DE2463435C2

DE2463435C2 - Vorrichtung zur Durchführung eines Verfahrens zum Nachweisen von Proteinen und Antikörpern

Info

Publication number: DE2463435C2
Application number: DE19742463435
Authority: DE
Inventors: Ivar Schenectady N.Y. Giaever
Original assignee: General Electric Co
Current assignee: General Electric Co
Priority date: 1973-07-30
Filing date: 1974-07-11
Publication date: 1986-12-04
Also published as: JPS5944583B2; SE464784B; IT1212274B; DE2433246A1; BR7406086D0; JPS59160763A; SE7409777L; NL177939B; NL7410231A; JPS6130215B2; NL177939C; DE2433246C2; JPS5076226A; CA1047918A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Vorrichtung zum Bestimmen der Anwesenheit oder Abwesenheit eines spezifischen Proteins in einer biologischen Probe durch einfaches Betrachten, um festzustellen, ob eine oder zwei Proteinschichten auf dem Substrat vorhanden sind, bestehend aus einem Substrat, das mit einem Goldüberzug versehen ist, an dem ein mit dem genannten spezifischen Protein spezifisch reagierendes Protein haftet, nach Patent 23 30 702.

Immunologische Reaktionen sind hochspezifische biochemische Reaktionen, in denen ein als Antigen bezeichnetes erstes Protein sich mk einem zweiten Protein verbindet, das für dieses Antigen spezifisch ist und dessen Antikörper genannt wird, wobei ein immunologisch komplexiertes Protein gebildet wird. Immunologische Reaktionen, die innerhalb eines biologischen Systems, wie einem tierischen Lebewesen, stattfinden, sind von großer Bedeutung für das Tier bei der Bekämpfung von Krankheit. In einem biologischen System veranlaßt der Eintritt eines fremden Proteins, d. h. des Antiges, das biologische System zur Erzeugung der für das entsprechende Antigen spezifischen Antikörper-Proteine in einem Verfahren, das bisher noch nicht vollständig verstanden wird. Die Antikörper-Proteinmoliküle weisen verfügbare chemische Bindestellen auf, die die am Antigenmolekül ergänzen, und so können das Antigen und der Antikörper sich chemisch unter Bildung eines immunologisch komplexierten Proteins verbinden.

Da Antikörper durch biologische Systeme als Antwort auf das Eindringen von fremden Proteinen erzeugt werden, ist der Nachweis von in einem biologischen System vorhandenen Antikörpern von medizinisch diagnostischem Wert bei der Bestimmung der Antigene, denen das System ausgesetzt wurde. Umgekehrt hat auch der Nachweis bestimmter Antigene in einem biologischen System medizinisch diagnostischen Wert. Beispiele des diagnostischen Nachweises von Antigenen sind der Nachweis von HCG-Proteinmolekülen im Urin zur Feststellung der Schwangerschaft und der Nachweis der mit der Hepatitis verbundenen Antigenmoleküle im Blut von in Aussicht genommenen Blutspendern.

Um solche diagnostischen Untersuchungen durchführen zu können, muß das geeignete Protein mindestens einen immunologisch reagierenden Paares in konzentrierter gereinigter Form erhältlich sein. Die einzige bekannte Quelle für Antikörper-Proteine ist ein lebendes biologisches System. Darüber hinaus ist es bisher nur von Wirbeltieren bekannt, daß sie der Einführung eines Fremdproteins mit immunologischen Reaktionen begegnen. Beispielsweise wurden viele Antikörper im Blutserum von tierischen Lebewesen gefunden, die den entsprechenden Antigenen ausgesetzt worden waren. Das Blutserum ist jedoch eine sehr komplexe Mischung, in der die erforderlichen Antikörper in sehr geringen Konzentrationen bei Anwesenheit einer Vielzahl anderer Bestandteile vorkommen. Viele Antigene können andererseits in kontrollierbarer Weise in Laboratoriumskulturen hergestellt werden. Einige Antigene jedoch, wie z. B. das mit der Hepatitis verbundene Antigen, sind derzeit, wie Antikörper, nur aus höheren Iebenden biologischen Systemen erhältlich.

In der derzeit praktizierten Weise basieren sowohl die Ansammlung als auch die Reinigung und die diagnostische Verwendung immunologisch aktiver Proteine auf den Ausfällungs- oder Agglutinierungseigenschaften, die für die Proteine charakterisch sind, die aus der immunologischen Komplexierungsreaktion herrühren. Das klassische Beispiel dieser diagnostischen Verwendungen ist das Verfahren zur Feststellung der Blutgruppe, bei dem Blutproben mit Serum-Antikörpern vom Typ » und β vermischt werden und man bestimmt die Blutgruppe durch Feststellen irgendwelcher Agglutination in den Blutproben.

Die Schwangerschaftsbestimmung über das HCG-Protein, wie sie derzeit durchgeführt wird, ist ein Inhibitions-Test, der ausgeführt wird, indem man eine Menge des HCG-Antiserums in eine Urin-Probe einmischt. Eine Vielzahl von Poylstyrolkügelchen, die mit HCG-Protein beschichtet worden sind, bringt man in eine so vorbereitete Urinprobe ein. Die Polystyrolkugeln agglutinieren, wenn, aber nur wenn in der Probe kein HCG-Protein vorhanden ist. Ist in einer Urinprobe kein HCG-Protein vorhanden, dann bildet das HCG-Protein auf den Polystyrolkugeln mit dem zuvor in die Urinprobe eingebrachten HCG-Antiserum Komplexe und die Kugeln agglutinieren. Wenn andererseits in der Urinprobe HCG-Protein vorhanden ist, dann bildet diese mit dem zuvor eingebrachten HCG-Antiserum einen Komplex, der aus der Probe ausfällt, so daß das vorher eingeführte Serum nicht länger für die Komplexbildung mit dem HCG-Protein auf den Kugeln verfügbar ist und so auch keine Agglutinierung der Kugeln verursachen kann. Gemäß der Lehre der vorliegenden Erfindung kann die bekannte Schwangerschaftbestimmung über das HCG-Protein vereinfacht werden, indem man das HCG-Antiserum auf den Poylstyrolkugeln haften läßt, und eine Urinprobe direkt untersucht. In diesem Falle würden die Polystyrolkugeln agglutinieren, wenn, aber nur wenn in der Probe HCG-Protein vorhanden ist.

Es scheint, daß der Grund, weshalb dieses einfache Verfahren bisher nicht angewendet worden ist, der ist, daß die verfügbaren HCG-Antiseren komplexe Mischungen sind, die einen großen Anteil an Bestandteilen anderer Art als HCG-Antikörper enthalten. Die zusätzliche Bemühung, die nach dem bekannten Verfahren erforderlich ist, um die Antikörper aus den HCG-Antiseren zu extrahieren führen dazu, daß die Seren für den Inhibitionstest bisher direkt verwendet worden sind. Jedes Antigenmolekül bildet typischerweise Komplexe mit einer Vielzahl von Antikörpermolckühlen, die mit verschiedenen Teilchen verbunden sein können und bildet dabei sichtbare Klumpen von /.. B. beschichteten Polystyrolkügelchen oder roten IJIut/.ellen. Rine Unzulänglichkeit von Agglutinierungs-Untcrsuehungen ist

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die, daß die beteiligten Teilchen aus irgendeinem einer Diese Aufgabe wird erfindungsgemaß gelöst durch

"i| Vielzahl von Gründen agglomerieren können, die mit ein weiteres Metall zur Verbesserung der Haftung zwi-

f| der immunologischen Agglutinierung nichts zu tun ha- sehen dem Goldüberzug und dem Substrat

ff ben, und auf diese Weise die Zuverlässigkeit der Unter- Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform ist das

If suchung vermindern. Üblicherweise werden Agglutinie- 5 andere Metall unter Bildung einer Legierung in das

r-'i rungs-Untersuchungen mit größter Sorgfalt von ausge- Gold diffundiert, wodurch die Empfindlichkeit der Vor-

V; bildeten Fachkräften durchgeführt, doch treten trotz- richtung erhöht wird.

j"! dem gelegentlich diagnostische Fehler auf. Die Erfindung wird nachfolgend unter Bezugnahme

■'^r· Beim derzeitigen Verfahren zur Gewinnung gerei- auf die Zeichnung näher erläutert Im einzelnen zeigt

:' nigter Anreicherungen von Antikörpern wird zuerst 10 F i g. 1 eine Seitenansicht einer Ausführungsform der

,j| durch Einführung des Antigens in das tierische System diagnostischen Vorrichtung nach Patent 23 30 702 und

p die Erzeugung von Antikörpern in einem tieirischen Le- F i g. 2 eine graphische Darstellung des Betriebsprin-

|ä bewesen angeregt dann entnimmt man dem Tier Blut- zips, der in F i g. 1 dargestellten Ausführungsform einer

p serum, welches die Antikörper in hochverdünnter Form diagnostischen Vorrichtung.

Jf enthält und vermischt eine bestimmte Menge des spezi- 15 Eine Ausführungsform einer diagnostischen Vorrich-■fI Fischen Antigens mit dem Serum. Die Mischung aus An- tiujg ist strukturell in F i g. 1 gezeigt, und ihr Betriebs-Il tigen und Antikörper bildet Komplexe und fällt aus der prinzip ist graphisch in F i g. 2 illustriert If Serumlösung aus. Die verbleibenden Bestandteile des Die Vorrichtung nach F i g. 1 umfaßt ein Goldsubstrat ui Serums werden abgezogen und der Niederschlag aus 91, das aus wirtschaftlichen Gründen vorzugsweise aus H Antikörper und Antigen wird in einer Säure gelöst, wel- 20 einem mit einer dünnen Goldschicht versehenen ande-[| ehe die Komplexverbindungen trennt Man erhält da- ren Metall besteht und auf dem eine monomolekulare fl durch eine. Lösung der Antigen- und Antikörpermolekü- Schicht 92 eines ersten Proteins adsorbiert ist Gold hat ;V Ie in der Säure. Da die Antikörper- und Antigenmolekü- ein Absorptionsband innerhalb des sichtbaren Spek- |S Ie unterschiedliche physikalische Eigenschaften haben, trums. Diese Tatsache ist für die charakteristische Goldig z. B. unterschiedliches Gewicht, können sie voneinander 2s farbe verantwortlich und ermöglicht diese Ausfüh-P mechanisch, z.B. durch Zentrifugieren, getrennt wer- rungsform der Vorrichtung.

§ den. F i g. 2 illustriert den Betrieb dieser Ausführungsform te Es ist bekannt, daß die Antikörper-Antigen-Komple- und gibt eine Reihe von Reflektivitätskurven wieder, bei ·:} xierungsreaktion stattfindet wenn ein Antigen an einer denen die relative Reflektivität als Funktion der Wellen-Ψ; Oberfläche absorbiert ist Die Komplexierungsreaktion 30 länge aufgetragen ist Die Kurve 93 repräsentiert die Κ an einer Oberfläche ist mittels Eilipsometers beobachtet Reflektivität von Goldmetall. Die Kurve 94 gibt die Re-Il worden. Ein Eilipsometer ist ein komplexes, speziell zur flektivität von Goldmetall wieder, das eine monomole-'. Bestimmung der Elliptizität polarisierten Lichtes kulare Proteinschicht aufweist Kurve 95 zeigt die Re-'< brauchbares optisches Instrument, mit dessen Hilfe man flektivität von Goldmetall mit einer bimolekularen Pro-■ Filmdicken in der Größenordnung von 0,1 A messen 35 teinschicht darauf. Ein Goldsubstrat, wie 91, hat in Überkann. Eilipsometer sind teuer und erfordern ausgebilde- einstimmung mit Kurve 93, die leuchtend gelbe Farbe ': tes Bedienungspersonal. Bei Untersuchungen immuno- des Goldmetalles. Wird die Testproteinschicht 92 auf ; logischer Reaktionen unter Verwendung von Ellipso- das Substrat 91 aufgebracht, dann hat die Testplatte . meiern, soweit sie bisher durchgeführt wurden, verwen- gemäß Kurve 94 ein dunkelgelbes Aussehen. Nachdem dete man zwei Verfahren. Nach dem einen Verfahren 40 die Testplatte einer Lösung ausgesetzt worden ist in der : ließ man die zu untersuchende Reaktion ablaufen und man das mit dem Protein der Schicht 92 immunologisch ordnete dann den Objektträger, auf dem die Reaktion reagierende Protein vermutet, dann weist die Testplatte, iύ stattgefunden hatte, in einem Eilipsometer an, um die wenn ein solches spezifisch reagierendes Protein in der \A Filmdicke zu bestimmen. Bei dem anderen Verfahren Lösung vorhanden war eine Reflektivitätscharakterij^ wurde der Objektträger von vornherein im Ellipsome- 45 stik, wie sie in Kurve 95 gezeigt ist auf und die Platte hat γ\ ter befestigt und man beobachtete mit dem Ellipsome- deutlich grünes Aussehen.

j$ ter die sich mit dem Fortschreiten der immunologischen Nach bisher durchgeführten Versuchen haben die Jw Reaktion ändernde Filmdicke. Die Bestimmung der ab- Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung, die ein U soluten Dicke erfordert eine außerordentliche Sorgfalt Substrat mit Metallkügelchen und ein Goldsubstrat ver-)l Ist andererseits die Konzentration der Antikörper in der 50 wenden, die im allgemeinen brauchbarsten zu sein. Weil| Lösung gering, dann erfordert die Messung der relati- ter wurde festgestellt, daß diese Ausführungsformen un-Xf ven Dickenänderung, obwohl sie leichter durchzuführen terschiedliche Empfindlichkeiten haben in Abhängigkeit j£ ist als die Bestimmung der absoluten Dicke, eine lange von den Dicken der interessierenden Proteinfilme. Im S\j Zeit. Aus wirtschaftlichen Gründen ist daher der Nach- einzelnen weist die Ausführungsform mit einem Sub- || weis immunologischer Reaktionen auf einer Oberfläche 55 strat und Metallkügelchen die größte Empfindlichkeit ■■;: unter Verwendung eines Eilipsometers nicht für diagno- auf, wenn die Filmdicken unterhalb von etwa 200 A Hell stische Zwecke verwendet worden. gen. Das Goldsubstrat hat die größte Empfindlichkeit te Die vorliegende Erfindung schließt die Feststellung für Filme, die eine Dicke von 30 A übersteigen. uj ein, daß irgendein willkürlich ausgewähltes Protein sich In einem diagnostischen Verfahren, das mit der Vor-[| an einem Substrat nur in einer monomolekularen 60 richtung gemäß der vorliegenden Erfindung ausgeführt Jp Schicht absorbiert und d?9 ein spezifischer Antikörper worden ist wurden Glasobjektträger mit einer dünnen '*'- (oder Antigen) für ein solches willkürlich ausgewähltes Indiumschicht bedeckt und mit einer Goldschicht über-'h' Protein sich mit diesem unter Bildung einer bimolekula- schichtet Die Verwendung einer Indiumunterschicht ■' ren Proteinschicht auf dem Substrat verbinden wird. wai erforderlich, um die Adhäsion zwischen Glas und :;.j Es ist daher Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ei- 65 Gold zu verbessern. Es wurde weiter festgestellt, daß t · ne verbesserte Vorrichtung für den Nachweis immun- die Diffusion des Indiums in die darüberliegende GoId- |; ologischer Reaktionen zu schaffen, die auf einer Ober- schicht die optischen Charakteristiken der Testobjekt-M, fläche stattfinden. träger verbesserte.

Die so vorbereiteten Objektträger wurden mit einer monomolekularen Schicht des mit der Hepatitis verbundenen Antigens bedekt Proben menschlichen Blutes, die auf die Anwesenheit von Hepatitis zu untersuchen waren, wurden durch Einmischen einer Menge gegenüber dem mit der Hepatitis verbundenen Antigen zubereitet, wobei eine ausreichende Menge der Antiköper verwendet wurde, um immunologisch aus der Mischung entfernt zu werden, wenn das mit der Hepatitis verbundene Antigen in der Probe vorhanden ist Dann wurden die Testobjektträger in die so vorbereiteten Blutproben eingetaucht Nach dem Herausnehmen wiesen die in die Hepatitis-negativen Proben eingetauchten Objektträger eine bimonokulare Proteinschicht auf, die das zuerst aufgebrachte mit der Hepatitis verbundene Antigen umfaßten und eine zweite Schicht von Antikörpern gegenüber dem mit der Hepatitis verbundenen Antigen, die immunologisch damit verbunden waren, wie ein grüngefärbter Streifen auf dem Objektträger zeigt Die-Objektträger, die in Hepatitis-positive Proben eingetaucht waren, bleiben ihre ursprüngliche dunkelgelbe Färbung bei, und dies zeigt an, daß nur die monomolekulare Schicht aus mit der Hepatitis verbundenem Antigen auf dem Objektträger vorhanden war, während die in die Probe eingebrachten Antikörper durch Komplexbildung mit dem darin enthaltenen Antigen aus der Probe ausgefallen waren und nicht mehr mit dem Antigen auf dem Testobjektträger reagieren konnte.

Es zeigt sich, daß der oben beschriebene Test ein Inhibitionstest ist In einem anderen diagnostischen Verfahren wurde ein direkter Test mit einer Vorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung durchgeführt Bei dem direkten Test wurden Objektträger aus Glas-Indium-Gold und wie oben beschrieben vorbereitet und dann mit einer monomolekularen Schicht aus Antikörpern gegenüber dem mit der Hepatitis verbundenen Antigen beschichtet Einige der Objektträger wurden dann in Serum eingetaucht daß von hepatitispatienten entnommen war und von dem man daher wußte, daß es das mit der Hepatitis verbundene Antigen enthält Andere Objektträger wurden in Serumproben eingetaucht von denen man wußte, daß sie frei sind von dem mit der Hepatitis verbundenen Antigen. Wie erwartet wiesen die in das Hepatitisserum eingetauchten Objektträger eine bimolekulare Proteinschicht auf, während die in das Hepatitisfreie Blut eingetauchten Objektträger nur eine monomolekulare Schicht aufwiesen.

Theoretisch ist der eben beschriebene direkte Test das bevorzugte diagnostische Verfahren sowohl wegen seiner relativen Einfachheit als auch weil in diesem Falle der direkte Test eine höhere Empfindlichkeit hat als der Inhibitionstest Die höhere Empfindlichkeit des direkten Tests resultiert aus der Tatsache, daß die mit der Hepatitis verbundenen Antigenmoleküle sehr viel größer sind als die Moleküle des Antikörpers gegenüber dem mit der Hepatitis verbundenen Antigen. Daher bewirkt der direkte Test eine sehr viel größere prozentuale Änderung der Filmdicke und demgemäß ist ein größerer Kontrast beobachtbar.

Die Konzentration des mit der Hepatitis verbundenen Antigens im Blut einer Person, die der Krankheit ausgesetzt ist ist eine Funktion der Zeit Die Konzentration des Hepatitisantigens ist sehr hoch, während der klinischen und unmittelbar vor klinischen Phasen der Hepatitis. In den weit nachklinischen Phasen ist die Konzentration des Hepatitisantigens im Blut einer Person jedoch sehr gering. Beide Zustände sind medizinisch von Interesse. Der Nachweis des Antigens während der klinischen und unmittelbar vorklinischen Phasen ist für Diagnosezwecke wertvoll. Der Nachweis des Antigens in der weit nachklinischen Phase ist für die Untersuchung des Blutes von in Aussicht genommenen BIm-Spendern wertvoll. Der einfachere empfindliche direkte Test ist daher für diagnostische Zwecke bevorzugt, da er leicht durchgeführt werden kann, wegen der relativ hohen Konzentration des Hepatitisantigens in der Blutprobe.

Der für Überprüfungszwecke beschriebene Inhibitionstest ist experimentell ausgewertet worden, um seinen Wert relativ zu anderen bekannten Überprüfungstests zu bestimmen. In diesen Tests wurde das Hepatitispositive Serum mit bekanntem Hepatitis-negativem Se- rum verdünnt. Unter Anordnung der oben beschriebenen Inhibitionsprozedur führt eine Verdünnung eines Teiles Hepatitis-positiven Serums mit 32 Teilen bekannten Hepatitis-negativem Serum zu einem zuverlässigen Nachweis während einer Stunde. Die Anwendung einer Verdünnung eines Teiles Hepatitis-positiven Serums mit 3000 Teilen bekannt negativem Serums, ergab einen zuverlässigen Nachweis während 24 Stunden. Diese Ergebnisse erweisen sich als sehr ähnlich in der Empfindlichkeit bzw. der erforderlichen Zeit wie das bekannte Verfahren der Gegenelektrophorese bzw. der Radioimmunisierung. Ein Uberprüfungsverfahren mit der Vorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung ergibt also Resultate, die vergleichbar sind mit den besten nach bekannten Verfahren erhältlichen, wobei ein zusätzii eher Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens der ei nes beträchtlich billigeren Verfahrens ist.

Die bevorzugte Verwendung eines goldbeschichteten Substrates gegenüber einem mit Metallkügelchen beschichteten Substrat bei dem vorbeschriebenen diagno- stischen Hepatitis-Verfahren ist durch den Durchmesser der Hepatitis-Antigenmoleküle bedingt, der bei etwa 210 Ä liegt. Solche Filmdicken liegen gut im Bereich der Möglichkeiten goldbeschichteter Substrate, um eine empfindliche Anzeige zu geben, doch sind sie zu dick für eine hochempfindliche Anzeige unter Verwendung mit Metallkügelchen beschichteten Substrats.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1. Vorrichtung zum Bestimmen der Anwesenheit oder Abwesenheit eines spezifischen Proteins in einer biologischen Probe durch einfaches Betrachten, um festzustellen, ob eine oder zwei Proteinschichten auf dem Substrat vorhanden sind, bestehend aus einem Substrat, das mit einem Goldüberzug versehen ist, an dem ein mit dem genannten spezifischen Protein spezifisch reagierendes Protein haftet, nach Patent2330702, gekennzeichnet durch ein weiteres Metall zur Verbesserung der Haftung zwischen dem Goldüberzug und dem Substrat

2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das andere Metall unter Bildung einer Legierung in das Gold diffundiert, wodurch die Empfindlichkeit der Vorrichtung erhöht wird.