该酶的细胞或者组织的培养物作为原料的分离纯化方法,(2)化学合成方法,或(3)从进行了基因重组技术等操作以表达环状脂肽酰基转移酶的细胞中纯化的方法等。
本发明的环状脂肽酰基转移酶的分离纯化例如可以如下进行。也就是说,在合适的液体培养基中培养表达环状脂肽酰基转移酶的细胞,用众所周知的方法从所得的培养物中进行提取、纯化。所述提取、纯化的方法可以使用适用于含有目标产物的级分的已知方法。
具体如下进行。首先,通过对培养物原样过滤或者离心分离等常规方法,回收细胞或上清液。在细胞中积聚有该酶的情况下,将所述回收的细胞悬浮在合适的缓冲液中,并且加入适当浓度的表面活性剂以溶解膜。在宿主细胞有细胞壁的情况下,需要采用溶菌酶或超声波进行预处理。作为表面活性剂,例如有十二烷基硫酸钠(SDS)、鲸蜡基三甲基溴化铵(CTAB)等。由于这些表面活性剂具有强力蛋白质变性作用,故最好使用例如Triton X-100等温和的非离子型表面活性剂,以使蛋白质折叠而具有生物活性。然后,通过适当组合的常用方法,必要时在表面活性剂存在下,从所得的粗制提取液中分离纯化所述酶。
在所述酶存在于培养基中的情况下,首先通过将培养物过滤或者离心分离来除去沉淀物(细胞等固体物质),仅留下溶液部分,按照适当组合的常用方法,从中分离纯化目标物质。例如有盐析、溶剂沉淀法等利用溶解度的方法;透析、超滤、凝胶过滤、SDS-PAGE等利用分子量差异的方法;离子交换层析等利用电荷的方法;亲和层析等利用特异性亲和性的方法;反相高效液相层析等利用疏水性差异的方法;等电点聚焦等利用等电点差异的方法。更具体地讲,可以通过例如减压浓缩、冷冻干燥、通过常用溶剂进行萃取、pH调节、通过阴离子交换树脂或者阳离子交换树脂、非离子型吸附树脂等常用吸附剂进行处理、结晶、再结晶等常规方法进行分离、纯化,具体可以参照WO97/32975号公报上记载的方法。
通过化学合成的本发明环状脂肽酰基转移酶的制备,例如可以根据序列表序列标识号1所示的核苷酸序列,指定所述序列的全部或一部分所编码的氨基酸,用肽合成仪合成或半合成所述氨基酸来进行。
环状脂肽酰基转移酶基因的克隆通常通过以下方法进行。首先,按照常规方法,从产生环状脂肽酰基转移酶的细胞或组织中完全纯化或部分纯化所述酶,按照Edman法测定大亚基和小亚基各自的N末端氨基酸序列。而且,用序列特异性蛋白酶部分分解各亚基,同样按照Edman法测定所得寡肽的氨基酸序列。合成具有与所测定的部分氨基酸序列相对应的核苷酸序列的寡核苷酸,用其作为引物或探针,通过PCR法或菌落(或噬菌斑)杂交法,从由产生环状脂肽酰基转移酶的细胞或组织制备的RNA或DNA,克隆各亚基。
以所得各亚基的核苷酸序列为基础合成寡核苷酸,将其用作引物,重复PCR法或菌落(或噬菌斑)杂交法,再次从由产生环状脂肽酰基转移酶的细胞或组织制备的RNA或DNA,克隆环状脂肽酰基转移酶。
或者,可以将完全纯化或部分纯化的环状脂肽酰基转移酶的全部或其部分作为抗原,按照常规方法制备针对该酶或其亚基的抗体,通过抗体筛选从由产生环状脂肽酰基转移酶的细胞或组织制备的cDNA或者基因组DNA文库,克隆编码所述酶和/或所述酶的亚基的DNA。
此外,与上述方法不同,可以用PCR法直接克隆本发明的环状脂肽酰基转移酶的编码DNA。也就是说,通过用得自具有所述酶活性的细胞或组织的基因组DNA或cDNA(或mRNA)作为模板,用一对合适的寡核苷酸作为引物,按照常规方法进行PCR,可以扩增含有所述酶编码区、大亚基编码区或小亚基编码区的DNA片段,其中用作引物的寡核苷酸要能使扩增片段覆盖环状脂肽酰基转移酶的编码区、大亚基编码区或者小亚基编码区。
所得DNA***片段的核苷酸序列,可以用化学测序法(Maxam-Gilbert法)或双脱氧终止法等已知的测序技术来测定。
编码本发明环状脂肽酰基转移酶的基因包含基本上由序列表序列标识号1所示核苷酸序列组成的DNA的全部或其一部分。这里所谓“基本上由...组成的DNA”是指除了由上述特定核苷酸序列组成的DNA外,能够在严格条件下(在本发明中,是指核苷酸序列有60%以上相同的DNA能够杂交的条件,严格性可以通过适当改变杂交反应和洗涤期间的温度、盐浓度等来进行调节)与由上述特定核苷酸序列组成的DNA杂交的核苷酸序列组成的DNA、或者与序列表序列标识号1所示的核苷酸序列有至少(1)60%同一性,(2)70%同一性,(3)80%同一性,(4)90%同一性,或(5)95%同一性的DNA。上述基因所编码的环状脂肽酰基转移酶能够将例如FR901379物质及其类似物或者棘白菌素B之类相关物质的酰基侧链脱酰,并且各亚基具有上述物理化学性质。
编码本发明环状脂肽酰基转移酶的基因的其它形式是含有基本上由序列表序列标识号1所示核苷酸序列中核苷酸序号1065-3359所示核苷酸序列组成的DNA的全部或其部分的基因。在这里,所谓“基本上由...组成的DNA”如上文所定义。
此外,本发明提供编码以下(a)或(b)的蛋白质的基因。
(a)由序列表序列标识号2所示氨基酸序列中氨基酸序号-1或1-765组成的蛋白质
(b)由在氨基酸序列(a)中缺失、置换或添加一个或多个氨基酸的氨基酸序列组成、且具有环状脂肽酰基转移酶活性的蛋白质。
本发明还提供编码上述环状脂肽酰基转移酶的大亚基和小亚基的基因。
本发明的基因可以是以任何方法获得的基因。例如,包括由mRNA制备的互补DNA(cDNA)、由基因组文库制备的基因组DNA、化学合成的DNA、通过用RNA或者DNA作为模板经PCR法扩增获得的DNA以及将这些方法适当组合而构建的DNA等。
本发明还涉及含有上述任何基因的重组载体。本发明的重组载体只要能够在原核细胞和/或真核细胞的各种宿主中复制保持或者自主增殖,则对其没有特别的限制,包括质粒载体和噬菌体载体。可以通过在本领域可得到的克隆载体或表达载体中,利用适当的限制性酶切位点***上述任何DNA,方便地制备所述重组载体。
特别是,本发明的重组载体是功能性地含有环状脂肽酰基转移酶编码基因的表达载体。在这里,所谓“功能性地”是指该基因被定位从而使得该基因(DNA)能够在适合于所述载体的宿主细胞中转录,而且能够产生被其编码的蛋白质。最好是具有表达盒的载体,在所述表达盒中启动区、起始密码子、编码环状脂肽酰基转移酶或其各个亚基的基因、终止密码子以及终止区顺序排列。对于所用的表达载体并没有特别限制,只要它在原核细胞和/或真核细胞的各种宿主细胞中有功能,含有能够表达置于其下游的基因的启动区、终止该基因转录的信号亦即终止区,所述启动区和所述终止区通过含有至少一个独特限制性酶识别位点的序列连接即可,但最好还含有用于选择转化体的选择标记基因。此外,根据需要,所述表达载体可以分别在启动区下游和终止区上游含有起始密码子和终止密码子。
当使用含有环状脂肽酰基转移酶大亚基(或者小亚基)编码基因的表达载体制备环状脂肽酰基转移酶时,所用的表达载体除所述DNA外,还以在宿主细胞中可表达的形式含有小亚基(或者大亚基)的编码DNA。可以将大亚基的编码DNA、小亚基的编码DNA分别置于不同的启动子控制之下,或者也可以串联置于同一启动子控制之下。
为了将环状脂肽酰基转移酶分泌到培养基中以获得所述酰基转移酶,本发明的表达载体最好功能性地含有信号序列。对于所述信号序列并没有特别的限制,只要宿主细胞的蛋白质分泌机制能够被识别即可。当宿主细胞是放线菌(Actinomycetes)时,最好是其来源与本发明环状脂肽酰基转移酶的编码基因相同的链霉菌属的信号序列。所述信号序列被细胞内的蛋白酶切除,成熟的蛋白质被分泌到细胞外。
使用细菌作为宿主细胞时,表达载体除含有上述启动区和终止区外,一般还需要包含在宿主细胞中能够自主复制的可复制单位。启动区包括启动子、操纵基因和Shine-Dalgarno(SD)序列。例如,当宿主是大肠杆菌(E.coli)时,作为启动区例如有Trp启动子、lac启动子、recA启动子、lpp启动子、tac启动子等;此外,当宿主是枯草芽孢杆菌(Bacill subtilis)时,作为启动区例如有SPO1启动子、SPO2启动子、penP启动子等;当宿主是放线菌时,例如有melC、tipA、ermE、aphI等。作为终止区,可以是常用的天然或合成的终止子。此外,关于选择标记基因,可以使用四环素、氨苄青霉素、卡那霉素、硫链丝菌肽等各种药物的抗性基因。关于起始密码子,可以使用通常的ATG,但根据情况也可以使用GTG。关于终止密码子,可以使用常用的TGA、TAA和TAG。
当本发明的环状脂肽酰基转移酶的编码基因由来源于产生该酶的细胞或组织的基因组DNA制备,并以含有原始启动区和终止区的形式获得时,可以通过将所述DNA***在待转化的宿主细胞中能够复制保持或自主增殖的已知克隆载体中的合适位点,来构建本发明的表达载体。当宿主是细菌时,所用的克隆载体例如有来源于大肠杆菌的pBR系列载体、pUC系列载体等、或者来源于枯草芽孢杆菌的pUB110、pTP5、pC194等、或者来源于放线菌的pIJ702、pSK1、pSK2、SCP2、SCP1.2、pGA482、pMCXpress等。
本发明的转化体可以通过用含有本发明环状脂肽酰基转移酶编码基因的重组载体转化宿主细胞而制备。对于宿主细胞并没有特别的限制,只要适合于所用的重组载体、能够被转化即可,可以利用本领域常用的天然存在的细胞或者人工构建的突变细胞或者重组细胞等各种各样的细胞。优选细菌,特别是大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和放线菌等,更优选作为一种放线菌的链霉菌属细菌。
将重组载体导入宿主细胞,可以用先前已知的方法来实现。例如,当宿主为大肠杆菌或枯草芽孢杆菌等细菌时,可以使用例如Cohen等的方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,69:2110(1972))、原生质体法(Mol.Gen.Genet.,168:111(1979))以及感受态法(J.Mol.Biol.,56:209(1971))等。
当宿主是放线菌、特别是链霉菌属细菌时,例如可以使用transformation Genetic Manipulation of Streptomyces.A LaboratoryManual.The John Innes Foudation,Norwich,UK,1985中记载的方法(PEG辅助的原生质体转化法)等。
本发明还提供环状脂肽酰基转移酶。
通过在合适的培养基中培养包含功能性地含有上述环状脂肽酰基转移酶编码基因的表达载体的任何转化体,从所得的培养物中收集所述酶,可以制备本发明的环状脂肽酰基转移酶。可以通过适当组合如上所述的各种常用分离技术,对存在环状脂肽酰基转移酶活性的级分进行分离纯化。当用各亚基单位制备时,可以通过使用功能性地含有各亚基编码基因的表达载体,按照同样方法制备而得到。
关于所用的营养培养基,例如有作为碳源的葡萄糖、木糖、半乳糖、甘油、淀粉、糊精等之类的糖类,作为其它碳源的麦芽糖、鼠李糖、棉子糖、***糖、甘露糖、水杨苷、琥珀酸钠、果糖、甘露醇、葡萄糖醇、乳糖、山梨糖、蔗糖等。
作为优选的氮源,可以包含无机或有机氮源(例如硫酸铵、氯化铵、酪蛋白水解物、酵母提取物、聚胨、细菌用胰蛋白胨、牛肉膏、大豆粉、小麦胚芽、potetoprotein、米糠、花生粉、面筋、玉米提取物等。此外,根据需要,也可以在培养基中添加其它营养源(例如无机盐(如二磷酸钠或二磷酸钾、磷酸氢二钾、氯化镁、硫酸镁、氯化钙)、维生素类(例如维生素B1)、抗生素(例如氨苄青霉素、卡那霉素、硫链丝菌肽)等)。
特别是当培养基显著起泡时,根据需要可以添加液体石蜡、脂肪油、植物油、硅酮等消泡剂。
通常在pH4-9、优选pH6-7,15-35℃、优选25-35℃下,将转化体培养10-144小时。
本发明的将环状脂肽物质侧链酰基脱酰的方法,是在合适的培养基中培养包含功能性地含有上述环状脂肽酰基转移酶编码DNA的表达载体的任何转化体,然后通过使所得培养物原样与环状脂肽物质接触,将该物质的侧链酰基脱酰为氨基。或者当所述酶活性存在于所述转化体胞内部分时,通过使环状脂肽物质与所述细胞提取液接触,将所述物质的侧链酰基脱酰为氨基。
当使环状脂肽物质与细胞提取液接触时,可以将培养结束后的培养物离心分离或过滤,回收细胞,将其悬浮于合适的缓冲液例如乙酸缓冲液中,通过超声波处理等破碎细胞,然后离心处理,用所得的上清液作为细胞提取液。
此外,可以通过在所述环状脂肽物质存在下培养生产环状脂肽酰基转移酶的宿主细胞,获得脱酰的环状脂肽物质。
作为本发明的环状脂肽酰基转移酶底物的环状脂肽物质,是指具有多肽环、该环上有作为侧链的“酰基氨基”的物质,这种物质也可以有其它侧链。例如WO97/32975号公报中所记载的物质。
FR901379物质是所述“环状脂肽物质”的一个实例,是通过微生物鞘茎点霉(Coleophoma sp.)F-11899菌株(FERM BP-2635;该菌株保藏于通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所(日本国茨城县つくば市东1丁目1番3号),原保藏日为平成元年10月26日)生产的具有抗真菌活性的已知物质(特开平3-184921号公报),是由下式[Ia]所示的化合物。
本发明的环状脂肽酰基转移酶是将环状脂肽物质的侧链“酰基氨基”脱酰产生“氨基”的酶,具体地说,是将FR901379物质或其盐的棕榈酰侧链或者含FR901379物质的由上述式[I]表示的酰基转移酶FR901379物质类似物或其盐的酰基侧链脱酰以生产环状脂肽物质、具体地说是下式[IIa]所示化合物(FR179642物质)或其盐
化合物[I]和[II]的优选盐有常用的无毒一盐或二盐,包括金属盐例如碱金属盐(如钠盐、钾盐等)、碱土金属盐(如钙盐、镁盐等)、铵盐、与有机碱形成的盐(如三甲胺盐、三乙胺盐、吡啶盐、甲基吡啶盐、二环己胺盐、N,N’-二苄基乙二胺盐等)等、有机酸加成盐(如甲酸盐、乙酸盐、三氟乙酸盐、马来酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐、苯磺酸盐、甲苯磺酸盐等)、无机酸加成盐(如盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、硫酸盐、磷酸盐等)、与氨基酸(例如精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸等)形成的盐等。
脱酰反应完成后,可以适当地组合先前已知的分离纯化方法,例如减压浓缩、冷冻干燥、萃取、pH调节、吸附树脂、离子交换树脂、结晶、再结晶等方法,从脱酰的环状脂肽物质、具体地说是通式[II]所示的FR179642类似物(含FR179642物质)的反应液中进行分离纯化。
实施例
下面描述实施例,以具体说明本发明,但本发明不受这些实施例的限制。
再者,在本发明中使用的多种方法、反应和分析方法是本领域技术人员众所周知的。另外,酶、质粒、宿主等是市售的,除非另有说明。实施例1 链霉菌(Streptomyces sp.)6907号菌株生产的环状脂肽酰基转移酶(FR901379酰基转移酶)的克隆(1)链霉菌6907号菌株染色体DNA的制备
将1接种环的链霉菌6907号菌株(FERM BP-5809;WO97/32975号公报;该菌株保藏于通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所(日本国茨城县つくば市东1丁目1番3号),原保藏日为平成8年3月8日,国际保藏日(移交)为平成9年2月3日)的冷冻保存液,在由0.3%酵母提取物、0.5%蛋白胨、0.3%麦芽汁、1%葡萄糖、5%蔗糖、5mM MgCl2、0.5%甘氨酸组成的培养基(pH6.5)中于30℃培养48小时。通过将10ml培养液离心(5,000rpm,10分钟)收集细菌后,用QIAGEN Genomic tip 20/G(QIAGEN Inc.)按照所述方案进行处理,制备染色体DNA。(2)小亚基的分析①根据小亚基的已知氨基末端氨基酸序列设计PCR用引物
根据FR901379酰基转移酶的小亚基的氨基末端氨基酸序列GlySer Gly Leu Ser Ala Val Ile Arg Tyr Thr Glu Tyr Gly Ile Pro His His ValAla(序列表序列标识号5)(WO 97/32975号公报)[此外,所述小亚基的氨基末端氨基酸序列通过随后详细分析,知道其正确的序列是Gly SerGly Leu Ser Ala Val Ile Arg Tyr Thr Glu Tyr Gly Ile Pro His Ile Val Ala(序列表序列标识号4)。],设计了以下正向引物(SF3)和反向引物(SR2)。SF3 -CTS TCS GCS GTS ATC (序列表序列标识号6)SR2 -GTG GTG SGG GAT SCC (序列表序列标识号7)S:表示C或G。②使用根据小亚基的已知氨基末端氨基酸序列设计的引物进行的PCR
用100ng上述(1)中制备的链霉菌6907号菌株的染色体DNA和1nmol在上述①中设计的各种引物,使用GeneAmp PCR***2400型(Perkin-Elmer,In.c)进行PCR。用50μl反应混合物(在PCR缓冲液中,dNTP各0.2mM和KOD Dash(东洋纺社)1.5单位)进行30个循环的PCR,每个循环为98℃变性20秒、60℃退火2秒和74℃聚合10秒。扩增后,通过5%琼脂糖凝胶电泳分离编码所述小亚基的已知氨基末端的一部分的片段(45bp)。③PCR片段的克隆
用pCR-Script Amp克隆试剂盒(Stratagene公司),按照所述方案处理在上述②中分离的PCR扩增片段(45bp),获得在pCR-Script AmpSK(+)中***该片段的质粒p3S4。④核苷酸序列分析
根据双脱氧终止法,用310 DNA测序仪(Perkin-Elmer,Inc.),用作为M13测序引物的反向引物(New England Biolabs公司),按照所附的方案,对在上述③中得到的质粒p3S4的核苷酸序列进行测序分析。结果示于图1中。(3)大亚基的分析①根据大亚基的已知氨基末端氨基酸序列设计PCR用引物
根据FR901379酰基转移酶的大亚基的氨基末端氨基酸序列SerAsn Ala Val Ala Phe Asp Gly Ser Thr Thr Val Asn Gly Arg Gly Leu LeuLeu Gly(序列表序列标识号3)(WO 97/32975号公报),设计了以下正向引物(LF2)和反向引物(LR)。LF2 -CS GTS GCS TTC GAC GG (序列表序列标识号8)LR -SCC SAG SAG SAG SCC (序列表序列标识号9)S:表示C或G。②使用根据大亚基的已知氨基末端氨基酸序列设计的引物进行的PCR
用100ng上述(1)中制备的链霉菌6907号菌株的染色体DNA和1nmol在上述(3)①中设计的各种引物,使用GeneAmp PCR***2400型(Perkin-Elmer,In.c)进行PCR。用50μL反应混合物(在PCR缓冲液中,dNTP各0.2mM和KOD Dash(东洋纺社)1.5单位)进行30个循环的PCR,每个循环为98℃变性20秒、65℃退火2秒和74℃聚合10秒。扩增后,通过5%琼脂糖凝胶电泳分离编码所述大亚基的已知氨基末端的一部分的片段(53bp)。③PCR片段的克隆
用pCR-Script Amp克隆试剂盒(Stratagene公司),按照所述方案处理在上述(3)②中分离的PCR扩增片段(53bp),获得在pCR-Script AmpSK(+)中***了该片段的质粒p3L1。④核苷酸序列分析
根据双脱氧终止法,用310 DNA测序仪(Perkin-Elmer,Inc.),用作为M13测序引物的反向引物(New England Biolabs公司),按照所附的方案,对质粒p3L1的核苷酸序列进行测序分析。结果示于图2中。(4)FR901379酰基转移酶的分析①用于在小亚基和大亚基之间进行PCR的引物的设计
在迄今已知的酰基转移酶中,其中大部分是以小亚基、大亚基的顺序排列编码的。因此,根据在小亚基的已知氨基酸序列中经PCR所测定的核苷酸序列,设计了正向引物20S。同样,根据在大亚基的已知氨基酸序列中经PCR所测定的核苷酸序列,设计了反向引物19L。20S -ATC CGG TAC ACG GAG TAC GG (序列表序列标识号10)19L -C GTT CAC CGT CGT GGA GCC (序列表序列标识号11)②在小亚基和大亚基之间进行的PCR
用100ng上述(1)中制备的链霉菌6907号菌株的染色体DNA和20pmol在上述(4)①中设计的各种引物,使用GeneAmp PCR***2400型(Perkin-Elmer,In.c)进行PCR。用50μl反应混合物(在PCR缓冲液中,dNTP各0.2mM和2.5单位KOD Dash(东洋纺社))进行30个循环的PCR,每个循环为98℃变性20秒、70℃退火2秒和74℃聚合20秒。扩增后,通过2%琼脂糖凝胶电泳分离编码所述酰基转移酶的一部分的片段(约600bp)。③PCR片段的克隆
用pCR-Script Amp克隆试剂盒(Stratagene公司),按照所述方案处理在上述(4)②中分离的PCR扩增片段(约600bp),获得在pCR-ScriptAmp SK(+)中***了该片段的质粒pSL1。④核苷酸序列分析
根据双脱氧终止法,用310 DNA测序仪(Perin-Elmer,Inc.),用作为M13测序引物的正向引物和反向引物(New England Biolabs公司),按照所附的方案,对在上述(4)③中获得的pSL1的核苷酸序列进行测序分析。结果获得了被认为是所述酰基转移酶的基因的一部分。(5)染色体DNA文库的制备
用Sau3A I(100mU)将1μg在上述(1)中制备的链霉菌6907号菌株的染色体DNA于37℃处理10分钟,进行部分消化。此外,用BamHI5U将1μg粘粒pcos6EMBL(参照Gene,57,229-237(1987))于37℃处理1小时。将两种处理液进行乙醇沉淀,然后用5μl2倍稀释的TE(5mM Tris-HCl(pH8.0),0.5mM)溶解后,加入0.7μl 10×T4 DNA连接酶缓冲液(660mM Tris-HCl(pH7.6),66mM MgCl2,100mM DTT,1mM ATP)和0.7μl T4 DNA连接酶,于22℃保温3小时。用GIGAPACKIII XL包装提取物(Stratagene公司),按照所述方案,对3μl所述连接溶液进行体外包装。使所述包装溶液与指示菌大肠杆菌XL-1 BlueMRA接触,构建了粘粒文库。(6)通过菌落直接PCR进行筛选
用引物20S和19L各20pmol,使用GeneAmp PCR***2400型(Perkin-Elmer,In.c)将上述得到的480个粘粒克隆进行菌落直接PCR。用20μl反应混合物(在PCR缓冲液中,dNTP各0.2mM和2.5单位KOD Dash(东洋纺社))进行30个循环的PCR,每个循环为98℃变性20秒、68℃退火2秒和74℃聚合20秒,获得约600bp片段特异性扩增的粘粒克隆133号。(7)粘粒克隆133号的亚克隆
用EcoR I和Pst I消化粘粒克隆133号,将所得的约8kb片段***pUC18的EcoR I/Pst I位点中,从而获得质粒pEP1。进而用EcoR I和BamH I消化质粒pEP1,将所得的约5.5kb片段***pUC18的EcoRI/BamH I位点中,从而获得质粒pEB。(8)核苷酸序列分析
根据双脱氧终止法,用310 DNA测序仪(Perkin-Elmer,Inc.),用作为M13测序引物的正向引物、反向引物(New England Biolabs公司)和表1中所述的合成寡核苷酸,按照所附的方案,对质粒pEB的核苷酸序列进行测序分析。
表1
AC1AC2AC3AC4AC5AC6AC7AC8AC9AC10AC11AC12AC13AC14AC15AC16AC17AC18AC19AC20AC21AC22AC23AC24AC25AC26AC27AC28AC29AC30AC31AC32AC33AC34AC35AC36AC37AC38AC39AC40AC41AC42AC43AC44AC45 | CAA CTG CGC GTA GTC C (序列表序列标识号13)CAT GGG TTC CAA CGC G (序列表序列标识号14)GCT GTC AAC CGT CTG G (序列表序列标识号15)ACG CGC TGA ACG ATC C (序列表序列标识号16)CGG ACC TGG ACC TAC C (序列表序列标识号17)GTG GGT GAA CAC GAT CG (序列表序列标识号18)GAC CTT CAG CGG CAG C (序列表序列标识号19)CAA GTG GTG TGC GGC G (序列表序列标识号20)GTC GCT GGG CAT CTG G (序列表序列标识号21)GCT GCT GAC GTA CTC C (序列表序列标识号22)GTC AAC CGC ATG GTC C (序列表序列标识号23)ATC GCC TGG ATC GTC G (序列表序列标识号24)CGT CAG CGC GAT CAC C (序列表序列标识号25)GGT GTA CAG CAG CTG C (序列表序列标识号26)CTC CCT CGT CCT GAC C (序列表序列标识号27)GAG TTG TGC GCG TAG G (序列表序列标识号28)TGA CGC TTG GCC GTC C (序列表序列标识号29)GAC TAC GCG CAG TTG G (序列表序列标识号30)TAC AAC GCG TGG ATC G (序列表序列标识号31)GGT GAT CCG GTT CTG C (序列表序列标识号32)GGG TAG TGC GGG TTG C (序列表序列标识号33)CTG CAT CAG CTC AGC C (序列表序列标识号34)GTC CAC CAC TGG GTG C (序列表序列标识号35)GAA GCG GGG TAG GTG G (序列表序列标识号36)CCG GTG CTG AAG AAC C (序列表序列标识号37)CTG CCG CTG AAG GTC C (序列表序列标识号38)TCG AAC GGC GTC CTC C (序列表序列标识号39)TGG AGG ACG CCG TTC G (序列表序列标识号40)GCC TGG ATG TAG CTG G (序列表序列标识号41)GGA CAT CGC GCG TTC G (序列表序列标识号42)CGA ACG CGC GAT GTC C (序列表序列标识号43)CCG TGA CCA TGC GTG C (序列表序列标识号44)GCA CGC ATG GTC ACG G (序列表序列标识号45)GAG GAG ACC TAC CTC G (序列表序列标识号46)AGG TCC CGC TAC GAC G (序列表序列标识号47)GAC CAT GCG GTT GAC G (序列表序列标识号48)CAG TTC CGC CTC GTC G (序列表序列标识号49)CAG GTG GAC GTT GTC G (序列表序列标识号50)GTC GCT GAC GAT CAC G (序列表序列标识号51)GTG ATC GTC AGC GAC C (序列表序列标识号52)GGC GGT GAT GAA GTC G (序列表序列标识号53)CGA CTT CAT CAC CGC C (序列表序列标识号54)GGC GAC TTC TTC ACC G (序列表序列标识号55)CGG TGA AGA AGT CGC C (序列表序列标识号56)CCA GAC GGT TGA CAG C (序列表序列标识号57) |
通过核苷酸序列分析,发现ORF,其中完整地包含对应于小亚基和大亚基的氨基末端氨基酸序列的DNA序列。含有该酰基转移酶基因的质粒pEB的核苷酸序列示于序列表序列标识号1中。实施例2环状脂肽酰基转移酶在宿主细胞中的表达(1)浅青紫链霉菌1326/pIJ702-SB的构建
构建其中将质粒pEB的EcoR I位点变为Sac I位点的质粒pSB。首先,用30U的T4多核苷酸激酶将100pmol合成寡聚体(AAT TGAGCT C;序列表序列标识号12)于37℃处理1小时,将5’-OH末端磷酸化。将反应液于70℃加热10分钟,使T4多核苷酸激酶失活。另一方面,用5U的EcoR I处理1μg质粒pEB后,用1U细菌碱性磷酸酶(BAP)于37℃处理1小时,将5’末端去磷酸化。将这两种处理溶液用LigationHigh(东洋纺社)连接,从而构建了质粒pSB。
用20U的Sac I和20U的BamH I处理5μg质粒pSB,获得含有酰基转移酶基因的5.7kb Sac I-BamH I片段。此外,用10U的Sac I和10U的Bgl II处理作为放线菌用载体的pIJ702(2μg)(ATCC35287),在Ligation High(东洋纺社)的存在下,与先前制备的含酰基转移酶基因的5.7kb Sac I-BamH I片段进行连接。按照GeneticManipulation of Streptomyces.A Laboratory Manual.The John InnesFoudation,Norwich,UK,1985中描述的方法,用该连接溶液转化浅青紫链霉菌1326菌株(J.General Microbiology 1983,129,2703-2713)。将所得的转化体中的1株作为浅青紫链霉菌1326/pIJ702-SB(图3)。(2)转化体的培养和FR901379酰基转移酶的表达
将包含5%蔗糖、1%葡萄糖、0.3%酵母提取物(Difco公司)、0.5%细菌用蛋白胨(bactopeptone)(Difco公司)、0.3%肉膏(Difco公司)、5mMMgCl2、0.5%甘氨酸、50μg/ml硫链丝菌肽(pH6.5)的培养基10ml装入100ml三角烧瓶中,接种5mm见方的转化株浅青紫链霉菌1326/pIJ702-SB细胞。将其于30℃培养3天(260rpm),测定该培养液的FR901379酰基转移酶活性,获得每1ml培养液1小时生成30mgFR179642(脱酰的FR901379物质)的活性。
而且,对于酰基转移酶活性达到最高值的培养时间,转化株浅青紫链霉菌1326/pIJ702-SB为2-3天,比链霉菌6907号菌株的7天缩短至了一半以下。
如下测定该酰基转移酶活性。<酰基转移酶活性的测定>
向由0.1ml 100mg/ml FR901379(参照WO97/32975号公报)水溶液、0.1ml磷酸缓冲液(pH6.0)、0.1ml甲醇、0.6ml蒸馏水组成的溶液中,加入0.1ml培养液,使之在37℃(125rpm)进行反应。15分钟后,加入1ml 4%乙酸和2ml蒸馏水,终止反应。用高效液相层析(HPLC),在以下条件下对所生成的FR179642(脱酰的FR901379物质)进行定量。
柱:Kaseisorb LC PO Super(4.6mm内径×250mm)(东京化成社)
柱温:50℃
洗脱液:蒸馏水∶甲醇∶磷酸=960∶40∶1
流速:1ml/min
检测:UV-215nm
实施例3(1)发酵液的制备
将含有硫链丝菌肽(50μg/mL)的50mL PM-1培养基(6%日食#3600、3%脱脂大豆粉、0.5%CaCO3、0.005%硫链丝菌肽,未调节pH)装入500mL体积的烧瓶中,接种5mm见方的转化株浅青紫链霉菌1326/pIJ702-SB后,于30℃培养3天。将2.5mL该培养物接种到装有50mL SG培养基(8%麦芽糖、3%脱脂大豆粉、3%脱脂小麦胚芽、0.5%CaCO3、0.005%硫链丝菌肽,未调节pH)的500mL烧瓶中,于30℃培养3天。(2)FR901379酰基转移酶的纯化
将8mL 4M KCl加入24mL发酵液中,于4℃放置过夜,将离心(10,000rpm,10分钟)获得的上清液作为KCl萃取液。将该KCl萃取液用Microcon 50(Millipore公司)浓缩10倍,用0.5M磷酸钠缓冲液(pH6.0)调至原始溶液量,将该操作重复2次,除去低分子量的蛋白质。(3)SDS-PAGE分析
用multigel10/20或15/25(第一化学药品社;丙烯酰胺10-20%或者15-25%梯度凝胶),进行SDS-PAGE分析。(4)FR091379酰基转移酶活性的测定
按照实施例2进行测定。(5)蛋白质的定量
用DC蛋白质测定(Lowry法;Biolab公司),以白蛋白为标准进行测定。(6)氨基末端氨基酸序列分析
通过Horizblot(Atto Co.Ltd.),将经SDS-PAGE后的凝胶中的蛋白质电泳转移到PVDF膜上,然后进行CBB染色,用剪刀剪下目标条带。进行氨基末端氨基酸序列分析。
根据分析结果,可知在所生产的环状脂肽酰基转移酶小亚基中,45%具有序列表序列标识号4所示的N末端氨基酸序列,而55%具有其中丝氨酸残基加到其N末端上的N末端氨基酸序列。
工业应用领域
本发明中,从导入环状脂肽酰基转移酶编码基因而获得的转化体得到的重组环状脂肽酰基转移酶,其具有的活性与通过培养生产原来的链霉菌6907号菌株或环圈链霉菌8703号菌株等环状脂肽酰基转移酶的天然分离株所获得的酰基转移酶活性相同,并且通过应用该转化体,可以缩短培养所需的时间(亦即生产环状脂肽酰基转移酶所需的时间)。
本申请以平成11年在日本申请的专利申请第189644号为基础,其内容通过引用全部结合到本说明书中。
序列表独立文本
序列标识号6:寡核苷酸,设计用作扩增FR901379酰基转移酶小亚基N末端氨基酸的编码区DNA的正向引物。
序列标识号7:寡核苷酸,设计用作扩增FR901379酰基转移酶小亚基N末端氨基酸的编码区DNA的反向引物。
序列标识号8:寡核苷酸,设计用作扩增FR901379酰基转移酶大亚基N末端氨基酸的编码区DNA的正向引物。
序列标识号9:寡核苷酸,设计用作扩增FR901379酰基转移酶大亚基N末端氨基酸的编码区DNA的反向引物。
序列标识号10:正向引物,用于扩增FR901379酰基转移酶小亚基和大亚基之间氨基酸的编码区DNA。
序列标识号11:反向引物,用于扩增FR901379酰基转移酶小亚基和大亚基之间氨基酸的编码区DNA。
序列标识号12:寡核苷酸,设计用以将限制位点从Eco RI位点变换为Sac I位点。
序列标识号13:寡核苷酸,设计用作测序引物。
序列标识号14:寡核苷酸,设计用作测序引物。
序列标识号15:寡核苷酸,设计用作测序引物。序列标识号16:寡核苷酸,设计用作测序引物。序列标识号17:寡核苷酸,设计用作测序引物。序列标识号18:寡核苷酸,设计用作测序引物。序列标识号19:寡核苷酸,设计用作测序引物。序列标识号20:寡核苷酸,设计用作测序引物。序列标识号21:寡核苷酸,设计用作测序引物。序列标识号22:寡核苷酸,设计用作测序引物。序列标识号23:寡核苷酸,设计用作测序引物。序列标识号24:寡核苷酸,设计用作测序引物。序列标识号25:寡核苷酸,设计用作测序引物。序列标识号26:寡核苷酸,设计用作测序引物。序列标识号27:寡核苷酸,设计用作测序引物。序列标识号28:寡核苷酸,设计用作测序引物。序列标识号29:寡核苷酸,设计用作测序引物。序列标识号30:寡核苷酸,设计用作测序引物。序列标识号31:寡核苷酸,设计用作测序引物。序列标识号32:寡核苷酸,设计用作测序引物。序列标识号33:寡核苷酸,设计用作测序引物。序列标识号34:寡核苷酸,设计用作测序引物。序列标识号35:寡核苷酸,设计用作测序引物。序列标识号36:寡核苷酸,设计用作测序引物。序列标识号37:寡核苷酸,设计用作测序引物。序列标识号38:寡核苷酸,设计用作测序引物。序列标识号39:寡核苷酸,设计用作测序引物。序列标识号40:寡核苷酸,设计用作测序引物。序列标识号41:寡核苷酸,设计用作测序引物。序列标识号42:寡核苷酸,设计用作测序引物。序列标识号43:寡核苷酸,设计用作测序引物。序列标识号44:寡核苷酸,设计用作测序引物。序列标识号45:寡核苷酸,设计用作测序引物。序列标识号46:寡核苷酸,设计用作测序引物。序列标识号47:寡核苷酸,设计用作测序引物。序列标识号48:寡核苷酸,设计用作测序引物。序列标识号49:寡核苷酸,设计用作测序引物。序列标识号50:寡核苷酸,设计用作测序引物。序列标识号51:寡核苷酸,设计用作测序引物。序列标识号52:寡核苷酸,设计用作测序引物。序列标识号53:寡核苷酸,设计用作测序引物。序列标识号54:寡核苷酸,设计用作测序引物。序列标识号55:寡核苷酸,设计用作测序引物。序列标识号56:寡核苷酸,设计用作测序引物。序列标识号57:寡核苷酸,设计用作测序引物。
序列表<110> 藤泽药品工业株式会社<120> 编码环状脂肽酰基转移酶的基因及其表达<130> 09368<150> JP 11-189644<151> 1999-7-2<160> 57<210> 1<211> 5692<212> DNA<213> 链霉菌(Streptomyces Sp.)<220><221> CDS<222> (948)..(3362)<400> 1gaattccgga tggttggaga ggccgatcca gacggtgggc ggggcgaaga ggctgtcggc 60caggcccgct tcgacgaggt cgaagatcga ggcggcgtcc ggaccgtcca ggatggtgtt 120ctccgcgccg accgccagat agggcagcag gaacacgtgc atctgggccg agtggtagag 180cggcagggag tgcacgggcc ggtcggtcgc ggcgaggccg agcgcggtga tcgcgctgac 240gtactcgtgg accagggccc cgtgcgtcat catcgcgccc ttgggcaggg cggtggtccc 300ggaggtgtac agcagctgca ccaggtcgtc ggaggcgggc gggcgccgcg gggtgaacgc 360ccgttccgtc tccagggcgt cgagcagcga gccgggcgcg tcgcggagcg cgcgcaccgg 420gagtccggcg gggagccgcc cggcgaggtc cgggtcggtc aggacgaggg aggagccgga 480ctggtcgagg aggtaggcca ggtcgtcgcc ggtgaggttc tggttgaccg gtacgtggac 540gagaccggcc cgtgcgcagg cgaggaagcc gatcagatag gcgtcggagt tgtgcgcgta 600ggcggccacc cggtcgccgg gggcgagagc gtactcctcg gtgaggacgg cggcggccgt 660ggagacggcg gcgtccaggg agcggtaggt ccaggtccgg tcggcgtacc gcacggcggt 720ccggtcgggg gtgcgccggg cgctgcgggt gaggacgccg tcgactgtgc tgctgcgtac 780acctgtcatg gcgtgatcct gtgcgtccgg gccctcgggg gtcaagaggc tggataccga 840ccagacggtt gacagcttcc cgggctccct ggctgagtga cgcttggccg tccgggcgtt 900ccggaccggc cgcgcccgtg ccacccgtac cgctgggagg aaacacc ttg acg tta 956
Leu Thr Leucgc aac cgt ctg aga ctg ctc ggg gtc gcc ggt ctc gcc ctg ttc acc 1004Arg Asn Arg Leu Arg Leu Leu Gly Val Ala Gly Leu Ala Leu Phe Thr
-35 -30 -25gtg tcg gcg tcg ctg ccg cct gcc acc gcg tcc ggg acc cag gag acg 1052Val Ser Ala Ser Leu Pro Pro Ala Thr Ala Ser Gly Thr Gln Glu Thr-20 -15 -10 -5cgg cac ccg tcc ggg agc ggt ctt tcg gcc gtc atc cgg tac acg gag 1100Arg His Pro Ser Gly Ser Gly Leu Ser Ala Val Ile Arg Tyr Thr Glu
1 5 10tac ggc att ccg cac atc gtg gcg gag gac tac gcg cag ttg ggc ttc 1148Tyr Gly Ile Pro His Ile Val Ala Glu Asp Tyr Ala Gln Leu Gly Phe
15 20 25ggc acc ggc tgg gcg cag gcc gcc gat cag gtg tgc acg ctg gcg gac 1196Gly Thr Gly Trp Ala Gln Ala Ala Asp Gln Val Cys Thr Leu Ala Asp
30 35 40ggc ttc ctc acg gtg cgc ggg gag cgg tcg agg ttc ttc ggc ccg gac 1244Gly Phe Leu Thr Val Arg Gly Glu Arg Ser Arg Phe Phe Gly Pro Asp45 50 55 60gcc gcc acg gac tac tcc ctc tcc tcg gcg gcg acg aac ctc tcc agc 1292Ala Ala Thr Asp Tyr Ser Leu Ser Ser Ala Ala Thr Asn Leu Ser Ser
65 70 75gac ctg tac ttc cgg ggc gtc cgc gac agc ggc acg gtg gag aag ctg 1340Asp Leu Tyr Phe Arg Gly Val Arg Asp Ser Gly Thr Val Glu Lys Leu
80 85 90ctc aag gag ccc gcg ccc gcc ggt ccg agc agg gac gtc aag gag acg 1388Leu Lys Glu Pro Ala Pro Ala Gly Pro Ser Arg Asp Val Lys Glu Thr
95 100 105atg cgc ggg ttc gcc gcc ggg tac aac gcg tgg atc gcg cag aac cgg 1436Met Arg Gly Phe Ala Ala Gly Tyr Asn Ala Trp Ile Ala Gln Asn Arg
110 115 120atc acc gac ccc gcc tgc cgg ggc gcg tcc tgg gtg cgc ccg gtg acg 1484Ile Thr Asp Pro Ala Cys Arg Gly Ala Ser Trp Val Arg Pro Val Thr125 130 135 140gcg ctg gac gtg gcg gcg cgc ggc tac gcg ctg gcg gtg ctc ggc ggc 1532Ala Leu Asp Val Ala Ala Arg Gly Tyr Ala Leu Ala Val Leu Gly Gly
145 150 155cag ggg cgc ggc atc gac ggc atc acc gcg gca cag ccg ccg acc gcc 1580Gln Gly Arg Gly Ile Asp Gly Ile Thr Ala Ala Gln Pro Pro Thr Ala
160 165 170gct cct ccg gcg gcc ggg gtc acg ccc gag gag gcg gcg acg gcg gcg 1628Ala Pro Pro Ala Ala Gly Val Thr Pro Glu Glu Ala Ala Thr Ala Ala
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190 195 200gcc ttc gac ggc tcc acg acg gtg aac ggg cgc ggg ctg ttg ctc ggc 1724Ala Phe Asp Gly Ser Thr Thr Val Asn Gly Arg Gly Leu Leu Leu Gly205 210 215 220aac ccg cac tac ccg tgg cag ggc gga cgc cgc ttc tgg cag gcg cag l772Asn Pro His Tyr Pro Trp Gln Gly Gly Arg Arg Phe Trp Gln Ala Gln
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320 325 330gcg ggg ctg ccg ttg ccg tgg acg gcg agc acg gcg tac gcg ctg aac 2108Ala Gly Leu Pro Leu Pro Trp Thr Ala Ser Thr Ala Tyr Ala Leu Asn
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20<210> 5<211> 20<212> PRT<213> 链霉菌(Streptomyces Sp.)<400> 5Gly Ser Gly Leu Ser Ala Val Ile Arg Tyr Thr Glu Tyr Gly Ile Pro1 5 10 15His His Val Ala
20<210> 6<211> 15<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 寡核苷酸,设计用作扩增FR901379酰基转移酶小亚基N末端氨基酸的
编码区DNA的PCR引物(正向)。<400> 6ctstcsgcsg tsatc 15<210> 7<211> 15<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 寡核苷酸,设计用作扩增FR901379酰基转移酶小亚基N末端氨基酸的编码区DNA的PCR引物(反向)。<400> 7gtggtgsggg atscc 15<210> 8<211> 16<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 寡核苷酸,设计用作扩增FR901379酰基转移酶大亚基N末端氨基酸的编码区DNA的PCR引物(正向)。<400> 8csgtsgcstt cgacgg16<210> 9<211> 15<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 寡核苷酸,设计用作扩增FR901379酰基转移酶大亚基N末端氨基酸的编码区DNA的PCR引物(反向)。<400> 9sccsagsags agscc15<210> 10<211> 20<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 寡核苷酸,设计用作扩增FR901379酰基转移酶小亚基和大亚基之间氨基酸的编码区DNA的PCR引物(正向)。<400> 10atccggtaca cggagtacgg 20<210> 11<211> 19<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 寡核苷酸,设计用作扩增FR901379酰基转移酶小亚基和大亚基之间氨基酸的编码区DNA的PCR引物(反向)。<400> 11cgttcaccgt cgtggagcc 19<210> 12<211> 10<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 寡核苷酸,设计用以将限制位点EcoR I位点改变为Sac I位点。<400> 12aattgagctc10<210> 13<211> 16<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 寡核苷酸,设计用作测序引物。<400> 13caactgcgcg tagtcc 16<210> 14<211> 16<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 寡核苷酸,设计用作测序引物。<400> 14catgggttcc aacgcg 16<210> 15<211> 16<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 寡核苷酸,设计用作测序引物。<400> 15gctgtcaacc gtctgg 16<210> 16<211> 16<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 寡核苷酸,设计用作测序引物。<400> 16acgcgctgaa cgatcc 16<210> 17<211> 16<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 寡核苷酸,设计用作测序引物。<400> 17cggacctgga cctacc 16<210> 18<211> 17<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 寡核苷酸,设计用作测序引物。<400> 18gtgggtgaac acgatcg 17<210> 19<211> 16<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 寡核苷酸,设计用作测序引物。<400> 19gaccttcagc ggcagc 16<210> 20<211> 16<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 寡核苷酸,设计用作测序引物。<400> 20caagtggtgt gcggcg 16<210> 21<211> 16<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 寡核苷酸,设计用作测序引物。<400> 21gtcgctgggc atctgg 16<210> 22<211> 16<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 寡核苷酸,设计用作测序引物。<400> 22gctgctgacg tactcc 16<210> 23<211> 16<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 寡核苷酸,设计用作测序引物。<400> 23gtcaaccgca tggtcc 16<210> 24<211> 16<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 寡核苷酸,设计用作测序引物。<400> 24atcgcctgga tcgtcg 16<210> 25<211> 16<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 寡核苷酸,设计用作测序引物。<400> 25cgtcagcgcg atcacc 16<210> 26<211> 16<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 寡核苷酸,设计用作测序引物。<400> 26ggtgtacagc agctgc 16<210> 27<211> 16<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 寡核苷酸,设计用作测序引物。<400> 27ctccctcgtc ctgacc 16<210> 28<211> 16<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 寡核苷酸,设计用作测序引物。<400> 28gagttgtgcg cgtagg 16<210> 29<211> 16<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 寡核苷酸,设计用作测序引物。<400> 29tgacgcttgg ccgtcc 16<210> 30<211> 16<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 寡核苷酸,设计用作测序引物。<400> 30gactacgcgc agttgg 16<210> 31<211> 16<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 寡核苷酸,设计用作测序引物。<400> 31tacaacgcgt ggatcg 16<210> 32<211> 16<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 寡核苷酸,设计用作测序引物。<400> 32ggtgatccgg ttctgc 16<210> 33<211> 16<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 寡核苷酸,设计用作测序引物。<400> 33gggtagtgcg ggttgc 16<210> 34<211> 16<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 寡核苷酸,设计用作测序引物。<400> 34ctgcatcagc tcagcc 16<210> 35<211> 16<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 寡核苷酸,设计用作测序引物。<400> 35gtccaccact gggtgc 16<210> 36<211> 16<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 寡核苷酸,设计用作测序引物。<400> 36gaagcggggt aggtgg 16<210> 37<211> 16<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 寡核苷酸,设计用作测序引物。<400> 37ccggtgctga agaacc 16<210> 38<211> 16<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 寡核苷酸,设计用作测序引物。<400> 38ctgccgctga aggtcc 16<210> 39<211> 16<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 寡核苷酸,设计用作测序引物。<400> 39tcgaacggcg tcctcc 16<210> 40<211> 16<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 寡核苷酸,设计用作测序引物。<400> 40tggaggacgc cgttcg 16<210> 41<211> 16<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 寡核苷酸,设计用作测序引物。<400> 41gcctggatgt agctgg 16<210> 42<211> 16<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 寡核苷酸,设计用作测序引物。<400> 42ggacatcgcg cgttcg 16<210> 43<211> 16<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 寡核苷酸,设计用作测序引物。<400> 43cgaacgcgcg atgtcc 16<210> 44<211> 16<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 寡核苷酸,设计用作测序引物。<400> 44ccgtgaccat gcgtgc 16<210> 45<211> 16<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 寡核苷酸,设计用作测序引物。<400> 45gcacgcatgg tcacgg 16<210> 46<211> 16<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 寡核苷酸,设计用作测序引物。<400> 46gaggagacct acctcg 16<210> 47<211> 16<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 寡核苷酸,设计用作测序引物。<400> 47aggtcccgct acgacg 16<210> 48<211> 16<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 寡核苷酸,设计用作测序引物。<400> 48gaccatgcgg ttgacg 16<210> 49<211> 16<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 寡核苷酸,设计用作测序引物。<400> 49cagttccgcc tcgtcg 16<210> 50<211> 16<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 寡核苷酸,设计用作测序引物。<400> 50caggtggacg ttgtcg 16<210> 51<211> 16<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 寡核苷酸,设计用作测序引物。<400> 51gtcgctgacg atcacg 16<210> 52<211> 16<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 寡核苷酸,设计用作测序引物。<400> 52gtgatcgtca gcgacc 16<210> 53<211> 16<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 寡核苷酸,设计用作测序引物。<400> 53ggcggtgatg aagtcg 16<210> 54<211> 16<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 寡核苷酸,设计用作测序引物。<400> 54cgacttcatc accgcc 16<210> 55<211> 16<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 寡核苷酸,设计用作测序引物。<400> 55ggcgacttct tcaccg 16<210> 56<211> 16<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 寡核苷酸,设计用作测序引物。<400> 56cggtgaagaa gtcgcc 16<210> 57<211> 16<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 寡核苷酸,设计用作测序引物。<400> 57ccagacggtt gacagc 16
Claims (26)
1.含有全部或部分以下(a)、(b)或(c)的编码环状脂肽酰基转移酶的基因,
(a)由序列表序列标识号1所示核苷酸序列组成的DNA,
(b)能够在严格条件下与上述(a)的DNA杂交的DNA,
(c)与序列表序列标识号1所示核苷酸序列有至少(1)60%同一性、(2)70%同一性、(3)80%同一性、(4)90%同一性、或(5)95%同一性的DNA。
2.对以下(a)或(b)的蛋白质或其一部分进行编码的基因,
(a)由序列表序列标识号2所示氨基酸序列组成的蛋白质,
(b)由在氨基酸序列(a)中缺失、置换或添加一个或多个氨基酸的氨基酸序列组成、并且具有环状脂肽酰基转移酶活性的蛋白质。
3.重组载体,所述重组载体含有权利要求1或2中所述的基因。
4.表达载体,所述表达载体功能性地含有权利要求1或2中所述的基因。
5.转化体,所述转化体是通过用权利要求3或4中所述载体转化宿主细胞而得到的。
6.生产环状脂肽酰基转移酶的方法,所述方法包括在培养基中培养用权利要求4中所述表达载体转化的宿主细胞,从所得到的培养物中收集环状脂肽酰基转移酶,该环状脂肽酰基转移酶能够催化环状脂肽物质的侧链酰基氨基脱酰为氨基的反应。
7.环状脂肽酰基转移酶,所述环状脂肽酰基转移酶是按照权利要求6中所述的生产方法生产的。
8.含有全部或部分以下(a)、(b)或(c)的编码环状脂肽酰基转移酶的基因,
(a)由序列表序列标识号1所示核苷酸序列中核苷酸序号1065-3359所示的核苷酸序列组成的DNA,
(b)能够在严格条件下与上述(a)的DNA杂交的DNA,
(c)与序列表序列标识号1所示核苷酸序列中核苷酸序号1065-3359所示的核苷酸序列有至少(1)60%同一性、(2)70%同一性、(3)80%同一性、(4)90%同一性、或(5)95%同一性的DNA。
9.编码以下(a)或(b)的蛋白质的基因,
(a)由序列表序列标识号2所示氨基酸序列中氨基酸序号-1或1-765组成的蛋白质,
(b)由在氨基酸序列(a)中缺失、置换或添加一个或多个氨基酸的氨基酸序列组成、并且具有环状脂肽酰基转移酶活性的蛋白质。
10.重组载体,所述重组载体含有权利要求8或9中所述的基因。
11.表达载体,所述表达载体功能性地含有权利要求8或9中所述的基因。
12.转化体,所述转化体是通过用权利要求10或11中所述载体转化宿主细胞而得到的。
13.生产环状脂肽酰基转移酶的方法,所述方法包括在培养基中培养用权利要求11中所述表达载体转化的宿主细胞,从所得到的培养物中收集环状脂肽酰基转移酶,该环状脂肽酰基转移酶能够催化环状脂肽物质的侧链酰基氨基脱酰为氨基的反应。
14.环状脂肽酰基转移酶,所述酶是按照权利要求13中所述的生产方法生产的。
15.环状脂肽酰基转移酶,所述酶由序列表序列标识号1所示核苷酸序列中核苷酸序号1065-3359所示核苷酸序列组成的DNA所编码。
16.环状脂肽酰基转移酶,所述酶由这样的DNA所编码,即该DNA与序列表序列标识号1所示核苷酸序列中核苷酸序号1065-3359所示的核苷酸序列有至少(1)60%同一性、(2)70%同一性、(3)80%同一性、(4)90%同一性、或(5)95%同一性。
17.以下(a)或(b)的蛋白质,
(a)由序列表序列标识号2所示氨基酸序列中氨基酸序号-1至200的氨基酸序列组成的蛋白质,
(b)由在上述(a)的氨基酸序列中缺失、置换或添加一个或多个氨基酸的氨基酸序列组成、并且与下述(c)或(d)的蛋白质形成复合体而显示出环状脂肽酰基转移酶活性的蛋白质,
(c)由序列表序列标识号2所示氨基酸序列中氨基酸序号201-
765的氨基酸序列组成的蛋白质,
(d)由在上述(c)的氨基酸序列中缺失、置换或添加一个或多个
氨基酸的氨基酸序列组成、并且与上述(a)或(b)的多肽形
成复合体而显示出环状脂肽酰基转移酶活性的蛋白质。
18.以下(c)或(d)的蛋白质,
(c)由序列表序列标识号2所示氨基酸序列中氨基酸序号201-765的氨基酸序列组成的蛋白质,
(d)由在上述(c)的氨基酸序列中缺失、置换或添加一个或多个氨基酸的氨基酸序列组成、并且与下述(a)或(b)的蛋白质形成复合体而显示出环状脂肽酰基转移酶活性的蛋白质,
(a)由序列表序列标识号2所示氨基酸序列中氨基酸序号-1或
1-200的氨基酸序列组成的蛋白质,
(b)由在上述(a)的氨基酸序列中缺失、置换或添加一个或多个
氨基酸的氨基酸序列组成、并且与上述(c)或(d)的蛋白质
形成复合体而显示出环状脂肽酰基转移酶活性的蛋白质。
19.DNA,所述DNA编码权利要求17中所述的蛋白质。
20.DNA,所述DNA编码权利要求18中所述的蛋白质。
21.重组载体,所述重组载体至少含有权利要求19和20的其中之一。
22.表达载体,所述表达载体至少含有权利要求19和20的其中之一。
23.转化体,所述转化体是用权利要求21或22中所述载体转化宿主细胞而得到的。
24.生产环状脂肽酰基转移酶的方法,所述方法包括在培养基中培养用权利要求22中所述表达载体转化的宿主细胞,从所得到的培养物中收集环状脂肽酰基转移酶,该环状脂肽酰基转移酶能够催化环状脂肽物质的侧链酰基氨基脱酰为氨基的反应。
25.环状脂肽酰基转移酶,所述酶是按照权利要求24中所述的生产方法生产的。
26.将环状脂肽物质的侧链酰基氨基脱酰为氨基的方法,所述方法包括以下步骤:在培养基中培养用权利要求4、11、22中所述表达载体转化的宿主细胞,使环状脂肽物质与所得到的培养物或其处理物接触。
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