DE3787706T2 - Verfahren zur quantitativen Bestimmung der Antigene und Antikörper. - Google Patents

Verfahren zur quantitativen Bestimmung der Antigene und Antikörper.

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Description

  • Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Antigenen oder Antikörpern. Genauer betrifft sie ein Verfahren zur quantitativen Analyse eines Antigens (oder eines Antikörpers), das dadurch gekennzeichnet ist, daß man das Antigen (oder den Antikörper) mit einem Antikörper (oder Antigen), welcher (bzw. welches) auf einen unlöslichen Träger aus Teilchen mit einer feinen Größe aufgebracht ist, Licht auf den resultierenden Antigen-Antikörper-Komplex aufstrahlt, reagieren läßt und dessen Absorption bei einer spezifischen Wellenlänge mißt, insbesondere ein Verfahren, das die Menge des Antigens oder Antikörpers in Proben, die lebenden Körpern entnommen worden sind, einfach und mit hoher Empfindlichkeit messen kann.
  • Auf dem Gebiet der Medizin war die Messung der Konzentration von Antigenen oder Antikörpern in Proben, die dem lebenden Körper entnommen wurden, jüngst ein wichtiger Faktor für die Diagnose von Krankheiten. Insbesondere bestand ein großer Bedarf nach der Entwicklung eines hochempfindlichen Verfahrens zur quantitativen Analyse dieser Komponenten, die in Proben (z. B. dem Blut) in geringen Mengen vorhanden sind, wie beispielsweise das CRP (C-reaktives Protein), das eine akute reaktive Substanz ist und AFP (α- Fetoprotein) das ein Tumormarker ist.
  • Das Verfahren, das herkömmlicherweise zur quantitativen Analyse von Antigenen und Antikörpern verwendet wurde, umfaßt Dispergieren von Latexteilchen eines Trägers, der einen Antikörper (oder ein Antigen) trägt, in einem Lösungsmittel, das Reagierenlassen des Antigens (oder Antikörpers) mit den Teilchen und das Messen der Erhöhung der Trübung (oder Absorption) der Dispersion, welche durch die Antigen-Antikörper-Reaktion bei einer Wellenlänge im Bereich von 600 bis 2400 nm hervorgerufen wurde, wodurch die Menge des Antigens (oder Antikörpers) bestimmt wurde (ungeprüfte japanische Patentpublikation Nr 11575/1983).
  • Ein anderes Verfahren wurde jüngst entwickelt, bei dem man eine Dispersion, die agglutinierte Latexteilchen, die aus einer Antigen-Antikörper-Reaktion stammen, in einen bedeckten Fließstrom gibt, um einen Fluß von einzelnen Stücken der Agglomerate zu erzeugen und das Ausmaß der Agglutination mittels des Verfahrens der Lichtstreuung unter Verwendung eines Laserstrahls als Lichtquelle analysiert, wodurch das Antigen (oder der Antikörper) bestimmt wird (Shimadzu review, 1986, 43, 4, 81).
  • Ein anderes Verfahren, das auch auf der Lichtstreuung beruht, ist in dem U.S. Patent Nr. 4 174 952 beschrieben.
  • Jedoch besitzen die vorstehend erwähnten Verfahren die folgenden Nachteile.
  • Bei dem vorstehenden Verfahren ist die Absorptionsveränderung infolge der Latexagglutination sehr gering, verglichen mit der Absorption der Latexdispersion selbst. Wenn versucht wird, die Veränderung der Absorption durch geeignete Auswahl der Wellenlänge zur Messung zu erhöhen, neigt die Absorption der Latexdispersion selbst auch zur Erhöhung. Daher ist es schwierig, den Endpunktassay (Subtraktion der Absorption der Latexdispersion selbst von der Absorption, die eine ausreichende Zeitspanne nach Beginn der Reaktion gemessen wird) anzunehmen, und der Zweipunktassay (Messen der Veränderung der Absorption bei zwei Punkten zu vorgeschriebenen Zeitspannen nach Beginn der Antigen-Antikörper-Reaktion) oder der Geschwindigkeitsassay (Messung der Geschwindigkeit der Absorptionsveränderung) müssen verwendet werden. Als Ergebnis muß ein automatisierter Analysator verwendet werden, der automatisch die Arbeitsschritte von der Proben- und Reagenzpipettierung bis zur Absorptionsmessung kontrolliert. Zusätzlich benötigt der vorstehende Zweipunktassay eine große Menge an teurem Latexreagenz, weil eine niedrigere Latexkonzentration zu einer niedrigeren Agglutinationsgeschwindigkeit und niedrigeren Empfindlichkeit führt.
  • Ein weiteres Problem im Zusammenhang mit diesem Verfahren ist die Tatsache, daß die Absorptionsveränderung nicht durch den Grad der Latexagglutination allein bestimmt wird, weil die Absorption sowohl von der Anzahl als auch der Größe der enthaltenen Teilchen abhängt. Wie in Fig. 13 gezeigt, sind Fälle bekannt, in denen trotz Fortschreiten der Latexagglutination mit Erhöhung der Antigenkonzentration die Absorption abzunehmen beginnt, wenn die Konzentration einen bestimmten Spiegel erreicht. Große Fehler sind in diesen Fällen unvermeidbar.
  • Diese Nachteile wurden in dem zuletzt genannten Verfahren (das Verfahren der Lichtstreuung) vermieden; das Ergebnis der Messung hängt nur vom Grad der Latexagglutination ab, und der Endpunktassay kann angenommen werden, die Latexagglutination schreitet fort und die Empfindlichkeit wird mit zunehmender Reaktionszeit höher und die Empfindlichkeit bleibt hoch, selbst wenn die Latexkonzentration vermindert ist. Jedoch liegt das Problem darin, daß eine aufwendige Apparatur verwendet werden muß, weil der Fließkanal die Struktur eines umhüllten Flusses haben muß und weil ein Laserstrahl als Lichtquelle verwendet werden muß, um das von den einzelnen Teilchen gestreute Licht zu detektieren.
  • Bei dem Lichtbrechungsverfahren, das in der U.S. 4 174 952 beschrieben ist, werden die erheblichen Hintergründe auf die Tatsache zurückgeführt, daß bei diesem Verfahren die Streuintensität sowohl von dem Durchmesser der Teilchen als auch ihrer Anzahl abhängt.
  • Die vorliegende Erfindung wurde unter solchen Umständen durchgeführt, um ein einfaches Verfahren zur Messung der Konzentration eines Antigens (oder eines Antikörpers) durch eine Art Endpunktassay unter Verwendung eines vielseitigen Spectrophotometers bereitzustellen, ohne daß irgendeine aufwendige Apparatur verwendet werden muß und ohne daß das Meßverfahren sowohl von dem Durchmesser als auch von der Anzahl der Teilchen abhängt.
  • Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung eines Antigens oder Antikörpers, bei dem man eine zu testende, ein Antigen oder einen Antikörper enthaltende Probe mit einer Dispersion eines unlöslichen Trägers aus Teilchen feiner Größe, an den ein Antikörper oder ein Antigen gebunden ist, versetzt, um eine Antigen-Antikörper- Reaktion hervorzurufen, dadurch gekennzeichnet, daß man weiter die Absorption des Reaktionsgemisches Aλ&sub1; und Aλ&sub2; bei zwei verschiedenen Wellenlängen λ&sub1; und λ&sub2;, die so ausgewählt sind, daß die Wellenlängendifferenz zwischen λ&sub1; und λ&sub2; im Bereich von 300 nm bis 600 nm liegt, mißt und die Konzentration des Antigens oder Antikörpers in der Probe von dem Absorptionsverhältnis Aλ&sub1;/Aλ&sub2; berechnet.
  • Die vorliegende Erfindung beruht auf der neu gefundenen Tatsache, daß das Absorptionsverhältnis zwischen zwei verschiedenen Wellenlängen Aλ&sub1;/Aλ&sub2; eine Funktion des mittleren Durchmessers der in der Dispersion suspendierten Teilchen ist. Der Grad des Wachstums des mittleren Teilchendurchmessers infolge der Agglutination des unlöslichen Trägers entspricht der Konzentration des Antigens (oder Antikörpers) in der Probe; daher kann die Menge an Antigen (oder Antikörper) einfach durch den Wert des Absorptionsverhältnisses Aλ&sub1;/Aλ&sub2; bestimmt werden.
  • Ein anderer Vorteil dieses Verfahrens ist die Tatsache, daß der Endpunktassay gewählt werden kann, weil dieses Verhältnis kaum durch die kleine Veränderung der Teilchenkonzentration in der Probenlösung beeinflußt wird und von der Veränderung der relativen Teilchengröße bei den beiden Wellenlängen abhängt.
  • So kann eine quantitative Bestimmung eines Antigens (oder eines Antikörpers) unter Verwendung der Agglutination des unlöslichen Trägers, welcher durch eine Antigen-Antikörper-Reaktion hervorgerufen wurde, einfach unter Verwendung eines vielseitigen Spectrophotometers durchgeführt werden, wodurch die Notwendigkeit einer aufwendigen Apparatur für die automatische Messung der Absorptionsgeschwindigkeitsveränderungen oder einer Spezialapparatur unter Verwendung eines abgedeckten Flusses und der Laserstrahl-Streutechnik beseitigt wird.
  • Zusätzlich kann eine hochempfindliche und kostengünstige quantitative Analyse, die mit herkömmlichen Verfahren nicht zu erwarten ist, durch geeignete Auswahl der Kombination der Meßwellenlängen λ&sub1; und λ&sub2;, der Teilchengröße des unlöslichen Trägers, der Teilchenkonzentration in der Dispersion, der Reaktionszeit und anderer Faktoren (Zelllänge, etc.) erzielt werden.
  • Fig. 1 ist eine graphische Darstellung für das Absorptionsverhältnis bei verschiedenen Wellenlängen zu dem bei 1000 nm, gemessen mit verschiedenen Latexdispersionen mit unterschiedlichen mittleren Durchmessern der Latexteilchen.
  • Fig. 2 zeigt die Beziehung zwischen A&sub3;&sub4;&sub0;/A&sub1;&sub0;&sub0;&sub0;, A&sub5;&sub0;&sub0;/- A&sub1;&sub0;&sub0;&sub0; und A&sub6;&sub0;&sub0;/A&sub1;&sub0;&sub0;&sub0; gegen den Durchmesser der Latexteilchen. Die Fig. 3, 4 und 5 zeigen graphische Darstellungen, die die Beziehung zwischen der Absorption bei verschiedenen Wellenlängen, den Absorptionsverhältnissen (A&sub5;&sub0;&sub0;/A&sub1;&sub0;&sub0;&sub0; und A&sub6;&sub0;&sub0;/A&sub1;&sub0;&sub0;&sub0;) und dem mittleren Teilchendurchmesser nach der Latexagglutinationsreaktion gegen die jeweilige CRP-Konzentration zeigen.
  • Fig. 6 zeigt eine graphische Darstellung, die die Wirkung der Reaktionszeit für die Beziehung zwischen der Absorption für verschiedene Wellenlängen gegen die CRP-Konzentration, zeigt.
  • Die Fig. 7, 8 und 9 zeigen graphische Darstellungen, die die Wirkung der Latexkonzentration bei verschiedenen Reaktionszeiten für das Verhältnis zwischen Absorption, Absorptionsverhältnis bzw. mittleren Teilchendurchmesser gegen die CRP-Konzentration zeigen.
  • Fig. 10 ist eine graphische Darstellung, die die Wirkung des Unterschieds zwischen zwei Wellenlängen für die Beziehung zwischen dem Absorptionsverhältnis bei verschiedenen Reaktionszeiten gegen die CRP-Konzentration zeigt.
  • Fig. 11 zeigt eine graphische Darstellung, die die Beziehung zwischen der Konzentration an AFP gegen das Absorptionsverhältnis zwischen zwei verschiedenen Wellenlängen zu verschiedenen Reaktionszeiten erläutert.
  • Fig. 12 erläutert die Beziehung zwischen den Veränderungen im Absorptionsverhältnis wie in Fig. 11 gezeigt und der AFP-Konzentration.
  • Fig. 13 zeigt graphische Darstellungen, die die Beziehung zwischen der Veränderung in der Absorption gegen die Veränderung in dem mittleren Teilchendurchmesser, welche durch die Agglutinationsreaktion in einem Modellfall hervorgerufen wurde, zeigen.
  • Die Antigene und Antikörper, die mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens gemessen werden können, umfassen solche, die in Proben, die lebenden Körpern entnommen wurden, vorkommen können. Erläuternde Beispiele umfassen Albumin, Feritin, AFP, β&sub2;-Microglobulin, Myoglobin, CRP, ASO, RF&sub1; FDP, hCG, hPL, CEA, Fibrinogen und Gonadotropin (Antigene) und die Immunglobuline A, E, D, G und M und γ-Globulin (Antikörper).
  • Die unlöslichen Träger aus Teilchen mit einer feinen Größe, die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet wurden, sind solche Materialien, die in dem verwendeten Dispersionsmedium unlöslich sind und die die Antigene oder Antikörper fixieren können. Diese umfassen Polystyrol, carboxyliertes Polystyrol, Polymethylstyrole, Styrol-Butadiencopolymere, carboxylierte Styrol-Butadiencopolymere, und Poly(meth)acrylate. Bevorzugte Dispersionsmedien sind wäßrige Medien, wie Wasser, Salzlösungen und Pufferlösungen.
  • Der an dem unlöslichen Träger zu fixierende Antikörper bzw. Antigen wird so ausgewählt, daß eine wirksame Antigen-Antikörper-Reaktion mit dem zu messenden Antigen oder Antikörper stattfindet. Die Fixierung dieses Antikörpers oder Antigens an den unlöslichen Träger kann nach irgendwelchen bekannten Verfahren durchgeführt werden: beispielsweise durch Zugabe des Antikörpers oder Antigens zu einer Dispersion des unlöslichen Trägers und Rühren des Gemisches für eine bestimmte Zeit, um die Adsorption (sogenanntes Adsorptionsverfahren) zu bewirken; oder Zugabe des Antikörpers (oder Antigens) und eines Kupplungsreagenzes zu einer Dispersion eines unlöslichen Trägers der Carboxylgruppen trägt und Rühren des Gemisches für eine bestimmte Zeitspanne, um die Fixierungsreaktion zu beenden (sogenanntes Verfahren der covalenten Bindung).
  • Der Teilchendurchmesser des unlöslichen Trägers sollte bevorzugt im Bereich von 0,05 bis 1,0 um, ausgedrückt als Absorptionsmeßbereich (üblicherweise 2 ABS oder niedriger) liegen und im Bereich von 0,1 bis 0,2 um, wenn eine Messung mit hoher Empfindlichkeit beabsichtigt ist. Die geeignete Konzentration des unlöslichen Trägers in der Dispersion ist derart, daß die Absorption bei 500 nm unter 2 ABS liegt und sollte bevorzugt im Bereich von 1 bis 100 mg/l für Messungen mit hoher Empfindlichkeit liegen.
  • Solche Dispersionen von Trägern, die einen daran gebundenen Antikörper (oder ein Antigen) wie vorstehend beschrieben, enthalten, sind im Handel erhältlich und können vorteilhafterweise für den Zweck dieser Erfindung verwendet werden.
  • Üblicherweise kann die Antigen-Antikörper-Reaktion durch Zugabe einer Testprobe (beispielsweise Serum, Plasma, Lymphocyten und Urin) zu einer Dispersion eines unlöslichen Trägers, wie vorstehend beschrieben, und durch Rühren des Gemisches oder Stehenlassen für eine bestimmte Zeit durchgeführt werden. Das geeignete Volumen der zuzusetzenden Testprobe beträgt etwa 1/5 bis 1/20 dessen der Dispersion. Eine Reaktionszeit von etwa 30 Minuten reicht üblicherweise aus, aber sollte bevorzugt für Messungen mit hoher Empfindlichkeit länger sein; 0,5 bis 2 Stunden, wenn die Konzentration des unlöslichen Trägers im Bereich von 1 bis 100 mg/l liegt. Die Temperatur hat keinen meßbaren Effekt auf die Reaktion, aber liegt bevorzugt im Bereich von 25 bis 37ºC angesichts der Tatsache, daß Proben, die lebenden Körpern entnommen wurden, gehandhabt werden.
  • Eine höhere Empfindlichkeit kann erzielt werden, wenn die zwei bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Wellenlängen voneinander weiter entfernt sind. Da jedoch die Absorption mit abnehmender Wellenlänge zunimmt und bei niedrigen Wellenlängen nicht gemessen werden kann, sollten die optimalen Wellenlängen in Abhängigkeit von der Größe und der Konzentration der Teilchen und dem Konzentrationsbereich des Antigens (oder Antikörpers), das gemessen werden soll, ausgewählt werden. Bei der tatsächlichen Praxis ist es bevorzugt, daß zwei Wellenlängen, λ&sub1; und λ&sub2;, innerhalb der sichtbaren und nahen Infrarotregionen üblicherweise innerhalb des Bereiches von 330 bis 1000 nm ausgewählt werden. Innerhalb des vorstehend definierten Bereiches wird eine um so höhere Empfindlichkeit erzielt, je größer der Unterschied zwischen λ&sub1; und λ&sub2; ist. Für eine Messung mit hoher Empfindlichkeit ist insbesondere ein Wellenlängenunterschied im Bereich von 300 bis 600 nm am bevorzugtesten.
  • Eine höhere Empfindlichkeit kann für eine kürzere verwendete Zellenlänge für die Absorptionsmessung erzielt werden, weil ein größerer Unterschied zwischen den zwei Wellenlängen angenommen werden kann, aber die Länge sollte bevorzugt im Bereich von 0,5 bis 1 cm ausgedrückt als S/N- Verhältnis liegen.
  • Die Konzentration des Antigens (oder Antikörpers) in einer Testprobe kann von dem Absorptionsverhältnis Aλ&sub1;/Aλ&sub2; (berechnet von den Absorptionswerten, die bei λ&sub1; und gemessen werden) unter Verwendung einer Kalibrationskurve, die zuvor unter Verwendung schrittweiser Verdünnungen einer Antigen-(oder Antikörper)-Lösung bekannter Konzentration aufgestellt wurde, bestimmt werden.
    • TEST UND BEISPIELE Test
  • In diesem Test wurden sechs Latices unterschiedlichen Teilchendurchmessers wie nachstehend aufgeführt (MISCELLANEOUS POLYSTYRENE SPHERES; Produkte von Duke Scientific Corporation) verwendet. Kat. Nr. Latex Mittlerer Durchmesser (um) Standard Abweichung Ungefähre Anzahl pro Packung (5 ml) Polystyrolkugeln-Butadienkugeln
  • Für jeden der obigen sechs Latices wurden fünf Verdünnungsstufen mit Wasser hergestellt (für Katalog Nr. 110, vorläufige Verdünnung 1 : 21, anschließende weitere Verdünnung 1 : 1, 1 : 2, 1 : 3, 1 : 4 und 1 : 5; und für die anderen fünf Latices vorläufige Verdünnung 1 : 101, anschließende Weiterverdünnung 1 : 1, 1 : 2, 1 : 3, 1 : 4 und 1 : 5). Die Absorption wurde für jede der so hergestellten Verdünnungen bei verschiedenen Wellenlängen im Bereich von 340 nm bis 1000 nm gemessen und das Verhältnis der Absorption bei variierenden Wellenlängen zu der bei 1000 nm (Aλ/A&sub1;&sub0;&sub0;&sub0;) wurde berechnet und gegen die Wellenlänge aufgetragen. Das Ergebnis ist in Fig. 1 gezeigt. Jeder der Werte des Verhältnisses Aλ/A&sub1;&sub0;&sub0;&sub0;, die in dieser Figur gezeigt sind, ist der Durchschnitt der Werte für fünf Verdünnungen unterschiedlicher Konzentrationen (n = 5). Die Absorption bei jeder Wellenlänge nahm zu, wenn die Latexkonzentration zunahm, aber das Verhältnis Aλ/A&sub1;&sub0;&sub0;&sub0; blieb praktisch konstant. Beispielsweise betrug das Verhältnis Aλ/A&sub1;&sub0;&sub0;&sub0; für den Latex mit einem mittleren Teilchendurchmesser von 0,260 um 14,78-15,29, 7,22-7,63, 4,22-4,51, 2,78-2,97, 1,78 -2,03 und 1,33-1,41 für λ = 500, 600, 700, 800 bzw. 900 nm. Ferner betrug das Verhältnis Aλ/A1000 für den Latex mit einem mittleren Teilchendurchmesser von 0,804 um 3,40 -3,61, 2,88-3,08, 2,44-2,35, 1,88-1,93, 1,51-1,54 bzw. 1,23-1,24.
  • Die Fig. 2 zeigt das Verhältnis zwischen A&sub3;&sub4;&sub0;/A&sub1;&sub0;&sub0;&sub0;, A&sub5;&sub0;&sub0;/A&sub1;&sub0;&sub0;&sub0; und A&sub6;&sub0;&sub0;/A&sub1;&sub0;&sub0;&sub0; gegen den Teilchendurchmesser auf der Grundlage der in Fig. 1 gezeigten Daten. Es ist offensichtlich, daß der Wert des Absorptionsverhältnisses mit zunehmendem Teilchendurchmesser in jedem Fall sich erhöht.
  • Das in diesem Test erhaltene Ergebnis legt nahe, daß bei der Agglutinationsreaktion des Trägers, der einen Antikörper (oder ein Antigen) trägt, das Ausmaß der Agglutination mit steigender Konzentration des zugesetzten Antigens (oder Antikörpers) zunimmt, was zu einer Erhöhung des mittleren Teilchendurchmessers und zu einer Abnahme des Absorptionsverhältnisses Aλ/A&sub1;&sub0;&sub0;&sub0; führt und daß die Konzentration des Antigens (oder Antikörpers) nach diesem Verfahren bestimmt werden kann.
  • Es wurde auch gefunden, daß je kleiner der Teilchendurchmesser des einen Antikörper (oder ein Antigen) tragenden Latex ist, umso größer die Veränderung des Wertes Aλ/A&sub1;&sub0;&sub0;&sub0; nach der Agglutination sein wird. Dies bedeutet, daß die Verwendung eines Latex mit einem kleineren Teilchendurchmesser eine hochempfindliche Messung für Proben mit niedrigerer Antigen-(oder Antikörper)Konzentration erlaubt und somit den Konzentrationsmeßbereich an Antigen (oder Antikörper) erweitert, weil ein weiterer Bereich an Teilchendurchmessern vorliegt, bei dem dessen Veränderungen gemessen werden können.
  • Zusätzlich wurde auch gezeigt, daß je größer der Unterschied zwischen den zwei Wellenlängen, die zur Messung verwendet werden, ist, umso größer die Veränderungen in dem Absorptionsverhältnis sind; das heißt die Wahl von zwei Wellenlängen, die voneinander weiter getrennt sind, erzielt eine hochempfindliche Messung für Proben mit niedrigerer Antigen-(oder Antikörper)Konzentration.
    • Beispiel 1
  • Ein Polystyrollatex (Teilchendurchmesser: etwa 0,2 um) mit einem daran gebundenen CRP-Antiserum (Cellatestam M, CRP- Latexreagenz; Produkt von Hitachi Chemical Co., Ltd.) wurde 1 : 15 mit einer Pufferlösung (Cellatestam M, CRP-Verdünnungsmittel; Produkt von Hitachi Chemical Co., Ltd.) verdünnt. 1500 ul dieser verdünnten Dispersion ließ man mit 12 ul eines Standardserums, das eine bekannte Menge an CRP enthielt, bei 37ºC 90 Minuten lang reagieren und die Absorption wurde bei unterschiedlichen Wellenlängen (Zelllänge: 1 cm) gemessen. Die Tabelle 1 zeigt die Daten bei 500, 600, 700 und 1000 nm und die Absorptionsverhältnisse A&sub5;&sub0;&sub0;/A&sub1;&sub0;&sub0;&sub0; und A&sub6;&sub0;&sub0;/A&sub1;&sub0;&sub0;&sub0;. Tabelle 1 CRF-Konz. (mq/dl)
  • Die Fig. 3 zeigt die Beziehung zwischen der Absorption bei unterschiedlichen Wellenlängen und der CRP-Konzentration (Kalibrationkurven bei dem herkömmlichen Verfahren). In dieser Figur werden Streuungen in den gemessenen Werten infolge von Streuungen in der Menge der zugesetzten Latices beobachtet. Zusätzlich ist die Absorptionsveränderung bezogen auf die CRP-Konzentration für A&sub5;&sub0;&sub0; groß, was eine hohe Empfindlichkeit anzeigt, aber der Absorptionswert erreicht ein Maximum und beginnt bei einem bestimmten Grad der CRP-Konzentration abzunehmen. Keine solche Umkehrung der Kurve wird für A&sub1;&sub0;&sub0;&sub0; beobachtet, aber die Veränderung der Absorption ist gering (niedrige Empfindlichkeit) und das S/N-Verhältnis ist auch niedrig bei niedrigen Konzentrationen (insbesondere 1 mg/dl oder weniger).
  • Die Fig. 4 zeigt Kalibrationskurven, die die Beziehung zwischen den Absorptionsverhältnissen A&sub5;&sub0;&sub0;/A&sub1;&sub0;&sub0;&sub0; und A&sub6;&sub0;&sub0;/A&sub1;&sub0;&sub0;&sub0; gegen die CRP-Konzentration erläutern (typische Fälle dieser Erfindung). Die Veränderung des Absorptionsverhältnisses ist in den niedrig-konzentrierten Bereichen (hohe Empfindlichkeit) groß und irgendeine Umkehrung der Kurve, wie in Fig. 3 beobachtet, tritt nicht ein, unabhängig davon, wie hoch die CRP-Konzentration sein mag. Zusätzlich wird keine Streuung der gemessenen Werte infolge von Streuungen der Mengen der zugesetzten Latices in diesem Falle beobachtet, weil die Messung des Absorptionsverhältnisses bei zwei verschiedenen Wellenlängen die Streuung in jeder Absorption beseitigt.
  • Fig. 5 zeigt das Verhältnis zwischen dem mittleren Durchmesser des Antigen-Antikörper-Komplexes (agglutinierte Teilchen) erhalten aus der Kurve der Fig. 2 (A&sub6;&sub0;&sub0;/A&sub1;&sub0;&sub0;&sub0;) gegen die CRP-Konzentration. Dies zeigt klar, daß das erfindungsgemäße Verfahren ein einfaches und nützliches Verfahren zur quantitativen Bestimmung niedrig-konzentrierter Antigene und Antikörper auf der Grundlage der Latexagglutination bereitstellt.
    • Beispiel 2
  • Der Polystyrollatex, an den CRP-Antiserum gebunden ist, der in Beispiel 1 verwendet wurde, wurde auf verschiedene Konzentrationen verdünnt. Jede der so erhaltenen Verdünnungen ließ man mit einem Standardserum, das eine bekannte Menge an CRP enthielt, bei 37ºC 30 Minuten lang und 90 Minuten lang reagieren, und die Absorption wurde bei zwei unterschiedlichen Wellenlängen (Zellänge: 1 cm) gemessen. Die Tabelle 2 zeigt die Daten bei 340, 500, 600 und 1000 nm und die Absorptionsverhältnisse A&sub3;&sub4;&sub0;/A&sub1;&sub0;&sub0;&sub0;, A&sub5;&sub0;&sub0;/A&sub1;&sub0;&sub0;&sub0; und A&sub6;&sub0;&sub0;/A&sub1;&sub0;&sub0;&sub0;. Tabelle 2 Latex-Verdünnungsverhältnis CRP-Konzentration (mg/dl) Reaktionszeit (min) Absorption Absorptionsverhältnis Latex-Verdünnungsverhältnis CRP-Konzentration (mg/dl) Reaktionszeit (min) Absorption Absorptionsverhältnis
  • Fig. 6 zeigt das Verhältnis zwischen der CRP-Konzentration und Aλ bei einem Verdünnungsverhältnis von 1/2 bezogen auf die in Tabelle 2 gezeigten Daten (Kurven für das herkömmliche Verfahren, bei dem die Absorption nur bei einer Wellenlänge gemessen wird). Es geht aus der Figur klar hervor, daß bei niedrigeren Wellenlängen die Absorption exzessiv hoch ist und in extremen Fällen kaum gemessen werden kann, und eine Umkehrung der Kurven, wie in Fig. 13 beobachtet wurde, findet statt.
  • Fig. 7 zeigt die Beziehung zwischen der CRP-Konzentration gegen die Absorption bei 600 nm (A&sub6;&sub0;&sub0;) bei verschiedenen Verdünnungsverhältnissen, bezogen auf die in Tabelle 2 gezeigten Daten. Aus dieser Figur geht hervor, daß bei Messung der Konzentration eines Antigens (oder Antikörpers) aus der Absorption bei einer Wellenlänge (herkömmliches Verfahren), die Empfindlichkeit bei abnehmender Latexkonzentration sich erniedrigt.
  • Fig. 8 zeigt die Wirkung des Latexverdünnungsverhältnisses, bezogen auf die Beziehung zwischen der CRP-Konzentration und A&sub5;&sub0;&sub0;/A&sub1;&sub0;&sub0;&sub0;. Wie aus der Figur hervorgeht, ist die Empfindlichkeit bei hohen CRP-Konzentrationen wegen der Sättigung der Agglutination niedrig, während sie bei niedrigen CRP-Konzentrationen ziemlich hoch bleibt. Dies ist auf die Tatsache zurückzuführen, daß die Veränderung des mittleren Teilchendurchmessers mit abnehmender Latexkonzentration, wie in Fig. 9 gezeigt, zunimmt. Der mittlere Teilchendurchmesser in Fig. 9 wurde aus den Werten A&sub6;&sub0;&sub0;/A&sub1;&sub0;&sub0;&sub0; in Tabelle 2 und der in Fig. 2 gezeigten Beziehung berechnet.
  • Dies zeigt, daß die Wahl niedriger Latexkonzentrationen zu keiner Verringerung der Empfindlichkeit führt, sondern eine hohe Empfindlichkeit erzielt, wenn eine ausreichend lange Reaktionszeit gewählt wird. Dies erklärt auch die Verringerung der Meßkosten, weil eine kleinere Menge des teuren Latexreagenzes verwendet wird.
  • Fig. 10 zeigt die Beziehung zwischen den Absorptionsverhältnissen A&sub3;&sub4;&sub0;/A&sub1;&sub0;&sub0;&sub0;, A&sub5;&sub0;&sub0;/A&sub1;&sub0;&sub0;&sub0; und A&sub6;&sub0;&sub0;/A&sub1;&sub0;&sub0;&sub0; gegen die CRP-Konzentration bei einem Latexverdünnungsverhältnis von 1/4, bezogen auf die in Tabelle 2 gezeigten Daten. Aus dieser Figur geht hervor, daß eine höhere Empfindlichkeit erzielt werden kann, wenn die zwei verwendeten Wellenlängen, λ&sub1; und λ&sub2; voneinander weiter entfernt sind.
    • Beispiel 3
  • Ein Polystyrollatex, an den ein Anti-AFP-Antikörper gebunden ist (Anti-AFP-Antikörper sensibilisierter Latex; Produkt von IATRON LABORATORIES, INC.) wurde 1 : 7 mit dessen Stabilisatorlösung (Produkt von IATRON) verdünnt. 1400 il dieser verdünnten Dispersion ließ man mit 50 il AFP-Lösungen unterschiedlicher Konzentrationen bei 37ºC 40 und 80 Minuten lang reagieren, und die Absorption wurde bei 400, 500, 600 und 1000 nm (A&sub4;&sub0;&sub0;, A&sub5;&sub0;&sub0;, A&sub6;&sub0;&sub0; und A&sub1;&sub0;&sub0;&sub0;) gemessen. Die Fig. 11 zeigt die Beziehung zwischen Aλ/A&sub1;&sub0;&sub0;&sub0; und der AFP-Konzentration und Fig. 12 zeigt die Beziehung zwischen der Veränderung in Aλ/A&sub1;&sub0;&sub0;&sub0; bezogen auf die AFP- Konzentration.
  • Es wurde gezeigt, daß AFP auch einfach und mit hoher Empfindlichkeit auf der Grundlage des Absorptionsverhältnisses zwischen zwei verschiedenen Wellenlängen bestimmt werden kann.
  • Die Reproduzierbarkeit der gemessenen Werte wurde für die Werte der Abnahme bezüglich A&sub6;&sub0;&sub0;/A&sub1;&sub0;&sub0;&sub0; untersucht. Das erhaltene Ergebnis betrug -0,26 im Mittelwert (entsprechend 26,9 ng/ml AFP) und 0,03 im Bereich (entsprechend 4,0 ng/ml AFP), was eine hohe Reproduzierbarkeit anzeigt.

Claims (7)

1. Verfahren zur quantitativen Bestimmung eines Antigens oder Antikörpers, bei dem man eine zu untersuchende, ein Antigen oder einen Antikörper enthaltende, Probe mit einer Dispersion eines unlöslichen Trägers aus Teilchen mit einer feinen Größe, an die ein Antikörper oder ein Antigen gebunden ist, versetzt, um eine Antigen-Antikörper- Reaktion hervorzurufen, dadurch gekennzeichnet, daß man weiterhin die Absorption des Reaktionsgemisches Aλ&sub1; und Aλ&sub2; bei zwei verschiedenen Wellenlängen λ&sub1; und λ&sub2;, die so ausgewählt sind, daß der Wellenlängenunterschied zwischen λ&sub1; und λ&sub2; im Bereich von 300 nm bis 600 nm liegt, mißt und die Konzentration des Antigens oder Antikörpers in der Probe aus dem Absorptionsverhältnis Aλ&sub1;/Aλ&sub2; berechnet.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der mittlere Teilchendurchmesser des Trägers 0,05 bis 1,0 um beträgt.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der mittlere Teilchendurchmesser 0,1 bis 0,2 um beträgt.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Dispersion den unlöslichen Träger in einer Konzentration von 1 bis 100 mg/l enthält, und daß die Antigen-Antikörper-Reaktion 0,5 bis 2 Stunden lang durchgeführt wird.
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Wellenlängen λ&sub1; und λ&sub2; aus dem Bereich von 330 nm bis 1000 nm ausgewählt werden.
6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das zu bestimmende Antigen Albumin, Ferritin, AFP, β2-Nicroglobulin, Myoglobin, CRP, ASO, RF, FDP, hCG, hPL, CEA, Fibrinogen oder Gonadotropin ist.
7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der zu bestimmende Antikörper Immunglobulin A, E, D, G oder M, oder γ-Globulin ist.
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Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5354498A (en) * 1990-03-16 1994-10-11 Fuji Xerox Co., Ltd. Phase separation liquid crystal polymer
DE69228817T2 (de) * 1991-07-26 1999-09-23 Dade Chemistry Systems Inc Signalerkennungspruefung in der anwesenheit von einem suspendierten festen träger
US5550630A (en) * 1993-03-19 1996-08-27 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Spectrophotometric method for structural analysis of organic compounds, polymers, nucleotides and peptides
EP1072887B1 (de) * 1999-07-30 2005-11-16 Mitsubishi Chemical Corporation Immunoassay
CA2505921A1 (en) * 2002-11-12 2004-05-27 Becton, Dickinson And Company Diagnosis of sepsis or sirs using biomarker profiles
US20060120566A1 (en) * 2003-04-24 2006-06-08 Toru Myogadani Optical inspection device
BRPI0609302A2 (pt) 2005-04-15 2011-10-11 Becton Dickinson Co métodos para prever o desenvolvimento de sepse e para diagnosticar sepse em um indivìduo a ser testado, microarranjo, kit para prever o desenvolvimento de sepse em um indivìduo a ser testado, produto de programa de computador, computador, sistema de computador para determinar se um indivìduo é susceptìvel de desenvolver sepse, sinal digital embutido em uma onda portadora, e, interface gráfica de usuário para determinar se um indivìduo é susceptìvel de desenvolver sepse
EP2265947A4 (de) * 2008-03-20 2011-03-30 Abay Sa Analysen von solpartikel-spezifischen bindungstests bei mehreren wellenlängen
WO2009123737A2 (en) 2008-04-03 2009-10-08 Becton, Dickinson And Company Advanced detection of sepsis
EP2635895A1 (de) 2010-11-03 2013-09-11 Reametrix Inc. Messsystem zur fluoreszenzdetekion und verfahren dafür
CN104370761B (zh) * 2014-09-29 2016-09-14 安徽师范大学 一种邻苯二甲酸丁基苄酯半抗原衍生物及制备方法、邻苯二甲酸丁基苄酯的检测方法

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3813168A (en) * 1971-03-19 1974-05-28 Hitachi Ltd Two-wavelength spectrophotometer
JPS5291483A (en) * 1976-01-28 1977-08-01 Hitachi Ltd Multi-component analyzer
JPS5352180A (en) * 1976-10-22 1978-05-12 Hitachi Ltd Two light beams spectrophotometer
US4197088A (en) * 1977-09-23 1980-04-08 Akro-Medic Engineering, Inc. Method for qualitative and quantitative determination of immunological reactions
US4174952A (en) * 1978-01-23 1979-11-20 Massachusetts Institute Of Technology Immunoassay by light scattering intensity anisotropy measurements
US4225233A (en) * 1978-02-02 1980-09-30 The Trustees Of Boston University Rapid scan spectrophotometer
DE3264269D1 (en) * 1981-07-17 1985-07-25 Toray Industries Method of assaying biologically active substances and labelling agents therefor
JPH06105256B2 (ja) * 1983-06-14 1994-12-21 株式会社東芝 免疫分析方法
SU1251908A1 (ru) * 1983-12-27 1986-08-23 Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов АН СССР Способ определени скорости реакции агглютинации
JPS63149565A (ja) * 1986-12-12 1988-06-22 Sekisui Chem Co Ltd 免疫測定法
US4954435A (en) * 1987-01-12 1990-09-04 Becton, Dickinson And Company Indirect colorimetric detection of an analyte in a sample using ratio of light signals

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