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PATENTANSPRÜCHE
1. Verfahren zur Herstellung der krebsbekämpfende Wirkung aufweisenden Antibiotica Achlacinomycin A und B oder von Mischungen davon, dadurch gekennzeichnet, dass Streptomyces lavendofoliae des Stammes 12/3-A CBS 261.83 unter aeroben Bedingungen in einem Nährmedium, das kohlenstoff- und stickstoffhaltige Verbindungen sowie Mineralsalze enthält, bei Temperaturen von 20-30"C und einem pH-Wert von 6-8,5 48-96 h kultiviert werden, wonach die gebildeten Achlacinomycine A und B gewonnen werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1 zur Herstellung von Achlacinomycin A und B, dadurch gekennzeichnet, dass die gewonnenen Achlacinomycine A und B getrennt und gereinigt werden.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin bei einem pH-Wert von 6,9-7,9 kultiviert wird.
4. Streptomyces lavendofoliae, Stamm 12/3-A CBS 261.83 als Mittel zur Durchführung des Verfahrens gemäss Anspruch 1.
Die Erfindung betrifft ein neues Verfahren für die Hentel- lung der Antibiotica-Verbindungen Achlacinomycin A und B mit antitumoröser Wirkung.
Die Erfindung betrifft auch einen neuen Stamm von Mikroorganismen der bei diesem Verfahren verwendbar ist.
Achlacinomycin hat die allgemeine Formel:
EMI1.1
In Achlacinomycin A bedeutet R
EMI1.2
In Achlacinomycin B bedeutet R
EMI1.3
Die Achlacinomycine A und B gehören zu der Gruppe der Anthracyclinen Antibiotica. Sie sind im Zusammenhang mit verschiedenen gram-positiven Bakterien wirksam und verhindern das Wachstum von Tumoren in Tieren. Die Achlacinomycine A und B und Verfahren zu ihrer Herstellung wurden erstmalig in der JA-PS 864851, Anmeldungstag 27. Juli 1974, beschrieben. Äquivalente zu der genannten JA-PS sind die GB-PS 1 491 266 und die US-PS 3 988315 und 4071411.
Im genannten Patent wird als der das Achlacinomycin erzeugende Stamm Streptomyces galilaeus MA 144 M1 verwendet, der in der American Type Cultuire Collection unter A.T.C.C. No. 31133 und im Japanese Fermentation Research Institute unter FERM No. 2455 hinterlegt ist.
Der genante Stamm von Mikroorganismen weist folgende Charakteristika auf: schwach entwickeltes Luftmyzel auf festem Nährboden, Farbe: Grau. Bildet spiralige Sporenträger, die Sporen sind oval mit glatter Oberfläche, die Sporengrösse beträgt 0,4 bis 0,8 m. Die Kolonien sind faltenartig und das Trägermyzel ist gelb-braun. Lösbares Pigment fehlt oder ist hellbraun. Auf manchen Nährböden wird ein gelblich grünes Pigment gebildet.
Streptomyces galilaeus wird unter aeroben Bedingungen kultiviert. Das optimale Wachstum tritt zwischen 24 und 30"C auf; bei 50"C findet kein Wachstum statt. Es hydrolisiert Gelatine, peptonisiert Milch und hydrolisiert Stärke geringfügig. Melanoid-Pigmente werden auf organischen Nährböden gebildet. Es gedeiht auf dem Priedheim- und Gottlied-Nährboden, der D-Glukose, D-Xylose, L-Arabinose, L-Rhamnose, D-Galaktose und Inosit enthält, wächst aber nicht auf einem Substrat, das D-Mannit enthält.
Wird der Stamm auf einem Nährmedium, das Sojamehl, Glukose, Stärke und verschiedene Salze enthält, unter aeroben Bedingungen kultiviert, dann bildet er nach 36 Stunden 46 mg/l Achlacinomycin A und 23 mg/l Achlacinomycin B.
Die Antibiotica sind sowohl im Myzel als auch im Nährmedium enthalten. Sie werden aus dem Myzel mit Azeton und aus der Kulturflüssigkeit mit Äthylacetat extrahiert.
Die Extrakte werden kombiniert, und die Achlacinomycine A und B werden unter Verwendung der Säulenchromatographie abgetrennt. Die erhaltenen Achlacinomycine A und B enthalten als Verunreinigungen Antibiotica der E-Pyrromycin-Gruppe, die durch Behandlung mit Kupferionen eliminiert werden.
Ein Nachteil des oben erwähnten bekannten Verfahrens ist
die geringe Produktionsaktivität des Mikroorganismus.
Neben den Achlacinomycinen werden verschiedene Antibiotica der E-Pyrromycin-Gruppe gebildet, so dass die Technik der chemischen Reinigung komplizierter wird.
Die Hauptaufgabe der vorliegenden Erfindung bestand darin, neue, Achlacinomycin A und B erzeugende Kulturen vorzusehen, die eine grössere Aktivität bei der Erzeugung von Achlacinomycin A im Vergleich zu den bekannten Kulturen entwickeln und die diese Antibiotika als Hauptkomponenten erzeugen.
Als Ergebnis dieser Nachforschungen wurde aus einer Probe von Erde aus Mittelasien ein neuer Stamm 12/3-A gefunden, der den Spezies Streptomyces lavendofoliae zuzuordnen ist und der hauptsächlich Achlacinomycin A bildet.
Der Streptomyces lavendofoliae-Stamm wurde am 20. Jänner 1982 in der Sammlung von Kulturen der VNIIA unter No. 1670 hinterlegt. Die Sammlung von Mikroorganismen-Stämmen des Institutes VNIIA ist im Register der International Federation of Collections unter der No. 337 (1972) registriert.
Der Streptomyces lavendofoliae-Stamm 12/3-A wurde auch hinterlegt beim Hinterlegungsinstitut des Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS), Osteerstraat 1, Baarn, Niederlande, und zwar am 31. März 1983 unter No. CBS 261.83.
Streptomyces lavendofoliae, Stamm 12/3-A zeigt folgende morphologische, physiologische und antagonistische Eigenschaften.
Morphologische Eigenschaften:
Streptomyces lavendofoliae bildet ein ausgebreitetes Luftmyzel von lila-rosa Farbe ()K 3). Die Sporenträger sind spiralförmig, die Sporen haben eine glatte Oberfläche und eine Grösse von 0,7 bis 1,4 Film. Das Trägermyzel ist beige-rosa bis schmutzig-lila färbig (K1 + M2). Das im Trägermedium entwickelte Pigment ist dunkelbraun bis braun-rosa-violett + r 2+ H2). Die Farben werden nach der Bondarzev Farbskala der USSR Akademie der Wissenschaften, 1954, bestimmt.
Die Kultur findet bei einer Temperatur von 28 C während 28 Tagen statt.
Tabelle 1 Nährboden Parameter Charakteristika 2 2 3 Czapeck's Nährboden Luftmyzel gut entwickelt, lilarosa ()K 3)
Trägermyzel beige-rosa-lila (K + K2) lösliches Pigment braun-blass-rosa (Kl) Gauze I Nährboden Luftmyzel reichlicher Wuchs, fahl blassrosa (#3+D3)
Trägermyzel braun-schmutzig violett(#2+H2) lösliches Pigment braun-blassrosa (Kl) Krasiljnikov's Luftmyzel reichlicher Wuchs, lila-blassrosa ()K3) Medium I Trägermyzel beige-schmutzig violett(Kl +H2) lösliches Pigment braun-blassrosa-violett (K +F2+H2) Stärke Nährboden Luftmyzel mässiger Wuchs,
blassrosa ()IC3)
Trägermyzel beige-rosa (Kl) lösliches Pigment beige-rosa (Kl) Glukose-Aspargin Luftmyzel extensiver Wuchs, hellgrau (K6)
Trägermyzel sandig bräunlich bis braun (Jl 7-K7) lösliches Pigment sandig braun (JI7+K7) Waxman's Nährboden Luftmyzel extensiver Wuchs, blassrosa-grau (A3)
Trägermyzel braun-haselnussbraun bis schmutzig violett (B2-H2) lösliches Pigment braun-dunkelbraun (B2) Hefe-Nährboden mit Luftmyzel extensiver Wuchs, rosa-grau (A3) löslicher Stärke Trägermyzel braun (B7) lösliches Pigment sandbraun bis braun (B7-K7) Glukose Hefe-Nährboden Luftmyzel extensiver Wuchs, weisslich (Dl)
Trägermyzel dunkelbraun (JI 5) lösliches Pigment braun (K7) Hafer-Nährboden Luftmyzel guter Wuchs,
rosa-grau (A3)
Trägermyzel dunkelbraun-braun (B2) lösliches Pigment hellbraun (B7) Malz-Nährboden Luftmyzel extensiver Wuchs, rosa-grau (A3)
Trägermyzel braun-haselnussbraun (B2+ K7) lösliches Pigment dunkelbraun-braun (B2+K7) Gauze 2 Nährboden Luftmyzel mässiger Wuchs, hellgrau (A6)
Trägermyzel braun (K7) lösliches Pigment braun (K7) MPA Luftmyzel schwacher Wuchs
Trägermyzel beige-sandfarben (B6) lösliches Pigment fehlt
Tabelle 1 (Fortsetzung) Nährboden Parameter Charakterislika 2 .
3 Agar mit Tyrosin Luftmyzel reichlicher Wuchs, lila-rosa ()K3)
Trägermyzel pflaumenblau-schwarz.(O 1) lösliches Pigment umbra (07) Tresner's Nährboden mit Luftmyzel guter Wuchs, lila-rosa ()K3) Eisenzitrat Kartoffelschnitzel Trägermyzel dunkelumbra (fl 2) lösliches Pigment dunkelumbra (#2)
Luftmyzel guter Wuchs, weiss bis rosa (03-X(3)
Trägermyzel dunkelbraun (Kl +Bl) lösliches Pigment dunkelbraun (K 1 +Bl)
Physiologische Eigenschaften:
Aerob, optimales Wachstum bei 24 bis 30 C. Kein
Wachstum bei 50 C. Es wirkt mässig verflüssigend auf Gela tine, peptonisiert Milch unter Bräunung und wirkt mässig hydrolisierend auf Stärke. Es formt Melanoide (Tresner's
Medium mit Eisenzitrat und Agar mit Tyrosin).
Streptomyces lavendofoliae, Stamm 12/3-A assimiliert gut die folgenden Kohlenstoffquellen: D-Glukose, D-Xylose,
L-Arabinose, D-Fruktose, D-Galaktose, Inositol. Es assimi liert schlecht oder überhaupt nicht: L-Rhamnose, Saccha rose, Rafinose und D-Mannitol. Streptomyces lavendofoliae,
Stamm 12/3-A kann auf einem passenden Nährmedium unter einer Schicht von Vaselinöl 6 Monate bei einer Tempe ratur von +5 C gelagert werden.
Antagonistische Eigenschaften:
Streptomyces lavendofoliae 12/3-A wird in einem flüssigen Nährmedium auf einem Schüttelbehälter kultiviert.
Nach 3 Tagen hat sich eine Menge von etwa 56 bis 60 mg/ml Achlacinomycin A gebildet, das die nachstehende antimi krobe Wirkung, zytotoxische Aktivität und antitumoröse Wirkung auf Versuchstiere aufweist (Tabellen 2 bis 4).
Tabelle 2 Antimikrobes Spektrum von Achlacinomycin A, das aus einer Kultur von Streptomyces lavendofoliae Stamm 12/3-A erhalten wurde, und von einem Vergleichspräparat.
Testorganismus MîC,ug/mlt
Achlacinomycin A Achlacinomycin A isoliert aus erhältlich von
Str. lavendofoliae Zaideanhojin
Biseibutsu Kagaku
Kenkyukai, Tokio,
Japan 1. 2. 3.
Staphylococus aureus 15,56 7,8 209P Staph. aureus 209P
Streptomycin-resistent 15,56 15,56
Penicillin-resistent 15,56 15,56
Gentamycin-resistent 15,56 15,56
Kanamycin-resistent 11,6 11,6
Oelandomycin-resist. 15,56 11,6
Linkomycin-resistent 15,56 23,3
Violarin-resistent 23,3 19,0
Erythromycin-resist. 31,2 23,2
Dactinomycin-resist. 31,2 70,0
Novobiocin-resist. > 250,0 > 250,0
Rimfampicin-resist. 125,0 125,0
Tabelle (Fortsetzung)
Vankomycin-resist. 125,0 125,0 E.
coli 675 > 250,0 > 250,0 Pseudomanas aeruginosa > 250,0 250,0 Klebsiella pneumoniae > 250,0 > 250,0 Providencia stuartii
ATCC 7240 > 250,0 > 250,0 Candida albicans > 250,0 > 250,0 * MIC, die minimale, wachstumsllemmende pharmazeutische Konzentration wird dadurch bestimmt, dass in zwei parallellautenden Testprogrammen eine Mikroben-Standardladung von 105/ml in einer Reihe von Teströhr chen. die Peptonbrühe als Nährmedium und einen zunehmenden Anteil des pharmazeutiscllen Mittels enthalten. 20 Stunden lang bei einer Temperatur von 37"C und einem pH-Wert 7 kultiviert wird.
Tabelle 3 Antitumoröse Wirkung von Achlacinomycin A auf Versuchstiere.
EMI3.1
<tb>
Tierrasse <SEP> Anwendungs- <SEP> Optimale <SEP> Lebenszeit- <SEP> Tumor
<tb> <SEP> zeit <SEP> (Tage) <SEP> Dosierung <SEP> verl. <SEP> (%) <SEP> Wachstumsver
<tb> <SEP> (mg/kg) <SEP> zög. <SEP> (0MO) <SEP>
<tb> La
<tb> CBFI <SEP> 1#9 <SEP> <SEP> 2,5 <SEP> 92
<tb> LLC
<tb> CBF <SEP> 1--+9 <SEP> 5 <SEP> 67
<tb> S-37
<tb> Bastard- <SEP> 1#5 <SEP> <SEP> 2,5 <SEP> 80
<tb> Mäuse
<tb>
Tabelle 4 Zytostatische Wirkung von Achlacinomycin A und seiner Komplexe mit DNA auf eine suspendierte Kultur von Tumorzellen P-388 Präparat EDso, psxml* Achlacinomycin A 0,01 Achlacinomycin A -DNA Komplex 0,01 * Die Dosis, die zu einer Verringerung des Wachstums der Nukleinsäuren (DNA + RNA) um 50% führt.
Ein Vergleich der morphologischen und physiologischen Eigenschaften des Stammes 12/3-A nach der Erfindung mit jenem des bekannten Produzenten von Achlacinomycin A und B, Streptomyces galilaeus bestätigt die Unterschiede zwischen den betreffenden Kulturen.
Anderseits entspricht der Mikrobenstamm nach der vorliegenden Erfindung, wie sich aus den obigen Grundzügen ergibt, den Eigenschaften von Streptomyces lavendofoliae entsprechend der Definition von Bergey (Tabelle 5).
Tabelle 5 Vergleich der morphologischen und physiologischen Eigenschaften einer Kultur des Stammes 12/3-A nach der Erfindung, mit den Eigenschaften des Prototyps Streptomyces galilaeus MA 144und Streptomyces lavendofoliae.
Parameter Stamm 12/3-A Str. galilaeus Str. lavendofoliae
MA 144M1 (Prototyp) 2. 2. 3. 4.
Sporenträger spiralförmig spiralförmig spiralförmig Sporen glatt, oval glatt, oval glatt, oval Synthetisches Mediums: Luftmyzel Wachstum mässiges gutes von gut bis Wachstum, Wachstum reichlich, hellgrau bis lila-rosa bläulich-rosa grau ()K3) Trägermyzel beige-rosa bis gelb-braun, gelb-braun schmutzig lila auf manchen bis (Jl 7-M2) Medien dunkelbraun gelblich grün lösliches dunkelbraun keine oder gelblich Pigment bis braun braun oder dunkelbraun- dunkelbraun rosa-violett (Kl+r2+H2) Organische Medien:
: Luftmyzel guter Wuchs mässiger guter Wuchs rosa-grau(A3) Wuchs lila-blassrosa hellgrau bis schmutzig violett Trägermyzel sandbraun bis gelbbraun dunkelbraun braun bis tief (X(7+B7- dunkelbraun
K7) lösliches dunkelbraun braun dunkelbraun Pigment (x7-B2+K7) oder tief dunkelbraun UCartoffelschnitzel: Luftmyzel guter Wuchs guter Wuchs guter Wuchs weiss bis rosa hellgrau dunkelbraun (D3-)K3) bis rosa Trägermyzel dunkelbraun braun-gelb dunkelbraun (Kl+Bl) lösliches dunkelbraun haselnuss- dunkelbraun Pigment (Kl+Bl) braun Melanoide: gebildet gebildet gebildet Wachstum auf Zellulose gut gemässigt gut Milch:
unter gemässigt unter
Bräunung peptonisiert Bräunung peptonisiert peptonisiert Hydrolyse von Strärke gemässigt schwach gemässigt
Tabelle (Fortsetzung) Verflüssigung von Gelatine gemässigt schwach gemässigt Saccharose - + D-Glukose + + + D-Xylose + + + L-Arabinose + + + L-Rhamnose - + - D-Fruktose + + D-Galaktose + + + Raffinose - + D-Mannitol Inositol - + +
Bei der taxonometrischen Bestimmung der Kultur 12/3-A wurden folgende Literaturstellen verwendet: Krasiljnikov, N.V. Radiant fungi , Nauka Publishers, 1970, Seiten 172, 238; Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, Editors: Buchanan R.E., Gibbons, N.E. et al., Seiten 808 bis 810.
Als Nährmedium kann jedes Substrat verwendet werden, das vom Achlacinomycin produzierenden Stamm der Spezies Streptomyces lavendofoliae assimiliert werden kann.
Als Kohlenstoffquelle (Kohlenhydratquelle) im Nährmedium werden vorzugsweise Fruktose, Glukose, Arabinose, Xylose, Galaktose, Stärke usw. verwendet.
Als Stickstoffquelle können Fleischextrakl, Peplon, Maisextrakt, Hefeextrakt, Kasein, Hydrolysat, Maismehl, Sojamehl, Baumwollsamenmehl usw. ebenso wie stickstoffhaltige organische und anorganische Verbindungen, wie Ammoniumsalze (Nitrate, Sulfate, Phosphate u.a.), Harnstoff usw.
verwendet werden.
Dem Medium können noch Mineralsalze wie Calziumkarbonat, Natrium und Kaliumphosphat, Natrium und Kaliumchlorid, Magnesiumsalze, Kupfer und andere Mineralsalze zugefügt werden.
Grössere Mengen von Achlacinomycin A und B werden unter Verwendung einer belüfteten Tiefkultur in zwei Stufen erzeugt. Die Inokulation des Fermenters erfolgt mit vegetativem Myzel. Das Substrat, das für die Kultur des vegetativen Myzels Verwendung findet, kann das gleiche sein, das auch bei der Biosynthese von Achlacinomycin A und B Verwendung findet, kann aber auch verschieden sein.
Ein Test verschiedener möglicher Medien zeigte. dass die Nährmedien B-2 und B-3 am günstigsten erscheinen: Bestandteil Nährmedium B-2 (%) B-3 (%)
1. Ammoniumsulfat 0,1 1,5 2. Sojamehl 1,1 1,5 3. Kartoffelstärke 2,6 3,0 4. Calziumkarbonat 0,8 1,4 5. Natriumchlorid 0,3 0,3 6. Kupfersulfat 0,007 0,007 7. Anti-Schäummittel AC-60 0,5 0,5
Das Medium wird bei einer Temperatur von 124 bis 126dz 30 bis 40 Minuten lang sterilisert, wonach der pH-Wert des Mediums neutral ist.
Streptomyces lavendofoliae, Stamm 12/3-A erzeugt bei der Kultur und bei einer Belüftung im Ausmass von 11/1 Medium/min. (ein Liter Luft pro Liter Medium und Minute), bei einer Temperatur von 20 bis 30"C und einem pH-Wert von etwa 6-8,5, vorzugsweise 6,9-7,9, nach 48 bis 96 Stunden Achlacinomycin A in einer Menge bis zu 60 mg/l und Achlacinomycin Bin einer Menge von 4-10 mg/l.
Tabelle 6 Vergleich der physico-chemischen Eigenschaften von Achlacinomycin A vom Str. galilaeus (Antibioticum von der Firma Zaidanhojin Biseibutsu Kagaku, Kenkyukai, Tokio, Japan) und vom Str. lavendofoliae.
Antibiotica erzeugender Stamm
Str. galilaeus MA 144 Ml Str. lavendofoliae
2. 3.
UV-Spektrum*
1% Xnm/E max 1 cm 90%MeOH 431,5/146,1/290/ 431,5/148,6/,289/ 112,1/ 137,4/257/302,9/
257/285,3/,228/ ,228/502/;
485,7/; 0,1N HCl 431,5/146,1/,257/ 431,5/151,4/,289/
285,3/ 137,4/ ,290/112,1/,228/ ,257/302,9/,228/
485,7/; 499,2/; 0,1N NaOH 521,3/118,9/,317,3/ 521,3/130/,318,3/
64,5/285/101,9/,236/ 78,5/,284/126,2/
424,6 ,236/440,3/.
IR-Spektrum** Wmax cm- 3450,2980,2945,2820, 3480,2980,2950,2825,
2760,1735,1675,1620, 2775,1735,1680,1625,
1600,1010. 1600,1010.
PMR-Spektrum*** #ppm 12,55, lH,s.; 12,7, 1H,s.;
12,0, lH,s.; 12,0, 1H,s.;
7,15-7,85,4H,m.; 7,83 1H,J1 = 1,8 Hz
5,58 1H,s.; J2 = 7,8 Hz; 7,68, lH,t.
J = 7,8 Hz;
7,68, 1H,s.; 7,30,
5,31 1H,s.; 1H,J1 = 1,8 Hz,J2=
4,95-5,20, 2H, m.; 7,8 Hz
4,35-4,65,2H,m.; 5,52 1H,m.;5,28,1H,
4,11,1H,s.; m.;4,95-5,20,2H,m;
4,40-4,70, 2H, m.;
4,11 1H,s.;
3,68, 3H, s.; 3,70, 3H, s;
2,3-2,7 5H, m.;
2,25-2,65, 5H, m.; 2,23, 6H, s.; 1,40-2,15,
2,20,6H,s.; 8H,m.;1,32,3H,d.;
J = 6,6 Hz.; 1,45-2,15, 8H, m.; 1,29, 3H, d.,
J = 6,4 Hz;
1,00-1,36 12H,m.; 1,17,3H,d.,
J = 6,2 Hz;
1,08,3H,t.,J = 7 Hz.
Massespektrum**** m/z 376/100%/; 114,/2,6%/,
377/50%/, 376/100%/, 795/15%/, 377/42,8%/,
812,30%/, 394,/5,1%/,
416/1,5%/,
794/10,2%/,
812/28,8%/.
* Die UV-Spektren wurden aufeinem Pye Unicam SP-8-100-Instrument aufgenommen, das mit den Standardfiltern HO-720540 und Di-720538
Pye Unicam kalibriert war.
** Die lR-Spektren wurden auf einem UR-20-Instrument in einer Tablette mit KBr aufgenommen.
*** Die PMR-Spektren wurden auf einem Bruker-WH-90-Instrument,
90 MHz mit CDCl3, TMS als Bezug aufgenommen.
**** Die Massespektren der Felddesorption wurden auf einem Varian Mat 31 l-A-lnstrument aufgenommen. Die Kalibrierung erfolgte mit PFK.
Der Emitterstrom betrug 5 bis 20 mA.
Tabelle 7 Vergleich der physikalisch-chemischen Eigenschaften von Achlacinomycin B aus Str. galilaeus und Str. lavendofoliae.
Antibiotica erzeugender Stamm
Str. galilaeus MA 144 Ml Str. lavendofoliae 1. 2. 3.
UV-Spektrum 1% Xnm/E/ max Icm 90% MeOh 432/159/,298,5/137/ 431,5/149,2/,290/ ,259/313/,229,5/498; 119/,257/296/,228/
508/; 0,1N HCl 431/162/,289,5/156/ 431,5/149/,290/119/ ,259/355/,229/586/; ,257/296/,228/503; 0,1N NaOH 522/145/,315/101/ 521,3/127/,316,3/ ,284/160/,239/510. 77,3/,285/119/,236/
453/.
IR-Spektrum vcm-1 3540,2980,2945,2820, 3490,2980,2950,2830, max 2760,1730,1675,1620, 2780,1735,1680,1625,
1600,1010. 1605,1015.
PMR-Spektrum #ppm 12,2, lH,s.; 12,68, lH,s.;
11,5,1H,s.; 12,02,1H,s.;
7,2-7,9, 4H, m.; 7,24-7,89, 4H, m.;
5,5, 1H,s.; 5,48, lH,s.;
5,1-5,3, 3H, m.; 5,09-5,27, 3H, m.:
4,6-4,9, 2H, m.; 4,62-4,90, 2H, m;
4,5, 1 H, s.; 4,53, 1 H, s.;
4,3-4,4, 1 H, m.; 4,36, 1 H, q.;
4,15, lH,s.; 4,11, lH,s.;
3,8-4,0, 2H, m.; 3,90-4,03, 2H, m.;
3,7,3H,s.; 3,75,1H,s.;
2,2-2,7,4H,m.; 3,69,3H,s.;
2,2, 6H, s.;
2,58, 2H, d.; 1,4-2,0, 8H, m.; 2,46, 1 H, d.; 0,9-1,4, 12H, m.; 2,35, lH,s.;
2,15,6H,s.;
1,45-2,01, 8H, m.;
0,89-1,45, 12H, m.;
Die UV-IR- und PMR-Spektren von Achlacinomycin A und B sind in den Fig. 1 bis 6 dargestellt.
Fig. 1 zeigt das UV-Spektrum von Achlacinomycin A Hydrochlorid in 90% Methanol, Fig. 2 zeigt das UV-Spektrum von Achlacinomycin B Hydrochlorid in 90% Methanol, Fig. 3 zeigt das IR-Spektrum von Achlacinomycin A Hydrochlorid aus einer KBr Tablette, Fig. 4 zeigt das IR Spektrum von Achlacinomycin B Hydrochlorid aus einer KBr Tablette, Fig. 5 zeigt das PMR-Spektrum von Achlacino mycin A Hydrochlorid (CDCl3 - TMS ; T = 303"C) und Fig. 6 zeigt das PMR-Spektrum von Achlacinomycin B Hydrochlorid(CDCl3-TMS;T = 303 C).
Die Achlacinomycine A und B sind im Myzel und im (Nähr-)Medium enthalten. Nach der Fermentation wird das Medium bei einem pH-Wert von 4,5 - 6,0 gefiltert. Die Antibiotica werden aus dem Medium mit Äthylacetat extrahiert (für 10 Volumsteile des Mediums wird ein Volumsteil Äthylacetat verwendet).
Die antibioticahältige organische Schicht wird vom Myzel getrennt. Nach Entfernung der Lösungsmittel werden die wässrigen Rückstände kombiniert und auf einen pH-Wert 6,9 neutralisiert. Danach werden die Antibiotica mit Toluol und dem doppelten Volumen einer 0,01 N-HCL-Lösung extrahiert. Die Antibiotica werden mit Chloroform aus der wässrigen Lösung extrahiert, das auf Na2SO4-Anhydrid getrocknet wird.
Das Chloroform-Extrakt wird in einem Drehverdampfer auf das 0, I-fache Volumen konzentriert und der Rückstand wird 10 bis 12 Volumsteilen trockenem Hexan zugesetzt. Die ausgefällten Antibiotica werden abgetrennt und getrocknet.
Die Reinigung und Abtrennung der Antibiotica erfolgt chromatographisch auf wässriger Kieselsäure in einem Lösungsmittelsystem, das aus Kohlenstoff-Tetrachlorid und Isopropanol besteht.
Die Tabellen 6 und 7 zeigen die Ergebnisse eines Vergleiches von Achlacinomycin A und B, welche Ergebnisse mit UV-IR-PMR- und Massenspektrographie erhalten wurden und welche die Ähnlichkeiten zwischen den Antibiotica, die mit dem erfindungsgemässen Stamm und den früher bekannten Stämmen erhalten werden, bestätigen.
Die Antibiotica Achlacinomycin A und B, die mit dem Stamm 1 2/3-A von Str. lavendofoliae erzeugt werden, sind somit ident mit den Antibiotica, die durch die Kultur von Str.
galilaeus MA144 M1 erhalten werden. Es war bisher nicht bekant, dass Str. lavendofoliae in der Lage ist, Achlacinomycin A und B zu erzeugen. Das erfindungsgemässe Verfahren wird im Zusammenhang mit den folgenden Ausführungsbeispielen erläutert.
Beispiel I
Streptomyces lavendofoliae des Stammes 12/3-A werden auf einem festen Hafer-Nährboden bei einer Temperatur von 28"C 12 Tage lang bis zur Entwicklung von reichlichem Luftmyzel kultiviert. Die Kultur wird in einen 750 ml Erlenmeyer-Kolben in ein B-2 Medium übertragen, das weder Kupfersulfat noch ein Antischäummittel enthält. Der Kolben wird auf einer Schüttelvorrichtung mit 250 U/min umgerührt. Die Temperatur beträgt 28"C, die Behandlungszeit 2 Tage. Die Kultur aus dem Erlenmeyer-Kolben wird in einem Anteil von 5% in einen 10 1 - Inokulationsfermenter in ein B-2 Medium übertragen, das kein Kupfersulfat enthält.
Der Fermenter wird mit einer Geschwindigkeit von 200 U/min umgerührt und einen Tag lang bei einer Temperatur von 28"C mit 10 I/min Luft belüftet.
3 Liter der Kulturflüssigkeit aus diesem Fermenter werden in 60 Liter B-2 Nährmedium in einen 100 Liter Fermenter übertragen. Der Fermenter wird mit 200 U/min umgerührt und mit 60 I/min Luft bei einer Temperatur von 27"C 3 Tage lang belüftet.
Der Gehalt an Achlacinomycin A und B im Medium wird nach dem folgenden Verfahren bestimmt.
1) Bestimmt des Gehaltes an Achlacinomycin A und B im Myzel:
Nach Beendigung der Fermentation wird das Myzel von 5 ml durch Zentrifugieren mit 2000 U/min während 10 Min.
abgetrennt. Aus dem so erhaltenen Myzel werden die Antibiotica während zweier Stunden mit Hilfe von 4 ml Azeton extrahiert, wobei die Mischung in Intervallen von 15 bis 20 Minuten umgerührt wird. Das Azeton wird von 1 ml Extrakt in Vakuum bei einer Temperatur unter 40 C verdampft und der Rückstand wird mit 1,0 ml Chloroform extrahiert. Das konzentrierte Chloroform-Extrakt wird für die chromatographische Abtrennung des Antibiotica enthaltenden Komplexes verwendet. Zu diesem Zweck wird eine Platte verwendet, die unter Freilassung 2 cm breiter Randstreifen am linken und unteren Rand mit einer adsorbierenden Schicht bedeckt ist. Auf die Platte wird der gesamte Chloroform Extrakt mit Hilfe eines Kapillargefässes in Form einer Linie von 1 bis 1,5 cm Breite aufgetragen. Auf die gleiche Platte wird eine Standardlösung von Achlacinomycin A und B aufgetragen.
Die Platte wird in eine chromatographische Kammer eingebracht, welche ein Chloroform-Äthylacetat Methanol-Gemisch im Verhältnis 7:2:1 enthält. Wenn die Lösungsmittelfront den Plattenrand erreicht, wird die Platte herausgenommen und in Luft 20 Min. lang getrocknet. Die sich entsprechend der Mobilität von Achlacinomycin A und B ergebenden gelben Zonen werden getrennt mit 4 ml Methanol (pH-Wert = 6) ausgewaschen und spektralfotometrisch bei einer Wellenlänge von 430 nm gemessen. Die Gehalte an Achlacinomycin (mg/l Kulturmedium) werden auf der Basis der spezifischen Extinktion der Achlacinomy eine (E"i cm für die Achlacinomycin A und B betragen 161 bzw. 159, J.
Antibiotics 1979, 32, no. 8, s. 781-800) nach der folgenden Formel bestimmt: Achlacinomycin A C mg/ml = 199 D Achlacinomycin B C mg/ml = 201 D
2) Bestimmung des Gehaltes von Achlacinomycin A und B im Medium:
Von 5 ml Medium wird das Myzel durch Zentrifugierung abgetrennt. Die Extraktion wird mit Hilfe von Äthylacetat bei einem pH-Wert 6 und bei einem Mengenverhältnis von 5 ml Medium auf 5 ml Äthylacetat durchgeführt. 2 ml des Äthylacetatextraktes werden im Vakuum verdampft und der Rückstand wird mit 2 ml Chloroform extrahiert. Das weitere Verfahren erfolgt wie unter Punkt 1).
Die Mengen an Achlacinomycin A und B werden auf der Basis der spezifischen Extinktion nach der folgenden Formel bestimmt: Achlacinomycin A C mg/ml = 124,2 D Achlacinomycin B C mg/ml = 125,8 D
Nach 3 Tagen der Fermentation im Medium B-2 erzeugt die Kultur 1 2/3-A etwa 56 mg/l Achlacinomycin A und etwa 4 bis 8 mg/l Achlacinomycin B.
Um das Achlacinomycin A und B vom Medium zu trennen, werden 60 Liter in einem Saugfilter bei einem pH-Wert4.5 - 5,0 gefiltert. Die Antibiotica im Medium werden mit Äthylacetat im Verhältnis 10:1 extrahiert. Die organische Schicht wird abgetrennt und im Vakuum in einem Drehverdampfer bei einer Temperatur nicht über 40"C verdampft, bis der Rückstand eine wässrige Lösung ist.
Das nasse Myzel (5 kg) wird zweimal mit 10 Liter Azeton extrahiert. Das Myzel wird durch Filtration abgetrennt und abgelegt. Die Azetonextrakte werden kombiniert und verdampft. Die wässrigen Rückstände, die sich nach Verdampfung des Äthylacetates und Azetons ergeben, werden kombiniert und das auf diese Weise erhaltene Konzentrat (51) wird mit einer 1 0%gen NaOH-Lösung auf einen pH-Wert von 6,8 neutralisiert, wobei die Antibiotica mit 3 x 10 1 Toluol extra hiert werden. Die Toluol-Extrakte werden kombiniert und die wässrige Schicht wird abgelegt. Das Toluol-Extrakt (30 1) wird im Vakuum bei einer Temperatur, die 40"C nicht überschreitet, verdampft, bis der Rückstand 3 1 beträgt.
Aus diesem Konzentrat werden die Antibiotica mit dem 0,5-fachen Volumen von 0,01N HCI extrahiert. Die aus dieser Extraktionsstufe resultierende Emulsion wird durch Zentrifugieren gebrochen. Die Antibiotica in der wässrigen
Lösung werden mit dem 0,5-fachen Volumen Chloroform extrahiert. Die Extraktionszeit beträgt unter fortlaufendem
Rühren 20 bis 30 Minuten.
Die erhaltene Emulsion wird durch Zentrifugieren gebrochen. Dic Chloroformschicht ( 1,5 1) wird gewonnen und vier Stunden lang über Na2SO4-Anhydrid (10 g Na2SO4/100 ml des Extraktes) getrocknet. Das Na2SO4 wird abgefiltert und das Chloroform wird unter Vakuum in einem
Drehverdampfer auf das 0, I-fache Volumen destilliert. Der Rückstand wird dem 10-bis 12-fachen Volumen an trokkenem Hexan zugesetzt, wobei ein Niederschlag gebildet wird, der setzen gelassen wird (30 min.). Die niedergeschlagenen Antibiotica werden auf einem Glasfilter Nr. 4 gefiltert und getrocknet.
Das Filtrat wird bis zur Trockenheit in einem drehenden Verdampfcr bei einer Temperatur, die 40"C nicht überschreitet, verdampft. Der Rückstand wird in Hexan suspendiert, und das Hexan wird durch Filtration abgetrennt. Beide Rückstände werden abgetrennt und chromatographisch gereinigt. Die Ausbeute beträgt 2,5 g an Rohprodukt.
Chromatographische Abtrennung der Achlacinomycine
Eine Säule (8x95 cm) wird mit 5,5 1 einer Suspension gefüllt, die aus 1,8 kg wässriger Kieselsäure (250-400 ,um) und 5,51 Chloroform besteht, in dem 0,5% Triäthylamin und Essigsäure gelöst wurden. Nach dem Füllen wird die Säule mit 3 1 Chloroform gespült. Das oben erwähnte Rohprodukt (10 g) wird in 100 ml Chloroform aufgelöst zugesetzt. Nach der Absorption der Antibiotica wird die Säule ausgespült. Für die Abtrennung der Antibiotica wird eine schrittweise Auswaschung vorgenommen.
Zu diesem Zweck werden folgende Stoffe durch die Säule geleitet:
1) 41 Kohlenstofftetrachlorid
2) 8 1 eines Lösungsmittelsystems, das aus Kohlenstofftetrachlorid und Isopropanol (25:1) besteht
3) 8,5 1 eines Lösungsmittelsystems, das aus Kohlenstofftetrachlorid und Isopropanol (20:1) besteht
4) 20,5 1 eines Lösungsmittelsystems, das aus Kohlenstofftetrachlorid und Isopropanol (10:1) besteht.
Achlacinomycin B wird aus der Säule mit dem System CCI4: Isopropanol (20:1) und Achlacinomycin A mit dem System CCI4: Isopropanol (10:1) entfernt. Die Auswaschungen (5 bis 7 1), die die Achlacinomycine A und B enthalten, werden getrennt mit dem 0,2-fachen Volumen einer 0,01 N NaOH-Lösung extrahiert.
Die Antibiotica werden aus der wässrigen Phase mit dem 0,2-fachen Volumen extrahiert. Die Chloroform-Extrakte der Achlacinomycine A und B werden getrennt mit Na2SO4- Anhydrid (2g/100 ml Lösung) getrocknet, das Natriumsulfat wird abgefiltert und das Filtrat im Vakuum bei 40"C auf das 0, 1-fache Volumen verdampft. Ein 10-faches Volumen an trockenem Hexan wird beigefügt und die Mischung wird etwa 30 Min. lang stehen gelassen. Der Rückstand wird auf einem Glasfilter Nr. 4 filtriert und das erhaltene Produkt wird luftgetrocknet. Auf diese Weise werden aus 2,5 g des Rohproduktes 0,7 g Achlacinomycin A und 0,1 g Achlacinomycin B verhalten.
Beispiel 2
Streptomyces lavendofoliae Stamm 12/3-A wird 12 Tage lang auf einem Hafer-Nährboden kultiviert. Die Kultur wird in einen Kolben übertragen. der als Nährmedium B-2 ohne Kupfersulfat enthält. Der Kolben wird 2 Tage lang bei einer Temperatur von 28"C mit 250 U/min. geschüttelt. Die Kultur wird in einen Erlenmeyer-Kolben übertragen. Die übertragene Menge entspricht typisch 5-10% des Volumens des Mediums. Als Medium wird B-3 verwendet, das aus folgenden Bestandteilen besteht:Sojamehl - 1,5%, Kartoffelstärke - 3%, Calziumkarbonat - 1,4%, Natriumchlorid 0,3%, Kupfersulfat - 0,007%. Die Kulturbedingungen sind die gleichen, wie beim Beispiel 1 und die Kulturzeit beträgt 72 Stunden. Die Aktivität des Kulturmediums liegt dann bei 60 mg/l Achlacinomycin A und 10 mg/l Achlacinomycin B.
Die chemische Abtrennung der Achlacinomycine A und B wird in der gleichen Verfahrensweise wie beim Beispiel 1 vorgenommen.
Wie sich aus den Ausführungsbeispielen ergibt, erbringt das erfindungsgemässe Verfahren für die Herstellung von Achlacinomycin A und B im Vergleich zu dem bekannten Verfahren folgende Vorteile:
1. Höhere Ausbeute an Achlacinomycin A. Der Prototyp Stamm erzeugt 46,ug/ml und der erfindungsgemässe Stamm sogar 60 g/ml.
2. Keine Bildung von Cinerubin A und B, so dass eine zusätzliche Reinigung vermieden wird. In den bekannten Verfahren müssen diese Nebenprodukte als Metall-Ionen Komplexe abgetrennt werden.
3. Es wird weniger Achlacinomycin B gebildet. Der Prolotypstamm erzeugt 23,ug/ml und der erfindungsgemässe Stamm 4 bis 8,ug/ml.