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Inhibitoren für Glykosid-Hydrolasen aus Bacillen
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Es ist bekannt, daß eine Reihe von Actinomyceten, vor allem Actinoplanaceen
Inhibitoren für Glykosidhydrolasen, vorzugsweise kohlenhydratspaltender Enzyme des
Verdauungstraktes bilden (DT-OS 2.064.092).
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Weiterhin weiß man, daß Nojirimycin, ein bakteriostatisch wirkendes
Antibioticum aus Stämmen der Gattung Streptomyces, gewisse mikrobielle CI-Glucosidasen
hemmt (T. NIWA et al.
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Agr. Biol. Chem. 34, 966 (1970)).
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Die vorliegende Erfindung betrifft Inhibitoren für Glykosidhydrolasen,
und zwar insbesondere Glucosidase-Inhibitoren, die im Verdauungstrakt wirksam werden.
Diese Inhibitoren werden von Organismen der Familie Bacillaceae, besonders von Stämmen
der Gattung Bacillus gebildet. Des weiteren betrifft die Erfindung pharmazeutische
Zusammensetzungen, die diese Inhibitoren als Wirkstoffe enthalten, sowie Verfahren
zur Kontrolle und Beeinflussung des Kohlenhydratstoffwechsels von Menschen und Tieren
durch Hemmung von Glykosidhydrolasen mit Hilfe dieser Wirkstoffe.
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Zur Auffindung geeigneter Stämme bedient man sich der nachstehend
beschriebenen Methoden.
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Aus Erdproben isoliert man in bekannter Weise Stämme der Familie Bacillaceae,
insbesondere solche der Gattung Bacillus.
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Mit Abimpfungen dieser Stämme beimpft man Kulturkolben mit Nährlösungen,
die das Wachstum dieser Stämme ermöglichen.
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Man kann z. B. eine Nährlösung verwenden, die 5 g Pepton und 3 g Fleischextrakt
pro Liter enthält, jedoch sind grundsätzlich viele andere Typen von Nährlösungen,
die geeignete Kohlenstoff-und Stickstoffquellen und Nährsalze enthalten, einsetzbar.
Der pH-Wert der Nährlösungen kann in weiten Grenzen variieren; bevorzugt wird ein
Anfangs-pH der Nährlösung zwischen 6,0 und 8,0 gewählt.
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Als Kohlenstofflieferant für die Nährlösung kommen die verschiedenartigsten
organischen Substanzen in Frage. Kohlenhydrate, organische Säuren und Alkohole seien
beispielhaft genannt.
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Als Stickstoffquelle können Hefeextrakt, Sojamehl, Peptone, Fleischextrakt
und viele andere organische Substanzen Verwendung finden.
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Die Konzentrationen der Kohlenstoff- und Stickstoffquellen sowie der
Nährsalze,von denen Fels04, CaC03 und MgSO bei-4 spielhaft erwähnt seien, können
in weiten Grenzen schwanken.
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Auf den gesonderten Zusatz von Nährsalzen kann in manchen Fällen ganz
verzichtet werden, da sie oftmals in den komplexen Stickstoffquellen als Beimengungen
enthalten sind.
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Da die Bildung von Inhibitoren oft stark von der Zusammensetzung der
Nährböden abhängig ist, empfiehlt es sich, die Stämme zur Optimierung der Produktionsleistung
in verschiedenen Nährlösungen zu kultivieren. Entsprechende Vorschläge können den
Beispielen entnommen werden.
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Von der Nährlösung füllt man z. B. 100 - 200 ml in einen l-Litr-Erlenmeyer-Kolben,
sterilisiert in bekannter Weise,
beimpft mit dem zu untersuchenden
Stamm und bebrütet den Kolben bei 15 - 800C, vorzugsweise bei 24 - 400C bzw. 50
- 700C bei thermophilen Bacillen, auf Schüttelmaschinen. Zeigt die Kultur Wachstum,
was im allgemeinen nach 1 - 10 Tagen, meist nach 1 - 5 Tagen, sichtbar wird, so
entnimmt man eine Probe von z. B. 5 ml und trennt in dieser Probe die Zellen durch
Filtration oder Zentrifugation ab. Von den Kulturbrühen werden 1 - 100 /ul in die
nachfolgend beschriebenen Tests eingesetzt und die Hemmkapazität pro ml berechnet.
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Die Zellen werden zweimal mit je 5 Volumina (bezogen auf das Zellvolumen)
Aceton und anschließend einmal mit 5 Volumina Diäthyläther extrahiert. Die vereinigten
Extrakte werden zur Trockene eingeengt, in Wasser aufgenommen und lyophilisiert.
Die Lyophilisate werden in onzentrationen von 10 - 1000 /ug/ml in die nachfolgend
beschriebenen Tests eingesetzt.
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Amylasetest Eine Amylase-Inhibitor-Einheit (1 AIE) ist definiert als
die Menge Inhibitor, die zwei Amylaseeinheiten zu 50 % inhibiert.
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Eine Amylaseeinheit (AE) ist die Menge an Enzym, die in einer Minute
unter den unten angegebenen Testbedingungen 1 Äquivalent glucosidischer Bindungen
in der Stärke spaltet.
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Die /uVal gespaltenen Bindungen werden als /uVal gebildeter reduzierender
Zucker mit Dinitrosalicylsäure kolorimetrisch bestimmt und mit Hilfe einer Maltoseeichkurve
als /uVal Maltoseäquivalente angegeben. Zur Durchführung des Testes werden 0,1 ml
Amylaselösung (20 - 22 AE/ml) mit 10 - 1000 /ug Inhibitor oder 1 - 100 /ul der zu
testenden Kulturlösung in 0,4 ml 0,02M Natriumglycerophosphatpuffer / 0,001 M CaCl2
pH 6,9 versetzt und etwa 10 - 20 Minuten in einem Wasserbad von 35°C äquilibriert.
Dann wird 5 Minuten mit 0,5 ml einer auf 35 0C vorgewärmten 1 , Stärkelösung bei
35 0C inkubiert und anschließend mit 1 ml Dinitrosalicylsäure-Reagens
(nach
P. Bernfeld in Colowick-Kaplan, Meth. Enzymol., Band 1, Seite 149) versetzt. Zur
Farbentwicklung wird der Ansatz 5 Minuten auf dem siedenden Wasserbad erhitzt, dann
abgekühlt und mit 10 ml destilliertem Wasser versetzt. Die Extinktion bei 540 nm
wird gegen einen entsprechend angesetzten Leerwert ohne Amylase gemessen. Zur Auswertung
wird aus einer vorher aufgenommenen Amylaseeichkurve die nach Inhibitorzusatz noch
wirksame Amylaseaktivität abgelesen und daraus die prozentuale Hemmung der eingesetzten
Amylase errechnet. Die prozentuale Hemmung wird als Funktion des Quotienten Inhibitor
* AE ** * bezogen auf Trockensubstanz ** AE in nicht inhibierten Ansatz der gleichen
Serie aufgetragen, der 50 % Hemmungspunkt aus der Kurve abgelesen und auf AIE/mg
Inhibitor umgerechnet.
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Saccharasetest Eine Saccharase-Inhibitor-Einheit (SIE) ist definiert
als die Menge Inhibitor, die zwei Saccharaseeinheiten zu 50 % inhibiert. Eine Saccharaseeinheit
(SE) ist die Menge an Enzym, die in einer Minute unter den unten angegebenen Testbedingungen
1 /uMol Saccharose in Glucose und Fructose spaltet. Die /uMol gebildete Glucose
werden mit Hilfe der Glucoseoxidasereaktion quantitativ bestimmt unter Bedingungen,
bei denen eine weitere Saccharosespaltung durch die Saccharase nicht mehr stattfindet.
Zur Durchführung des Testes werden 0,05 ml einer auf 0,12 SE eingestellten Saccharaselösung
l) mit 1 - 20 /ug Inhibitor oder 1 - 20 /ul der zu testenden Lösung versetzt und
mit 0,1 M Natriummaleinatpuffer pH 6,0 auf 0,1 ml aufgefüllt.
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1) Solubilisierte Saccharase aus Schweinedünndarmmucosa nach B. Borgström,
A. Dahlquist, Acta Chem. Scand. 12, (1958), Seite 1997. Mit 0,1 m Natriummaleinatpuffer
pH5,0 auf entsprechenden SE-Gehalt verdünnt.
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Es wird 10 Minuten bei 35 0C äquilibriert und dann mit 0,1 ml einer
auf 35 0C vorgewärmten 0,05 m Saccharoselösung in 0,1 m Natriummaleinatpuffer pH
6,0 versetzt. Man inkubiert 20 Minuten bei 35 0C und stoppt die Saccharasereaktion
durch Zugabe von 1 ml Glucoseoxidasereagens 1)ab und inkubiert weitere 30 Minuten
bei 350C Danach wird 1 ml 50 % H2S04 zugesetzt und bei 545 nm gegen einen entsprechenden
Leerwert gemessen.
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Zur Auswertung wird die prozentuale Hemmung der eingesetzten Saccharase
berechnet und aus dem 50 % Hemmpunkt mit Hilfe einer Glucoseeichkurve auf SIE/g
bzw. SIE/Liter umgerechnet.
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Maltasetest Eine Maltase-Inhibitor-Einheit (MIE) ist definiert als
die Menge Inhibitor, die zwei Maltaseeinheiten zu 50 % inhibiert.
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Eine Maltaseeinheit (ME) ist die Menge an Enzym, die in einer Minute
unter den unten angegebenen Testbedingungen 1/ uMol Maltose in 2 /uMol Glucose spaltet.
Die /uMol gebildete Glucose werden mit Hilfe der Glucoseoxidasereaktion quantitativ
bestimmt unter Bedingungen, bei denen eine weitere Maltosespaltung durch die Maltase
nicht mehr stattfindet. Zur Durchführung des Testes werden 0,05 ml einer auf 0.060
-0.070 ME eingestellten Maltaselösung 2) mit 1 - 20 /ug Inhibitor oder 1 - 20/ul
der zu testenden Lösung versetzt und mit 0,1 M Natriummaleinatpuffer pH 6.0 auf
0.1 ml einer auf 350C vorgewärmten 0,05 M Maltoselösung in 0.1 M Natriummaleinatpuffer
pH 6.0 versetzt. Man inkubiert 20 Minuten bei 350C und stoppt die Maltasereaktion
durch Zugabe von 1 ml Glucose oxidasereagens 1) ab und inkubiert weitere 30 Minuten
bei 35°C.
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1) Das Glucoseoxidasereagens wird durch Lösen von 2 mg Glucoseoxidase
(Fa. Boehringer, Reinheitsgrad I) in 100 ml 0,565 m Tris-HCl-Puffer pH 7,0 und anschließenden
Zusatz von 1 ml Detergenslösung (2 g Triton X 100 + 8 g 95 % Äthanol p. a.), 1 ml
Di#nisidinläsung (260 mg o-Dianisidin . 2 HCl in 20 ml H2O) und 0,5 ml 0,1 % - iger
wäßriger Peroxidaselösung (Fa. Boehringer, Lyophilisat, Reinheitsgrad II) hergestellt.
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2) Solubilisierte Maltase aus Schwelnedünndarmmucosa nach B. Borgström,
A. Dahlquist, Acta Chem. Scand. 12, (1958), Seite 1997. Mit 0.1 m Natriummaleinatpuffer
pH-5.0 auf entsprechenden ME-Gehalt verdünnt.
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Danach wird 1 ml 50 % H2504 zugesetzt und bei 545 nm gegen einen entsprechenden
Leerwert gemessen.
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Zur Auswertung wird die prozentuale Hemmung der eingesetzten Maltase
berechnet und aus dem 50% Hemmpunkt mit Hilfe einer Glucoseeichkurve auf MIE/g bzw.
MIE/Liter umgerechnet.
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Nach der oben beschriebenen Methode wurde eine ganze Reihe von Stämmen
der Familie Bacillaceae geprüft. Dabei wurden insbesondere bei Stämmen der Gattung
Bacillus deutliche Glykosidhydrolasen inhibierende Aktivitäten gefunden. Am günstigsten
hinsichtlich der Ausbeute erwiesen sich die Arten B.subtilis, B.subtilis var. niger,
B. amyloliquefaciens, B.longisporus, B.polymyxa sowie B. coagulans.
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Die Häufigkeit mit der nach der angegebenen Methode Stämme gefunden
wurden, die sich in den Tests als aktive Inhibitoren erwiesen,lag über 5 9' Beispiele
besonders wirksamer Stämme werden in Tabelle 1 aufgeführt: Tabelle 1: Bacillus-Stämme
mit Saccharase-Inhibitor-Wirkung Art Stamm-Nr.
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B.subtilis DSM 704 B.subtilis var.niger DSM 675 (ATCC 9372) B.amyloliquefaciens
DSM 7 (ATCC 23 350) B.coagulans DSM 1 (ATCC 7050) B.longisporus DSM 479 * B.polymyxa
DSM 365 B.polymyxa DSM 372 B.polymyxa DSM 742 B.polymyxa DSM 292 * hemmt auch Amylase
Art
Stamm-Nr.
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B.polymyxa DSM 356 (ATCC 8523) B.polymyxa DSM 36 (ATCC 842) B.polymyxa
DSM 740 B.polymyxa DSM 741 B.subtilis DSM 1060 B.subtilis DSM 1061 Subtilis DSM
1062 B.subtilis DSM 1063 B.subtilis DSM 1064 B.subtilis DSM 1065 B.subtilis DSM
1066 B.subtilis DSM 1067 Die aufgeführten Stämme sind unter den angegebenen DSM-Nummern
bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen (DSM), Göttingen hinterlegt und von
dort zu beziehen.
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Die Stämme DSM 704, 740, 741 und 742 werden in Tabelle 2 beschrieben;
die restlichen Stämme sind aus der Literatur bekannt und werden im "Catalogue of
Strains 1974" der DSM aufgeführt.
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Zur Gewinnung der Glycosid-Hydrolasen-Inhibitoren werden die oben
aufgeführten Stämme in den oben beschriebenen Nährlösungen kultiviert. Dabei ist
zu beachten, daß praktisch jeder Stamm zur optimalen Produktion eine andere qualitativ
und quantitativ anders zusammengesetzte Nährlösung benötigt.
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Nach 1 - l0-tgiger Bebrütung bei 15 - 800C, vorzugsweise 24 - 4O0C
bzw. bei Thermophilen 50 - 700C, in Schttelkolben oder in Fermentern verschiedener
Größe werden die Zellen von der Kulturlösung abgetrennt und Je nach dem Auftreten
der Inhibitoren das wirksame Prinzip aus der Kulturlösung und/oder aus den Zellen
angereichert.
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Aus den Kulturbrühen gewinnt man die Inhibitoren durch Lyophilisation
oder Fällung mit Salzen oder wasserlös1iche organischen Lösungsmitteln (wie z. B.
niedere Alkohole und Ketone) oder durch Adsorption der Wirkstoffe an Ionenaus tauschern.
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Aus den Zellen gewinnt man die Inhibitoren durch Extraktion mit organischen
Lösungsmitteln, wie z. B. Alkoholen, Ketonen, Äthern, Estern und Sulfoxiden.
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Dazu wird der Fermentationsansatz bei 3000 - 20 000 Upm, vorzugsweise
6 - 10 000 Upm, 10 - 60 Minuten, vorzugsweise 30 Minuten, zentrifugiert oder filtriert,
vorzugsweise mit Druck und unter Zuhilfenahme von Filterhilfsmitteln, und derart
in Kulturbrühe und Zellrückstand getrennt.
Tabelle 2
Uigeaschaften @@@ st @@me DSM DSM DSM DSM |
740 741 742 704 |
St@bchen |
@@@@@@@@@@ @-6 2-5 3-7 204 |
@@@@@@@@@@ @@@-@,8 3,6-0.8 0,7-0,8 0,6-0,8 |
Gran-Reaktion + # # + |
Sporen |
ellipsoid/zylindrisch + + + + |
rund - - - - |
termindal/subterminal + + + + |
sentral/Parazentrol + + + + |
Sporenmutterzelle + + + - |
@@@@@@@@@llen |
Beweglichkeit + + + + |
Maximale Wachstumstemperatur |
Wachstum positiv bei °C 40 40 45 55 |
Wachstum negativ bei °C 45 45 50 60 |
Catalase + + + + |
Anserobes wachstum + + + - |
Voges-Proskauer Reaktion + + + + |
pH in VP - Medium 6,2 6,5 6,5 5,6 |
Eigelb-Reaktion - - - - |
Wachstum |
pH 5,7 + + + + |
NaCl 5% # - - + |
NaCl 7% - - - + |
Nacl 10 - - - + |
Lysozym (0,001%) - + - - |
Säurebildung aus |
D-Glucose + + + + |
L-Arabinose + + + + |
D-XYlose + + + + |
D-Mannit + + + + |
Eigenschaften der Stämme DSM DSM DSM DSM |
740 741 742 704 |
Gasbildung aus Glucose + + + - |
Abbau von |
Stat@e + + + + |
C@sein + + + + |
G lutine + + + + |
Pyrosin - - + - |
Hippurat - |
@@. + + + |
Verwertung von |
Citrat - - + |
Pr@pionit - |
Des@@ia@erung von |
Phesylal@nin |
Reduktion von NO3 zu NO + + + + |
G@s@ildung aus Nitrat - - - |
Bildung von |
kristallinen Dextrinen - - |
Indol - - - |
D@hydroxyaceton + + - |
Die Stämme DSM 740, DSM 741, DSM 742 und DSM 704 sind aufgrund von Sporenbildung
und aerobem Wachstum der Gattung Bacillus zuzuordnen. Die ermittelten morphologischen
und physiologischen Merkmale der Stämme DSM 740, DSM 741 und DSM 742 entsprechen
denjenigen von Bacillus polymyxa, während der Stamm DSM 704 der Art Bacillus subtilis
zuzuordnen ist.
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Die Identifizierung erfolgte nach den Angaben von R. E. Cordon, W.
C. Haynes, C. Hor-Nay Pong: The Genus Bacillus, Washington 1973.
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Die Isolierung des Inhibitors aus der jeweiligen Kulturbrühe kann
auf verschiedene Weise erfolgen: a) Einengen der Kulturbrühen bei vermindertem Druck
(10 -50 Torr) bei Bad-Temperaturen von 20 - 1000C, vorzugsweise 40 - 800C, auf ca.
1/5 - 1/50 des Ausgangsvolumens. Der eingeengte Extrakt wird filtriert oder zentri.
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fugiert und das klare Filtrat (der klare Uberstand) evtl.
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nach vorheriger Entsalzung lyophilisiert.
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b) Ausfällung der Inhibitoren aus der Kulturbrühe (oder den nach a)
eingeengten Kulturbrühen) durch Zusatz von wasserlöslichen organischen Lösungsmitteln,
wie z. B.
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Alkoholen oder Ketonen, vorzugsweise Methanol, Äthanol, Aceton, bis
zu einem Cehalt von 60 - 90 9'. Da bei niederer Konzentration an Lösungsmittel inaktive
Begleitsubstanzen gefällt werden, eignet sich dieses Fällungsverfahren besonders
gut zur fraktionierenden Fällung zur Abtrennung von unerwünschten Begleitstoffen.
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c) Aussalzen der Inhibitoren aus den Extrakten (oder den narh a) eingeengten
Extrakten), z. B. mit Ammonsulfat, Kochsalz usw. Der ausfallende Niederschlag wird
durch Zentrifugation oder Filtration gesammelt und entweder direkt mit Aceton und
Äther gewaschen und im Vakuum getrocknet oder nach Rücklösen in Wasser dialysiert
und lyophilisiert.
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d) Adsorption der Inhibitoren an Ionenaustauscher.
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Dieses Verfahren eignet sich zur Isolierung von solchen Inhibitoren,
die auf Grund ihrer chemischen Natur Ladungen tragen. Die Desorption des Inhibitors
geschieht durch Änderung der Ionenstärke oder des pH-Wertes des Elutionsmediums.
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Neben dem Inhibitor finden sich in den Kulturbrühen häufig unerwünschte
Begleitsubstanzen. Die Abtrennung dieser Begleitstoffe kann auf verschiedene Weise
erfolgen, z. B.
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durch Hitzedenaturierung der Begleitstoffe bei Inhibitoren, die hitzestabil
sind, oder durch Dialyse durch entsprechende Membranen bei niedermolekularen Inhibitoren,
wobei die ungewünschten Begleitstoffe von der Membran zurückgehalten werden oder
durch fraktionierende Fällung (vgl. b) oder durch Adsorption der Begleitstoffe an
Ionenaustauscher.
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Die Gewinnung von Inhibitoren aus den Zellen geschieht durch mehrmalige
Extraktion der Zellen mit organischen Lösungsmitteln, vorzugsweise zweimaliger 10
- 20-minütiger Extraktion mit 3 - 5 Vol. Aceton (bezogen auf das Zellfeuchtvolumen)
und anschließend einmaliger 5 - l0-minütiger Extraktion mit Äther. Die Aceton- und
Äther-Extrakte werden im Vakuum zur Trockne eingeengt, in Wasser aufgenommen und
lyophilisiert.
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Die neuen Substanzen lösen sich gut in Wasser. Eine Gruppe der Inhibitoren
ist bei neutralen pH-Werten hitzestabil, säurestabil (pH 2), alkalistabil (pH 12)
und dialysierbar. Diese Inhibitoren werden durch Trypsin und Pepsin nicht inaktiviert,
sie hemmen ihrerseits die genannten Enzyme nicht. Sie sind mit den typischen Proteinfärbestoffen
nicht anfärbbar. Nach Abschätzungen aus der Gelfiltration liegt das Molekulargewicht
dieser Inhibitoren über 100 aber unter 2000.
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Die besten Inhibitoren dieser Gruppen zeichnen sich durch eine extrem
hohe, auch alle bisher bekannten Saccharase-Inhibitoren Ubertreffende Hemmaktivität
gegenüber Saccharase aus.
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Bei Fermentation des Stammes DSM 7 in einer Nährlösung der Zusammensotzung
A (siehe Beispiel 4) werden nach viertägiger Fermentation über 400 000 SIE/1, bei
einer Kultivierung dieses Stammes in Nährlösung S3 (siehe Beispiel 3) werden nach
sechstägiger Fermentation über 300 000 SIE/1 gewonnen.
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Durch Adsorption an stark sauren Kationenaustauschern in der -Form
und anschließende Desorption mit wäßriger NH3-Lösung sowie Einengen und Lyophilisation
des Desorbats wird ein Rohinhibitor mit etwa 40 000 SIE/g erhalten. Extraktion des
Rohinhibitors mit Methanol, Einengen des Extraktes zur Trockene, Rücklösen in Wasser
und Chromatographie der wäßrigen Lösung an schwach sauren Austauschern auf Dextran-
oder Cellulose-Basis, insbesondere Carboxymethylcellulose, Desorption mit verdünnten
Mineralsäuren, vorzugsweise lO - 10'1 N Salzsäure, Einengen der saccharase-inhibitorisch
aktiven Fraktionen und Lyophilisation dieser Fraktionen führt zu einem angereicherten
Rohprodukt mit etwa 250 000 SlE/g. Chromatographie des angereicherten Rohproduktes
an modifiziertem Dextran (Sephadex # LH 20) in Methanol, Einengen der saccharase-inhibitorisch
aktiven Fraktionen und Zusatz von konzentrierten Mineralsäuren, vorzugsweise konzentrierte
Salzsäure, bis zu einem pH-Wert von 1 - 3 liefert ein kristallines Produkt mit 540
000 SIE/g. Diese Substanz ist chromatographisch rein.
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Als Summenformel wurde C6H1304N bzw. C6H14O4NCl für das Hydrochlorid
ermittelt. Auf Grund ihrer physikalischen Parameter (IR-, NMR-, W-Spektren; Schmelzpunkt;
spezifischer Drehwert) und den chemischen Eigenschaften (Perjodat-Oxidation, Elementaranalyse)
ist sie identisch mit einer von S. INOYE et al. (Tetrahedron 23, 2125 (1968)) beschriebenen
Verbindung der Summenformel C6Hl3°4N bzw. C6H14O4NCl fUr das Hydrochlorid, welcher
von den Autoren die Strukturformel
zugeordnet und für die der Name "l-Desoxynojirimycin" vorgeschlagen wurde.
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Diese Verbindung wurde von den Autoren auf chemischem Wege durch Hydrierung
des Antibioticums Nojirimycin erhalten.
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Das Ausgangsprodukt Nojirimycin wird nach T. NIIDA et al.
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(J. Antibiotics, Ser. A. 20, 62 (1967)) durch Fermentation von Organismen
der Gattung Streptomyces erhalten.
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Durch die vorliegende Erfindung wird es erstmalig möglich, Desoxynojirimycin
in einem Arbeitsgang durch direkte mikrobiologische Synthese mit guten Ausbeuten,
ohne Umweg über das relativ instabile und dadurch schwierig zu handhabende Nojirimycin
herzustellen.
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Es ist außerordentlich überraschend und war nicht vorherzusehen, daß
diese Verbindungen von Organismen der Gattung Bacillus produziert werden, da sich
diese Mikroorganismen im allgemeinen als Sekundärstoff-Produzenten weniger eignen
und allenfalls im wesentlichen peptidartige Sekundärstoffe bilden.
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Darüber hinaus werden von einzelnen Stämmen, z. B. DSM 372, Saccharase-Inhibitoren
gebildet, die im Gemisch neben Desoxynojirimycin und/oder Nojirimycin noch andere
im DUnnschicht-Chromatogramm deutlich unterscheidbare saccharase-inhibitorisch aktive
Komponenten produzieren.
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Andere Stämme, z.B. DSM 741, 479 und 372 bilden Inhibitoren, die im
Dünnschicht-Chromatogramm kein Desoxynojirimycin oder Nojirimycin erkennen lassen
und die somit chemisch von anderer Struktur sind.
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Es ist bekannt, daß bei Tieren und Menschen nach Aufnahme von kohlonhydrathaltigon
Nahrungsmitteln und Getränken (z.
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B. Getreide-, Kartoffelstärke, Obst, Fruchtsaft, Bier, Schokolade)
Hyperglykämien auftreten, die infolge eines raschen Abbaus der Kohlenhydrate durch
Glycosidhydrolasen (z. B. Speichel- und Pankreasamylasen, Maltasen, Saccharasen)
nach folgendem Schema
Amylase Maltase Stärke bzw. Clycogen --------
Maltose -------+ Glucose Saccharase Saccharose -----------§ Glucose + Fructose bewirkt
werden. Diese Hyperglykämien sind bei Diabetikern besonders stark und anhaltend
ausgeprägt. Bei Adipösen bewirkt die alimentäre Hyperglykämie oftmals eine besonders
starke Sekretion von Insulin, das seinerseits zu vermehrtem Fettaufbau und vermindertem
Fettabbau führt. Im Anschluß an derartige Hyperglykämien tritt bei stoffwechselgesunden
und adipösen Personen infolge der Insulinsekretion häufig eine Mypoglykämle auf.
Bekannt ist, daß sowohl Hypoglykämien als auch im Magen verweilender Speisebrei
die Produktion von Magensaft fördern, der seinerseits die Entstehung einer Gastritis,
eines Ulcus ventriculi oder duodeni auslöst oder begünstigt.
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Ferner ist bekannt, daß in der Mundhöhle Kohlenhydrate, besonders
Saccharose, durch Mikroorganismen gespalten werden und dadurch die Kariesbildung
gefördert wird.
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Malabsorption von Kohlenhydraten, z.B. infolge intestinalen Saccharasemangels,
bewirkt eine Diarrhoe. Geeignete Dosen eines Glucosidase-Inhibitors bewirken eine
künstliche Malabsorption und sind deshalb geeignet, einer Obstipation entgegen zu
wirken.
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Die erfindungsgemäßen Inhibitoren eignen sich deshalb als Theropeutica
für folgende Indikationen: Adipositas, Hyperlipoproteinämie, Atherosklerose, Diabetes,
Prädiabetes, Gastritis, Obstipation, Karies.
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Zur Verbreiterung des Wirkungsspektrums kann es sich empfehlen, Inhibitoren
für Glycosidhydrolasen, die sich gegenseitig in ihrer Wirkung ergänzen,zu kombinieren,
sei es, daß es sich
um Kombinationen der erfindungsgemäßen Inhibitoren
untereinander oder um Kombinationen der erfindungsgemäßen Inhibitoren mit bereits
bekannten handelt. So kann es beispielsweise zweckmäßig sein, erfindungsgemäße Saccharase-Inhibitoren
mit bereits bekannten Amylase-Inhibitoren zu kombinieren.
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Vorteilhaft sind in manchen Fällen auch Kombinationen der erfindungsgemäßen
Inhibitoren mit bekannten oralen Antidiabetica (ß-cytotrope Sulfonylharnstoffderivate
und/oder blutzuckerwirksame Biguanide) sowie mit blutlipid-senkenden Wirkstoffen
wie z. B. Clofibrat, Nicotinsäure, Cholestyramin und andere.
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Die Verbindungen können ohne Verdürmung, z. B. als Pulver oder in
einer Gelatinehülle oder in Kombination mit einem Trägerstoff in einer pharmazeutischen
Zusammensetzung appliziert werden.
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Pharmazeutische Zubereitungen können eine größere oder kleinere Menge
des Inhibitors enthalten, z. B. 0,1 , bis 99,5 %, in Kombination mit einem pharmazeutisch
verträglichen nichttoxischen, inerten Trägerstoff, wobei der Trägerstoff eine oder
mehrere feste, halbfeste oder flüssige Verdünnungsmittel, Füllstoffe und/oder nichttoxisches,
inertes und pharmazeutisch-verträgliches Formulierungshilfsmittel enthalten kann.
Solche pharmazeutischen Zubereitungen liegen vorzugsweise in Form von Dosierungseinheiten
vor, d. h. physikalisch-diskrete, eine bestimmte Menge des Inhibitors enthaltenden
Einheiten, die einem Bruchteil oder einem Vielfachen der Dosis entsprechen, die
zur Herbeiführung der gewurischten Hemmwirkung entsprechen. Die Dosierungseinheiten
können 1, 2, 3, 4 oder mehr Einzeldosen oder 1/2, 1/3 oder 1/4 einer Einzeldosis
enthalten. Eine Einzeldosis enthält vorzugsweise eine genügende Menge Wirkstoff,
um bei einer Applikation gemäß eines vorher bestimmten Dosierungsschemas einer oder
mehrerer Dosierungseinheiten die gewünschte Hemmwirkung zu erzielen, wobei eine
ganze, eine halbe, oder ein Drittel oder ein Viertel der Tagesdosis gewöhnlich einmal,
zweimal,
dreimal oder viermal am Tage verabreicht wird.
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Andere therapeutische Mittel können auch eingenommen werden. Obgleich
die Dosierung und das Dosierungsschema in jedem Fall sorgsam abgewogen werden sollte,
unter Anwendung gründlichen fachmännischen Urteils und unter Beachtung des Alters,
des Cewichts und des Zustands des Patienten, der Art und der Schwere der Erkrankung,
wird die Dosierung gewöhnlich in einem Bereich zwischen etwa 30 bis etwa 3 x 105
AIE/kg und zwischen etwa 1 bis etwa 1 x 104 SIE/kg des Körpergewichtes pro Tag liegen.
In manchen Fällen wird man dabei eine ausreichende therapeutische Wirkung mit einer
geringeren Dosis erreichen, während in anderen Fällen eine größere Dosis erforderlich
sein wird.
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Orale Applikation kann unter Verwendung fester und flüssiger Dosierungseinheiten
durchgeführt werden, wie z. B. Pulver, Tabletten, Dragees, Kapseln, Granulate, Suspensionen,
Lösungen und dergleichen.
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Pulver wird durch Zerkleinerung der Substanz in einer geeigneten Größe
und Vermischen mit einem ebenfalls zerkleinerten pharmazeutischen Trägerstoff hergestellt.
Obgleich ein eßbares Kohlenhydrat, wie z. B. Stärke, Lactose, Saccharose oder Glucose
normalerweise zu diesem Zwecke Verwendung findet und auch hier benutzt werden kann,
ist es wünschenswert ein nicht metabolisierbares Kohlenhydrat, wie z. B.
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ein Cellulosederivat zu benutzen.
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Süßmittel, Geschmackszusätze, Konservierungsstoffe, Dispergiermittel
und Färbemittel können auch mitverwendet werden.
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Die Kapseln können durch Zubereitung der oben beschriebenen Pulvermischung
und durch Füllung bereits gebildeter Gelatinehüllen hergestellt werden. Die Pulvermischung
kann man vor dem Füllvorgang mit Gleitmitteln, wie z. B. Kieselgel, Talkum, Magnesiumstearat,
Calciumstearat oder festem Polyäthylenglykol versetzen. Die Mischung kann man ebenfalls
mit
einem Desintegrator oder Lösungsvermittler, wie z. B.
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Agar-Agar, Calciumcarbonat oder Natriumcarbonat versetzen, um bei
Einnahme der Kapsel die Zugänglichkeit des Inhibitors zu verbessern.
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Die Anfertigung der Tabletten erfolgt zum Beispiel durch Herstellung
einer Pulvermischung, grob oder feinkörnig, und Hinzufügung eines Gleitmittels und
Desintegrators. Aus dieser Mischung formt man Tabletten. Eine Pulvermischung bereitet
man vor durch Mischung der Substanz, welche in geeigneter Weise zerkleinert wurde
und ergänzt ein Verdünnungsmittel oder eine andere Trägersubstanz wie oben beschreiben.
Gegebenenfalls fügt man ein Bindemittel hinzu: z. B. Carboxymethylcellulose, Alginate,
Gelatine oder Polyvinylpyrrolidone, einen Lösungsverzägerer, wie z. B. Paraffin,
einen Resorptionsbeschleuniger, wie z. B. ein quarternäres Salz und/oder ein Adsorptionsmittel,
wie z. B. Bentonit, Kaolin oder Dicalciumphosphat. Die Pulvermischung kann granuliert
werden zusammen mit einem Bindemittel, wie z. B. Syrup, Stärkepaste, Akazienschleim,
oder Lösungen aus Zellulose- oder Polymerenmaterialien. Danach preßt man das Produkt
durch ein grobes Sieb. Als Alternative hierzu kann man die Pulvermischung durch
eine Tablettenmaschine laufen lassen und die sich ergebenden ungleichmäßig geformten
Stücke bis auf Korngröße zerkleinern. Damit die entstandenen Körner nicht in den
tablettenbildenden Düsen stecken bleiben, kann man sie mit einem Gleitmittel versetzen,
wie z. B. Stearinsäure, Stearatsalz, Talkum oder Mineralöl. Diese gleitfähig gemachte
Mischung wird dann in Tablettenform gepreßt. Die Wirkstoffe können auch mit freifließenden
inerten Trägerstoffen vereinigt werden und direkt in Tablettenform gebracht werden
unter Auslassung der Granulat-oder Zerstückelungsschritte. Man kann das Produkt
mit einer klaren oder opaken Schutzhülle versehen, z. B. einem aber zug aus Schellack,
einem Uberzug aus Zucker oder Polymersubstanzen und einer polierten Hülle aus Wachs.
Farbstoffe
können diesen Uberzügen beigefügt werden, damit zwischen
den verschiedenen Dosierungseinheiten unterschieden werden kann.
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Die oral zu verabreichenden Zubereitungsformen, wie z. B. Lösungen,
Syrup und Elixire, lassen sich in Dosierungseinheiten herstellen, so daß eine bestimmte
Menge Präparat eine bestimmte Menge Wirkstoff enthält. Syrup kann so hergestellt
werden, daß der Wirkstoff in einer wäßrigen Lösung, welche geeignete Geschmacksstoffe
enthält, gelöst wird; Elixire werden unter Verwendung nichttoxischer, alkoholischer
Trägerstoffe erhalten. Suspensionen kann man durch Dispergieren der Verbindung in
einem nicht toxischen Trägerstoff darstellen. Lösungsvermittler und Emulgiermittel,
wie z. B. äthoxylierte Isostearylalkohole und Polyoxyäthylensorbitester, Konservierungsmittel,
geschmacksverbessernde Zusätze,wie z. B. Pfefferminzöl oder Saccharin und dergl.,können
auch zugegeben werden.
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Dosierungsvorschriften können auf der Kapsel angegeben werden.
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Uberdies kann die Dosierung so abgesichert sein, daß der Wirkstoff
verzögert abgegeben wird, z. B. durch Einhalten des Wirkstoffes in Polymerensubstanzen,
Wachse oder dergl.
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Zusätzlich zu den oben erwähnten pharmazeutischen Zusammen setzungen
lassen sich auch diese Wirkstoffe enthaltende Lebensmittel herstellen; beispielsweise
Zucker, Brot, Kartoffelprodukte, Fruchtsaft, Bier, Schokolade und andere Konfektartikel,
und Konserven, wie z. B. Marmelade, wobei zu diesen Produkten eine therapeutisch-wirksame
Menge minbestens eines der erfindungsgemäßen Inhibitoren gegeben wurde.
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Die erfindungsgemäßen Inhibitoren weisen weiterhin die Eigenschaft
auf, in Tieren das Verhältnis des Anteiles an unerwUnschtem Fett zum Anteil des
erwUnschten fettarmen Fleisches (mageres Fleisch) zugunsten des mageren Fleisches
in hohem
Maße zu beeinflussen. Dies ist von besonderer Bedeutung
für die Aufzucht und Haltung von landwirtschaftlichen Nutztieren, z. B. in der Schweinemast,
aber auch von erheblicher Bedeutung für die Aufzucht und Haltung von sonstigen Nutztieren
und Ziertieren. Die Verwendung der Inhibitoren kann weiterhin zu einer erheblichen
Rationalisierung der Fütterung der Tiere führen, sowohl zeitlich, mengenmäßig wie
auch qualitätsmäßig. Da sie eine gewisse Verzögerung der Verdauung bewirken, wird
die Verweildauer der Nährstoffe im Verdauungstrakt verlängert, wodurch eine mit
weniger Aufwand verbundene ad libitum-Fütterung ermöglicht wird. Weiterhin ergibt
sich bei der Verwendung der erfindungsgemäßen Inhibitoren in vielen Fällen eine
erhebliche Einsparung von wertvollem Proteinfutter Die Wirkstoffe können somit praktisch
in allen Bereichen der Tierernährung als Mittel zur Reduzierung des Fettansatzes
sowie der Einsparung von Futtereiweiß verwendet werden.
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Die Wirksamkeit der Wirkstoffe ist hierbei weitgehend unabhängig von
der Art und dem Geschlecht der Tiere. Besonders wertvoll erweisen sich die Wirkstoffe
bei Tierarten, die überhaupt oder in bestimmten Lebens abschnitten zu stärkerer
Fetteinlagerung neigen.
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Als Tiere, bei denen die Inhibitoren zur Reduzierung des Fettansatzes
und/oder zur Einsparung von Futtereiweiß eingesetzt werden können, seien beispielsweise
folgende Nutz- und Ziertiere genannt: Warmblüter wie Rinder, Schweine, Pferde, Schafe,
Ziegen, Katzen, Hunde, Kaninchen, Pelztiere, z. B.
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Nerze, Chinchilla, andere Ziertiere, z. B. Meerschweinchen und Hamster,
Labor- und Zootiere, z. B. Ratten, Mäuse, Affen usw. Geflügel, z. B. Broiler, Htihner,
Gänse, Enten, Truthähne, Tauben, Papageien und Kanarienvögel und Kaltblüter, wie
Fische, z. B. Karpfen und Reptilien, z. B. Schlagen.
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Die Menge der Wirkstoffe, die den Tieren zur Erreichung des gewünschten
Effektes verabreicht wird, kann wegen der günstigen Eigenschaften der Wirkstoffe
weitgehend variiert werden. Sie liegt vorzugsweise bei etwa 0,5 mg bis 2,5 g, insbesondere
10 bis 100 mg/kg Futter. Die Dauer der Verabreichung kann von wenigen Stunden oder
Tagen bis zu mehreren Jahren betragen. Die passende Menge Wirkstoff sowie die passende
Dauer der Verabreichung stehen in engem Zusammenhang mit dem Fütterungsziel. Sie
hängen insbesondere von der Art, dem Alter, dem Geschlecht, dem Gesundheitszustand
und der Art der Haltung der Tiere ab und sind durch jeden Fachmann leicht zu ermitteln.
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Die erfindungsgemäßen Wirkstoffe werden den Tieren nach den üblichen
Methoden verabreicht. Die Art der Verabreichung hängt insbesondere von der Art,
dem Verhalten und dem Allgemeinzustand der Tiere ab. So kann die Verabreichung einmal
oder mehrmals täglich, in regelmäßigen oder unregelmäßigen Abständen,oral erfolgen.
Aus Zweckmäßigkeitsgründen ist in den meisten Fällen eine orale Verabreichung, insbesondere
im Rhythmus der Nahrungs- und/oder Getränkeaufnahme der Tiere, vorzuziehen.
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Die Wirkstoffe können als reine Stoffe oder in formulierter Form verabreicht
werden, wobei die formulierte Form sowohl als Premix, also in Mischung mit nichttoxischen
inerten Trägerstoffen beliebiger Art, als auch als Teil einer Gesamtration in Form
eines Beifutters bzw. als Mischungsbestandteil eines alleinigen Mischfutters zu
verstehen ist. Mit eingeschlossen ist auch die Applikation geeigneter Zubereitungen
über das Trinkwasser.
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Die Wirkstoffe können gegebenenfalls in formulierter Form auch zusammen
mit anderen Nähr- und Wirkstoffen, z. B. Mineralsalzen, Spurenelementen, Vitaminen,
Eiweißstoffen, Energieträgern
(z. B. Stärke, Zucker, Fette), Farbstoffen
und/oder Geschmacksstoffen oder anderen Futterzusatzstoffen, z. B.
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Wachstumsförderern in geeigneter Form verabreicht werden.
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Die Wirkstoffe können den Tieren vor, während oder nach der Nahrungsaufnahme
gegeben werden.
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Empfehlenswert ist die orale Verabreichung zusammen mit dem Futter
und/oder Trinkwasser, wobei je nach Bedarf die Wirkstoffe der Gesamtmenge oder nur
Teilen des Futters und/oder Trinkwassers zugegeben werden.
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Die Wirkstoffe können nach üblichen Methoden durch einfaches Mischen
als reine Stoffe, vorzugsweise in fein verteilter Form oder in formulierter Form
in Mischung mit eßbaren, nichttoxischen Trägerstoffen, gegebenenfalls auch in Form
eines Premix oder eines Futterkonzentrates, dem Futter und/oder dem Trinkwasser
beigefügt werden.
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Das Futter und/oder Trinkwasser kann beispielsweise die erfindungsgemäßen
Wirkstoffe in einer Konzentration von etwa 0,001 bis 5,0 %, insbesondere 0,02 bis
2,0 % (Gewicht) enthalten. Die optimale Höhe der Konzentration des Wirkstoffs im
Futter und/oder Trinkwasser ist insbesondere abhängig von der Menge der Futter-
und /oder Trinkwasseraufnahme der Tiere und kann durch jeden Fachmann leicht ermittelt
werden.
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Die Art des Futters und seine Zusammensetzung ist hierbei ohne Belang.
Es können alle gebräuchlichen, handelsüblichen oder speziellen Futterzusammensetzungen
verwendet werden, die vorzugsweise das übliche, für eine ausgewogene Ernährung notwendige
Gleichgewicht aus Energie- und Eiweißstoffen, einschließlich Vitaminen und Mineralstoffen
enthalten. Das Futter kann sich beispielsweise zusammensetzen aus pflanzlichen Stoffen,
z. B. olkuchenschroten, Getreideschroten, Getreidenebenprodukten, aber auch aus
Heu, Gärfutter, Rüben und anderen Futterpflanzen,
aus tierischen
Stoffen, z. B. Fleisch- und Fischprodukten, Knochenmehl, Fetten, Vitaminen, z. B.
A, D, E, K und B-Komplex, sowie speziellen Proteinquellen, z. B. Hefen, sowie bestimmten
Aminosäuren und Mineralstoffen und Spurenelementen, wie z. B. Phosphor und Eisen,
Zink, Mangan, Kupfer, Kobalt, Jod usw.
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Premixe können vorzugsweise etwa 0,1 bis 50 %, insbesondere 0,5 bis
5,0 % (Gewicht) der Wirkstoffe der Formel I neben beliebigen eßbaren Trägerstoffen
und/oder Mineralsalzen, z. B.
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kohlensaurem Futterkalk enthalten und werden nach den üblichen Mischmethoden
hergestellt.
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Mischfutter enthalten vorzugsweise 0,001 bis 5,0 %, insbesondere 0,02
bis 2,0 % (Gewicht) der Wirkstoffe der Formel I neben den üblichen Rohstoffkomponenten
eines Mischfutters, z. B. Getreideschrote oder -nebenprodukte, Ölkuchenschrote,
tierisches Eiweiß, Mineralien, Spurenelemente und Vitamine.
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Sie können nach den üblichen Mischmethoden hergestellt werden.
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Vorzugsweise in Premixen und Mischfuttermitteln können die Wirkstoffe
gegebenenfalls auch durch ihre Oberfläche bedeckende geeignete Mittel, z. B. mit
nichttoxischen Wachsen oder Gelatine,vor Luft, Licht und/oder Feuchtigkeit geschützt
werden.
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Beispiel für die Zusammensetzung eines fertigen Mischfutters, für
Geflügel, das einen erfindungsgemäßen Wirkstoff enthält: 200 g Weizen, 340 g Mais,
360,3 g Sojaschrot, 60 g Rindertalg, 15 g Dicalciumphosphat, 10 g Calciumcarbonat,
4 g codiertes Kochsalz, 7,5 g Vitamin-Mineral-Mischung und 3,2 g Wirkstoff-Premix
ergeben nach sorgfältigem Mischen 1 kg Futter.
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Die Vitamin-Mineral-Mischung besteht aus: 6000 I.E. Vitamin A, 1000
I.E. Vitamin DD, 10 mg Vitamin E, 1 mg Vitamin K3, 3 mg Riboflavin, 2 mg Pyridoxin,
20 mcg Vitamin B12, 5 mg Calciumpantothenat, 30 mg Nikotinsäure, 200 mg Cholinchlorid,
200 mg Mn SO4 x H20, 140 mg Zn SO4 x 7H20, 100 mg Fe S04 x 7H20 und 20 mg Cu S04
x 5H20.
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Der Wirkstoff-Premix enthält z. B. l-Desoxynojirimycin in der gewünschten
Menge, z. B. 1600 mg und zusätzlich 1 g DL-Methionin sowie so viel Sojabohnenmehl,
daß 3,2 g Premix entstehen.
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Beispiel für die Zusammensetzung eines Schweinemischfutters, das einen
Wirkstoff der Formel I enthält: 630 g Futtergetreideschrot (zusammengesetzt aus
200 g Mais-, 150 g Gerste-, 150 g Hafer- und 130 g Weizenschrot), 80 g Fischmehl,
60 g Sojaschrot, 58,8 g Tapiokamehl, 38 g Bierhefe, 50 g Vitamin-Mineral-Mischung
für Schweine (Zusammensetzung, z. B. wie beim Kükenfutter) 30 g Leinkuchenmehl,
30 g Maiskleberfutter, 10 g Sojaöl, 10 g Zuckerrohrmelasse und 2 g Wirkstoff-Premix
(Zusammensetzung z. B. beim Kükenfutter) ergeben nach sorgfältigem Mischen 1 kg
Futter.
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Die angegebenen Futtergemische sind vorzugsweise zur Aufzucht und
Mast von Küken bzw. Schweinen abgestimmt, sie können jedoch in gleicher oder ähnlicher
Zusammensetzung auch zur Aufzucht und Mast anderer Tiere verwendet werden.
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Wie bereits erwähnt, können die Inhibitoren einzeln oder aber auch
in beliebigen Mischungen untereinander verwendet werden, wobei sowohl die reinen
Wirkstoffe als auch die bei der Herstellung erhaltenen rohen Wirkstoffe gegebenenfalls
nach einer Crobreinigung eingesetzt werden.
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Beispiel 1 Beimpft man einen 1 Ltr.-Erlenmeyerkolben, der 120 ml einer
Nährlösung der Zusammensetzung 2.0 % Maisstärke 1.0 % Glucose 0.5 % Kaseinhydrolysat
1.0 % Hefeextrakt pH mit Na2CO3 auf 7.2 eingestellt + 0.4 Pro CaCO3 Sterilisation
30' bei 121 0C enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes DSM 704 und bebrütet
den Kolben bei 28 0C auf einer Rundschüttelmaschine, so zeigt die Kulturlösung nach
5 Tagen eine Aktivität von 70 SIE/ml.
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Beispiel 2 Beimpft man einen 1 Ltr.-Erlenmeyerkolben, der 120 ml einer
Nährlösung der Zusammensetzung 7.5 % Malzextrakt 0.3 % Kaseinhydrolysat 0.7 X Hefeextrakt
0.3 % CaCO3 0.3 % K2HPO4 Leitungswasser, Sterilisation 30' bei 121°C pH nach der
Sterilisation auf 6.6 - 6.8 mit K2C03 eingestellt enthält, mit einer Sporensuspension
des Stammes DSM 704 und bebrütet den Kolben bei 280C auf einer Rundschüttelmaschine,
so zeigt die Kulturlösung nach 5 Tagen eine Aktivität von 197 SIE/ml.
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Beispiel 3 - Nährlösung 53 Beimpft man einen 140 Ltr.-Fermenter, der
100 Ltr. Nährlösung der Zusammensetzung % Malzextrakt 0.3 Yv Kaseinhydrolysat 0.7
Hefeextrakt 0.3 96 CaCO3 0.3 % K2HPO4 Leitungswasser, Sterilisation 30' bei 121°C,
pH nach der Sterilisation auf 6.6 - 6.8 mit K2C03 eingestellt enthält, mit 1,7 Ltr.
Vorkultur, gewonnen durch Bebrütung von 10 1 Ltr.-Erlenmeyerschüttelkolben mit je
120 ml Nährlösung derselben Zusammensetzung, beimpft mit dem Stamm DSM 704 und bebrütet
unter Rührung und Belüftung 5 Tage bei 280C, so erhält man eine Kulturbrühe, die
260 SIE/ml enthält.
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Beispiel 4 - Nährlösung A Beimpft man einen 1 Ltr.-Erlenmeyerkolben,
der 120 ml einer Nährlösung der Zusammensetzung 3.0 % Sojamehl 3.0 % Glycerin 0.2
96 CaCO3 Leitungswasser Sterilisation 30' bei 1210C enthält, mit einer Sporensuspension
des Stammes DSM 7 und bebrütet den Kolben bei 280C auf einer Rundschüttelmaschine,
so zeigt die Kulturlösung nach 4 Tagen eine Aktivität von 437 SIE/ml.
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Beispiel 5 Beimpft man einen 1 Ltr.-Erlenmeyerkolben, der 120 ml einer
Nährlösung nach Beispiel 1 enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes DSM 7
und bebrütet den Kolben bei 280C auf einer Rundschüttelmaschine, so zeigt die Kulturlösung
nach 5 Tagen eine Aktivität von 162 SIE/ml.
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Beispiel 6 Beimpft man einen 1 Ltr.-Erlenmeyerkolben, der 120 ml einer
Nährlösung der Zusammensetzung 1.0 % Glucose 1.0 % Stärke lösl, 0.5 % Kaseinhydrolysat
0.75 % Fleischextrakt 0.75 % Peptone 0.5 % Hefe-Extrakt 0.1 % K2HP04 0.3 % NaCl
0.1 % MgSO4.7 H20 Leitungswasser, pH mit Na CO auf 7.2 eingestellt Sterilisation:
30 bei 121 C enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes DSM 7 und bebrütet
den Kolben bei 28 0C auf einer Rundschüttelmaschine, so zeigt die Kulturlösung nach
5 Tagen eine Aktivität von 36.4 SIE/ml.
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Beispiel 7 Beilnpft man einen 1 Ltr.-Erlenmeyerkolben, der 200 ml
einer Nährlösung nach Beispiel 3 enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes
DSM 7 und bebrütet den Kolben bei ?80C auf einer Rundschüttelmaschine, so zeigt
die Kulturlösung nach 6 Tagen eine Aktivität von 224 S.E/ml.
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Beispiel 8 Beimpft man einen 140 Ltr.-Fermenter, der 100 Ltr. Nährlösung
nach Beispiel 4 enthält, mit 1,2 Ltr. Vorkultur, gewonnen durch Bebrütung von 10
1 Ltr.-Erlenmeyerschüttelkolben mit je 120 ml Nährlösung derselben Zusammensetzung,
beimpft mit dem Stamm DSM 7 und bebrütet unter Rührung und Belüftung 5 Tage bei
280C, so erhält man eine Kulturbrühe, die 286 SIE/ml enthält.
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Beispiel 9 Beimpft man einen 1 Ltr.-Erlenmeyerkolben, der 120 ml einer
Nährlösung nach Beispiel 2 enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes DSM 1
und bebrütet den Kolben bei 280C auf einer Rundschüttelmaschine, so zeigt die Kulturlösung
nach 6 Tagen eine Aktivität von 28,4 SIE/ml.
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Beispiel 10 Beimpft man einen 1 Ltr.-Erlenmeyerkolben, der 120 ml
einer Nährlösung nach Beispiel 1 enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes
DSM 365 und bebrütet den Kolben bei 280C auf einer Rundschüttelmaschine, so zeigt
die Kulturlösung nach 4 Tagen eine Aktivität von 15.6 SIE/ml.
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Beispiel 11 Beimpft man einen 1 Ltr.-Erlenmeyerkolben, der 120 ml
einer Nährlösung nach Beispiel 2 enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes
DSM 365 und bebrütet den Kolben bei 28 0C auf einer Rundschüttelmaschine, so zeigt
die Kulturlösung nach 4 Tagen eine Aktivität von 25.8 SIE/ml.
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Beispiel 12 Beimpft man einen 1 Ltr.-Erlenmeyerkolben, der 120 ml
einer Nährlösung nach Beispiel 4 enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes
DSM 741 und bebrütet den Kolben bei 280C auf einer RundschUttelmaschine, so zeigt
die Kulturlösung nach 5 Tagen eine Aktivität von 3,2 SIE/ml.
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Beispiel 13 Beimpft man einen 1 Ltr.-Erlenmeyerkolben, der 120 ml
einer Nährlösung der Zusammensetzung nach Beispiel 1 enthält, mit einer Sporensuspension
des Stammes DSM 741 und bebrütet den Kolben bei 280C auf einer Rundschüttelmaschine,
so zeigt die Kulturlösung nach 5 Tagen eine Aktivität von 26.4 SIE/ml.
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Beispiel 14 Beimpft man einen 1 Ltr.-Erlenmeyerkolben, der 120 ml
einer Nährlösung der Zusammensetzung nach Beispiel 2 enthält, mit einer Sporensuspension
des Stammes DSM 741 und bebrütet den Kolben bei 28 0C auf einer Rundschüttelmaschine,
so zeigt die Kulturlösung nach 3 Tagen eine Aktivität von 24.0 SIE/ml.
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Beispiel 15 Beimpft man einen 1 Ltr.-Erlenmeyerkolben, der 120 ml
einer Nährlösung der Zusammensetzung 2.0 % Maisstärke 0.5 % Glucose 0.3 % Kaseinhydrolysat
pH mit Na2C03 auf 7.2 eingestellt + 0.4 % CaCO 0 Sterilisation: 301 bei 121 C enthält,
mit einer Sporensuspension des Stammes DSM 741 und bebrütet den Kolben bei 280C
auf einer Rundschüttelmaschine, so zeigt die Kulturlösung nach 2 Tagen eine Aktivität
von 81.7 SIE/ml und nach 3 Tagen eine Aktivität von 121 SIE/ml.
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Beispiel 16 Beimpft man einen 1 Ltr.-Erlenmeyerkolben, der 120 ml
einer Nährlösung nach Beispiel 4 enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes
DSM 675 und bebrütet den Kolben bei 280C auf einer Rundschüttelmaschine, so zeigt
die Kulturlösung nach 5 Tagen eine Aktivität von 8,6 SIE/ml Beispiel 17 Beimpft
man einen 1 Ltr.-Erlenmeyerkolben, der 120 ml einer Nährlösung nach Beispiel 1 enthält,
mit einer Sporensuspension des Stammes DSM 675 und bebrütet den Kolben bei 280C
auf einer RundschUttelmaschine, so zeigt die Kulturlösung nach 5 Tagen eine Aktivität
von 53.0 SIE/ml.
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Beispiel 18 Beimpft man einen 1 Ltr.-Erlenmeyerkolben, der 120 ml
einer Nährlösung nach Beispiel 2 enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes
DSM 675 und bebrütet den Kolben bei 280C auf einer RundschUttelmaschine, so zeigt
die Kulturlösung nach 4 Tagen eine Aktivität von 17.8 SIE/ml.
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Beispiel 19 Beimpft man einen 1 Ltr.-Erlenmeyerkolben, der 120 ml
einer Nährlösung nach Beispiel 4 enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes
DSM 372 und bebrütet den Kolben bei 280C auf einer Rundschüttelmaschine, so zeit
die Kulturlösung nach 5 Tagen eine Aktivität von 6.0 SIE/ml.
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Beispiel 20 Beimpft man einen 1 Ltr.-Erlenmeyerkolben, der 120 ml
einer Nährlösung nach Beispiel 1 enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes
DSM 372 und bebrUtet den Kolben bei 280C auf einer Rundschüttelmaschine, so zeigt
die Kulturlösung nach 4 Tagen eine Aktivität von 21.6 STE/ml.
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Beispiel 21 Beimpft man einen 1 Ltr.-Erlenmeyerkolben, der 200 ml
einer Nährlösung nach Beispiel 2 enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes
DSM 372 und bebrütet den Kolben bei 280C auf einer Rundschüttelmaschine, so zeigt
die Kulturlösung nach 3 Tagen eine Aktivität von 26.8 SIE/ml.
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Beispiel 22 Beimpft man einen 1 Ltr.-Erlenmeyerkolben, der 120 ml
einer Nährlösung der Zusammensetzung 2.0 % Maisstärke 1.0 % Glucose 0.5 % Kaseinhydrolysat
0.5 % Hefe-Extrakt pH mit Na2CO3 auf 7.2 eingestellt + 0.4 % CaCO3 Sterilisation:
30' bei 1210C enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes DSM 372 und bebrütet
den Kolben bei 280C auf einer Rundschüttelmaschine, so zeigt die Kulturlösung nach
3 Tagen eine Aktivität von 26.5 SIE/ml.
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Beispiel 23 Beimpft man einen 1 Ltr.-Erlenmeyerkolben, der 120 ml
einer Nährlösung nach Beispiel 22 enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes
DSM 479 und bebrütet den Kolben bei 280C auf einer Rundschüttelmaschine, so zeigt
die Kulturlösung nach 3 Tagen eine Aktivität von 7.9 SIE/ml.
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Beispiel 24 Beimpft man einen 1 Ltr. Erlenmeyerkolben, der 120 ml
einer Nährlösung nach Beispiel 6 enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes
DSM 36 und bebrütet den Kolben bei 280C auf einer RundschUttelmaschin., so zeigt
die Kulturlösung nach 3 Tagen eine Aktivität von 5.4 SIE/ml.
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Beispiel 25 Beimpft man einen 1 Ltr.-Erlenmeyerkolben, der 120 ml
einer Nährlösung nach Beispiel 2 enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes
DSM 36 und bebrütet den Kolben bei 280C auf einer Rundschüttelmaschine, so zeigt
die Kulturlösung nach 3 Tagen eine Aktivität von 5,4 SIE/ml.
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Beispiel 26 Beimpft man einen 1 Ltr.-Erlenmeyerkolben, der 120 ml
einer Nährlösung nach Beispiel 2 enthält, mit einer Sporen suspension des Stammes
DSM 356 und bebrütet den Kolben bei 280C auf einer Rundschüttelmaschine, so zeigt
die Kulturlösung nach 3 Tagen eine Aktivität von 8,8 SIE/ml.
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Beispiel 27 Beimpft man einen 1 Ltr.-Erlenmeyerkolben, der 120 ml
einer Nährlösung nach Beispiel 1 enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes
DSM 292 und bebrütet den Kolben bei 280C auf einer Rundschüttelmaschine, so zeigt
die Kulturlösung nach 3 Tagen eine Aktivität von 9,0 SIE/ml.
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Beispiel 28 Beimpft man einen 1 Ltr.-Erlenmeyerkolben, der 120 ml
einer Nätzrlisung nach Beispiel 2 enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes
DSM 292 und bebrütet den Kolben bei 280C auf einer RundschUttelmaschine, so zeigt
die Kulturlösung nach 3 Tagen eine Aktivität von 9,2 S[E/ml.
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Beispiel 29 Beimpft man einen 1 Ltr.-Erlenmeyerkolben, der 120 ml
einer Nährlösung nach Beispiel 2 enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes
DSM 742 und bebrUtet den Kolben bei 280C auf einer Rundschüttelmaschine, so zeigt
die Kulturlösung nach 3 Tagen eine Aktivität von 9,8 SIE/ml.
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Beispiel 30 Beimpft man einen 1 Ltr.-Erlenmeyerkolben, der 120 ml
einer Nährlösung nach Beispiel 1 enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes
DSM 740 und bebrütet den Kolben bei 280C auf einer Rundschüttelmaschine, so zeigt
die Kulturlösung nach 4 Tagen eine Aktivität von 5,7 SIE/ml.
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Beispiel 31 Die ernentationsbrühe aus einem 100 Ltr.-Fermenter nach
Beispiel 3 wurde mit halbkonz. HCl auf pH 3.0 - 3.5 eingestellt und die Bakterienmasse
nach dem Ausflocken abzentrifugiert. Man erhielt 70 Itr. tiefbraune Kulturlösung
mit einem SIE-Cehalt von 220 COO SIE/Ltr. Diese Lösung wurde mit einer Fließrate
von 20 I,/h über eine mit 12 kg Lewatit(R) SC 104 in der H+-Form gepackte Säule
von 30 cm gegeben. Der Durchlauf hatte praktisch keine saccharaseinhibitorische
Aktivität und wurde verworfen. Die Säule wurde mit 50 L dest. H20 (Waschwasser I),
20 L 0.01 n HCl und anschlieend nochmals 20 L dest. H20 (Waschwasser II) gewaschen.
Zur Desorption der Aktivität wurde nun 2.5 % Ammoniak angeschlossen. Parallel mit
dem Anstieg der Leitfähigkeit des Eluat und der Zunahme der Braunfärbung wird die
saccharaseinhibltorische Aktivität eluiert. Der Vorlauf (20 L) bis zum Anstieg der
Leitfähigkeit wird verworfen, die die Aktivität enthaltende Fraktion (35 L) im Rotationsverdampfer
eingeengt und in wenig Wasser rückgelöst (Konzentrat, 3 L). Das Konzentrat wurde
lyophilisiert. Man erhielt 288 g tiefbraunes Rohprodukt I mit 38 000 SIE/g.
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Beispiel 32 Die Fermentationsbrühe aus einem 100 Ltr.-Fermenter nach
Beispiel 8 wurde mit halbkonz. HCl auf pH 3.0 - 3.5 eingestellt und die Bakterienmasse
nach dem Austlocken abzentrifugiert. Man erhielt 60 Ltr. tiefbraune Kulturlösung
mit einem SIE-Gehalt von 240 000 SIE/Ltr. Diese Lösung wurde mit einer Fließrate
von 20 L/h über eine mit 12 kg Dowex 50 W x 4 in der H+-Form gepackt.
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Säule von 8 30 cm gegeben. Der Durchlauf hatte praktisch keine saccharaseinhibitorische
Aktivität und wurde verworfen. Die Säule wurde mit 50 L dest.H20 (Waschwasser I),
20 L 0.01 n HCl und anschließend nochmals 20 L dest. H20 (Waschwasser II) gewaschen.
Zur
Desorption der Aktivität wurde nun 2.5 % Ammoniak angeschlossen.
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Parallel mit dem Anstieg der Leitfähigkeit des Eluats und der Zunahme
der Braunfärbung wird die saccharaseinhibitorische Aktivität eluiert. Der Vorlauf
(20 L) bis zum Anstieg der Leitfähigkeit wird verworfen, die die Aktivität enthaltende
Fraktion (35 L) im Rotationsverdampfer eingeengt und in wenig Wasser rückgelöst
(Konzentrat, 3 L). Des Konzentrat wurde lyophilisiert.
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Man erhielt 360 g tiefbraunes Rohprodukt I mit 24 000 SIE/g.
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Beispiel 33 50 g Rohprodukt I aus Beispiel 31 wurden fein zermörsert
und anschließend 3 x mit je 300 ml techn. Methanol extrahiert. Dazu wurde der Ansatz
zunächst 2 Min. im Ultraturraxhomogenisator homogenisiert, dann in ein 40-500C warmes
Wasserbad eingebracht und 20' gerührt. Nach jeder Extraktion wurde durch ein Faltenfilter
abfiltriert. Der nach der 3. Extraktion im Faltenfilter verbleibende RUckstand wurde
im Vakuum getrocknet (28.4 g). Da die Testung nur eine geringe spezifische Aktivität
dieses RUckstandes ergab, wurde er anschließend verworfen. Die methanolischen Extrakte
wurden vereinigt und im Vakuum zur Trockne eingeengt.
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Der im Kolben verbleibende aktive Rückstand wurde in 750 ml H20 gelöst
(L = 2.8 mS, pH = 7,2) und mit einer Fließrate von 500 ml/h über eine 5 x 50 cm
Säule, gefüllt mit CM-Cellulose in der H+-Form (CM-Cellulose der Fa. Whatman, Typ
C 52), gegeben. Man wusch mit 5 L Wasser nach und schloß dann zur Elution 20 L 0.002
n HCL an. Durchlauf, Waschwasser und Eluat wurden in ca. 0.5 L-Portionen franktioniert
aufgefangen. Die saccharaseinhibitorische Aktivität wurde bestimmt und alle Fraktionen,
die mehr als 30 000 SIE/L enthielten, vereinigt: Im Durchlauf die tiefbraun gefärbten
Fraktionen 2-4 und im hellgelben Eluat die Fraktionen 16-33. Die vereinigten Fraktionen
wurden eingeengt und lyophilisiert. Man erhielt 18.2 g der Durchlauffraktion 2-4
mit einer spezifischen Aktivität von 4000 SIE/g (verworfen) sowie 3.1 g des sog.
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Rohprodukts II mit 250 000 SIE/g (ca. 50-60 % rein). Das Rohprodukt
II ist stark hygroskopisch und zerfließt an der Luft in kurzer Zeit zu einer klebrigen
Masse.
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Beispiel 34 g rS g des Rohprodukts II aus Beispiel 33 werden zur Abtrennung
der hauptmenge der begleitenden Peptide in 15 ml Methanol gelöst und über eine 5
x 90 cm mit Sephadex LH 20 in Methanol gefüllte Säule chromatographiert. Bei einer
Fließrate von 100 ml/h und einer Telnperatur von 4-50C sammelt man 10 ml-Fraktionen.
10111 dieser Fraktionen werden auf einer Kieselgelplatte (Fa. Merck) aufgetragen
und dünnschichtchromatographisch im System Aethanol/ 25 N NH3/H20 = 80/10/10 untersucht.
Die nach DC Inhibitor enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt, auf 5-10 ml eingeengt
und über die gleiche Säule rechromatographiert. Man analysierte die Fraktionen in
der DC und vereinigte die Inhibitor-haltigen Fraktionen, wobei nur ein sehr enger
Bereich geschnitten wurde.
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Man engt zur Trockne ein. Derart IH 20 gereinigter Inhibitor ist ca.
90 s rein. Zur Abtrennung der letzten verbliebenen Peptidverunreinigungen nimmt
man die nach dem Einrotieren als RUckstand verbleibende Substanz in 2-3 ml Methanol
auf und versetzt die gelbe methanolische Lösung mit 50 µ1 konz. HCl. Nach kurzer
Zeit, evtl. auch erst nach mehrstündigem Stehen, kristallisiert der Inhibitor in
Form leicht gelblicher WUrfel oder Quader aus. Die Peptide bleiben in der Mutterlauge.
Man zentrifugiert die Kristalle ab, wäscht 1 x mit eiskaltem Methanol und löst den
gewaschenen Niederschlag anschließend unter Erhitzen in 2 ml Methanol wieder auf.
Man setzt 4 ml Butanol hinzu und stellt über Nacht bei 40C ab. Die am nächsten Morgen
ausgefallenen farblosen Kristalle werden abzentrifugiert, 1 x mit eiskaltem Methanol,
1 mal mit Aceton und 1 mal mit Aether gewaschen und anschließend i.Vak.
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getrocknet. Ausbeute 460 mg des Inhibitor als Hydrochlorid mit 540
000 SIE/g.
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Beispiel 35 Zum Nachweis saccharaseinhibitorischer Komponenten in
Kulturlösung oder Rohprodukt wurde auch folgendes dünnschichtchromatographisches
Verfahren mit anschließender Enzymreaktion auf der Platte benutzt, welches den Nachweis
inhibitorischer Komponenten direkt auf der Platte gestattet. In dieser Dünnschichtchromatographit
trägt man 1-5 fl der Fermentationsbrühen oder 1-5 µg der Präparate allf Kiesel gelfertieplatten
(Fa. Merck, Typ KC 60 F 254) auf und entwickelt in Aethanol/NH3/H20 = 8/1/1. (I)
oder Aethylacetat/Methanol/Wasser = 10/6/4 (II).
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Zur direkten Sichtbarmachung der saccharaseinhibitorischen Komponenten
besprayt man die entwickelte und gut getrocknete Platte mit Enzymgel (20 ml / 20
x 20 cm Platte) und läßt das Gel erstarren.
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Dann wird für 5' in einer feuchten Kammer bei Raumtemperatur vorinkubiert
und anschließend satt mit Substratgel besprayt. Nach dem Erstarren dieser 2. Gelschicht
bringt man die Platte in eine feuchte Kammer ein und inkubiert bei 400C. Die Inhibitionsfärbung
(helle Flecken, rotbrauner Hintergrund) entwickelt sich in 60 -90'. Zum Zeitpunkt
der optimalen Farbentwicklung wird abgebrochen und die Platte mit den darauf befindlichen
Agarschichten am Föhn mit Warmluft getrocknet.
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Bereitung der Gele : Enzymgel : 1.5 g Agarose (L'Industrie Biologique
Francais) wird in 100 ml 0.2 m Na-Maleinatpuffer pH 6.0 suspendiert und anschließend
durch Aufkochen gelöst. Die klare Agaroselösung wird auf 500C abgekühlt und mit
250 l Triton X-l00 Lösung (2 g Triton X-lO0 + 8 g Aethanol p.a.) und 0.5 ml Dianisidinlösung
(20 mg Dianisidin/l ml Aceton) unter Umschwenken versetzt. Direkt vor Gebrauch des
Gels werden 1 ml GOD/POD-Reagens (12.5 mg Glucoseoxidase, Reinheitsgrad I, Fa. Böhringer,
Best.Nr.15423 und 2.5 mg Peroxidase, Reinheitsgrad II, Fa. Böhringer, Best.Nr.l5302,
gelöst in 5 ml Maleinatpuffer) und 4-5 Einheiten Saccharase aus Schweinedünndarm
1) zugesetzt. Das Gel muß bis zum Verspreyen auf 500C gehalten werden, da es sonst
beim Sprayvorgang in den Düsen erstarrt.
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1) Enzympräparation wie auf S. 4 , Fußnote 1 beschrieben.
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Substratgel: 0.5 g Agarose wird in 100 ml Na-Maleinatpuffer pH 0.0
suspendiert und unter Kochen gelöst. Man kühlt anschließend a'if 503C ab, versetzt
mit 100 µ1 Triton (2 g Triton X-100 + 8 g Aethanol p.a.) und gibt 1 g Saccharose
(Serva Nr.35579) zu. Nach dem lösen der Saccharose ist das Gel gebrauchsfertig.
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Die Untersuchung der Kulturlösungen der Stämme mit dieser Methode
ergaben saccharaseinhibitorische Komponenten mit folgenden Rf-Werten im System I
Stämme R-Werte DSM 7 0.25 DSM 741 0.25; 0.41; 0.50; 0.59; 0.71 DSM 704 0.25 DSM
372 0.25; 0.51; 0.60; 0.71 und folgenden Rf-Werten im System II Stämme Rf-Werte
DSM 704 0.05 DSM 479 (0.05); 0.22-0.35; 0.62-0.67; 0.88 DSM 741 (0.05); 0.23-0.35;
0.62-0.67 DSM 372 (0.05); 0.20-0.22
Beispiel 36 Beinpft man einen
1 Ltr.-Erlenmeyerkolben, der 120 ml einer Nährlösung der Zusammensetzung 1.0 % Stärke
0.1 % Glucose 0.5 % Kaseinhydrolysat 1.0 % Hefeextrakt pH mit Na2CO3 auf 7.2 eingestellt
+ 0.4 % CaCO3 Sterilisation: 30' bei 1210C enthält, mit einer Sporensuspension des
Stammes DSM 479 und bebrütet den Kolben bei 280C auf einer Rundschüttelmaschine,
so zeigt die Kulturlösung nach 2 Tagen eine Aktivität von 20.2 SIE/ml.
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Beispiel 37 Beimpft man einen 1 Ltr.-Erlenmeyerkolben, der 120 ml
einer Nährlösung der Zusammensetzung 2.0 , Maisstärke 1.0 X Glucose 0.5 , Kaseinhydrolysat
1.0 % Hefeextrakt 0.1 , K2HPO4 pH mit Na2C03 auf 7.2 eingestellt @ 0.4 % CaCO3 Sterilisation:
30' bei 1210C enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes DSM 372 und bebrütet
den Kolben bei 280C auf einer Rundschüttelmaschine, so zeigt die Kulturlösung nach
2.5 Tagen eine Aktivität von 50.3 SIE/ml.
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Beispiel 38 Beimpft man 1 Ltr.-Erlenmeyerkolben, die 120 ml einer
Nährlösung der Zusammensetzung nach den Beispielen 1, 2, 4 oder 6 enthalten, mit
Sporensuspensionen der angeführten Stämme und bebrütet die Kolben bei 280C auf Rundschüttelmaschinen,
so zeigen die Kulturlösungen nach 4 Tagen folgende Aktivitäten: Stamm Nährlösung
Aktivität der Kulturlösung nach Beispiel nach 4 Tagen in SIE/ml KA-63 4 31 " 1 6.6
" 6 25 n 2 7.9 IiLv1 1523 4 50 1 4.3 6 3.8 2 2.7 OUT 8108 4 8.4 1 3.6 2 3.1 OUT
8110 4 28 2 1 71 n 6 69 n 2 104 S 202 4 38 n 1 10.6 n 2 14.4 S 204 4 54 1 1 2.7
S 219 4 28 1 1.5 2 10.3 S 242 1 17 n 4 3.8 n 2 4.1