CH644593A5 - Antibiotikum aus dem pseudomonas-stamm g-6302. - Google Patents
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- CH644593A5 CH644593A5 CH1330178A CH1330178A CH644593A5 CH 644593 A5 CH644593 A5 CH 644593A5 CH 1330178 A CH1330178 A CH 1330178A CH 1330178 A CH1330178 A CH 1330178A CH 644593 A5 CH644593 A5 CH 644593A5
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Description
Die Erfindung betrifft ein neues Antibiotikum mit der Bezeichnung G-6302, seine Salze und ein Verfahren zu deren Herstellung.
Mit dem Ziel, neue Antibiotika zu finden, isolierte die Inhaberin eine grosse Zahl von Mikroorganismen aus Bodenproben und untersuchte die von diesen Mikroorganismen gebildeten Antibiotika. Die Untersuchung ergab, dass einige dieser Mikroorganismen ein neues Antibiotikum bilden, dass diese Mikroorganismen zur Gattung Pseudomonas gehören und dass diese Mikroorganismen bei Kultivierung in einem geeigneten Nährmedium ein Antibiotikum anhäufen, das eine hemmende Wirkung auf grampositive und gramnegative Bakterien ausübt. Die Inhaberin isolierte dieses Antibiotikum und stellte aufgrund seiner physikalisch-
-chemischen und biologischen Eigenschaften fest, d'ass dieses Antibiotikum neu ist. Es wurde daher als Antibiotikum. G-6302 bezeichnet.
Die Bedingungen für die Herstellung von Antibiotikum 5 G-6302 wurden ebenfalls untersucht. Hierbei wurde festgestellt, dass die Bildung des Antibiotikums G-6302 bedeutend gesteigert werden kann, wenn die in- Frage kommenden Mikroorganismen in einem Nährmedium, das mit einer Schwefelverbindung ergänzt ist, die die Mikroorganismen io zu verwerten vermögen, kultiviert werden. Diesen Feststellungen folgten weitere Untersuchungen, die in der vorliegenden Erfindung gipfelten.
In der vorliegenden Beschreibung und in den Ansprüchen wird das Antibiotikum G-6302 zuweilen kurz als 15 G-6302 bezeichnet.
Die Erfindung umfasst daher
1) das Antibiotikum G-6302 und seine Salze und
2) die Herstellung des Antibiotikums G-6302 nach einem Verfahren, das dadurch gekennzeichnet ist, d'ass man einen
20 Mikroorganismus, der zur Gattung Pseudomonas gehört und das Antibiotikum G-6302 zu bilden vermag, in einem Nährmedium kultiviert, das Antibiotikum durch den Mikroorganismus im Kulturmedium sich bilden und anhäufen lässt und das Antibiotikum isoliert.
25 Erfindungsgemäss können als Stämme, die das Antibiotikum G-6302 bilden, alle Bakterienstämme der Gattung Pseudomonas verwendet werden, vorausgesetzt lediglich,
dass die Stämme d'as Antibiotikum zu bilden vermögen. Als Beispiel eines solchen Stammes ist Pseudomonas Stamm 30 G-6302 (nachstehend zuweilen als Stamm G-6302 bezeichnet) zu nennen, der von der Inhaberin von Bodenproben, die in Ashigara-Shimo-Gun, Präfektur Kanagawa, Japan, entnommen wurden, isoliert wurde.
Die bakteriologischen Eigenschaften von Pseudomonas 35 Stamm G-6302 sind1 nachstehend genannt.
a) Morphologie
Nach 2 Tagen auf Schrägagar bei 28°C sind die Zellen stabförmig mit 0,7 bis 1,0 [im Durchmesser und 0,7 bis 3,5 40 [im Länge. Ohne Polymorphismus sind die Bakterien mit einer oder mehreren polaren Geissein beweglich. Keine Sporolation; keine Anreicherung von Poly-ß-hydroxybutter-säure als intrazelluläre Kohlenstoffreserve (R. Y. Stanier und Mitarbeiter, Journal of General Microbiology 43 (1966) 45 159. Gramnegativ, nicht säurefest.
b) Kulturmerkmaie auf verschiedenen Medien:
Bei 28°C kultiviert und 1 bis 14 Tage beobachtet.
1) Nähragarplatte: Kreisrunde, erhabene Kolonien von 50 1 bis 3 mm Durchmesser mit ganzem Rand werden nach
3 Tagen gebildet. Glatt, undurchsichtig, weiss, kein diffundierbares Pigment gebildet.
2) Schrägagar: massiges Wachstum, fadenförmig, opak und cremefarben.
55 3) Nährbrühe: trübes Wachstum, im wesentlichen ohne Sedimentation. Ein Pellikel erscheint nach Htägiger Kultivierung.
4) Stichkultur in Nährgelatine: Oberflächenwachstum ohne Verflüssigung.
60 5) Lackmusmilch: keine Veränderung.
c) Physiologische Eigenschaften
1) Reduktion von Nitraten: negativ
2) Denitrifikation: negativ
65 3) MR-Test (Methylrottest): negativ
4) VP (Voges-Prospkauer)-Test: negativ
5) Bildung von Indol: negativ
6) Bildung von Schwefelwasserstoff: positiv (schwach)
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7) Hydrolyse von Stärke: negativ
8) Verwertung von Citrat: positiv
9) Verwertung von anorganischen Stickstoffquellen
I) Kaliumnitrat: negativ bis schwach-positiv
II) Ammoniumsulfat: positiv
10) Bildung von Pigmenten: nein
11) Urease: positiv
12) Oxidase: negativ
13) Katalase: positiv
14) Wachstumsbereich
I) pH: Wachstum bei pH 4 bis 8, optimal pH 4,5 bis 6,0
II) Temperatur: Wachstum bei 2 bis 37°C, optimal 25 bis 30°C.
15) Sauerstoffbedarf: aerob
16) O-F-Test (oxydativ-fermentativ) (Hug-Leifson-Me-thode): oxydativ
17) Bildung von Säure und Gas aus Zuckern: Schwache Säurebildung, aber keine Gasbildung wird in Pepton-Was-ser festgestellt, das 1% (Gew./Vol.) D-Glucose, D-Mannose, D-Galactose, Maltose, Saccharose, Trehalose, D-Sorbit, D-Mannit, Inosit oder Glycerin enthält.
18) Assimilierung von Kohlenstoff quellen:
Die Ergebnisse der Kultivierung in anorganische Salze enthaltenden Medien (Gew./Vol.: 0,7% Dikaliumhydrogen-phosphat, 0,3% Monokaliumdihydrogenphosphat, 0,1% Ammoniumsulfat, 0,1% Natriumchlorid, 0,01% Magnesiumsulfat . 7 H20), die verschiedene Kohlenstoffquellen enthalten, für 14 Tage sind nachstehend in Tabelle 1 genannt.
TABELLE 1
Verwertung von Kohlenstoff quellen
Kohlenstoffquelle
Endkonzentration % (Gew.-Vol.)
Wachstum
L-Arabinose
1
+
D-Xylose
1
+
D-Glucose
1
-f-
D-Mannose
1
+
D-Fructose
1
+
D-Galactose
1
+
Maltose
1
+
Saccharose
1
+
Lactose
1
—
Trehalose
1
+
D-Sorbit
1
+
D-Mannit
1
+
Inosit
1
+
Glycerin
1
+
Stärke
—
a-Methyl-D-glucosid
1
+
Melibiose
1
—
Adonit
1
+
Dulcit
1
-
TABELLE 1 (Fortsetzung)
Kohlenstoffquelle
Endkonzentration % (Gew.-Vol.)
Wachstum
Raffinose
1
+
eis- Aconitat
0,3
+
Citrat
0,3
+
Isocitrat
0,3
+
Gluconat
0,3
+
Acetat
0,3
+
Fumarat
0,3
+
Malat
0,3
+
Tartarat
0,3
+
p-Hydroxybenzoat
0,3
+
L-Alanin
0,3
+
ß-Alanin
0,3
+
L-Isoleucin
0,3
+
Succinat
0,3
+
L-Valin
0,3
—
2-Ketogluconat
0,3
+
+ = Wachstum ± = spärliches Wachstum — = kein Wachstum
19) Andere Eigenschaften I) Verwertung von Malonat: negativ II) Desaminierung von Phenylalanin: negativ
III) Decarboxylase-Aktivität a) Arginin: negativ b) Lysin: negativ c) Ornithin: negativ
IV) Hydrolyse von Esculin: positiv
V) Hydrolyse von «Tween 80»: positiv VI) GC-Gehalt (Guanin-Cytosin) von DNA: 59,5 Mol.-%.
Ein Vergleich der vorstehend genannten bakteriologischen Eigenschaften des Stamms G-6302 mit der Beschreibung in Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, Auflage 7 und1 8, ergibt, dass der Stamm G-6302 angesichts der Tatsache, dass er ein gramnegatives stabförmiges Bakterium, streng aerob, mit einer oder mehreren polaren Geissein beweglich und Katalase-positiv ist, offensichtlich zur Familie Pseudomonadaceae gehört. Die Tatsache, dass er keinen Nährstoffbedarf und einen GC-Gehalt von 59,5 Mol-% hat, lässt erkennen, dass der Stamm zur Gattung Pseudomonas gehört. Da Pseudomonas-Bakterien hinsichtlich der vorstehend genannten Eigenschaften mit dem Stamm G-6302 verwandt sind, sind Pseudomonas syringae und Pseudomonas maltophilia zu nennen, die negativ für Cy-tochromoxydase sind. P. maltophilia ist jedoch vom Stamm G-6302 offensichtlich insofern verschieden, als P. maltophilia Methionin benötigt und bei 4°C kein Wachstum zeigt. Während Pseudomonas syringae eine Spezies ist, die eine grosse Anzahl von Nomenspezies enthält, ergibt sich eindeutig aus Tabelle 2, dass das gemeinsame Merkmal dieser
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Stämme, d.h. die Unfähigkeit, gewisse Kohlenstoffquellen zu verwerten, beim Stamm G-6302 nicht zu finden ist.
TABELLE 2
Vergleich der Verwertbarkeit verschiedener Kohlenstoffquellen
Kohlenstoffquelle Pseudomonas Stamm syringae G-6302
Trehalose — +
2-Ketogluconat — +
ß-Alanin — +
L-Isoleucin — +
+ = verwertet — = nicht verwertet
Ferner ist der optimale pH-Wert für das Wachstum des Stamms G-6302 sehr niedrig, nämlich 4,5 bis 6,0, wobei selbst bei pH 4,0 Wachstum stattfindet. Diese Unterschiede schalten die Möglichkeit aus, den Stamm G-6302 als einen Stamm von Pseudomonas syringae anzusehen. G-6302 ist daher als neue Spezies der Gattung Pseudomonas zu betrachten. Angesichts der Tatsache, dass sein niedriger optimaler pH-Wert für das Wachstum 4,5 bis 6,0 beträgt, der für Bakterien der Gattung Pseudomonas im allgemeinen niedrig ist, wurde der Stamm G-6302 als Pseudomonas acidophila G-6302 bezeichnet.
Proben dieses Stamms G-6302 wurden am 20. Dezember 1977 beim Fermentation Research Institute, Agen-cy of Industriai Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, 1-3, Higashi 1-chome, Yatabe--machi Tsubuka-gun, Ibaraki-ken 305, Japan, unter der Zugangsnummer FERM-P 4344, am 21. Dezember 1977 beim Institute for Fermentation, 17-85, Juso-honmachi 2-chome, Yodogawa-ku, Osoka 532, Japan, unter der Zugangsnummer IFO 13774 und am 28. Dezember 1977 bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rock-ville, Marylancî.20852, USA, unter der Zugangsnummer ATCC 31363 hinterlegt.
Die für die Zwecke der Erfindung verwendeten Pseudo-monas-Bakterien sind im allgemeinen sehr leicht variabel in d'en Eigenschaften und unterliegen Mutationen, wenn sie künstlich mutagenen Behandlungen, beispielsw. Bestrahlung mit UV-Licht oder Röntgenstrahlen oder einer Behandlung mit chemischen Mutagenen unterworfen werden. Alle diese Mutanten und Varianten sind jedoch für die Zwecke der Erfindung nur geeignet, wenn sie die Fähigkeit zur Bildung von G-6302, des gewünschten Antibiotikums gemäss der Erfindung, aufweisen und bewahren.
Für die Kultivierung des Stamms G-6302 können Kohlenstoffquellen wie Glucose, Saccharose, Maltose, ausgebrauchte Melasse, Glycerin, Öle und Fette (z.B. Sojaboh-nenöl und Olivenöl), organische Säuren (z.B. Citronensäuren, Bernsteinsäure und Gluconsäure) und' andere verwertbare Kohlenstoffquellen verwendet werden. Als Stickstoffquellen eignen sich organische und anorganische stickstoffhaltige Verbindungen und Materialien, beispielsweise Sojabohnenmehl, Baumwollsaatmehl, Maisquellwasser, Trockenhefe, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Pepton, Harnstoff, Ammonium-sulfat, Ammoniumnitrat, Ammoniumchlorid und Ammoniumphosphat. Ferner können die für die Kultivierung von Bakterien normalerweise erforderlichen anorganischen Salze, z.B. Natriumchlorid1, Kaliumchlorid, Calciumcarbonat, Magnesiumsulfat, Monokaliumdihydrogenphosphat und Di-natriummonohydrogenphosphat, allein oder in geeigneter Kombination verwendet werden. Es wurde gefunden, dass die Ausbeute an gewünschtem Antibiotikum gesteigert werden kann, wenn das Nährmedium durch eine Schwefelver-bindüng, die der G-6302 bildende Stamm zu verwertein vermag, nämlich anorganische Schwefelverbindungen, z.B. Sulfate (Natriumsulfat), Thiosulfate (z.B. Natriumthiosulfat) oder organische Schwefelverbindungen, beispielsweise schwe-felhaltige Aminosäuren (z.B. Cystin, Cystein und Methio-nin), ergänzt wird. Für diesen Zweck wird Natriumthiosulfat besonders bevorzugt. Die Konzentration dieser Schwefelverbindungen im Nährmedium beträgt 0,01 bis 1,0% (Gew./Vol.), vorzugsweise 0,02 bis 0,5%. Der Zusatz einer solchen Schwefelverbindung zum Nährmedium hat erhöhte Bildung von G-6302 zur Folge, so dass er kommerziell von erheblichem Wert ist.
Ferner können Salze von Schwermetallen, z.B. Eisen(II)-sulfat und Kupfersulfat, Vitamine, z.B. Vitamin Bl und Biotin, und andere Zusatzstoffe nach Bedarf zugesetzt werden. Schaumverhütungsmittel und oberflächenaktive Mittel, z.B. Siliconöl und Polyalkylenglykoläther, können ebenfalls zugesetzt werden. Natürlich können auch andere organische oder anorganische Stoffe, die das Wachstum des Mikroorganismus fördern und die Bildung von G-6302 steigern, in geeigneten Mengen zugegeben werden.
Die Kultivierung des Stamms G-6302 kann nach ähnlichen Verfahren, wie sie für die Erzeugung von Antibiotika im allgemeinen angewandt werden, unter Verwendung eines festen Kulturmediums oder in einem flüssigen Kulturmedium erfolgen. Die Flüssigkultur kann stationär, unter Rühren, Schütteln oder aerob durchgeführt werden, wobei die aerobe Kultur unter Rühren besonders zweckmässig ist. Die bevorzugte Kultivierungstemperatur liegt im Bereich von etwa 15 bis 35°C, während der pH-Wert des Nährmediums zwischen etwa 4 und 8 liegen kann. Die Kultivierung wird etwa 8 bis 168 Stunden, vorzugsweise 24 bis 144 Stunden durchgeführt. Da das gebildete Antibiotikum G-6302 zum grössten Teil in der flüssigen Phase des Kulturmediums vorliegt, ist es zweckmässig, das Kulturmedium zu zentrifugieren oder filtrieren, um den flüssigen Überstand oder das Filtrat von der Zellmasse zu entfernen, und das Antibiotikum G-6302 im flüssigen Überstand oder im Filtrat zu reinigen. Gegebenenfalls kann auch eine direkte Reinigung aus dem Kulturmedium vorgenommen werden.
Die Testung der Aktivität des in dieser Weise hergestellten Produkts kann gegen Proteus mirabilis IFO 3849 als Testmikroorganismus unter Verwendung von G-6302 als Standard nach der Zylindermethode oder der Papierblättchenmethode unter Verwendung von TSA (Trypticase-Soja-Agar) (Baltimore Biologicals, Ltd., U.S.A.) erfolgen.
Das Antibiotikum G-6302 kann mit Hilfe der verschiedenen Verfahren, die üblicherweise für die Isolierung von Metaboliten-Mikroorganismen angewandt werden, isoliert werden. Beispielsweise werden die Zellen durch Zentrifugieren entfernt, worauf da saktive Produkt nach üblichen Methoden vom flüssigen Überstand abgetrennt und gereinigt wird. Beispielsweise können das Verfahren, bei dem die Löslichkeit oder der Löslichkeitsunterschied in einem geeigneten Lösungsmittel ausgenutzt wird, das Verfahren, bei dem die Fällung oder der Unterschied in der Fällungsgeschwindigkeit des Antibiotikums aus einer Lösung ausgenutzt wird, das Verfahren, bei dem seine charakteristische Adsorptionsaffinität zu verschiedenen Adsorptionsmitteln ausgenutzt wird, die Tonenaustauschchromatographie an Ionenaustauschern, Konzentrierung unter vermindertem Druck, Gefriertrocknung, Kristallisation, Umkristallisation, Trock5
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nung usw. entweder allein oder in geeigneter Kombination und Reihenfolge und/oder in Wiederholung angewandt werden.
Ein typisches Verfahren wird1 nachstehend beschrieben. Nach beendeter Kultivierung wird das Kulturmedium filtriert, das erhaltene Filtrat durch eine Aktivkohlensäule geleitet und! das adsorbierte G-6302 mit einem hydrophilen organischen Lösungsmittel eluiert. Als hydrophile organische Lösungsmittel eignen sich beispielsweise niedere Ketone (z.B. Aceton, Methyläthylketon und Methylisobutvlketon) und niedere Alkohole (z.B. Methanol, Äthanol, Isopropanol, Pro-panol und Butanol). Diese Lösungsmittel können allein oder als Gemisch in Kombination mit Wasser verwendet werden. Aufgrund' der sauren Natur von G-6302 können Anionen-austauschharze, z.B. Harze der Cl-Form (Amberlite IRA-400 und 402, Hersteller Amberlite Co., USA; Dowex-1, Hersteller Dow and' Chemical Co., USA; Diaion SA-21A, Hersteller Mitsubishi Chemical Industries, Japan) vorteilhaft verwendet werden. Das absorbierte aktive Produkt wird beispielsweise mit einer wässrigen Natriumchloridlösung eluiert. Um das Eluat zu entsalzen, wird die Säulenchromatographie erneut mit Aktivkohle durchgeführt. Das erhaltene Eluat wird dann eingeengt und beispielsweise mit Aceton versetzt. Die hierbei gebildete Fällung wird abfiltriert, mit Aceton und Diäthyläther gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet, wobei ein hellbraunes Pulver gewonnen wird. Zur Reinigung des Antibiotikums G-6302 im Pulver kann Säulenchromatographie an DEAE-Sephadex (Pharmacia, Schweden) vorteilhaft angewandt werden. Beispielsweise wird eine Säule des Produkts DEAE-Sephadex A-25 mit 0,01-molarem Phosphatpuffer (pH 6,6) gewaschen und eine wässrige Lösung des Pulvers durch die Säule geleitet, an der das Antibiotikum adsorbiert wird. Die Säule wird mit der vorstehend genannten Pufferlösung gewaschen, worauf mit dem Puffer, der 0,5% (Gew./Vol.) Natriumchlorid enthält; eluiert wird. Die aktiven Fraktionen werden zusammengegossen, auf pH 3,0 eingestellt und1 erneut durch eine Aktivkohlesäule geleitet. Die Säule wird mit Wasser und anschliessend mit 20%igem wässrigem Methanol gewaschen. Die Elution wird dann mit wässrigem Aceton durchgeführt. Die aktiven Fraktionen werden zusammengegossen und unter vermindertem Druck getrocknet. Dem Konzentrat wird Aceton zugesetzt, wobei G-6302 erhalten wird. G-6302 bildet Metallsalze und das Ammoniumsalz. Als Beispiele von Metallsalzen sind das Natriumsalz, Kaliumsalz und Lithiumsalz zu nennen.
Die physikalisch-chemischen Eigenschaften des gemäss Beispiel 1 hergestellten Antibiotikums G-6302 sind nachstehend1 genannt.
1) Schmelzpunkt 120°C (Sinterung), 130°C(Zers.)
2) Aussehen: weisses Pulver
3 Elementaranalyse (nach Trocknung unter vermindertem Druck über Phosphorpentoxyd bei 40°C für 6 Stunden)
(%):
C 34,83
35,45
(34,99 ± 0,5)
H 5,41
5,24
( 5,58 ± 0,5)
N 13,22
13,73
(13,60 ± 0,5)
S 7,65
7,75
( 7,70 ± 0,5)
O
(38,13 ± 0,5)
4) Molekulargewicht durch Titrimetrie: 400 ± 20 Bruttoformel (auf der Grundlage der vorstehenden Kennzahlen)
C, ,H20N4SO9. H2O Berechnet: C 34,78 H 5,35 N 13,52 S 7,74
5) UV-Absorptionsspektrum: nur Endabsorptionen (über 210 nm keine charakteristischen Absorptionen)
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6) Infrarotabsorptionsspektrum (siehe Fig. 1), Haupt-peaks (KBR) (cm-1)
3440 (s), 2920 (m), 2850 (m), 2600 (w), 1770 (s), 1650 (s), 1530 (s), 1458 (m), 1390 (w), 1340 (w), 1280 (sh), 1240 (s), 1210 (sh), 1180 (m), 1118'(w), 1043 (s), 792 (w), 632 (s) (s = stark; m = mittel; w = schwach; sh = Schulter)
7) Spezifische Drehung: [a]D20 + 94° ± 10° (c = 0,35, H20)
8) Kernmagnetisches Resonanzspektrum (in Dimethylsulfoxyd, 100 MHz) § 3,31 ppm (s, chemische Verschiebung, die O-CH^zuzuschreiben ist)
9) Löslichkeit in Lösungsmitteln:
Unlöslich in Petroläther, Hexan, Diäthyläther, Benzol, Äthylacetat und1 Chloroform; schwerlöslich in Äthanol, Pyridin und Aceton; löslich in Methanol und Dimethylsulfoxyd; leicht löslich in Wasser
10) Farbreaktionen:
Positiv: Ninhydrin- und Kaliumpermanganatreaktion; negativ: Eisen(III)-chlorid-Kaliumferricyanid-, Sakaguchi-und Molisch-Reaktionen;
unsichere positive Reaktionen: Ehrlich-Reaktion
11) Stabilität: In wässriger Lösung im Bereich von pH 3 bis 7 bei 60°C 10 Minuten stabil; über pH 8,5 instabil
12) Basisch, neutral oder sauer: sauer.
Die physikalisch-chemischen Eigenschaften des Natriumsalzes des gemäss Beispiel 3 hergestellten Antibiotikums G-6302 sind nachstehend genannt.
1) Schmelzpunkt: kein scharfer Schmelzpunkt (Bräunung bei' 170°C)
2) Aussehen: weisses Pulver
3) Elementaranalyse (nach Trocknung unter vermindertem Druck über Phosphorpentoxyd bei 40°C für 6
Stunden) (%):
C 33,08
33,32
H 5,07
4,97
N 12,73
13,27
S 7,33
7,43
Na 5,19
5,31
4) Molekulargewicht: 438 ± 5 unter der Annahme,
dass jedes Molekül 1 Mol Na enthält Bruttoformel (auf der Grundlage der vorstehenden Daten)
C12H19N4S09Na.H20
Berechnet: C 33,03 H 4,85 N 12,84 S 7,35 Na 5,27
5) UV-Absorptionsspektrum: Nur Endabsorptionen
6) Infrarotabsorptionsspektrum (Fig. 2), Hauptpeaks (KBr) (cm"1): 3430 (stark), 3250 (Schulter), 3000 (mittel), 1770 (stark), 1640 (stark), 1530 (stark), 1450 (schwach), 1405 (schwach), 1343 (schwach), 1280 (Schulter), 1245 (stark), 1180 (schwach), 1118 (schwach), 1050 (stark), 820 (schwach), 785 (schwach), 632 (stark)
7) Spezifische Drehung: Tal,,23 + 85° ± 10° (c = 0,37, H20)
8) Löslichkeit in Lösungsmitteln:
Unlöslich in Petroläther, Hexan, Diäthyläther, Benzol, Äthylacetat, Chloroform und Aceton; schwerlöslich in Methanol, Äthanol und Pyridin; löslich in Dimethylsulfoxyd; leicht löslich in Wasser
9) Farbreaktionen:
Positiv: Ninhydrin- und Kaliumpermanganatreaktio-nen; negativ: Eisen(III)-chIorid-Kaliumferricyanid-, Sakaguchi- und Molisch-Reaktionen; unsichere positive Reaktionen: Ehrlich-Reaktion
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10) Stabilität: In wässriger Lösung im Bereich von pH 3 bis 7 bei 60°C für 10 Minuten stabil; über pH 8,5 instabil.
Die Umwandlung von G-6302 in Form der freien Säure in ein Salz, beispielsweise das Natriumsalz, kann durch Zusatz eines molaren Äquivalents Natriumhydroxyd zu einer wässrigen Lösung der freien Säure und anschliessende Gefriertrocknung des Systems erfolgen.
Das Salz von G-6302 kann in die freie Säure beispielsweise durch Zusatz von ln-Salzsäure zu einer wässrigen Lösung beispielsweise des Natriumsalzes von G-6302 zur Einstellung auf pH 3,0 und Entsalzen der Lösung mit Hilfe von Aktivkohle umgewandelt werden.
Die biologischen Merkmale von G-6302 sind nachstehend genannt. Das antibiotische Spektrum von G-6302 und seinem Natriumsalz gegen verschiedene Mikroorganismen ist in Tabelle 3 angegeben (Agarplatten-Verdünnungsmetho-de). Die Ergebnisse zeigen, dass das Antibiotikum G-6302 hauptsächlich gegen grammnegative Bakterien, jedoch auch gegen einige grampositive Bakterien wirksam ist.
Die akute Toxizität des Natriumsalzes von Antibiotikum G-6302 ist gering. Wenn das Salz in einer Dosis von 500 mg/kg Mäusen intravenös verabreicht wurde, starb kein Tier.
Ferner wurde gefunden, dass G-6302 bei einer subkutanen Dosis von 10 mg/kg oder bei einer oralen Dosis von 100 mg/kg eine Schutzwirkung auf Mäuse ausübt, die mit Escherichia coli oder Klebsiella pneumoniae infiziert worden sind.
TABELLE 3
Antimikrobielles Spektrum von G-6302 und seinem Natriumsalz
Testmikroorganismus Mindesthemmkonzentration tig/ml
G-6302
G-6302.Na
Escherichia coli NIHJ
25
25
Escherichia coli T-7
25
25
Salmonella typhosa Boxhill 58
12,5
12,5
Shigella flexneri EW-10
25
25
Klebsiella pneumoniae DT
12,5
12,5
Proteus vulgaris IFO 3988
100
100
Proteus morganii IFO 3168
100
100
Proteus mirabilis IFO 3849
25
25
Serratia marcescens IFO 12648
100
100
Pseudomonas aeruginosa U-31
>100
>100
Staphylococcus aureus FDA 209P
>100
>100
Streptococcus pyogen es E-14
>100
>100
Bacillus subtilis PCI 219
100
100
Corynebacterium diphtheriae Toronto
12,5
12,5
Candida albicans IFO 0583
>100 *
>100 *
Saccharomyces cerevisiae IFO 0209
>100*
>100 *
Aspergillus niger IFO 4066
>100 *
>100 *
Pénicillium chrysogenum IFO 4626
>100 *
>100*
Medium = Trypticase-Sojabrühe-Agar
* Medium: Nähragar mit 1 % Glucosegehalt.
Wie das vorstehende antibiotische Spektrum zeigt, übt das Antibiotikum G-6302 gemäss der Erfindung eine hemmende Wirkung auf grammegative und grampositive Bakterien aus. Es kann daher zur Behandlung von Infektionen mit den genannten Bakterien bei Säugetieren (z.B. Maus, Ratte, Hund und Mensch) und Geflügel (z.B. Huhn und Ente) verwendet werden. Für die Verwendung als Mittel gegen Infektionen mit Escherichia coli wird G-6302 beispielsweise in physiologischer Kochsalzlösung gelöst und parenteral, beispielsweise subkutan oder intramuskülär, in einer Tagesdosis von 5 bis 30 mg/kg Körpergewicht verabreicht. Für die orale Verwendung wird das Antibiotikum G-6302 beispielsweise mit Lactose gemischt, in Kapseln gefüllt und in einer Dosis von 20 bis 200 mg (als G-6302)/kg Körpergewicht täglich verabreicht.
G-6302 kann auch als keimtötendes Mittel oder Desinfektionsmittel verwendet werden. Beispielsweise wird G-6302 zur Herstellung einer Lösung, die 0,1 bis 1,0% (Gew./Vol.) G-6302 enthält, in destilliertem Wasser gelöst oder mit einer Salbengrundlage, z.B. Vaseline oder Lanolin, zur Herstellung einer Salbe formuliert, die 5 bis 20 mg G-6302/g enthält. Die Lösung bzw. Salbe wird auf Pfoten, Beine, Augen, Ohren oder andere Teile der vorstehend genannten Tiere als Desinfektionsmittel aufgebracht.
G-6302 ist insofern eine sehr aussichtsreiche Verbindung, als sie als Zwischenprodukt für die Synthese neuer Medikamente wertvoll ist.
Ein Vergleich von Antibiotikum G-6302 mit den bekannten Antibiotika hatte die folgenden Ergebnisse: Als Antibiotika, die wasserlölich und sauer sind und Schwefel enthalten, sind Penicillin und die Cephalosporine zu nennen. G-6302 unterscheidet sich jedoch von den Cephalosporinen darin, dass es im UV-Bereich des Spektrums nicht absorbiert Die Tatsache, dass das kernmagnetische Resonanzspektrum eine chemische Verschiebung zeigt, die O-Methylprotonen zuzuschreiben ist, und die Tatsache, d'ass G-6302 bei saurer Hydrolyse Glutaminsäure bildet, stellen Beweise dar, dass G-6302 von allen natürlich vorkommenden Penicillinen und Cephalosporinen verschieden ist.
Es gibt zwar zahlreiche bekannte Antibiotika, die von Bakterien der Gattung Pseudomonas gebildet werden, aber keines dieser Antibiotika ist in Wasser löslich und sauer und enthält Schwefel. Ferner unterscheidet sich G-6302 von allen bekannten Antibiotika, die von anderen Mikroorganismen als Pseudomonas-Stämmen gebildet werden, durch seine einmaligen physikalisch-chemischen und biologischen Eigenschaften. G-6302 ist daher als neue Verbindung anzusehen.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter erläutert. In diesen Beispielen verstehen sich die Teile als Gewichtsteile, falls nicht anders angegeben. Gewichtsteile verhalten sich zu Raumteilen wie Gramm zu Kubikzentimeter, und die Prozentsätze basieren auf «Gew./Vol.», falls nicht anders angegeben.
Beispiel 1
Die Zellen von Pseudomonas acidophila G-6302 (FERM--P Nr. 4344; IFO 13774; ATCC-31363), die auf Schrägagar gezüchtet worden waren, wurden zum Beimpfen von zwei Sakaguchi-Kolben verwendet, die ein Fassungsvermögen von 2000 Raumteilen hatten und je 500 Raumteile eines Mediums aus 1% Glucose, 0,5% Polypepton (Hersteller Daigo Nutritive Chemical Co., Japan), 0,5% Fleischextrakt und 0.5% Natriumchlorid enthielten (pH 7,0). Jeder Kolben wurde auf einer hin- und hergehenden Schüttelvorrichtung 48 Stunden bei 28°C bebrütet. Die hierbei erhaltene Kultur wurde als Impfkultur verwendet.
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In einen als Fermenter dienenden Tank aus nichtrostendem Stahl mit einem Fassunfsvermögen von 200 000 Raumteilen wurden 120 000 Raumteile eines Mediums gegeben, d'as 3% Glycerin, 0,1% Glucose, 0,5% Polypepton, 0,5% Fleischextrakt und 0,5 % NaCl enthielt und nach Einstellung auf pH 7,0 mit 30%igem wässrigem Natriumhydroxyd 20 Minuten mit Wasserdampf bei 120°C sterilisiert worden war. Der sterilisierte Tank wurde dann mit der vorstehend genannten Impfkultur beimpft und bei einer Temperatur von 28°C unter Belüftung mit einer Rate von 120 000 Raumteilten/Minute und einer Geschwindigkeit des Rührers von 180 UpM 78 Stunden bebrütet. Das erhaltene Kulturmedium wurde mit einem Shraples-Zentrifugalabscheider zur Entfernung der Zellen zentrifugiert, wobei 110 000 Raumteile eines flüssigen Überstandes zurückblieben. Die Flüssigkeit wurde auf pH 4,2 eingeteilt und durch eine Säule aus 15 000 Raumteilen Aktivkohle (chromatographische Qualität, Shi-rasagi, hergestellt von der Anmelderin) geleitet, wobei die aktive Substanz an der Aktivkohle adsorbiert wurde. Die Säule wurde mit 45 000 Raumteilen Wasser gespült und dann mit 45 000 Raumteilen 50%igem wässrigem Aceton eluiert. Das Eluat wurde in Fraktionen von je 10 000 Raumteilen aufgefangen. Die Fraktionen wurden gegen Proteus mirabilis IFO 3849 9etestet. Die Fraktionen Nr. 2 und 3 wurden zusammengegossen und mit 20 000 Raumteilen Wasser versetzt. Das Gemisch wurde durch eine Kolonne geleitet, die mit 10 000 Raumteilen des Harzes «Dowex-1» (Cl-Form, Hersteller Dow and Chemical Industries, USA) gefüllt war. Die Säule wurde mit 25 000 Raumteilen Wasser gespült und dann mit 50 000 Raumteilen einer 5 % igen wässrigen Natriumchloridlösung eluiert. Die aktiven Fraktionen wurden zusammengegossen, auf pH 4,0 eingestellt und erneut durch eine Aktivkohlesäule (8000 Raumteile) geleitet. Die Säule wurde mit 24 000 Raumteilen Wasser gewaschen und mit 20%igem wässrigem Methanol eluiert. Die aktiven Fraktionen wurden zusammengegossen und unter vermindertem Druck auf 50 Raumteile eingeengt. Dann wurden 200 Raumteile Aceton zugesetzt. Die hierbei gebildete Fällung wurde abfiltriert, mit 50 Raumteilen Aceton und 100 Raumteilen Diäthyläther gewaschen und dann unter vermindertem Druck getrocknet. Hierbei wurden 12 Teile rohes Produkt erhalten.
In 500 Raumteilen M/100-Phosphatpuffer (pH- 6,6) wurden 10 Teile des vorstehend genanten rohen Produkts gelöst. Die Lösung wurde durch eine Säule von 200 Raumteilen DEAÊ-Sephadex A-25 (Pharmacia, Schweden) geleitet, das vorher mit der vorstehend genannten Pufferlösung gepuffert worden war. Die Säule wurde mit 400 Raumteilen der gleichen Pufferlösung gewaschen und dann mit dem gleichen Puffer, dem 0,5% Natriumchlorid zugesetzt worden waren, eluiert. Die aktiven Fraktionen wurden zusammengegossen, mit ln-HCI auf pH 3,2 eingestellt und durch eine Säule von 60 Raumteilen Aktivkohle geleitet. Die Säule wurde mit 200 Raumteilen Wasser und 100 Raumteilen 20%igem wässrigem Methanol gewaschen und anschliessend mit 50%igem wässrigem Aceton eluiert. Die aktiven Fraktionen wurden zusammengegossen, unter vermindertem Druck eingeengt und in 5 Raumteilen Methanol gelöst.
Nach Zugabe von 100 Raumteilen Aceton wurde die Lösung in der Kälte stehen gelassen. Die hierbei gebildete Fällung wurde abfiltriert, mit Diäthyläther gewaschen und 6 Stunden unter vermindertem Druck bei 40°C über Phosphorpentoxyd getrocknet. Hierbei wurden 3,8 Teile eines Pulvers erhalten. Das Infrarot-Absportionsspektrum dieses Produkts ist in Fig. 1 dargestellt.
Elementaranalyse: C 34,83 H 5,41 N 13,22 S 7,65 (Gew.-%).
Beispiel 2
In einen als Fermenter dienenden Tank aus nichtrostendem Stahl mit einem Fassungsvermögen von 50 000 Raumteilen wurden 35 000 Raumteile eines Mediums gegeben, das aus 3% Glycerin, 0,1% Glucose, 0,5% Polypepton, 0,5 % Fleischextrakt und 0,5 % Natriumchlorid bestand. Nach Einstellung des Mediums auf pH 7,0 mit 30%igem wässrigem Natriumhydroxyd wurde 20 Minuten mit Wasserdampf bei 120aC sterilisiert. Der sterilisierte Tank wurde mit dem gleichen Mikroorganismus-Stamm, der bei dem in Beispiel 1 beschriebenen Versuch verwendet wurde, beimpft und zur Herstellung einer sekundären Impfkultur 48 Stunden bei 28°C unter Belüftung mit einer Rate von 35 000 Raumteilen/Minute und einer Geschwindigkeit des Rührers von 180 UpM bebrütet.
In einen als Fermenter dienenden Tank aus nichtrostendem Stahl mit einem Fassungsvermögen von 2 000 000 Raumteilen wurden 1 200 000 Raumteile eines Mediums gegeben, das aus 3% Glycerin, 0,1% Glucose, 0,5% Polypepton, 0,5% Fleischextrakt, 0,5% Natriumchlorid und 0,1% Natriumthiosulfat bestand. Nach Einstellung auf pH 7,0 mit 30%iger Natriumhydroxydlösung wurde 20 Minuten mit Wasserdampf bei 120°C sterilisiert. Der sterilisierte Tank wurde mit der vorstehend genannten sekundären Impfkultur beimpft.
Das beimpfte Medium im Tank wurde 90 Stunden bei 28°C unter Belüftung mit einer Rate von 1 200 000 Raumtei-len/Miniute bei einer Geschwindigkeit des Rührers von 180 UpM bebrütet, wobei 1 150 000 Raumteile Kulturmedium erhalten wurden. Diesem Kulturmedium wurden 40 000 Teile des Filterhilfsmittels «Hyflo-Super-Cel» (Johnes-Man-ville, USA) zugesetzt, worauf es mit einer Filterpresse filtriert wurde. Das Filtrat wurde mit 4n-Schwefelsäure auf pH 4,2 eingestellt und durch eine Säule über 120 000 Raumteile Aktivkohle geleitet. Die Säule wurde mit 300 000 Raumteilen Wasser gewaschen und mit 50%igem wässrigem Aceton eluiert. Die aktiven Fraktionen wurden zusammengegossen und zur Entfernung des Acetons unter vermindertem Druck eingeengt. Das hierbei erhaltene wässrige Konzentrat wurde mit Wasser auf 200 000 Raumteile verdünnt und durch eine Säule von 50 000 Raumteilen des Ionenaustauscherharzes «Diaion SA-21A» (Cl-Form, Hersteller Mitsubishi Chemical Industries, Japan) geleitet. Die Säule wurde dann mit 150 000 Raumteilen Wasser gespült und mit 1%-igem wässrigem Natriumchlorid eluiert. Die aktiven Fraktionen wurden zusammengegossen und unter vermindertem Druck auf 100 Raumteile eingeengt. Dann wurden 2000 Raumteile Methanol zugesetzt. Das ausgefällte Natriumchlorid wurde abfiltriert. Das Fitrat wurde unter vermindertem Druck weiter auf 200 Raumteile eingeengt, worauf 2000 Raumteile Aceton zugesetzt wurden. Die Fällung wurde abfiltriert und' getrocknet. Hierbei wurden 757 Teile rohes Produkt erhalten. Dieses rohe Produkt (500 Teile) wurde in 5000 Raumteilen Wasser gelöst, auf pH 4,0 eingestellt und an einer Aktivkohlesäule (5000 Raumteile) adsorbiert. Das aktive Ingrediens wurde nach der Grad'ienten-Elutions-methode, bei der das Laufmittel von 10 000 Raumteilen Wasser bis zu 10 000 Raumteilen 70%igem wässrigem Methanol verändert wurde, eluiert. Das Eluat wurde in Fraktionen von je 1000 Raumteilen aufgefangen. Die aktiven Fraktionen wurden zusammengegossen, zur Entfernung des Methanols unter vermindertem Druck eingeengt und mit M/100-Phosphatpuffer (pH 6,0) auf 6000 Raumteile aufgefüllt. Diese Probelösung wurde an einer Säule von 3000 Raumteilen des Ad'sorptionsmittels «DEAE-Sephadex A-25», das auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise vorbehand'elt worden war, adsorbiert. Die Säule wurde mit 6000 Raumteilen des gleichen Puffers gewaschen und dann mit dem
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gleichen Puffer, der mit 0,5% Natriumchlorid ergänzt war, eluiert. Das Eluat wurde in Fraktionen von je 500 Raumteilen aufgefangen. Die aktiven Fraktionen wurden zusammengegossen, mit ln-MCI auf pH 3 eingestellt und durch eine Säule von 500 Raumteilen Aktivkohle geleitet. Die Säule wurde mit 2000 Raumteilen Wasser bis 2000 Raumteilen 20%igem wässrigem Methanol gewaschen, worauf mit 50%-igem Aceton eluiert wurde. Das Eluat wurde in Fraktionen von je 200 Raumteilen aufgefangen. Die aktiven Fraktionen wurden zusammengegossen, unter vermindertem Druck eingeengt und durch Zuatz von 300 Raumteilen Methanol gelöst. Nach Zugabe von 3000 Raumteilen Aceton und 4000 Raumteilen Diäthyläther wurde die Lösung in der Kälte stehen gelassen. Das hierbei ausgefällte G-6302 wurde abfiltriert, mit Diäthyläther gewaschen und unter vermindertem Druck über Phosphorpentoxyd getrocknet. Ausbeute 72 Teile.
Elementaranalyse: C 35,45 H 5,24 N 13,73 S 7,75 (Gew.-%).
Beispiel 3
In 90 Raumteilen Wasser wurden 4,0 Teile der gemäss Beispiel 1 und 2 hergestellten freien Form von G-6302 gelöst. Unter Kühlen wurden etwa 9,0 Raumteile wässriges ln-Natriumhydroxyd1 zugesetzt. Anschliessend wurde eine weitere Menge ln-Natriumhydroxyd zugesetzt, wobei der pH-Wert der Lösung überwacht wurde, bis er 6,5 erreichte. Die Lösung wurde gefriergetrocknet, wobei 4,2 Teile G-6302-Mononatriumsalz als weisses Pulver erhalten wurden. Das Infrarot-Absorptionsspektrum dieses Produkt nach dem Trocknen unter vermindertem Druck für 6 Stunden bei 40°C ist in Fig. 2 dargestellt.
Elementaranalyse: C 33,08 H 5,07 N 12,73 S 7,33 Na 5,19 (Gew.-%).
Beispiel 4
Mit den Zellen von auf Schrägagar gezüchtetem Pseudomonas acidophila G-6302 (FERM-P Nr. 4344; IFO 13774; ATCC-31363) wurde ein Kolben geimpft, der ein Fassungsvermögen von 200 Raumteilen hatte und 40 Raumteile eines Mediums aus 1 % Glucose, 0,5 % Polypepton, 0,5 % Fleischextrakt und 0,5 % Natriumchlorid enthielt (pH 7,0). Der geimpfte Kolben wurde zur 'Herstellung einer Impfkultur auf einer rotierenden Schüttelvorrichtung 48 Stunden bei 28QC bebrütet.
Dann wurden in Kolben mit einem Fassungvermögen von 200 Raumteilen je 40 Raumteile eines Mediums, das 3 % Glycerin, 1 % Glucose, 0,5 % Polypepton (Daigo Nutritive Chemicals), 0,5 % Fleischextrakt und 0,5 % Natriumchlorid enthielt (pH 7,0), gegeben, worauf 0,02 bis 0,5 % verschiedener Schwefelverbindungen dem Kolben zugesetzt wurden. Jeder Kolben wurde dann mit 1 Raumteil der vorstehend genannten Impfkultur beimpft und 96 Stunden auf einer rotierenden Schüttelvorrichtung bei 28°C bebrütet. Wie die folgende Tabelle zeigt, wurde die Bildung von G-6302 durch den Zusatz der Schwefelverbindungen erheblich gesteigert.
Schwefelverbindung Konzen- Bildung tration von G-6302;
% [ig/ml
Ohne Zusatz
—
15
Methionin
0,02
20
0,5
43
Cystein
0,02
55
0,1
65
Cystin
0,02
30
0,5
65
Natriumsulfat
0,02
70
0,1
48
N atriumthiosulfat
0,02
55
0,1
80
Beispiel 5
In 7,5 Raumteilen kaltem Wasser wurde 1 Teil der gemäss Beispiel 1 oder 2 hergestellten freien Form von G-6302 gelöst. Der Lösung wurden 17,5 Raumteile kaltes Methanol zugesetzt.
Das erhaltene Gemisch wurde 24 Stunden in der Kälte stehen gelassen, wobei pulverförmiges G-6302 zu farblosen Kristallen kristallisierte. Die Kristalle wurden isoliert, mit einer geringen Menge kaltem wässrigem 80%igem Methanol, kaltem Methanol und Äther in dieser Reihenfolge gewaschen und unter vermindertem Druck 6 Stunden bei 60°C über Phosphorpentoxyd' getrocknet, wobei 0,930 Teile kristallines G-6302 erhalten wurden. Die physikalisch-chemischen Eigenschaften der erhaltenen Kristalle sind nachstehend genannt.
1) Schmelzpunkt 168 bis 170°C
2) Elementaranalyse (Gew.-%)
Gefunden
C 35,51 35,56 H 5,61 5,61
N 12,93 12,98 S 7,45 7,59
Berechnet für C12H20N4SO9. CH3OH . V£H20 C 35,69 H 5,76 N 12,81 S 7,33
3) Spezifische Drehung: [a]n23 + 82° ± 5° (c = 1,0, in ap)
4) IR-Absorptionsspektrum (Fig. 3), Hauptpeaks (KBr) (cm-1):
3440, 3355, 3000, 1780, 1660, 1650, 1538, 1265, 1245, 1220, 1038, 625
5) Kernmagnetisches Resonanzspektrum (in Dimethylsulfoxyd, 100 MHz)
8 3,31 ppm (s, 3H) (auf 0-CH3 von G-6302 zurückzuführende chemische Verschiebung).
S 3,20 ppm (s, 3H) (chemische Veschiebung, die auf das 0-CH3 des in den Kristallen enthaltenen Methanols zurückzuführen ist).
Die übrigen physikalisch-chemischen Eigenschaften, d.h. UV-Absorptionsspektrum, Löslichkeit in Lösungsmitteln, Farbreaktionen, Stabilität, Basizität, Neutralität oder Acidi-tät, sind die gleichen wie bei dem gemäss Beispiel 1 hergestellten Produkt.
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V
2 Blätter Zeichnungen
Claims (6)
1. Antibiotikum G-6302 und seine Salze, gekennzeichnet durch die folgenden Eigenschaften:
a) Schmelzpunkt 120°C (Sinterung), 130°C (Zers.)
b) Aussehen: weisses Pulver c) Elementaranalyse (%)
C 34,99 ± 0,5 H 5,58 ± 0,5 N 13,30 ± 0,5 O 38,13 dz 0,5 S 7,70 dz 0,5
nach 6stündiger Trocknung über Phosphorpentoxyd unter vermindertem Druck bei 40°C
d) Ultraviolettabsorptionsspektrum:
keine charakteristischen Absorptionen über 210 nm e) Infrarotabsorptionsspektrum in KBr, Hauptabsorptionen Wellenzahlen in cm"1: 1770, 1650, 1530, 1240, 1043
f) Spezifische Drehung: [a]D23 + 94° =fc 10° (c = 0,35), H20)
g) Löslichkeit: unlöslich in Petroläther, Hexan, Diäthyl-äther, Benzol, Äthylacetat und Chloroform; schwerlöslich in Äthanol, Pyridin und Aceton; löslich in Methanol und Dimethylsulfoxyd; leicht löslich in Wasser h) basisch, neutral oder sauer: sauer i) Molekulargewicht 400 dz 20, bestimmt durch Titrimetrie j) Farbreaktionen: Ninhydrin- und Kaliumpermanganat-
reaktionen positiv; Eisen(III)-chlorid-Kalium-ferricyanat-Reaktion, Sakaguchi- und Molisch-Reaktion negativ; Ehrlich-Reaktion: unsicher positiv.
2. Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums G-6302 gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man einen Mikroorganismus, der zur Gattung Pseudomonas gehört und Antibiotikum G-6302 zu bilden vermag, in einem Nährmedium kultiviert, das Antibiotikum G-6302 im Kulturmedium sich bilden und anhäufen lässt und das Antibiotikum isoliert.
2
PATENTANSPRÜCHE
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass man als Mikroorganismus Pseudomonas acidophi-la verwendet.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass man als Mikroorganismus Pseudomonas acidophila G-6302 mit der identifizierenden Kennzeichnung ATCC-31363, IFO 13774, FERM-P 4344 verwendet.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 2, 3 und 4, dadurch gekennzeichnet, dass man das Kulturmedium durch eine Schwefelverbindung ergänzt, die von dem Mikroorganismus, der zur Gattung Pseudomonas gehört und Antibiotikum G-6302 zu bilden vermag, verwertet wird.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass man als Schwefelverbindung Natriumthiosulfat, Natriumsulfat, Cystin, Cystein oder Methionin verwendet.
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