CH621687A5 - Process for producing the novel antibiotic A-28086 complex and its use for increasing the feed intake of ruminants - Google Patents

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung des neuen Antibioticum A-28086-Komplexes, aus dem sich die Faktoren A, B und D ableiten. Die antibiotischen Verbindungen sind interessante antibakterielle, anti-fungale, antivirale, anticoccidiale, insekticide und acaricide Mittel sowie Mittel gegen Pleuropneumie ähnliche Organismen und Mittel zur Verbesserung der Futterutilisation bei Wiederkäuern. Das neue Antibioticum A-28086-Komplex als solches, die Faktoren A bzw. D sowie auch die physiologisch unbedenklichen Salze davon und die C2-C0-Acylester können zur Erhöhung der Futteraufnahme bei Wiederkäuern verwendet werden.

Erfindungsgemäss wird ein Verfahren zur Herstellung des neuen Antibioticum A-28086-Komplexes mit den Faktoren A, B und D bereitgestellt, das darin besteht, dass man Streptomyces aureofaciens NRRL 5758 oder Streptomyces aureofaciens NRRL 8092 in einem Kulturmedium, das assimilierbare Quellen für Kohlehydrat, Stickstoff sowie anorganische Salze enthält, submers unter aeroben Fermentationsbedingungen solange züchtet, bis diese Organismen im Kulturmedium eine wesentliche Menge antibiotischer Aktivität produziert haben und den Antibioticum A-28086-Komplex aus dem Kulturmedium abtrennt.

Das Antibioticum A-28086 Faktor A ist nach Umkristallisieren aus Aceton-Wasser eine weisse kristalline Verbindung, die sich in niederen Alkoholen, Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid, Äthylacetat, Chloroform, Aceton und Benzol löst, in Hexan jedoch nur schwach löslich ist und sich in

Wasser nicht löst, bei etwa 98 bis 100°C schmilzt, sich wieder verfestigt und dann bei etwa 195 bis 200°C wieder schmilzt und folgende weitere Eigenschaften hat:

a) ein Molekulargewicht von 764, durch Spektrometrie 5 bestimmt,

b) eine ungefähre Elementarzusammensetzung von 66,69% Kohlenstoff, 9,85% Wasserstoff und 23,10% Sauerstoff,

c) eine empirische Formel Cj!3Hr,On, durch Massen-io spektrometrie bestimmt,

d) eine spezifische Drehung von —54° (c = 0,2, Methanol), gemessen bei 25°C,

e) ein Infrarotabsorptionsspektrum in Chloroform mit folgenden unterscheidbaren Absorptionsmaxima: 2,85, 3,34,

is 5,83, 6,82, 7,22, 7,53 (schwach), 7,78 (schwach), 8,75 (stark), 8,95 (stark), 9,15, 9,50 (stark), 9,55 (stark), 9,60, 9,85, 10,15, 10,45 und 10,70 (schwach) Mikron,

f) nur eine Endabsorption bei weniger als 200 m[j, im Ultraviolettspektrum in Äthanol,

20 g) ein magnetisches Kernresonanzspektrum in Deuterochloroform mit folgenden Eigenschaften: 5 6,01, 4,21, 4,11, 3,99, 3,89, 3,80, 3,67, 3,65, 3,57, 3,55, 2,83, 2,76, 2,74, 2,68, 2,66, 2,58, 2,56, 2,30, 2,22, 2,17, 2,10, 2,05, 1,96, 1,90, 1,85, 1,70, 1,62, 1,60, 1,47, 1,39, 1,31, 1,25, 1,18,0,95, 0,93,0,90, 25 0,88, 0,85, 0,77, 0,75, 0,73, 0,68 und 0,66 ppm,

h) eine titrierbare Gruppe mit einem pKa-Wert von 7,9 in 80-prozentigem wässrigem Dimethylformamid,

i) ein charakteristisches Röntgenbeugungsspektrum für das Pulver (Cu++ Strahlung, 1,5405 X, Nickelfilter) mit fol-

30 genden interplanaren Abständen in Angström (d):

d

Relative Intensität

12,00

100

10,10

50

9,25

90

8,00

40

7,50

15

6,92

90

6,40

40

5,98

05

5,68

15

5,20

40

4,98

40

4,62

40

4,21

20

3,48

10

j) einen Rr-Wert von 0,24 in der Dünnschichtchromatographie über Silicagel unter Verwendung eines 3 : 2 Lösungsmittelsystems aus Benzol-Äthylacetat und Bacillus subtilis 65 ATCC 6633 als Detektionsorganismus,

k) in den unten angegebenen papierchromatographischen Systemen unter Verwendung von Bacillus subtilis ATCC 6633 als Detektionsorganismus folgende Rf-Werte:

3

621687

R -Werte

Lösungsmittelsystem

Rf-Werte

Lösungsmittelsystem

0,11 Mit Methylisobutylketon (MIBK) gesättig tes Wasser

0,41 Mit MIBK plus 2% p-ToluolsuIfonsäure sowie 1 % Piperidin gesättigtes Wasser

0,54 Wasser : Methanol : Aceton (12 : 3 : 1)

mit NH4OH auf pH 10,5 eingestellt und dann mit H3P04 auf pH 7,5 erniedrigt

0,48 1 % MIBK, 0,5 % NH4OH in Wasser

0,15 17,4 g K2HP04, 30 ml Äthanol pro Liter

Wasser

0,24 Mit Wasser gesättigtes Benzol

0,24 Wasser

0,75 Wasser : MIBK : Äthylacetat (98 : 1 : 1)

10

15

0,16 Mit MIKB plus 2% p-Toluolsulfonsäure und 1 % Piperidin gesättigtes Wasser

0,46 Wasser : Methanol : Aceton (12 : 3 : 1)

mit NH4OH auf pH 10,5 eingestellt und dann mit H3P04 auf pH 7,5 erniedrigt

0,36 1 % MIBK, 0,5 % NH4OH in Wasser

0,51 Mit Wasser gesättigtes Benzol

0,11 Wasser

0,61 Wasser : MIBK : Äthylacetat (98 : 1 : 1)

1) eine zur Bildung von Salzen und Esterderivaten befähigte Säurefunktion und m) wenigstens eine veresterbare Hydroxylgruppe,

oder das obige Antibioticum liegt in Form seiner C2-Cu-Acyl-esterderivate sowie physiologisch annehmbaren Salze vor.

Das Antibioticum A-28086 Faktor B ist nach Umkristallisieren aus Aceton-Wasser eine weisse kristalline Verbindung, die sich in niederen Alkoholen, Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid, Äthylacetat, Chloroform, Aceton und Benzol löst, in Hexan jedoch nur schwach löslich ist und sich in Wasser nicht löst und folgende weitere Eigenschaften hat:

a) einen Schmelzpunkt von etwa 150-153°C,

b) ein Molekulargewicht von 762, bestimmt durch Mas-senspektrometrie mit hoher Auflösung,

c) eine empirische Formel C43H70On, bestimmt durch Massenspektrometrie hoher Auflösung,

d) ein Infrarotabsorptionsspektrum in Chloroform mit folgenden unterscheidbaren Absorptionsmaxima: 2,82, 3,30, 5,77, 5,85, 6,80, 7,20, 7,50 (schwach), 7,72 (schwach), 7,80 (schwach), 8,57 (stark), 8,68, 8,90 (stark), 9,10, 9,50, 9,83 (stark), 9,90, 10,10, 10,17 (stark), 10,43 (schwach), 10,80 (schwach), 11,20 (schwach), 11,35 (schwach), 11,73 (schwach) und 12,03 (schwach) Mikron,

e) ein Absorptionsmaximum in Äthanol im Ultraviolettspektrum bei 220 mu (E = 137,5, e = — 10 477),

f) ein magnetisches Kernresonanzspektrum in Deuterochloroform mit folgenden Eigenschaften: 5 7,20, 7,09, 6,26, 6,15, 4,19, 4,12, 4,05, 3,95, 3,89, 3,78, 3,62, 3,59, 3,52, 3,48, 2,81, 2,73, 2,63, 2,54, 2,52, 1,99, 1,91, 1,84, 1,71, 1,67, 1,64, 1,55, 1,43, 1,33, 1,18, 1,11,0,96, 0,94, 0,90, 0,87, 0,84, 0,77, 0,74 und 0,68 ppm,

g) einen RrWert von 0,42 im Dünnschichtchromato-gramm über Silicagel unter Verwendung eines 3 : 2-Gemi-sches aus Benzol und Äthylacetat sowie Bacillus subtilis ATCC 6633 als Detektionsorganismus,

h) in den im folgenden angegebenen papierchromatogra-phischen Systemen unter Verwendung von Bacillus subtilis ATCC 6633 als Detektionsorganismus folgende RrWerte:

i) eine zur Bildung von Salzen und Esterderivaten be-

20 fähigte Säurefunktion,

j) zwei Ketofunktionen und k) wenigstens eine Hydroxylgruppe,

oder das obige Antibioticum liegt in Form seiner physiologisch unbedenklichen Salze vor.

25 Das Antibioticum A-28086 Faktor D ist nach Umkristallisieren aus Aceton-Wasser eine weisse kristalline Verbindung, die in Methanol, Äthanol, Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid, Äthylacetat, Chloroform, Aceton und Benzol löslich ist, sich in Hexan jedoch nur schwach löst und in

30 Wasser unlöslich ist, bei etwa 96 bis 98°C schmilzt und folgende weitere Eigenschaften hat:

a) ein Molekulargewicht von 778, bestimmt durch Massenspektrometrie hoher Auflösung,

b) eine ungefähre Elementarzusammensetzung von

35 67,59% Kohlenstoff, 9,38% Wasserstoff und 22,77% Sauerstoff,

c) eine empirische Formel C^H^O,!, bestimmt durch Massenspektrometrie hoher Auflösung,

d) eine spezifische Drehung von —56° (c = 0,1, Metha-

40 noi), bestimmt bei 25°C,

e) ein Infrarotabsorptionsspektrum in Chloroform mit folgenden beobachtbaren Absorptionsmaxima: 2,89, 3,39, 3,43, 3,50, 5,88, 6,90, 7,27, 7,60, 7,84, 9,00, 9,26, 9,62, 10,31, 10,58, 11,10 und 11,49 Mikron,

45 f) in 95-prozentigem wässrigem Äthanol keine beobachtbare Ultraviolettabsorption,

g) in Chloroform ein magnetisches Kernresonanzspek-tium mit folgenden Eigenschaften: 6,00, 4,20, 4,10, 4,00, 3,98, 3,92, 3,86, 3,83, 3,79, 3,67, 3,64, 3,57, 3,54, 2,88, 2,81,

50 2,71, 2,62, 2,58, 2,48, 2,43, 2,37, 2,29, 2,21, 2,15, 2,10, 2,04, 1,97, 1,89, 1,83, 1,76, 1,68, 1,61, 1,58, 1,55, 1,47, 1,39, 1,30, 1,25, 1,18, 0,95, 0,90, 0,88, 0,84, 0,74 und 0,68 ppm,

h) in 80-prozentigem wässrigem Dimethylformamid eine titrierbare Gruppe mit einem pK.,-Wert von 8,67,

55 i) als Pulver folgendes charakteristisches Röntgenbeu-gungsspektrum (Cu++ Strahlung, 1,5405 X, Nickelfilter) mit folgenden interplanaren Abständen in Angström (d):

60

65

621687

4

d Relative Intensität

12,40

100

10,20

70

8,85

90

7,80

30

6,80

10

6,30

100

5,70

20

5,35

20

5,10

20

4,90

10

4,65

20

4,45

40

4,20

30

3,30

10

3,15

10

2,99

05

2,77

05

2,28

05

j) in dünnschichtchromatographischen Systemen auf Silicagel unter Verwendung von Bacillus subtilis ATCC 6633 als Detektionsorganismus folgende Rt-Werte:

Rr-Werte Lösungsmittelsystem

0,26 Benzol-Äthylacetat (3 : 2)

0,66 Äthylacetat-Diäthylamin (95 : 5)

k) in papierchromatographischen Systemen unter Verwendung von Bacillus subtilis ATCC 6633 als Detektionsorganismus folgende RrWerte:

Rt-Werte Lösungsmittelsystem

1) eine zur Bildung von Salzen und Esterderivaten befähigte Säurefunktion und m) wenigstens eine veresterbare Hydroxylgruppe,

oder das obige Antibioticum liegt in Form seiner C2-C6-Acyl-5 ester sowie physiologisch unbedenklichen Salze vor.

Es gibt zwar bereits eine Reihe antibakterieller Mittel, doch besteht immer noch ein Bedarf nach neuen und besseren Antibiotica. Ein Problem bei der derzeitigen Antibiotica-therapie ist die Tatsache, dass sich Antibiotica in ihrer io Wirksamkeit gegenüber pathogenen Organismen unterscheiden. Ein weiteres Problem ist die Entwicklung von Organismenstämmen, die gegenüber Standardantibiotica resistent sind. Ein anderes Problem ist schliesslich die Tatsache, dass einzelne Patienten oft an ernsten Reaktionen gegenüber 15 spezifischen Antibiotica leiden, die auf eine Hypersensitivität und/oder toxische Effekte zurückzuführen sind. Wegen dieser Probleme in der derzeitigen Therapie besteht immer noch Bedarf an neuen Antibiotica.

Ausser neuen Antibiotica zur Behandlung von Erkran-20 kungen des Menschen werden auch bessere Antibiotica in der Veterinärmedizin benötigt. Ein wichtiger Gesichtspunkt ist dabei der Bedarf an besseren Antibiotica zur Wachstumsförderung von Geflügel und Haustieren. Zu einer solchen Wachstumsförderung kommt es beispielsweise durch eine 25 Verringerung der Krankheiten und durch eine Verbesserung der Futterutilisation.

Eine bekannte Krankheit von wirtschaftlicher Bedeutung in der Veterinärmedizin, und zwar insbesondere in der Geflügelindustrie, ist die durch Protozoen hervorgerufene 30 Coccidiosis. Zu einer Coccidiosis kommt es durch Infektion mit einer oder mehreren Arten von Eimeria oder Isospora (bezüglich einer Zusammenfassung wird auf Lund and Farr in «Diseases of Poultry», 5. Auflage, Biester and Schwarte, Eds., Iowa State University Press, Ames, la., 1965, Seiten 35 1056 - 1096 hingewiesen. Wegen der starken wirtschaftlichen Verluste durch Coccidiosis und aufgrund der Nachteile einiger bekannter anticoccidialer Mittel wird immer noch nach besseren anticoccidialen Mitteln gesucht.

Eine weitere Erkrankung bei den Tieren ist die Enteritis, 40 durch die es bei den Tierzüchtern ebenfalls zu ernsthaften wirtschaftlichen Verlusten kommen kann. Die Enteritis tritt bei Hühnchen, Schweinen, Rindern und Schafen auf, und sie ist vorwiegend auf anaerobe Bakterien, insbesondere Clostridium perfringens, sowie Viren zurückzuführen. Die Entero-45 toxämie bei Wiederkäuern, von denen ein Beispiel das Überfressen bei Schafen ist, ist ein Zustand, der durch eine Infektion mit C. perfringens hervorgerufen wird.

Die Wachstumsförderung bei Wiederkäuern, wie Rindern, ist ein weiteres wirtschaftlich interessantes Ziel der Veterinär-50 medizin. Von besonderem Interesse ist dabei eine Wachstumsförderung, die man durch Verbesserung der Futterverwertung erreicht. Der Mechanismus für eine Utilisation des überwiegenden nutritiven Anteils (Kohlehydrate) des Futters von Wiederkäuern ist bekannt. Durch im Pansen 55 der Tiere vorhandene Mikroorganismen werden Kohlehydrate unter Bildung von Monosacchariden abgebaut, und diese Monosaccharide werden dann in Pyruvatverbindungen umgewandelt. Die Pyruvate werden durch mikrobiologische Verfahren zu Acetaten, Butyraten oder Propionaten metabo-60 Iisiert, die kollektiv als flüchtige Fettsäuren (VFA) bezeichnet werden. Bezüglich einer detaillierteren Diskussion wird auf Leng «Physiology of Digestion and Metabolism in the Ruminant», Phillipson et al. Eds., Oriel Press, Newcastle-upon-Tyne, England (1970) Seiten 408 - 410 verwiesen. 65 Die relative Effizienz der VFA-Utilisation wird von McCullough in Feedstuffs, 18. Juni 1971, Seite 19, Eskeland et al. in J. An. Sei. 33, 282 (1971) sowie Church et al. in «Digestive Physiology and Nutrition of Ruminants», Band 2

0,10

Mit Methylisobutylketon (MIBK)

gesättigtes Wasser

0,26

Mit MIBK plus 2% p-Toluolsulfonsäure

sowie 1 % Piperidin gesättigtes Wasser

0,36

Wasser : Methanol : Aceton (12 : 3 : 1)

mit NH4OH auf pH 10,5 eingestellt

und dann mit H,PO, auf pH 7,5

erniedrigt

0,29

1% MIBK, 0,5% NH4OH in Wasser

0,25

17,4 g K2HP04, 30 ml Äthanol pro Liter

Wasser

0,26

Mit Wasser gesättigtes Benzol

0,09

Wasser

0,64

Wasser : MIBK : Äthylacetat (98 : 1 : 1)

5

621687

(1971), Seiten 622 und 625 diskutiert. Es werden zwar auch Acetate und Butyrate utilisiert, die Propionate werden jedoch weit effizienter utilisiert. Darüber hinaus können die Tiere eine Ketosis entwickeln, falls zu wenig Propionat verfügbar ist. Eine entsprechend günstige Verbindung stimuliert daher die Tiere zur Bildung eines höheren Anteils an Propionaten aus Kohlehydraten, wodurch sich die Kohlehydrat-utilisation verbessert und der Befall an Ketosis geringer wird.

Das Antibioticum A-28086 Faktoren A, B und D gehört zu einem neuen Vertreter einer Gruppe von Polyätheranti-biotica. Beispiele von Vertretern aus dieser Gruppe sind unter anderem Monensin (US-PS 3 501 568), Dianemycin [R. L. Hamill, M. M. Hoehn, G. E. Pittenger, J. Chamberlin und M. Gorman, J. Antiniotics 22, 161 (1969)], Nigericin [L. K. Steinrauf, Mary Pinkerton und J. W. Chamberlin, Biochem. Biophys. Res. Comm. 33,29 (1968)] sowie Salino-mycin [JA-PS 47-25392, Anmeldenummer 19620/1971, Derwent Nr. 76960T, US-PS 3 857 948, und H. Kinashi, N. Otake, H. Yonehara, S. Sato und Y. Saito, Tetrahedron Lett. 49,4955-4958 (1973)].

Die Angabe antibiotischer Komplex, wie sie in der Fermentationschemie und auch in der vorliegenden Beschreibung verwendet wird, bezieht sich nicht auf einen chemischen Komplex, sondern auf ein Gemisch gleichzeitig gebildeter individueller antibiotischer Faktoren. Das Verhältnis der bei einem antibiotischen Komplex gebildeten einzelnen Faktoren schwankt, wie dem mit der Bildung von Antibiotica durch Fermentation vertrauten Fachmann bekannt ist, in Abhängigkeit von den jeweils angewandten Fermentationsbedingungen.

Der Antibioticum A-28086-Komplex wird gebildet, indem man den neuen Stamm Streptomyces aureofaciens NRRL 5758 submers unter aeroben Fermentationsbedingungen solange züchtet, bis eine wesentliche Menge antibiotischer Aktivität entstanden ist. Der antibiotische Komplex A-28086 wird ferner gebildet, indem man einen weiteren neuen Stamm, nämlich Streptomyces aureofaciens NRRL 8092, züchtet. Der entweder durch S. aureofaciens NRRL 5758 oder durch S. aureofaciens NRRL 8092 produzierte antibiotische Komplex wird aus der Fermentationsbrühe und dem Mycel vorzugsweise durch polare organische Lösungsmittel extrahiert. Das extrahierte antibiotische Gemisch kann durch Einengen der Lösungsmittel, Zugabe der Konzentrate zu überschüssigem Petroläther zur Ausfällung von Verunreinigungen, Abfiltrieren und Eindampfen der Filtrate gewonnen werden, wodurch man ein Gemisch des Antibioti-cums A-28086 erhält. Das antibiotische Gemisch wird dann gewöhnlich weiter gereinigt und kann durch Säulenchromatographie in die einzelnen Faktoren aufgetrennt werden.

Die A-28086-Verbindungen hemmen das Wachstum von tier- und pflanzenphatogenen Organismen. Diese Hemmwirkung beruht zum einen Teil darauf, dass die Verbindungen A-28086 anticoccidial wirken. Die Verbindungen A-28086 sind ferner antibakteriell, antiviral, gegen PPLO (Pleuropneumonia ähnliche Organismen), insekticid und aca-ricid wirksam und erhöhen die Futterutilisation bei Wiederkäuern.

Aus der anliegenden Zeichnung gehen folgende Infrarotabsorptionsspektren in Chloroform hervor:

Fig. 1 Antibioticum A-28086 Faktor A

Fig. 2 Antibioticum A-28086 Faktor B

Fig. 3 Antibioticum A-28086 Faktor A Acetylester-derivat

Fig. 4 Antibioticum A-28086 Faktor A Propionylester-derivat

Fig. 5 Antibioticum A-28086 Faktor A Butyrylester-derivat

Fig. 6 Antibioticum A-28086 Faktor A Valerylester-derivat

Fig. 7 Antibioticum A-28086 Faktor A Caproylester-derivat

Fig. 8 Antibioticum A-28086 Faktor D.

Die A-28086-Faktoren stehen strukturell zueinander in Beziehung. Während der Fermentation werden wenigstens vier antibiotische Faktoren gleichzeitig gebildet, die man in Form eines Gemisches erhält. Die Faktoren werden voneinander getrennt, wodurch sich die Faktoren A, B und D als einzelne Verbindungen, wie sie im folgenden beschrieben werden, isolieren lassen. Das Gemisch aus den Faktoren von A-28086 ist in den meisten organischen Lösungsmitteln löslich, jedoch in Wasser unlöslich.

In den folgenden Ausführungen werden die physikalischen und spektralen Eigenschaften von A-28086 Faktoren A, B und D beschrieben:

Das Antibioticum A-28086 Faktor A kristallisiert aus Aceton-Wasser. Der Faktor A des Antibioticums A-28086 schmilzt bei etwa 98-100°C, worauf er sich wieder verfestigt und dann wiederum bei etwa 195-200°C schmilzt. Die Elementaranalyse des Faktors A ergibt folgende mittlere prozentuale Zusammensetzung: Kohlenstoff 66,69%, Wasserstoff 9,85%, Sauerstoff 23,10%.

C43H72On wird für den Faktor A als empirische Formel vorgeschlagen.

Der Faktor A hat ein scheinbares Molekulargewicht von 764, und zwar bestimmt durch Massenspektrometrie.

Das Infrarotspektrum des Faktors A in Chloroform geht aus Fig. 1 der anliegenden Zeichnung hervor. Hierbei erhält man folgende Absorptionsmaxima: 2,85, 3,34, 5,83, 6,82, 7,22, 7,53 (schwach), 7,78 (schwach), 8,75 (stark), 8,95 (stark), 9,15, 9,50 (stark), 9,55 (stark), 9,60, 9,85, 10,15, 10,45 und 10,70 (schwach) Mikron.

Das Ultraviolettspektrum des Faktors A in Äthanol zeigt lediglich eine Endabsorption bei unter 220 mn„

Das magnetische Kernresonanzspektrum von A-28086 Faktor A in Deuterochloroform zeigt folgende Charakteristiken: 5 6,01, 4,21, 4,11, 3,99, 3,89, 3,80, 3,67, 3,65, 3,57, 3,55, 2,83, 2,76, 2,74, 2,68, 2,66, 2,58, 2,56, 2,30, 2,22, 2,17, 2,10, 2,05, 1,96, 1,90, 1,85, 1,70, 1,62, 1,60, 1,47, 1,39, 1,31, 1,25, 1,18, 0,95, 0,93, 0,90, 0,88, 0,85, 0,77 0,75, 0,73, 0,68 und 0,66 ppm.

Das aus Aceton-Wasser umkristallisierte Antibioticum A-28086 Faktor A ergibt als Pulver folgendes charakteristisches Röntgenbeugungsspektrum (Cu++ Strahlung, 1,5405 X, Nickelfilter, d = Interplanarabstand in Angström):

d

Relative Intensität

12,00

100

10,10

50

9,25

90

8,00

40

7,50

15

6,92

90

6,40

40

5,98

05

5,68

15

5,20

40

4,98

40

4,62

40

4,21

20

3,48

10

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

621687

6

Die spezifische Drehung des Antibioticums A-28086 Faktor A ist —54° (c = 0,2, Methanol), und zwar gemessen bei einer Temperatur von 25°C. Diese spezifische Drehung ist ein auf mehreren Bestimmungen basierender Mittelwert.

Die elektrometrische Titration des Faktors A in 80-prozentigem wässrigem Dimethylformamid zeigt die Gegenwart einer titrierbaren Gruppe mit einem pKa-Wert von 7,9.

Das Antibioticum A-28086 Faktor A löst sich in einer Reihe organischer Lösungsmittel, wie Methanol, Äthanol, Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid, Äthylacetat, Chloroform, Aceton und Benzol, ist jedoch in nichtpolaren organischen Lösungsmitteln, wie Hexan, nur schwach löslich und in Wasser unlöslich.

Das Antibioticum A-28086 Faktor A verfügt über eine zur Bildung von Salzen und Esterderivaten befähigte Säurefunktion und wenigstens eine veresterbare Hydroxylgruppe.

Auf der Basis der oben beschriebenen physikalischen Eigenschaften lässt sich für das Antibioticum A-28086 Faktor A eine Struktur vorschlagen. Nachdem die Strukturbestimmung nur postuliert wird, wird jedoch darauf hingewiesen, 20 dass es sich bei diesem Strukturvorschlag lediglich um eine Arbeitshypothese handelt. Das Antibioticum A-28086 Faktor A dürfte demzufolge die Struktur folgender Formel I haben:

10

15

HCH

Formel I

chs

Das Antibioticum A-28086 Faktor B ist eine weisse kristalline Verbindung (aus Aceton-Wasser), die bei etwa 150 bis 153°C schmilzt.

Der Faktor B verfügt aufgrund einer massenspektrometri-schen Bestimmung mit hoher Auflösung über ein scheinbares Molekulargewicht von 762, und es wird hierfür die empirische Formel C^H^On vorgeschlagen.

Das Infrarotspektrum des Faktors B in Chloroform geht aus Fig. II der anliegenden Zeichnung hervor. Hierbei lassen sich folgende Absorptionsmaxima feststellen: 2,82, 3,30, 5,77,5,85, 6,80, 7,20, 7,50 (schwach), 7,72 (schwach), 7,80 (schwach), 8,57 (stark), 8,68, 8,90 (stark), 9,10, 9,50, 9,83 (stark), 9,90, 10,10, 10,17 (stark), 10,43 (schwach), 10,80 (schwach), 11,20 (schwach), 11,35 (schwach), 11,73 (schwach) und 12,03 (schwach) Mikron.

Das Ultraviolettspektrum des Faktors B in Äthanol zeigt ein Absorptionsmaximum bei 220 mp, (E = 137,5, e = 10 477).

Das magnetische Kernresonanzspektrum von A-28086 von Faktor B in Deuterochloroform ergibt folgende Charakteristiken: S 7,20,7,09, 6,26, 6,15, 4,19, 4,12, 4,05, 3,95, 3,89, 3,78, 3,62, 3,59, 3,52, 3,48, 2,81, 2,73, 2,63, 2,54, 2,52, 1,99, 1,91, 1,84, 1,71, 1,67, 1,64, 1,55, 1,43, 1,33, 1,18, 1,11, 0,96, 0,94, 0,90, 0,87, 0,84, 0,77, 0,74 und 0,68 ppm.

Das Antibioticum A-28086 Faktor B ist in einer Reihe 45 organischer Lösungsmittel löslich, wie Methanol, Äthanol, Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid, Äthylacetat, Chloroform, Aceton und Benzol, es löst sich jedoch nur schwach in nichtpolaren organischen Lösungsmitteln, wie Hexan, und ist in Wasser unlöslich.

50 Die chemische Struktur des Antibioticums A-28086 Faktor B ist bis jetzt zwar noch nicht aufgeklärt, doch ergeben die verfügbaren physikalischen Daten, dass dieser Faktor B über eine einzelne Carbonsäuregruppe, zwei Ketogruppen und eine oder mehrere Hydroxylgruppen verfügt.

55 Bei der Herstellung über S. aureofaciens NRRL 5758 wird das Antibioticum A-28086 Faktor D als geringerer Faktor gebildet. Erfolgt die Herstellung jedoch über S. aureofaciens NRRL 8092, dann ist das Antibioticum A-28086 Faktor D in einer Menge von bis zu 10%, bezogen auf die ge-60 wonnene antibiotische Aktivität, vorhanden.

Das Antibioticum A-28086 Faktor D ist ein weisses kristallines Material (aus Wasser-Aceton) mit einem Schmelzpunkt von etwa 96-98°C. A-28086 Faktor D hat ein scheinbares Molekulargewicht von 778, und zwar bestimmt durch 65 Massenspektrometrie hoher Auflösung.

Die elementare Zusammensetzung des Maximums im Massenspektrum des Natriumsalzes von A-28086 Faktor D ergibt einen Wert von 800 5050 (berechnet für C44H73OuNa

7

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= 800 5050). Im Massenspektrum lässt sich an der freien Säure von A-28086 Faktor D ein kleines Maximum bei 778 und ein grösseres Maximum bei 760 5117 (berechnet für C44H72O10 = 760 5125) beobachten. Der im Massenspektrum der freien Säure erhaltene Wert m/e von 760 rührt vom Wasserverlust des Molekularions her. Die Molekularionen-zusammensetzung der freien Säure des Antibioticums A-28086 Faktor D ist daher C^H^Ou-

Für A-28086 Faktor D wird daher die empirische Formel C44H740h vorgeschlagen. Die Elementaranalyse des Faktors D ergibt folgende prozentuale Zusammensetzung: Kohlenstoff 67,59%, Wasserstoff 9,38%, Sauerstoff 22,77%.

Die theoretische prozentuale Zusammensetzung für C44H740h ist folgende: Kohlenstoff 67,87 %, Wasserstoff 9,51%, Sauerstoff 22,77%.

Das Infrarotabsorptionsspektrum von A-28086 Faktor D (Fig. 8) enthält folgende beobachtbare Absorptionsmaxima: 2,89, 3,39, 3,43, 3,50, 5,88, 6,90, 7,27, 7,60, 7,84, 9,00, 9,26, 9,62, 10,31, 10,58, 11,10 und 11,49 Mikron.

Das Antibioticum A-28086 Faktor D zeigt in 95-prozentigem wässrigem Äthanol keine Ultraviolettabsorption.

Das magnetische Kernresonanzspektrum des Antibioticums A-28086 Faktor D in Deuterochloroform ergibt folgende Charakteristiken: 5 6,00, 4,20,4,10, 4,00, 3,98, 3,92, 3,86, 3,83, 3,79, 3,67, 3,64, 3,57, 3,54, 2,88, 2,81, 2,71, 2,62, 2,58, 2,48, 2,43, 2,37, 2,29, 2,21, 2,15, 2,10, 2,04, 1,97, 1,89, 1,83, 1,76, 1,68, 1,61, 1,58, 1,55, 1,47, 1,39, 1,30, 1,25, 1,18, 0,95, 0,90, 0,88, 0,84, 0,74 und 0,68 ppm.

Das Antibioticum A-28086 Faktor D ergibt nach Umkristallisieren aus Aceton-Wasser in Pulverform folgendes charakteristisches Röntgenbeugungsspektrum (Cu++ Strahlung, 1,5405 X, Nickelfilter, d = Interplanerabstand in Angström):

to

15

20

d

Relative Intensität

5,70

20

5,35

20

5,10

20

4,90

10

4,65

20

4,45

40

4,20

30

3,30

10

3,15

10

2,99

05

2,77

05

2,28

05

d

Relative Intensität

12,40

100

10,20

70

8,85

90

7,80

30

6,80

10

6,30

100

Die spezifische Drehung des Antibioticum A-28086 Fak-25 tors D ist —56° (c — 0,1, Methanol), und zwar gemessen bei einer Temperatur von 25°C.

Die elektrometrische Titration von A-28086 Faktor D in 80-prozentigem wässrigem Dimethylformamid ergibt die Gegenwart einer titrierbaren Gruppe mit einem pKa-Wert von 30 8,67.

Das Antibioticum 28086 Faktor D ist in einer Reihe organischer Lösungsmittel löslich, wie Methanol, Äthanol, Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid, Äthylacetat, Chloroform, Aceton und Benzol, in nichtpolaren organischen Lösungs-35 mittein, wie Hexan, jedoch nur schwach löslich und in Wasser unlöslich.

Das Antibioticum A-28086 Faktor D hat eine zur Bildung von Salzen und Esterderivaten befähigte Säurefunktion und verfügt über wenigstens eine veresterbare Hydroxyl-4o gruppe.

Aufgrund der oben angegebenen physikalischen Eigenschaften lässt sich für das Antibioticum A-28086 Faktor D eine Struktur vorschlagen. Nachdem dieser Strukturvorschlag jedoch nur postuliert wird, soll die angegebene Struk-45 tur lediglich als Arbeitshypothese angesehen werden. Die für A-28086 Faktor D angenommene Struktur entspricht folgender Formel II:

cha

/\fH

CHa 0 f—CHa-CHs

Q/~ \/

r ! Formel II

/

:*~oh cha

Hierin steht der Substituent Rt für CH3 und der Substituent R2 für CoH3, oder der Substituent R4 bedeutet C2H5 und der Substituent R, steht für CH3.

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8

Die R£-Werte des Antibioticums A-28086 Faktoren A, B und D in verschiedenen papierchromatographischen Systemen unter Verwendung von Bacillus subtilis ATCC 6633 als Detektionsorganismus gehen aus folgender Tabelle I hervor.

TABELLE I

Rf-Werte

Faktor A Faktor B Faktor D

Lösungsmittelsystem

0,11 0,09 0,10 Mit Methylisobutylketon (MIKB) gesättigtes Wasser

0,41 0,16 0,26 Mit MIBK plus 2% p-Toluolsulfonsäure sowie 1 %

Piperidin gesättigtes Wasser

0,54 0,46 0,36 Wasser : Methanol : Aceton (12 : 3 : 1) mit NH40H

auf pH 10,5 eingestellt und dann mit H3P04 auf pH 7,5 erniedrigt

0,48 0,36 0,29 1 % MIBK, 0,5 % NH40H in Wasser

0,15 0,33 0,25 17,4 g K2HP04, 30 ml Äthanol pro Liter Wasser

0,24 0,51 0,26 Mit Wasser gesättigtes Benzol

0,24 0,11 0,09 Wasser

0,75 0,61 0,64 Wasser : MIBK : Äthylacetat (98 : 1 : 1)

In Tabelle II sind die Rt-Werte für Antibioticum A-28086 Faktoren A, B und D in zwei dünnschichtchromatographi-schen Systemen auf Silicagel (vorbeschichtete Platten, E. Merk, Darmstadt, F-254, Schichtstärke 0,25 mm) angegeben, wozu als Detektionsorganismus wiederum B. subtilis ATCC 6633 verwendet wird.

30

TABELLE II

Faktor A

RrWerte Faktor B

Faktor D

Lösungsmittelsystem

0,24 0,54

0,42 0,34

0,26 Benzol-Äthylacetat (3 : 2)

0,66 Äthylacetat-Diäthylamin (95 : 5)

Zusammen mit dem Antibioticum A-28086-Komplex wird eine weitere Substanz gebildet, die willkürlich als A-28086-I bezeichnet wird. A-28086-I ist zwar mikrobiologisch nicht wirksam, es ist jedoch strukturell zu den Faktoren den Antiboticums A-28086 verwandt. Bei A-18086-I handelt es sich um eine weisse kristalline Verbindung (aus Aceton-Wasser) mit einem Schmelzpunkt von etwa 160 bis 162°C. Vergleichsstudien der NMR-Spektren und anderer Eigenschaften von A-28086-I mit synthetisch hergestelltem A-28086 Faktor A Methylester liefern den Beweis, dass es sich bei A-28086-I um den Methylester von A-28086 Faktor A oder eine nahe verwandte Verbindung, wie ein Stereoisomer, handelt.

A-28086-I fällt ursprünglich zwar zusammen mit den wirksamen Faktoren des Antibioticums A-28086 aus, lässt sich von diesem jedoch ohne weiteres durch Silicagelchro-matographie trennen. A-28086-I hat einen ungefähren Rr-Wert von 0,53 im Dünnschichtchromatogramm auf Silicagel unter Verwendung von Äthylacetat als Eluiermittel und Vanillin als Sprühmittel (3% Vanillin in Methanol + 0,5 ml konzentrierte Schwefelsäure pro 100 ml Lösung) zur Detek-tion. Nach Besprühen mit Vanillin und Erhitzen ergibt

A-28086-I einen blauen Fleck, während die Faktoren von Antibioticum A-28086 helle pinkfarbene Flecken ergeben, die rasch dunkelbräunlich-blau werden.

50 Das neue Antibioticum 28086 Faktoren A, B und D sowie die angegebenen Acylester der Faktoren A und D sind zur Bildung von Salzen befähigt. Unter physiologisch unbedenklichen Salzen, bei denen es sich ebenfalls um pharmakologisch unbedenkliche Salze handelt, werden Salze verstan-55 den, bei denen sich die Toxizität der Verbindung in bezug auf die Nichtsalzform gegenüber Warmblütern insgesamt nicht erhöht. Typische und geeignete Alkali- sowie Erdalkalisalze von A-28086 Faktoren A und B sind beispielsweise die Natrium-, Kalium-, Lithium-, Cäsium-, Rubidium-, 60 Barium-, Calcium- und Magnesiumsalze. Geeignete Amin-salze von A-28086 Faktoren A und B sind unter anderem die Ammoniumsalze sowie die primären, sekundären und tertiären Cj-Q-Alkylammonium- und Hydroxy-C2-C4-alkyl-ammoniumsalze. Beispiele von Aminsalzen sind diejenigen, 65 die durch Umsetzung von A-28086 Faktoren A und B mit Ammoniumhydroxid, Methylamin, sec.-Butylamin, Isopropyl-amin, Diäthylamin, Diisopropylamin, Äthanolamin, Triäthyl-amin, 3-Amino-l-propanol und dergleichen entstehen.

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Die kationischen Alkali- und Erdalkalisalze von A-28086 Faktoren A, B und D und der entsprechenden C2-C6-Acyl-esterderivate der Faktoren A und D können nach Verfahren hergestellt werden, wie sie zur Herstellung kationischer Salze üblich sind. Hierzu wird beispielsweise die freie Säure des antibiotischen Faktors oder entsprechenden Esterderivats in einem geeigneten Lösungsmittel, wie warmem Methanol oder Äthanol gelöst, worauf man eine die stöchiometrische Menge der gewünschten anorganischen Base in wässrigem Methanol enthaltende Lösung zu dieser Lösung gibt. Das auf diese Weise entstandene Salz kann in üblicher Weise isoliert werden, beispielsweise durch Abfiltrieren oder Verdampfen des Lösungsmittels.

In ähnlicher Weise lassen sich auch die Salze organischer Amine herstellen. Hierzu kann man beispielsweise das gasförmige oder flüssige Amin zu einer Lösung geben, die den antibiotischen Faktor in einem geeigneten Lösungsmittel, wie Aceton, enthält, worauf man das Lösungsmittel und den Überschuss an Amin durch Verdampfen entfernen kann.

Es ist in der Veterinärmedizin bekannt, dass die Form des Antibioticums nicht signifikant ist, wenn man ein Tier mit dem Antibioticum behandelt. In den meisten Fällen wird der Wirkstoff durch die im Tier herrschenden Bedingungen zu Formen verändert, die anders sind als die verabreichten Formen. Die Salzform, in der sich der Wirkstoff verabfolgen lässt, ist daher für das Behandlungsverfahren nicht signifikant. Die Salzform kann jedoch aus Gründen der Wirtschaftlichkeit, der bequemen Anwendungsart und der günstigen Toxizität gewählt werden.

Das Antibioticum A-28086 Faktor A bildet C2-C0-Acyl-ester. Zu einer Veresterung kommt es z.B. an den Hydroxy-gruppen von A-28086 Faktor A nach Behandeln mit einem C2-C,-Säureanhydrid oder Säurechlorid. Solche Ester werden am besten hergestellt, indem man A-28086 Faktor A bei Raumtemperatur beispielsweise mit dem entsprechenden Säureanhydrid umsetzt. Diese Esterderivate eignen sich ebenfalls als Antibiotica und Mittel zur Verbesserung der Futterutilisation.

Die Eigenschaften der genannten Acylester von A-28086 Faktor A werden im folgenden näher beschrieben. Der A-28086 Faktor A Acetylester ist eine weisse kristalline Verbindung (aus Aceton-Wasser) mit einem Schmelzpunkt von etwa 100 - 103°C. Das Acetylesterderivat von A-28086 Faktor A hat eine empirische Formel von C45H74012 und ein Molekulargewicht von etwa 807, bezogen auf die für A-28086 Faktor A vorgeschlagene empirische Formel. Die Elementaranalyse des Acetylesters von Faktor A ergibt folgende prozentuale Zusammensetzung:

C45H74012:

berechnet: C 66,97 H 9,24 O 23,79

gefunden: C 67,67 H 8,71 O 23,13

Das Infrarotspektrum von A-28086 Faktor A Acetylester in Chloroform geht aus Fig. 3 der anliegenden Zeichnung hervor. Hierbei lassen sich folgende Absorptionsmaxima beobachten: 2,85, 3,36, 3,38 (stark), 5,80, 6,83, 7,25, 7,52, (stark), 7,60 (schwach), 7,80 (stark), 8,45 (stark), 8,80 (stark), 8,95 (stark), 9,10 (stark), 9,20, 9,63, 9,80 (stark), 10,12 (schwach), 10,25 (schwach) und 10,50 Mikron.

Das Ultraviolettspektrum von A-28086 Faktor A Acetylester in Äthanol zeigt lediglich eine Endabsorption.

Die elektrometrische Titration von A-28086 Faktor A Acetylester in 80-prozentigem wässrigem Dimethylformamid zeigt die Gegenwart einer titrierbaren Gruppe mit einem pKa-Wert von 8,5.

Der A-28086 Faktor A Propionylester ist eine weiss kristalline Verbindung (aus Aceton-Wasser) mit einem Schmelzpunkt von etwa 96-98°C. Der Propionylester von A-28086 hat eine empirische Formel von C40H7„O12 und ein Molekulargewicht von etwa 821, bezogen auf die für A-28086 Faktor A vorgeschlagene empirische Formel. Die Elementaranalyse von Faktor A Propionylester ergibt folgende prozentuale Zusammensetzung:

5 C4eH7e012:

berechnet: C 67,29 H 9,33 O 23,38 gefunden: C 66,06 H 9,17 O 23,41 Das Infrarotspektrum des Propionylesters von A-28086 Faktor A in Chloroform geht aus Fig. 4 der anliegenden io Zeichnung hervor. Hieraus lassen sich folgende Absorptionsmaxima beobachten: 2,85, 3,33, 3,38 (stark), 3,45 (stark), 5,75 (stark), 5,82, 6,81, 7,22, 7,30 (stark), 7,50 (schwach), 7,60 (schwach), 7,80, 8,43, 8,75 (stark), 8,90, 9,05, 9,15 (stark), 9,50 (stark), 9,63, 9,83 (schwach), 10,05 (stark), 15 10,13,10,20 (stark), 10,45 und 16,68 Mikron.

Das Ultraviolettspektrum des Propionylesters von A-28086 Faktor A in Äthanol zeigt lediglich eine Endabsorption.

Der Butyrylester des Antibioticums A-28086 Faktor A ist eine weisse kristalline Verbindung (aus Aceton-Wasser) 20 mit einem Schmelzpunkt von etwa 96-98°C. Der Butyrylester von A-28086 Faktor A hat die empirische Formel C47H78Oj2, ein Molekulargewicht von etwa 835 und eine ungefähre Zusammensetzung von 67,60% Kohlenstoff, 9,41% Wasserstoff und 22,99% Sauerstoff, und zwar auf Basis der 25 für A-28086 Faktor A vorgeschlagenen empirischen Formel. Das Infrarotspektrum für den Butyrylester von A-28086 Faktor A in Chloroform geht aus Fig. 5 der anliegenden Zeichnung hervor. Hierin lassen sich folgende Absorptionsmaxima beobachten: 2,89, 3,40, 3,45, 3,51, 5,85, 5,92 (stark), 30 5,97 (stark), 6,90,7,30,7,84 (schwach), 8,55, 8,85 (schwach), 9,01 (stark), 9,26, 9,76, 9,95, 10,31 und 10,64 Mikron.

Der Valerylester des Antibioticums A-28086 Faktor A ist eine weisse kristalline Verbindung (aus Aceton-Wasser) mit einem Schmelzpunkt von etwa 173 bis 175°C. Der Vale-35 rylester von A-28086 Faktor A hat die empirische Formel C4gHS0O12, ein Molekulargewicht von etwa 849 und eine ungefähre Zusammensetzung von 67,89% Kohlenstoff, 9,50% Wasserstoff und 22,61% Sauerstoff, und zwar auf Basis der für A-28086 Faktor A vorgeschlagenen empirischen Formel. 40 Das Infrarotspektrum für den Valerylester von A-28086 Faktor A in Chloroform geht aus Fig. 6 der anliegenden Zeichnung hervor. Hierin lassen sich folgende Absorptionsmaxima beobachten: 2,90, 3,40, 3,45, 3,51, 5,87,5,92 (stark), 5,99 (stark), 6,91, 7,30, 7,69 (schwach), 7,87 (schwach), 8,16, 45 8,58, 8,85 (schwach), 9,26, 9,76, 10,00 (schwach), 10,31 und 10,64 Mikron.

Der Caproylester des Antibioticums A-28086 Faktor A ist eine weisse kristalline Verbindung (aus Aceton-Wasser) mit einem Schmelzpunkt von etwa 163-167°C. Der Caproyl-50 ester von A-28086 Faktor A hat die empirische Formel Cj,,H8201;,, ein Molekulargewicht von etwa 863 und eine ungefähre Zusammensetzung von 68,18% Kohlenstoff, 9,58% Wasserstoff und 22,24% Sauerstoff, und zwar auf Basis aus der für A-28086 Faktor A vorgeschlagenen empirischen For-55 mei.

Das Infarotspektrum für den Caproylester von A-28086 Faktor A in Chloroform geht aus Fig. 7 der anliegenden Zeichnung hervor. Hierin lassen sich folgende Absorptionsmaxima beobachten: 2,90, 3,40, 3,45, 3,51, 5,87, 5,92 (stark), 60 5,97 (stark), 6,90, 7,30, 7,66 (schwach), 7,84 (schwach), 8,16, 8,58, 8,85 (schwach), 9,05 (stark), 9,17, 9,72, 9,95, 10,29 und 10,62 Mikron.

Die Acylierung von A-28086 Faktor A ergibt folgende Veränderungen in dem ^-magnetischen Kernresonanzspek-65 trum: Die bei etwa 4 ppm auftretende Carbinylresonanz wird um etwa 5,3 ppm nach unten verschoben (die genaue Position schwankt bei den verschiedenen Acylderivaten etwas), und die Signale des Vinylprotons werden ebenfalls verscho-

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10

ben. Dies ist charakteristisch für die Änderung, wie sie aus folgender Partialstruktur hervorgeht:

H

OH. H

RCOX

Der Substituent R steht hiefür C1-C5-Alkyl.

Die obige Teilstruktur stimmt völlig mit ^-homonu-clearen Entkopplungsversuchen und dem kernmagnetischen Nachweis von 13C für die Acetyl- und Propionylesterderivate überein.

Die C2-C0-Acylester von A-28086 Faktor A sind in einer Reihe organischer Lösungsmittel löslich, wie Methanol, Äthanol, Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid, Äthylacetat, Chloroform, Aceton und Benzol, lösen sich in nichtpolaren organischen Lösungsmitteln, wie Hexan, jedoch nur schwach und sind in Wasser unlöslich.

Jedes der C2-C0-Acylester von A-28086 hat eine zur Bildung von Salzen und Esterderivaten befähigte Säurefunktion.

Die neuen Antibiotica werden hergestellt, indem man einen A-28086 produzierenden Stamm von Streptomyces aureofaciens submers unter aeroben Bedingungen in einem geeigneten Kulturmedium bis zur Bildung einer wesentlichen antibiotischen Aktivität züchtet. Die Antibiotica können unter Einsatz verschiedener Isolations- und Reinigungstechniken, wie sie auf diesem Gebiet üblich sind, gewonnen werden.

Einer der zur Herstellung der Antibiotica A-28086 geeigneten neuen Organismen wurde aus einer Bodenprobe isoliert, die am Berg Ararat in der Türkei gefunden wurde. Dieser Organismus ist als Stamm von Streptomyces aureofaciens Duggar klassifiziert, wie er von E. B. Shirling und D. Gottlieb in «Cooperative Description of Type Cultures of 5 Streptomyces III, Additional Species Descriptions from First and Second Studios, «Intern. Bull. Systematic Bacteriol. 18, 297-392 (1968) beschrieben ist. Diese Klassifikation beruht auf Methoden, wie sie für das International Streptomyces Projekt [E. B. Shirling und D. Gottlieb «Methods for Cha-io racterization of Streptomyces species», Intern. Bull. Systematic Bacteriol. 16, 313-340 (1966)] zusammen mit bestimmten Ergänzungsuntersuchungen empfohlen werden. Die Zuordnung der Farbnamen erfolgt nach der ISCC-NBS-Methode (K. L. Kelly und D. B. Judd, «The ISCC-NBS Method of 15 Designating Color and a Dictionary of Color Names», U. S. Dept. of Commerce, Circ. 553, 1955, Washington, D. C.). Die in Parenthese angegebenen Zahlen beziehen sich auf die Farbtafeln von Tresner und Backus [Tresner, H. D. und S. J. Backus, «System of Color Wheels for Streptomyces 20 Taxonomy», Appi. Microbiol. 11, 335 - 338 (1963)]. Die Farbstreifenbestimmungen sind unterstrichen. Die entsprechenden Werte nach den Farbtabellen von Maerz und Paul (A- Maerz und M. R. Paul, «Dictionary of Color», McGraw-Hill Book Co., New York, N.Y., 1950) sind in Klammern 25 angegeben. Die entsprechenden Kulturen lässt man 14 Tage bei 30°C wachsen, sofern nichts anderes gesagt ist.

Charakterisierung des A-28086 produzierenden Stammes NRRL 5758

30

Morphologie

Die sporulierenden Lufthyphen bestehen aus Haaken, Schlaufen und offenen Spiralen. Es wurde ferner eine für rectus flexibilis typische Morphologie beobachtet. Die Spo-35 ren sind kurz und zylindrisch und liegen in Ketten aus 10 bis 50 Sporen vor. Die Sporen messen 1,3 n X 1,75 [i mit einem Bereich von 1,3 |x bis 1,95 (i X 1,3 [x. Die Sporenoberfläche ist aufgrund einer elektronenmikroskopischen Beobachtung glatt.

Kulturcharakteristiken von NRRL 5758 auf verschiedenen Medien

Medium

Charakteristiken

ISP ß2 (Hefeextrakt-Malzextrakt)

ISP ß3 (Hafermehl)

ISP ß4 (anorganische Salze-Stärke-Agar)

ISP ß5 (Glycerin-Asparagin-Agar)

Tomatenpaste-Hafermehl-Agar

Glycerin-Glycin-Agar

Glycose-Asparagin-Agar

Reichliches Wachstum, Unterseiten massig gelb [11K3], ausreichendes bis gutes Luftmycel und ausreichende bis gute Sporulation, weiss (W) 13 ba sowie dunkelgrau (Gy) 3 ih, kein lösliches Pigment

Gutes Wachstum, Unterseite gräulichgelb [11B2], ausreichendes Luftmycel (Gy), dunkelgrau, 3 ih, leicht braunes lösliches Pigment

Reichliches Wachstum, Unterseite leicht gelbbraun [12E5], Luftmycel und Sporen (W) purpurartig weiss 13 ba bis (Gy) hellgrau d, kein lösliches Pigment

Gutes Wachstum, Unterseite fahlgelbgrün [10B1], gutes Luftmycel und gute Sporen (Gy), gelblich grau 2 de bis hellgräulich rötlichbraun 5 fe, kein lösliches Pigment

Reichliches Wachstum, Unterseite hell gelblichbraun [13H7], ausreichendes bis gutes Luftmycel und entsprechende Sporen (W) weiss a bis (Gy) mittelgrau g, sehr hellbraunes lösliches Pigment

Reichliches Wachstum, Unterseite dunkelgräulichgelb [12J6], gutes Luftmycel und entsprechende Sporen (Y) fahlgelb 2 db, kein lösliches Pigment

Reichliches Wachstum, Unterseite gräulich-grünlichgelb [12E2] reichliches Luftmycel und entsprechende Sporen (Gy) gelblichgrau 2 de, sehr hellbraunes lösliches Pigment

11

621687

Kulturcharakteristiken von NRRL 5758 auf verschiedenen Medien

(Fortsetzung)

Medium

Charakteristiken

Nähr-Agar

Gutes Wachstum, Unterseite gräulichgelb [12B2], Luftmycel und Sporen,

wegen schlechten Wachstums keine Farbbestimmung, kein lösliches Pigment

Bennett-Agar

Reichliches Wachstum, Unterseite gräulichgelb [12K3], spärliches Luft

mycel und entsprechende Sporen (Gy) gelblichgrau 2 de, kein lösliches

Pigment

Calciummaleat-Agar

Gutes Wachstum, Unterseite gräulichbraun [15C8], kein Luftmycel und

keine Sporulation, braunes lösliches Pigment, die Fläche klärt sich durch

Inokulum auf

Czapek-Lösung-Agar

Schlechtes Wachstum, aufgrund dieses schlechten Wachstums keine Farb

bestimmung

Emerson-Agar

Reichliches Wachstum, Unterseite gräulichgelb [11J5], kein Luftmycel

und keine Sporen, kein lösliches Pigment

Tyrosin-Agar

Reichliches Wachstum, Unterseite hellolivbraun [14C4], reichliches Luft

mycel und entsprechende Sporen von (W) b (Zentrum) bis (Gy) hellbräun-

lichgrau 3 fe (an der Grenze), sehr hellbraunes lösliches Pigment

Trypton-Hefe-Agar

Spärliches Wachstum, keine Farbbestimmung

Der Organismus NRRL 5758 wurde nach Standardverfahren hinsichtlich bestimmter physiologischer Eigenschaften untersucht. Hierbei wurden folgende Eigenschaften untersucht und folgende Charakteristiken gefunden:

Beobachtete Eigenschaften

Charakteristiken

Wirkung auf Milch

Die Milch peptonisiert, es ist ein weisser Wachstumsring zu sehen, die

geklärte Fläche ist lohfarbengelb, der pH-Wert liegt bei 5,7

Nitratreduktion

Positiv

Nährgelatine

30% Verflüssigung nach 14 Tagen

Melaninpigment-Produktion:

Tyrosin-Schrägagar

Äusserst schwach positiv (Pigment nach 4 Tagen)

Difco-Pepton-Hefeextrakt-Eisen-Schrägagar

Negativ

T rypton-Hef eextrakt-Brühe

Negativ

Temperaturerfordernisse (ISP Medium ß2

Bei 26 bis 30°C gutes Wachstum, bei 30 bis 37°C hervorragendes Wachstum

Hefeextrakt-Malzextrakt-Schrägen)

und Sporulation, bei 45°C leicht vegetatives Wachstum, rötliches lösliches

Pigment.

Unter Verwendung des Organismus NRRL 5758 wurden auch Untersuchungen über die Kohlenstoffverwertung durch- 55 geführt, und diese Ergebnisse sind im folgenden angegeben. Die dabei verwendeten Symbole haben folgende Bedeutungen:

+ = gutes Wachstum, positive Verwertung 60

(+) = schlechtes bis ausreichendes Wachstum (—) = schwaches Wachstum, möglicherweise keine Verwertung

— = kein Wachstum, keine Verwertung

65

621687

12

Kohlenstoffquelle

Verhalten

D-Glucose

+

L-Arabinose

+

D-Xylose

+

D-Fructose

+

Saccharose

—

D-Mannit

—

i-Inosit

+

Rhamnose

+

Raffinose

—

-C Kontrolle

(kein Kohlehydrat)

Durch eine Reihe natürlicher Selektionen, an die sich eine chemische Mutation anschliesst, wird von S. aureofaciens NRRL 5758 auch ein zweiter neuer A-28086 produzierender Organismus abgeleitet. Dieser Organismus wird als NRRL

8092 bezeichnet, und er ist ebenfalls als Stamm von Streptomyces aureofaciens Duggar klassifiziert. Die Klassifikation beruht auf Studien des Organismus NRRL 8092 unter Verwendung der oben beschriebenen Klassifikationsmethoden für 5 Streptomyces und ähnlicher Wachstumsbedingungen. Die bei diesen Untersuchungen für den Organismus NRRL 8092 beobachteten Charakteristiken gehen aus den folgenden Ausführungen hervor.

10 Charakterisierung des A-28086 produzierenden Stammes NRRL 8092

Morphologie

Auf Medium ISP ß7 (Tyrosin-Agar) bildet die Kultur 15 gelegentlich Schlaufen, es entstehen vorwiegend jedoch kurze gerade Sporophoren. Die Sporenketten bestehen aus weniger als 10 Sporen pro Kette, nämlich normalerweise 4 bis 7 Sporen pro Kette.

In folgenden Medien lassen sich kurze gerade Sporenket-20 ten beobachten: ISP ß3, Czapek-Lösung-Agar und ISP ß5. Auf Emerson-Agar kann eine reichliche Coremia beobachtet werden. Auf Tyrosin-Agar (ISP ß7) und Glucose-Asparagin-Agar werden auch Untersuchungen im Elektronenmikroskop durchgeführt. Die Sporen sind glatt und 1,2 bis 2,0 p, lang 25 und haben einen Durchmesser von etwa 1,0 [i. Die mittlere Sporengrösse beträgt 1,6 n X 1,0 ja.

Kulturcharakteristiken von NRRL 8092 auf verschiedenen Medien

Medium

Charakteristiken

ISP ß2 (Hefeextrakt-Malzextrakt)

ISP ß3 (Hafermehl)

ISP ß4 (anorganische Salze-Stärke-Agar)

ISP ß5 (Glycerin-Asparagin-Agar)

Tomatopaste-Hafermehl-Agar

Glycerin-Glycin-Agar

Glucose-Asparagin-Agar

Nähr-Agar

Bennett-Agar

Calciummalat-Agar

Czapek-Lösung-Agar

Emerson-Agar

Tyrosin-Agar

Trypton-Hefe-Agar

Ausreichendes Wachstum, Unterseite hellgelbbraun [12H8], ausreichendes Luftmycel, schlechte Sporulation, Luftmycel fahlgrau [11 AI], kein lösliches Pigment

Spärliches Wachstum, Unterseite hyalin, kein Luftmycel, kein lösliches Pigment

Mässiges Wachstum, Unterseite gräulichgelb [11B2], spärliches Luftmycel und spärliche Sporulation, Luftmycel fahlgelbgrau [10A1], kein lösliches Pigment

Mässiges Wachstum, Unterseite fahlgelb [10F2], ausreichendes Luftmycel, spärliche Sporulation, Luftmycel weiss [10A1], kein lösliches Pigment

Mässiges Wachstum, Unterseite gräulichgrüngelb, ausreichendes Luftmycel, massige Sporulation, hellfahlgrau [53 A2], kein lösliches Pigment

Reichliches Wachstum, Unterseite gräulichgelb [11E4], mässiges Luftmycel, weiss [10A1], keine Sporulation, kein lösliches Pigment

Mässiges Wachstum, Unterseite fahlgelb [10F2], mässiges Luftmycel und massige Sporulation, weiss [10A1], kein lösliches Pigment

Spärliches Wachstum, Unterseite fahlgelb [10B2], kein Luftmycel, kein lösliches Pigment

Leidliches Wachstum, Unterseite mittel-gelb-pink [11A7], sehr spärliches Luftmycel, keine Sporulation, kein lösliches Pigment

Äusserst spärliches Wachstum, hyalin, kein Luftmycel, kein lösliches Pigment

Äusserst spärliches Wachstum, Unterseite hyalin, kein Luftmycel, kein lösliches Pigment

Mässiges Wachstum, Unterseite gräulichgelb [1115], fleckiges Luftmycel, keine Sporulation, kein lösliches Pigment

Mässiges Wachstum, Unterseite hellgelbbraun [12H6), mässiges Luftmycel, leicht fahlgrauer Rand [53A2], Zentrum nahezu weiss, mässige Sporulation, kein lösliches Pigment

Äusserst spärliches Wachstum, hyalin, kein Luftmycel, kein lösliches Pigment.

13

621687

Der Organismus NRRL 8092 wird ferner nach Standardverfahren hinsichtlich bestimmter physiologischer Eigenschaften untersucht. Hierbei werden folgende Eigenschaften beobachtet und folgende Charakteristiken gefunden:

Beobachtete Eigenschaften

Charakteristiken

Wirkung auf Milch

Nitratreduktion Nährgelatine

Melaninpigment-Produktion auf: Tyrosin-Schrägagar Trypton-Hefeextrakt-Brühe Karotten Kartoffel

Temperaturerfordernisse (ISP Medium ß2 Hefeextrakt-Malzextrakt-Schrägen)

Peptonisiert (90%), fahlgelber Wachstumsring, geklärte Fläche fahlgelb, pH-Reaktion 4,6

Positiv

50 % innerhalb von 14 Tagen hydrolysiert

Äusserst schwach positiv Negativ

Reichliches Wachstum, fahlgelb, kein Luftmycel reichliches Wachstum, gräulichweiss, kein Luftmycel, keine Veränderung

Bei 25°C reichliches Wachstum, ausreichendes Luftmycel, Unterseite hellbraun, kein lösliches Pigment

Bei 30°C reichliches Wachstum, ausreichendes Luftmycel, Unterseite hellbraun, kein lösliches Pigment

Bei 37°C reichliches Wachstum, ausreichendes Luftmycel, Unterseite braun, kein lösliches braunes Pigment

Bei 40°C reichliches Wachstum, spärliches Luftmycel, Unterseite rotbraun, tiefrotbraunes lösliches Pigment

Bei 45°C ausreichendes Wachstum, kein Luftmycel, Unterseite rotbraun, mittelmässig rotbraunes Pigment.

Der Organismus NRRL 8092 wird auch hinsichtlich seiner Kohlenstoffverwertung untersucht, und die dabei erhaltenen Ergebnisse sind im folgenden zusammengestellt. Die hierzu verwendeten Symbole haben folgende Bedeutungen:

+ = gutes Wachstum, positive Verwertung (+) = schlechtes bis ausreichendes Wachstum (—) = schwaches Wachstum, möglicherweise keine Verwertung

— = kein Wachstum, keine Verwertung

Bestimmte Charakteristiken der A-28086 produzierenden Stämme von S. aureofaciens unterscheiden sich von den 40 Charakteristiken des von Shirling und Gottlieb beschriebenen Organismus. Diese Unterschiede gehen aus der folgenden Tabelle III hervor.

45

Kohlenstoffquelle

Verhalten

50

D-Glucose

+

L-Arabinose

+

D-Xylose

+

55

D-Fructose

+

Saccharose

—

D-Mannit

—

60

i-Isosit

+

Rhamnose

+

Raffinose

—

65

-C Kontrolle

(kein Kohlehydrat)

621687

14

TABELLE III

Kohlenstoffverwertung

NRRL 5758

NRRL 8092

veröffentlichte Beschreibung

Saccharose i-Inosit

Rhamnose

Gelatineverflüssigung Wirkung auf Milch

+

+

30% in 14 Tagen

Milch peptonisiert, weisse Wachstumsringe

+

+

50% in 14 Tagen

Milch peptonisiert, fahlgelbe Wachstumsringe

+

begrenzt oder keine begrenzte oder variable Peptonisierung (oft keine), beschränktes Wachstum und begrenzte Koagulation

Die Charakteristiken des Organismus NRRL 5758, die von den Charakteristiken des Organismus NRRL 8092 verschieden sind, sind in der folgenden Tabelle IV zusammen- 20 gefasst.

TABELLE IV

Charakteristiken

NRRL 5758

NRRL 8092

Vegetative Farbe Sporulation

Wachstum auf:

Calciummalat anorganische Salze-Stärke

Bennett-Agar gelb auf mehreren Medien einige spiralenförmige Sporophoren auf Medien aus Tomatenpaste: Hafermehl und anorganischen Salzen-Stärke ausreichendes Wachstum, braun, Klärung mässige Sporulation, Luftmycel purpurweiss bis grau

Unterseite fahlgelb chemefarben bis fahlgelb auf mehreren Medien kurze gerade Sporophoren mit gelegentlichen Schlaufen spärliches Wachstum, klar, keine Klärung mässige Sporulation, Luftmycel fahlgelbgrau

Unterseite pinkfarben

Die zur Produktion von A-28086 Antibiotica geeigneten Streptomyces aureofaciens wurden hinterlegt und in die Kultursammlung von Northern Marketing and Nutrition Research Division, U.S. Dept. of Agriculture, Agricultural Research Service, Paoria, Illinois, 61604 aufgenommen, und sie können von dort unter den Nummern NRRL 5758 sowie NRRL 8092 frei bezogen werden.

Zum Wachsen von Streptomyces aureofaciens NRRL 5758 und Streptomyces aureofaciens NRRL 8092 lässt sich irgendein Kulturmedium verwenden. Aus Gründen der günstigen Produktion, einer optimalen Ausbeute und einer leichten Isolierung des Produkts werden jedoch bestimmte Kulturmedien bevorzugt. Für eine grosstechnische Fermentation werden daher als Kohlehydratquellen beispielsweise Tapioca-dextrin und Saccharose bevorzugt, man kann jedoch auch Glucose, Maisstärke, Fructose, Mannose, Maltose, Lactose und dergleichen verwenden. Andere geeignete Kohlenstoffquellen sind Maisöl, Erdnussöl, Sojabohnenöl sowie Fischöl. Eine bevorzugte Stickstoffquelle ist ein enzymhydrolysiertes Casein, es können hierfür jedoch auch Peptone, Sojabohnenmehl, Baumwollsaatmehl, Aminosäuren, wie Glutaminsäure, und dergleichen verwendet werden. Zu den anorganischen Nährsalzen, die man den Kulturmedien zusetzen kann, gehören die üblichen löslichen Salze, die Natrium-, Magnesium-, Calcium-, Ammonium-, Chlorid-, Carbonat-, Sulfat-, Nitrat- und ähnliche Ionen liefern.

Die zum Wachsen und zur Entwicklung der Organismen erforderlichen essentiellen Spurenelemente können auch in 45 dem Kulturmedium vorhanden sein. Solche Spurenelemente treten normalerweise als Verunreinigungen in anderen Bestandteilen des Mediums in Mengen auf, die den zum Wachsen des Organismus erforderlichen Bedürfnissen genügen. Steht man bei der grosstechnischen Fermentation vor 50 dem Problem einer Schaumbildung, dann empfiehlt es sich, solchen Fermentationsmedien geringe Mengen (nämlich 0,2 ml/1) eines Antischaummittels zuzusetzen, wie Polypropylen-glycol.

Die Produktion der Antibioticum A-28086 produzieren-55 den Stämme von Streptomyces aureofaciens lässt sich durch Zusatz einer geringen Menge eines Öls, wie Sojabohnenöl, verbessern, obgleich dies nicht wesentlich ist.

Zur Produktion wesentlicher Mengen der Antibiotica A-28086 wird eine submerse Fermentation unter aeroben Be-60 dingungen in Tanks bevorzugt. Geringe Mengen der Antibiotica A-28086 lassen sich auch durch Schüttelflaschen-kultur herstellen. Wegen der zeitlichen Verzögerung, zu der es bei der üblichen Produktion von Antibiotica durch Inokulation grosser Tanks mit der Sporenform des Organismus 65 kommt, geht man vorzugsweise von einem vegetativen Inoku-lum aus. Das vegetative Inokulum wird z.B. hergestellt, indem man eine geringe Menge Kulturmedium mit der Sporenform oder mit Mycelbruchstücken des Organismus inokuliert, wo

15

621687

durch man eine frische aktiv wachsende Kultur des Organismus erhält. Das vegetative Inokulum kann dann in einen grösseren Tank übertragen werden. Zum Anwachsen des vegetativen Inokulums kann man das gleiche Medium verwenden wie auch für grössere Fermentationen, man kann jedoch auch mit anderen Medien arbeiten.

Die A-28086 produzierenden Organismen kann man bei Temperaturen zwischen etwa 20 und etwa 40°C wachsen lassen. Zu einer optimalen Produktion an A-28086 kommt es anscheinend bei Temperaturen von etwa 27 bis 30°C.

Wie bei aeroben Submers-Kulturverfahren üblich, wird auch beim erfindungsgemässen Verfahren bevorzugt Luft durch das Kulturmedium geblasen. Für ein ausreichendes Wachstum des Organismus sollte man bei der Tankproduktion mit einem Luftvolumen von vorzugsweise über 0,1 Volumen Luft pro Volumen Kulturmedium pro Minute arbeiten. Für eine wirksame Produktion der A-28086 Antibiotica sollte das bei der Tankproduktion angewandte Luftvolumen vorzugsweise über 0,25 Volumen Luft pro Volumen Kulturmedium pro Minute betragen. Durch höhere Konzentrationen an gelöstem Sauerstoff wird die Bildung von Antibioticum nicht herabgesetzt.

Die Produktion an Antibiotica kann während der Fermentation überwacht werden, indem man Proben der Brühe oder von Extrakten der Mycelfeststoffe gegenüber Organismen, von denen man weiss, dass sie gegenüber den Antibiotica empfindlich sind, hinsichtlich ihrer antibiotischen Wirksamkeit untersucht. Ein derartiger zur Untersuchung der neuen Antibiotica geeigneter Testorganismus ist Bacillus subtilis ATCC 6633. Der Bioversuch wird am besten unter Verwendung von Papierblättchen auf Agarplatten durchgeführt.

Der pH-Anfangswert der nichtbeimpften Kultur schwankt in Abhängigkeit von dem verwendeten Medium. Der pH-Wert sollte im allgemeinen zwischen 6,0 und 7,5 liegen. Der pH-Wert am Ende der Fermentation, bei dem das Produkt geerntet wird, ist normalerweise etwa höher, und er beträgt insbesondere 6,5 bis 8,0.

Eine antibiotische Wirksamkeit lässt sich im allgemeinen am zweiten Tag der Fermentation feststellen. Zu einer maximalen Produktion an antibiotischer Aktivität kann es zwischen etwa dem sechsten und dem zehnten Tag kommen.

Nach erfolgter Produktion unter submersen aeroben Fermentationsbedingungen kann man die oben beschriebenen A-28086 Antibiotica aus dem Fermentationsmedium in hierzu üblicher Weise gewinnen. Die während der Fermentation eines A-28086 produzierenden Organismus gebildete antibiotische Aktivität tritt sowohl in der Mycelmasse als auch der filtrierten Brühe auf. Maximal lassen sich die A-28086 Antibiotica daher durch eine bevorzugte Kombination von Methoden gewinnen, zu denen eine Filtration, Extraktion sowie Absorptionschromatographie gehört. Ein bevorzugtes Lösungsmittel zur Abtrennung der A-28086 Antibiotica entweder aus der ganzen oder aus der filtrierten Fermentationsbrühe ist Äthylacetat, es reichen für diesen Zweck jedoch auch andere hierfür normalerweise verwendete Lösungsmittel aus.

Ein besonders zweckmässiges Verfahren zur Abtrennung der A-28086 Faktoren A, B und D besteht in der Erniedrigung des pH-Wertes der gesamten Fermentationsbrühe auf etwa pH 3,0. Bei diesem pH-Wert von 3,0 lassen sich A-28086 Faktoren A, B und D von der Mycelmasse mühelos durch Filtrieren trennen. Ein anderes günstiges Verfahren zur Abtrennung der A-28086 Faktoren besteht in einem Zusatz eines Bicarbonats, wie Natriumbicarbonat, zu der Gesamtbrühe, und zwar in Mengen von etwa 1 g pro Liter. Die A-28086 Faktoren können hierzu auch in Salzform von der Mycelmasse abgetrennt werden. Zur Abtrennung der Antibiotica aus der Mycelmasse wird Methanol als Lösungsmittel bevorzugt, es können hierzu jedoch auch andere niedere Alkohole und Ketone verwendet werden.

Die Gewinnung der A-28086 Antibiotica kann zweckmässigerweise auch durch azeotrope Destillation vorgenommen werden. Hierzu versetzt man z.B. die wässrige Fermentationsbrühe mit einem organischen Lösungsmittel, das mit Wasser ein geeignetes Azeotrop bildet. Dieses Gemisch aus Lösungsmittel und Fermentationsbrühe kann dann zur Entfernung wenigstens der Hälfte des Wassers aus der Brühe azeotrop destilliert werden, wodurch ein Gemisch aus Wasser und Lösungsmittel zurückbleibt, bei dem die A-28086 Antibiotica in dem organischen Lösungsmittel gelöst sind. Unlösliche Nebenprodukte lassen sich in geeigneter Weise abtrennen, beispielsweise durch Filtrieren oder Zentrifugieren. Die A-28086 Antibiotica können anschliessend aus der organischen Lösung in bekannter Weise gewonnen werden, beispielsweise durch Verdampfen des Lösungsmittels, Ausfällen unter Zugabe eines Nichtlösungsmittels oder Extraktion.

Organische Lösungsmittel, die mit Wasser ein zur Durchführung eines derartigen Gewinnungsverfahrens geeignetes Azeotrop bilden, sind vor allem Butylalkohol, Amylalkohol, Hexylalkohol, Benzylalkohol, Butylacetat, Amylacetat, 1,2-Dichloräthan, 3-Pentanon, 2-Hexanon, Benzol, Cyclohexa-non, Toluol, die Xylole und dergleichen.

Die Gewinnung durch azeotrope Destillation bietet einen besonderen Vorteil bei grosstechnischen Fermentationsverfahren. Sowohl Wasser als auch Lösungsmittel, die beide über Kopf im Azeotrop abgezogen werden, können durch bekannte Verfahren voneinander getrennt und dann zur weiteren Verwendung wieder rückgeleitet werden. Das auf diese Weise entfernte Wasser ist frei von Verunreinigungen und muss daher vor seiner Weiterleitung als Abwasser nicht zusätzlich behandelt werden. Das dabei entfernte Lösungsmittel kann in das Verfahren rückgeleitet werden.

Die weitere Reinigung der A-28086 Antibiotica besteht im allgemeinen in einem zusätzlichen Extraktions- und Adsorptionsverfahren. Hierzu werden zweckmässigerweise adsorptionsfähige Materialien eingesetzt, wie Silicagel, Aktivkohle, Florisil (Magnesiumsilicat, Floridin Co., P.O. Box 989, Tallahassee, Fla.) und dergleichen.

Wahlweise kann man die Feststoffe der Kulturbrühe unter Einschluss der Bestandteile des Mediums sowie des My-cels auch ohne Extraktion oder Abtrennung als Quelle für die A-28086 Antibiotica verwenden, wobei vorzugsweise jedoch zuerst das Wasser abgetrennt wird. So kann man das Kulturmedium nach Produktion der A-28086-antibiotischen Aktivität, beispielsweise durch Lyophilisieren trocknen und direkt mit einem Futtervorgemisch vermischen.

Das Mycélium kann jedoch nach Produktion der A-28086 Aktivität in dem Kulturmedium abgetrennt und getrocknet werden, wodurch man ein Produkt erhält, das sich direkt als Futtervorgemisch verwenden lässt. Wird das Mycel zu diesem Zweck abgetrennt, dann lässt sich das Ganze durch Zugabe von Calciumcarbonat (etwa 10 Gramm pro Liter) besser filtrieren, und man erhält zugleich ein besseres getrocknetes Produkt.

Unter den bis jetzt angewandten Bedingungen produzieren die oben beschriebenen Stämme von Streptomyces aureofaciens, die mit den Nummern NRRL 5758 sowie NRRL 8092 bezeichnet werden, insbesondere das Antibioticum A-28086 Faktor A als überwiegenden Faktor. Das Verhältnis der Faktoren schwankt zwar in Abhängigkeit von den angewandten Fermentationsbedingungen, doch macht der Faktor A im allgemeinen mehr als 99% der gesamten aus NRRL 5758 gewonnenen antibiotischen Aktivität und etwa 90% der gesamten aus NRRL 8092 gewonnenen antibiotischen Aktivität aus. A-28086 Faktor B macht den Grossteil der restlichen antibiotischen Aktivität aus NRRL 5758 aus,

5

10

IS

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

621687

und der Faktor D liegt lediglich in geringerer Menge vor. A-28086 Faktor D macht andererseits jedoch gewöhnlich etwa 8 bis 10% der gesamten gewonnenen antibiotischen Aktivität aus NRRL 8092 aus, und der Faktor B liegt hier lediglich in geringerer Menge vor.

Die Antibiotica A-28086 Faktoren A, B und D können in bekannter Weise voneinander getrennt und als Einzelverbindungen isoliert werden, beispielsweise durch Säulenchromatographie, Dünnschichtchromatographie und dergleichen. Zur Trennung der Faktoren A, B und D bedient man sich beispielsweise einer einer Säulenchromatographie über Silicagel, wobei man die Säule mit variierenden Lösungsmittelgemischen, wie Gemischen aus Benzol und Äthylacetat, eluiert. Bei Verwendung von bevorzugten Lösungsmittelgemischen aus Benzol und Äthylacetat zum Eluieren einer Silicagel-säule wird gewöhnlich der Faktor B als erster eluiert, und die Faktoren A und D kommen dann erst später. Das Fortschreiten der Elution lässt sich am einfachsten durch das oben beschriebene dünnschichtchromatographische Verfahren überwachen.

Die A-28086 Verbindungen inhibieren das Wachsen von Bakterien und Fungi, die Krankheitserreger für Tier und Pflanze sind. Die relativen mikrobiologischen Wirksamkeiten von A-28086 Faktoren A und B gehen aus der folgenden Tabelle V hervor.

Die hierin enthaltenen Werte werden nach dem üblichen Scheibendiffusionsverfahren ermittelt (hierzu werden 6 mm-Scheiben in Lösungen getaucht, die 1 mg Wirkstoff pro ml Lösung enthalten, und die so erhaltenen getrennten Scheibchen werden dann auf Agarplatten gelegt, die mit den jeweiligen Testorganismen geimpft sind).

TABELLE V

Inhibierungszone (mm) Testorganismus A-28086 A-28086

Faktor A Faktor B

16

TABELLE VI

Testorganismus

MIC (ng/ml)

5

Actinomyces bovis

<0,5

Clostridium inoeuum

<0,5

10

Clostridium perfringens

<0,5

Clostridium ramosum

4,0

Clostridium septicum

<0,5

Clostridium septicum bovine

<0,5

15

Eubacterium aerofaciens

1,0

Peptococcus anaerobius

< 0,5

Peptostreptococcus intermedius

16,0

20

Propionibacterium acnes 44

• 16,0

Propionibacterium acnes 79

2,0

Bacteroides fragilis ssp. fragilis

8,0

25

Bacteroides fragilis ssp. thetaiotacmicron

8,0

Bacteroides fragilis ssp. vulgatis Nr. 1563

8,0

30

Bacteroides fragilis ssp. vulgatis Nr. 1211

2,0

Fusobacterium symbiosum

<0,5

35

Fusobacterium necrophorum

8,0

Veillonella alcalescens

16,0

Staphylococcus aureus 19

Bacillus subtilis ATCC 6633 28

Sarcina lutea ATCC 9341 26

Mycobacterium avium ATCC

7992 12

Saccharomyces pastorianum

ATCC 2366 17

Candida tropicalis 14

Fusarium moniliforme 12

21 31 16

12 14

nicht untersucht

Ein wichtiger Gesichtspunkt ist die Tatsache, dass die A-28086-Verbindungen das Wachsen anaerober Bakterien hemmen. Die Minimalinhibierkonzentrationen (MIC), bei denen A-28086 Faktor A verschiedene anaerobe Bakterien hemmt, werden nach dem Standard-Agarverdünnungsver-such ermittelt, und die dabei erhaltenen Werte sind in Tabelle VI zusammengefasst. Die Endwerte werden nach 24-stündiger Inkubation ermittelt.

Auch die C2-CG-Acylester von A-28086 Faktor A sind 40 antibakteriell und antifungal wirksam. Diese Derivate zeigen eine erhöhte gram-positive Wirksamkeit. Die relative gram-positive Wirkung bestimmter solcher Derivate wird mit der Wirksamkeit von Faktor A verglichen. Die Verbindungen werden durch einen turbidometrischen Versuch auf 45 einem halbautomatisierten System untersucht (Autoturb®-Mikrobiologisches Untersuchungssystem, Elanco), wie es von N. R. Kuzel und F. W. Kavanaugh in J. Pharmaceut. Sei. 60 (5), 764 (1971) beschrieben wird. Zur Untersuchung der Antibiotica A-28086 werden folgende Versuchsparameter so herangezogen: Staphylococcus aureus (H-Heatley) NRRL B-314 in einem Nährbrühemedium (pH 7), wobei vier Stunden bei 37°C inkubiert wird. Die zu untersuchenden Verbindungen und der Standard werden in Methanol-Wasser (10:90) gelöst. Der Standard, nämlich A-28086 Faktor A, 55 wird in Konzentrationen von 2, 3,4 sowie 5 mg/ml in den Drehteller des Autoturbgerätes gegeben. Die zu untersuchenden Verbindungen werden soweit verdünnt, dass sie bei Eingabe in den Drehteller etwa 3 oder 4 mg Aktivität pro ml enthalten. Die untersuchten Verbindungen ergeben 6o im Vergleich zum Standard folgende relative Aktivitäten:

65

17

621687

Verbindung Relative-G+-Aktivität

Eine weitere interessante Wirkung ist die antimikrobielle Wirksamkeit der Verbindungen A-28086, nämlich die Wirksamkeit gegenüber Mycoplasma. Mycoplasmaarten, die auch als Pleuropneumonia-ähnliche (PPLO) Organismen bezeichnet werden, sind Krankheitserreger beim Menschen und bei verschiedenen Tieren. Mittel, die gegen PPLO-Or-ganismen wirken, werden insbesondere von der Geflügelindustrie benötigt. Durch in-vitro-Brühenverdünnungsstu-dien erhält man mit dem Antibioticum A-28086 Faktor A gegenüber verschiedenen Mycoplasmaarten folgende in Tabelle VII zusammengefasste Minimalinhibierkonzentratio-nen (MIC-Werte):

TABELLE VII

Organismus

M. gallisepticum

12,5

M. hyorhinis

12,5

M. synoviae

6,25

M. hypopneumoniae

6,25

M. hyosynoviae

6,25

Zum Desinfizieren von Oberflächen, um Tiere vor verschiedenen Mycoplasmaarten zu schützen, reichen bereits Lösungen mit nur 10 Milligramm Antibioticum A-28086 pro Milliliter Lösung aus.

Die A-28086 Verbindungen sind ferner antivirale Mittel. A-28086 Faktor A wirkt gegenüber Poliovirus Typ III, Vaccinia-Virus, Herpes-Virus und Semliki-Forest-Virus, wie durch invitro-Plattensuppressionsversuche gezeigt wird, die den von Siminoff in Applied Microbiology 9 (1), 66-72 (1961) beschriebenen Versuchen ähnlich sind. A-28086 Faktor A ist ferner gegenüber dem übertragbaren Gastroenteri-tis-Virus, Newcastle-Disease-Virus und infektiösen Rinder-Rhinotracheitis-Virus wirksam, wie durch ähnliche Gewebekulturuntersuchungen gezeigt wird.

Die Verbindungen A-28086 können zur Bekämpfung von Viren Säugetieren daher oral, topisch oder parenteral verabreicht werden. Geeignete Dosierungsspiegel zur Verhinderung oder Behandlung einer viralen Erkrankung liegen zwischen etwa 1 und etwa 5 mg/kg Tierkörpergewicht, und zwar je nach dem Virus und der Frage, ob der Wirkstoff prophylaktisch oder therapeutisch verwendet werden soll.

Lösungen, die eine A-28086 Verbindung, vorzugsweise zusammen mit einem oberflächenaktiven Mittel, enthalten, können darüber hinaus zur Dekontaminierung des in-vitro-Habitats verwendet werden, auf dem Viren, wie Polio oder Herpes, vorhanden sind. Lösungen mit einem Gehalt von etwa 1 bis etwa 1500 mg/ml einer A-28086 Verbindung reichen zur Bekämpfung von Viren aus.

Die akute Toxizität LD50 des Antibiotikums A-28086 Faktor A beträgt nach intraperitonealer Verabreichung an die Maus 7,15 mg/kg.

Die Verbindungen A-28086 sind ferner auch Insekti-5 cide sowie Acaricide. Die Verbindungen A-28086 wirken in Anwendungsmengen von nur 500 ppm gegenüber Insekten, wie dem Mexikanischen Bohnenkäfer, dem Wolfsmilchkäfer und der Hausfliege, und sie sind ferner wirksam gegenüber Milben, wie der Blattspinnmilbe. Darüber hinaus io wirken die Verbindungen A-28086 in Auftragsmengen von 0,1 ppm gegenüber Moskitolarven.

Eine wichtige Eigenschaft der Verbindungen A-28086 ist ihre anticoccidiale Wirkung. Fütterungsversuche zeigen beispielsweise, dass man günstigere Gewichtszunahmen bei 15 jungen Hühnchen erhält, wenn man diesen ein Futter gibt, das nur 0,003% einer A-28086-Verbindung enthält, und mit Wirkstoffkonzentrationen von nur 0,005 % lässt sich die Mortalität verhindern und die Anzahl von Verletzungen bei Hühnchen herabsetzen, die von Coccidiosis befallen 20 sind. Die bei Versuchen unter Verwendung von Faktor A an Hühnchen, die von verschiedenen Eimeria-Species befallen sind, erhaltenen Ergebnisse gehen aus den folgenden Tabellen VIII bis X hervor.

MIC (mg/ml)

A28086 Faktor A (Standard)

1

A28086-A-Acetylesterderivat

2,5

A28086-A-Propionylesterderivat

7

A28086-A-n-Butyrylesterderivat

8

A28086-A-n-V alerylesterderivat

14

A28086-A-n-Caproylesterderivat

20

621687 18

TABELLE Vili

Wirksamkeit des Antibioticums A-28086 Faktor A gegenüber Eimeria Tenella

Wirkstoffkonzentration im Futter in Gew.-%

Anzahl der Hühnchen prozentuale Mortalität prozentuale Gew.-Zunahme

Mittlerer Schädigungswert prozentuale Erniedrigung des Schädigungswertes

0,04

10

0

50

0

100

0,02

10

0

82

0,2

95

0,01

10

0

94

0,2

95

Infizierte Kontrollen

20

35

68

3,65

—

Normale Kontrollen

20

0

100

—

—

0,02

20

0

84

0

100

0,01

20

0

96

0

100

0,005

20

0

91

2,8

27

0,0025

20

10

87

3,85

0

Infizierte Kontrollen

20

40

74

3,85

—

Normale Kontrollen

20

0

100

—

—

TABELLE IX

Wirksamkeit des Antibioticums A-28086 Faktor A gegenüber verschiedenen Spezies von Eimeria 1

infizierende Organismen

Wirkstoffkonzentration im Futter in Gew.-%

prozentuale Mortalität prozentuale Gewichtszunahme

Mittlerer Schädigungswert prozentuale Erniedrigung des Schädigungswertes gesamte durchgekommene Oocyten/Tier (1 X 106)

prozentuale Reduktion

Eimeria acervulina

0,005 0,0025

0 0

87 82

0,75 1,25

53

6,15 4,91

83 86

infizierte Kontrollen

—

0

63

1,60

—

36,32

—

Eimeria maxima

0,005

0

85

0,2

85

1,95

40

infizierte Kontrollen

—

0

65

1,3

—

3,24

—

Eimeria brunetti

0,005

0

88

1,2

__

2,31

58

infizierte Kontrollen

—

0

62

1,7

—

5,55

—

1 vier Wiederholungen, jeweils 5 Brathähnchen

19

TABELLE X

Wirksamkeit des Antibioticums A-28086 Faktor A gegenüber gemischten Spezies von Eimeria 1

621687

Infizierende Organismen

Wirkstoffkonzentration in Gew.-%

prozentuale Mortalität prozentuale Gewichtszunahme

Intestinalschädigungen prozentuale Reduktion

Mittel

Caecalschädigungen prozentuale Reduktion

Mittel

E. necatrix und E. tenella infizierte Kontrollen

0,005

0 20

94 52

0,7 1,7

59

1,75 3,5

50

E. tenella, E. necatrix, E. maxima, E. brunetti, E. acervulina und

E. mivati infizierte Kontrollen

0,01

0 50

91 12

0,4 1,9

79

0,9 3,3

73

1 vier Wiederholungen, jeweils 5 Brathähnchen

Zur Verhinderung oder Behandlung von Coccidiosis bei Geflügel kann man den Tieren eine nichttoxische anti-coccidiale Menge einer Verbindung A-28086, und zwar vorzugsweise oral auf täglicher Basis, verabreichen. Die Verbindung A-28086 kann über eine Reihe von Wegen geliefert werden. Die einfachste Verabreichungsart besteht jedoch in Verbindung mit einem physiologisch unbedenklichen Träger, vorzugsweise dem jeweiligen Futter der Tiere. Zur Bestimmung der geeigneten Konzentration der Verbindung A-28086 müssen zwar verschiedene Faktoren berücksichtigt werden, die zu verabreichenden Mengen betragen im allgemeinen jedoch 0,003 bis 0,04 Gewichtsprozent, auf das nicht mit Wirkstoff versehenes Futter bezogen, und sie machen vorzugsweise 0,005 bis 0,02 Gewichtsprozent des Futters aus.

Eine weitere wichtige Eigenschaft der Verbindungen A-28086 ist ihre Fähigkeit zur Verbesserung der Futterutili-sationseffizienz bei Tieren. So wird beispielsweise die Fut-terutilisationseffizienz bei Wiederkäuern, die über eine entwickelte Pansenfunktion verfügen, durch Einsatz von A-28086 Verbindungen verbessert.

Wie oben erwähnt, wird die Effizienz der Kohlenhydrat-verwertung bei Wiederkäuern durch Behandlungen verbessert, durch die die Pansenflora des Tieres eher zur Produktion von Propionatverbindungen als zur Produktion von Acetat- oder Butyratverbindungen angeregt wird. Die Effizienz der Futterverwertung lässt sich überwachen, indem man die Produktion und Konzentration der Propionatverbindungen im Pansen unter Einsatz folgender Methoden beobachtet:

Über eine in den Pansen reichende chirurgisch eingesetzte Fistel entnimmt man einem Ochsen Pansenflüssigkeit. Der Ochse wird mit einem hochwertigen Kornfutter gefüttert. Eine Probe der Pansenflüssigkeit wird über ein aus vier Tüchern bestehendes Seihtuch abgeseiht, und das dabei erhaltene Filtrat wird gesammelt. Das von dem Seihtuch zurückgehaltene stückige Material wird anschliessend in soviel physiologischem Puffer resuspendiert, dass man wieder das ursprüngliche Volumen der Pansenflüssigkeit er-

30 hält, und diese Suspension wird erneut filtriert. Der hierzu verwendete Puffer hat folgende Zusammensetzung:

Bestandteile g/Liter

35

Na,HP04

0,316

kh2po4

0,152

NaHCOa

2,260

40

KCl

0,375

NaCl

0,375

MgS04

0,112

45

CaCl2. 2H,0

0,050

FeS04. 7H2H

0,008

MnS04. H20

0,004

50

ZnS04. 7H20

0,004

CuS04. 5HaO

0,002

CoC12 . 6HLO

0,001

Dieser Puffer ist im übrigen von Cheng et al. in J. Dairy Sei. 38, 1225-1230 (1955) beschrieben.

Die beiden Filtrate werden vereinigt, worauf man sie so lange stehen lässt, bis sich oben festes Material abschei-60 det. Die klare Schicht wird abgetrennt, mit dem gleichen Puffer (1:1) verdünnt und dann auf einen pH-Wert von 6,8 bis 7,0 eingestellt.

Die verdünnte Pansenflüssigkeit (10 ml) wird zusammen mit 40 mg des oben beschriebenen Futters, einem wei-65 teren Milligramm Sojabohnenprotein und der zu untersuchenden Verbindung in einen 25 ml-Kolben gegeben. Jede Behandlung wird in vier Kolben durchgeführt. Es werden auch 2 Sätze aus je vier Vergleichskolben verwendet. Man

621687

20

arbeitet mit einem Vergleich zur Zeit Null und einem Ver-gleich nach 16-stündiger Inkubation. Alle Versuchskolben werden 16 Stunden bei 38°C inkubiert. Nach erfolgter Inkubation wird der pH-Wert gemessen, und man versetzt jeden Kolben mit 25-prozentiger Methaphosphorsäure 5

(2 ml). Hierauf lässt man den Kolbeninhalt absetzen, und die überstehenden Flüssigkeiten werden gaschromatogra-phisch bezüglich der darin enthaltenen Propionat-, Acetat-und Butyratverbindungen analysiert. Durch die erfindungs-gemässen Wirkstoffe wird die Produktion von Propionat ge- 10 gemiber den Vergleichen stark erhöht.

Die mit den neuen Wirkstoffen erhaltenen Ergebnisse werden statistisch mit den Ergebnissen der Vergleiche verglichen. Aus Tabelle XI geht das Verhältnis der Konzentrationen an flüchtigen Fettsäuren in den behandelten Kolben 15 und der Konzentrationen in den Vergleichskolben hervor.

TABELLE XI

Verhältnis aus Behandlung zu Kontrolle

Verbindung

ppm in der Pansenflüssigkeit

Molprozent Acetat

Molprozent Butyrat

Molprozent Propionat gesamtes VFA mMol/Liter

A-28086 Faktor

A

1

0,94

0,87

' 1,34

1,26

A-28086 Faktor

B

1

0,92

0,96

1,15

1,29

A-28086 Faktor Acetylester

A

1

0,79

0,76

2,04

1,04

A-28086 Faktor Propionylester

A

1

0,90

0,68

1,73

1,25

A-28086 Faktor Butyrylester

A

1

0,91

0,81

1,56

1,19

A-28086 Faktor Valerylester

A

1

0,92

0,79

1,55

1,18

A-28086 Faktor Caproylester

A

1

0,86

0,97

1,57

0,99

tischen Futter, das mit A-28086 Faktor A versetzt ist. Jede Teilmenge (100 ml) der entnommenden Pansenflüssigkeit 45 wird mit 10-prozentiger Metaphosphorsäure (100 ml) versetzt. Sodann lässt man die Proben absetzen und analysiert die überstehenden Flüssigkeiten gaschromatographisch zur Bestimmung der Propionsäurekonzentration.

Die in Tabelle XII angeführten Versuchsergebnisse sind 50 die mittleren prozentualen Zunahmen der Propionsäurekonzentration im Pansen, und zwar Mittelwerte aus 5 Analysen während einer 14tägigen Versuchsdauer. Die Vergleiche enthalten etwa 20 Mol-prozent Propionsäure.

TABELLE XII

A-28086 Faktor A prozentuale Zunahme gegenüber

(mg/Tag) den Kontrollen

60 25 17,4

100 54,0

Durch in-vivo-Versuche wird darüber hinaus gezeigt, 65 dass A-28086 Faktor A die Futterutilisationseffizienz bei Schafen erhöht. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen, die über eine Zeitspanne von 56 Tagen durchgeführt werden, gehen aus der folgenden Tabelle XIII hervor.

aus jeder Behandlungsgruppe füttert man mit einem iden-

Die Wirksamkeit der Kohlehydratutilisation wird anhand von in-vivo-Untersuchungen weiter demonstriert, die an Tieren durchgeführt werden, in deren Pansen Fisteln angelegt sind, über die man Proben des Panseninhalts entnehmen kann.

Der in Tabelle XII angeführte Versuch wird unter Verwendung erwachsener mit Fisteln versehener Ochsen durchgeführt, die jeweils etwa 554 kg wiegen. Zwei Ochsen werden mit einem normalen Futter gefüttert, und vier Ochsen

21

621687

TABELLE XIII

A-28086 Faktor A Anzahl in g pro Tonne Futter der Tiere

Mittlere tägliche Gewichtszunahme in kg pro Tag

Futteraufnahme in kg pro Tag

Verhältnis aus Futteraufnahme zu Gewichtszunahme prozentuale Verbesserung

9

18

Kontrolle

13 13 17

0,20 0,17 0,19

1,50 1,43 1,61

7,40 8,31 8,38

12 1

Die Verbindungen A-28086 Faktor D sind antivirale Mittel. A-28086 Faktor D wirkt gegenüber Maryland-B-Virus, Poliovirus Typ III, COE-Virus, Herpes-Virus und Semliki-Forest-Virus, wie durch den in-vitro-Plattensup-pressionsversuch gezeigt wird, der dem von Siminoff in Applied Microbiology 9 (1), 66-72 (1961) beschriebenen Versuch ähnlich ist. A-28086 Faktor D ist ferner wirksam gegenüber dem übertragbaren Gastroenteritis-Virus, New-castle-Disease-Virus und infektiösem Rinder-Rhinotrachei-tis-Virus, wie sich durch ähnliche Gewebekulturuntersu-chunigen ergibt.

Die Tatsache, dass die Verbindungen A-28086-Faktor D sowohl gegenüber Viren als auch gegenüber anaeroben Bakterien wirksam sind, macht diese Verbindungen besonders geeignet zur Behandlung oder Verhinderung von Enteritis bei Hühnchen, Schweinen, Rindern und Schafen. Die Verbindung A-28086 Faktor D eignet sich ferner zur Behandlung einer Enterotoxämie bei Wiederkäuern.

Die anticoccidiale Wirkung der neuen Verbindungen A-28086 Faktor D ist eine wichtige Eigenschaft. Die anticoccidiale Wirkung von A-28086 Faktor D gegenüber Eimeria tenella wird durch in-vitro-Versuche gezeigt. Hierzu bedient man sich des folgenden Verfahrens [bezüglich Einzelheiten wird auf L. R. McDougald und R. B. Galloway in Exper. Parasitology 34, 189-196 (1973) verwiesen]:

Unter Einsatz üblicher Techniken stellt man unter Verwendung von Leighton-Röhrchen, Plastikschälchen oder Platten oder sonstiger geeigneter Kulturbehältnisse Wirtszellkulturen her. Nach 2 bis 3 Tage langem Wachsen in einem geeigneten Kulturmedium (Eeagle Minimalessential-medium, Lactalbuminhydrolysat in Earle- oder Hank-Salzlösung, Medium 199 und dergleichen) bildet sich gewöhnlich eine geeignete Monoschicht, die infiziert und mit Wirkstoff behandelt werden kann. Für diese Untersuchungen werden Primärkulturen von Hühnchennierenzellen verwen-det.

Aus den Fäkalien infizierter Hühnchen gewinnt man lebende Oocysten von Eimeria tenella, und diese werden vor ihrer Verwendung gereinigt und sterilisiert. Die Oocysten sporuliert man dann durch Inkubation bei Raumtemperatur, indem man durch die Suspension Luft leitet oder diese Suspension auf einem Rotationsschüttler oder einem sonstigen geeigneten Gerät leicht schüttelt. Zur Verhinderung von Bakterien oder Schimmelwachstum während der Sporulation kann man Kaliumdichromat oder Schwefelsäure (oder andere Chemikalien) verwenden.

Die infektiven Sporozoiten lassen sich aus den Oocysten durch eine Kombination aus einer mechanischen Zerstörung der Wand des Oocysten, anschliessende Behandlung mit Trypsin und Behandlung mit Gallensalzen excystieren, wodurch die Selbstbefreiung der Sporozoiten aus den Spo-rocysten eingeleitet wird.

Zellkulturen werden infiziert, indem man in das Kultur-gefäss lebende Sporozoiten einbringt. Die zu untersuchenden Chemikalien kann man gleichzeitig damit oder auch später einführen. Der zu untersuchende Wirkstoff wird in is der gewünschten Konzentration in 10% Dimethylformamid in physiologischer Salzlösung eingebracht. Der Endpunkt des Versuchs besteht in einer Hemmung nichtgeschlechtlicher Entwicklungsstufen, und er wird durch mikroskopische Untersuchung von Kulturen bestimmt, die man 96 Stun-20 den nach Infektion fixiert und anfärbt. Die Ergebnisse werden angegeben in wirksam (A), unwirksam (N) oder cycotoxisch (C), und zwar je nach der Gegenwart oder Fehlen von Schizonten der zweiten Generation und irgendeiner offensichtlichen Toxizität gegenüber der Zellmono-25 schicht.

Die bei dieser Untersuchung für A-28086 Faktor D erhaltene anticoccidiale Wirksamkeit ist in der folgenden Tabelle XIV zusammengefasst.

30

TABELLE XIV

Anticoccidiale Wirksamkeit Antibioticum A-28086 Faktor D

35

40

45

50

Konzentration von A-28086 Faktor D (mg/ml)

Bewertung

5

C

1

C

0,2

c

0,4

A, C *

0,03

A

0,02

A

0,01

A

0,008

N

* Ergebnis aus zwei Versuchen.

Ein weiteres interessantes Merkmal der Verbindungen 55 A-28086 Faktor D ist ihre Fähigkeit zur Verbesserung der Futterutilisationseffizienz bei Wiederkäuern, die über eine entwickelte Pansenfunktion verfügen. Der Mechanismus zur Utilisation bzw. Verwertung des überwiegenden nutritiven Anteils (Kohlehydrate) von Wiederkäuerfutter ist ge-60 nau bekannt. Durch im Pansen des Tieres vorhandene Mikroorganismen werden Kohlenhydrate unter Bildung von Monosacchariden abgebaut, und diese Monosaccharide werden dann in Pyruvatverbindungen umgewandelt. Die Pyru-vate werden durch mikrobiologische Verfahren unter Bil-65 dung von Acetaten, Butyraten oder Propionaten metaboli-siert, die man kollektiv als flüchtige Fettsäuren (VFA) bezeichnet. Bezüglich einer detallierteren Erörterung dieser Zusammenhänge wird auf Leng in «Physiology of Digestion

621687

22

and Metabolismi in the Ruminant, «Phillipson et al. Eds., Oriel Press, Newcastle upon Tyne, England (1970), Seiten 408-410 verwiesen.

Die relative Effizienz der VFA-Utilisation wird von McCullough in Feedstuffs, 19. Juni 1971, Seite 19, Eskeland et al. in «Digestive Physiology and Nutrition of Ruminants», Band 2, (1971), Seiten 622 und 625 erörtert. Es werden zwar auch die Acetate und Butyrate utilisiert, die Utilisation der Propionate ist jedoch höher. Ist zu wenig Propionat vorhanden, dann entwickelt sich bei den Tieren ferner eine sogenannte Ketosis. Durch eine geeignete Verbindung werden die Tiere daher zur Bildung eines höheren Anteils an Propionaten aus Kohlenhydraten angeregt, wodurch sich die Utilisationseffizienz für Kohlenhydrate erhöht und gleichzeitig die Gefahr einer Ketosis verringert.

Die Wirksamkeit eines derartigen Wirkstoffes lässt sich bestimmen, indem man seinen Einfluss auf die Produktion und Konzentration der Propionatverbindungen im Pansen nach dem gleichen Verfahren ermittelt, wie es auch oben im Zusammenhang mit Faktor A verwendet wird.

Die dabei erhaltenen Versuchsergebnisse sind verglichen mit Vergleichsergebnissen statistischer Werte. Aus Tabelle XV geht das Verhältnis der Konzentrationen an flüchtigen Fettsäuren in mit A-28086 Faktor D behandelten Kolben und den Konzentrationen in den Vergleichskolben hervor.

10

15

20

25

TABELLE XV

A-28086 D mg/ml

Molprozent Acetat

Molprozent Butyrat

Molprozent Propionat gesamtes VFA mMol/Liter

1,0 0,3

0,8715 0,8976

0,7973 0,8726

1,7981 1,5871

1,1979 1,0630

Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele näher erläutert.

Beispiel 1

A. Schiittelflaschenfermentation von A-28086 unter Verwendung von S. aureofaciens NRRL 5758

Es wird eine Kultur von Streptomyces aureofaciens NRRL 5758 hergestellt und auf Schrägagar folgender Zusammensetzung gehalten:

Bestandteile

Menge derserumsuspension der Sporen und der Mycelfragmente 40 wird zu 6 Pellets lyophilisiert.

Ein auf diese Weise hergestelltes lyophilisiertes Pellet verwendet man zum Inokulieren von 50 ml eines vegetativen Mediums folgender Zusammensetzung:

Agar

20

g

Dextrin

10

g mit Enzym hydrolysiertes Casein

2

g

Rinderextrakt

2

g

Hefeextrakt

2

g

Destilliertes Wasser q. s. auf

1

Liter

45

50

55

Bestandteile

Menge

Glucose

20

g

Sojabohnenschrot

15

g

Maisquellwasser

10

g

CaC03

2

g

Leitungswasser q. s. auf

1

Liter

Die Schräge wird mit Streptomyces aureofaciens NRRL 5758 inokuliert, worauf man die beimpfte Schräge 6 bis 10 Tage bei 30°C inkubiert. Die reife Schrägkultur wird mit Rinderserum überdeckt und zum Ablösen der Sporen mit einer sterilen Schlaufe abgekratzt. Die dabei erhaltene Rin-

Das inokulierte vegetative Medium wird in einen 250 ml Erlenmeyer-Kolben gegeben und bei einer Temperatur von 30°C über eine Zeitspanne von 72 Stunden auf einem 60 Schüttler, der in einem Bogen mit etwa 5 cm Durchmesser bei 250 Umdrehungen pro Minute rotiert, inkubiert.

B. Tankfermentation von A-28086 unter Verwendung von S. aureofaciens NRRL 5758 65 Zur Bildung eines grösseren Volumens Inokulum verwendet man 10 ml des oben beschriebenen inkubierten vegetativen Mediums zum Inokulieren von 400 ml eines zweiten vegetativen Wachstumsmediums, das die gleiche Zu-

23

621687

sammemsetzung wie das vegetative Medium hat. Dieses in einem 2-Liter Kolben befindliche zweite Medium wird bei einer Temperatur von 30°C über eine Zeitspanne von 24 Stunden auf einem Schüttler, der in einem Bogen von etwa 5 cm Durchmesser, bei einer Geschwindigkeit von 250 Umdrehungen pro Minute rotiert, inkubiert.

Das in dieser zweiten Stufe erhaltene vegetative Medium (Liter) verwendet man zum Inokulieren von 100 Liter sterilem Produktionsmedium folgender Zusammensetzung:

Bestandteile Menge

Tapiocadextrin

60,0

g/Liter mit Enzym hydrolysiertes Casein

8,0

g/Liter

Melasse

15,0

g/Liter

MgS04. 7H20

0,5

g/Liter

CaC03

2,0

g/Liter raffiniertes Sojabohnenöl

5,0

g/Liter

Deionisiertes Wasser q. s. auf

1

Liter

Nach 30 Minuten langem Sterilisieren in einem Autoklaven bei einer Temperatur von 120°C und einem Druck von 1,05 bis 1,41 kg/cm2 hat das Medium einen pH-Wert von 6,7. Das inokulierte Produktionsmedium lässt man dann in einem 165 Liter fassenden Fermentationstank 10 Tage bei einer Temperatur von 29°C fermentieren. Das Fermentationsmedium wird mit steriler Luft belüftet, und zwar mit einer Geschwindigkeit von 0,4 Volumina Luft pro Volumen Kulturmedium und pro Minute. Das Medium wird mit üblichen Rührern bei einer Rührgeschwindigkeit von 250 Umdrehungen pro Minute gerührt.

Beispiel 2

Die Herstellung der Antibiotica A-28086 erfolgt nach dem gleichen Verfahren wie bei Beispiel 1, wobei man jedoch ein Kolbenproduktionsmedium folgender Zusammenr setzung verwendet:

Bestandteile Menge

Glucose

10

g/Liter essbare Melasse

20

g/Liter

Pepton

5

g/Liter

CaC03

2

g/Liter

Leitungswasser q. s. auf

1

Liter

Beispiel 3

Abtrennung des durch S. aureofaciens NRRL 5758 produzierten Antibioticum A-28086-Komplexes

Die nach dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren erhaltene gesamte Fermentationsbrühe (132 Liter) wird unter Verwendung einer Filterhilfe (Hyflo Supercel, nämlich einer Diatomeenerde, Johns-Manville Products Corp.) filtriert, wodurch man 97 Liter filtrierte Brühe erhält. Die filtrierte Brühe wird mit einem etwa gleichen Volumen Äthylacetat extrahiert. Der Äthylacetatextrakt wird von der wässrigen Phase abgetrennt und auf etwa 500 ml Volumen eingeengt. Der so erhaltene konzentrierte Äthylacetatextrakt wird zu einem grossen Überschuss Petroläther (Skelly Solve F; etwa 10 Liter) gegeben, um auf diese Weise unerwünschtes Material auszufällen und abzutrennen. Das abgetrennte Filtrat wird unter Vakuum eingedampft, wodurch man den Brühenaniteil des Antibioticum A-28086-Komplexes erhält (6,9 g).

Den im Mycel vorhandenen Anteil des Antibioticum A-28086-Komplexes erhält man durch zweimaliges Extrahieren des abfiltrierten Mycels mit jeweils etwa dem halben Volumen Methanol (62 Liter und 59 Liter). Die zwei Methanolextrakte werden vereinigt und zur Entfernung des Methanols unter Vakuum konzentriert. Nach diesem Einengen bleichen etwa 10 Liter einer wässrigen Phase zurück. Die wässrige Phase stellt man mit verdünntem Natriumhydroxid auf etwa pH 7,5 ein. Die dabei erhaltene Lösung wird zweimal mit etwa gleichen Volumina Äthylacetat (9 Liter und 10 Liter) extrahiert. Die Äthylacetatextrakte werden vereinigt und dann auf etwa 400 ml Volumen eingeengt. Der so erhaltene konzentrierte Äthylacetatextrakt wird zur Entfernung unerwünschter Materialien zu einem grossen Überschuss Petroläther gegeben, wozu man genauso vorgeht wie oben bei dem konzentrierten filtrierten Brühenextrakt. Der auf diese Weise aus dem Filtrat erhaltene im Mycel vorhandene Anteil des A-28086-Antibioticumkomplexes wiegt 20,6 g.

Beispiel 4

Isolierung der einzelnen Faktoren A und B aus A-28086

Der Mycelanteil des A-28086-Antibioticumkomplexes (235 g, hergestellt gemäss Beispiel 3) wird in etwa 80 ml Benzol gelöst. Die Benzollösung wird auf eine Silicagelsäule (9X130 cm, 8 Liter, Matheson Silicagel Sorte 62) aufgegeben. Die Säule eluiert man mit variierenden Gemischen aus Benzol und Äthylacetat. Der Fortgang der Elution wird dünnschichtchromatographisch verfolgt. Unter Verwendung eines Lösungsmittelsystems aus Benzol und Äthylacetat (90:10) wird zuerst der Faktor B eluiert und als Einzelfaktor isoliert. Der aus Aceton-Wasser umkristallisierte Faktor B (43 g) schmilzt bei 150 bis 153°C.

Es wird weiter mit Gemischen aus Benzol und Äthylacetat eluiert, wobei man die Menge an Äthylacetat jedoch graduell steigert. Hierbei wird der Faktor A eluiert. Die verschiedenen Fraktionen, die den Faktor A enthalten, werden vereinigt und unter Vakuum zu einem Rückstand eingedampft. Der dabei erhaltene Rückstand wird in Aceton (etwa 150 ml) gelöst, worauf man die Acetonlösung mit Wasser (etwa 150 ml) versetzt. Sodann stellt man den pH-Wert der erhaltenen Lösung durch Zugabe von 1 n Chlorwasserstoffsäure auf pH 3 ein. Das angesäuerte Gemisch wird etwa 1 Stunde gerührt, und während dieser Zeit entsteht ein Niederschlag. Der Niederschlag wird durch Filtrieren abgetrennt und aus Aceton (etwa 150 ml) unter anschliessender Zugabe von Wasser (etwa 60 ml) umkristallisiert. Das dabei angefallene Produkt wird über Nacht unter Vakuum getrocknet, wodurch man den Faktor A (etwa 6,6 g) erhält. Nach teilweiser Verdampfung des Acetons aus dem Filtrat erhält man eine zweite Ernte des Faktors A (etwa 1,2 g).

Beispiel 5 A-28086 Faktor A Acetylester

Antibioticum A-28086 Faktor A (7,4 g) wird in Pyridin (150 ml) gelöst. Die Lösung versetzt man mit Essigsäureanhydrid (50 ml). Die erhaltene Lösung wird gründlich durchmischt, worauf man sie über Nacht bei Raumtemperatur

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

621687

24

stehen lässt. Unter gründlichem Durchmischen gibt man dann Wasser (200 ml) zu. Das so erhaltene Gemisch lässt man 4 Stunden bei Raumtemperatur stehen. Der dabei ausfallende weisse Feststoff wird durch Filtrieren abgetrennt, mit Wasser gewaschen und an der Luft getrocknet. Der erhaltene Feststoff wird in Aceton (100 ml) gelöst, worauf man die Acetonlösung unter Vakuum zur Trockne eindampft (der obige Vorgang wird dreimal wiederholt). Nach Umkristallisieren dieses Feststoffes aus Aceton (100 ml) und Wasser (50 ml) erhält man A-28086 Faktor A Acetylester-derivat (6,14 g), das bei 100-103°C schmilzt.

Beispiele 6-9

a) Nach dem in Beispiel 5 beschriebenen Verfahren stellt man durch Umsetzen von Faktor A mit Propionsäure-anhydrid in Gegenwart von Pyridin Antibioticum A-28086 Faktor A Propionylesterderivat her, das bei 96-98°C schmilzt.

b) Nach dem in Beispiel 5 beschriebenen Verfahren stellt man durch Umsetzen des Faktors A mit n-Buttersäu-reanhydrid in Gegenwart von Pyridin Antibioticum A-28086 Faktor A n-Butyrylesterderivat her, das bei 79-81°C schmilzt.

c) Nach dem in Beispiel 5 beschriebenen Verfahren stellt man durch Umsetzen des Faktors A mit Capronsäure-anhydrid in Gegenwart von Pyridin Antibioticum A-28086 Faktor A n-Caproylesterderivat her, das bei 163-167°C schmilzt.

d) Nach dem in Beispiel 5 beschriebenen Verfahren stellt man durch Umsetzen von Faktor A mit Valeriansäu-reanhydrid in Gegenwart von Pyridin Antibioticum A-28086 Faktor A n-Valerylesterderivat her, das bei 173-175°G schmilzt.

Beispiel 10

Herstellung von A-28086 Faktor A Natriumsalz

Antibioticum A-28086 Faktor A (500 mg) wird in Aceton (50 ml) gelöst. Die erhaltene Lösung wird mit Wasser (50 ml) versetzt, worauf man den pH-Wert 5 n Natriumhydroxid auf 10,5 bis 11 einstellt. Die Lösung wird 1 Stunde gerührt und dann mit Äthylacetat extrahiert. Der Äthylacetatextrakt wird unter Vakuum zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird aus Aceton-Wasser-Lösung ausgefällt, wodurch man 378 mg A-28086 Faktor A Natriumsalz erhält, das bei 120-123°C schmilzt.

Beispiele 11-15

a) Durch Umsetzen von Antibioticum A-28086 Faktor A (500 mg) mit gesättigtem Bariumhydroxid unter Verwendung des in Beispiel 10 beschriebenen Verfahrens erhält man

369 mg A-28086 Faktor A Bariumsalz, das bei 188-190°C schmilzt.

b) Durch Umsetzen von Antibioticum A-28086 Faktor A (500 mg) mit 5 n Kaliumhydroxid nach dem in Beispiel 10 beschriebenen Verfahren erhält man 363 mg A-28086 Faktor A Kaliumsalz, das bei 165-167°C schmilzt.

c) Durch Umsetzen von Antibioticum A-28086 Faktor A (500 mg) mit 1 n Cäsiumhydroxid nach dem in Beispiel 10 beschriebenen Verfahren erhält man 540 mg A-28086 Faktor A Cäsiumsalz, das bei 190-210°C schmilzt.

d) Durch Umsetzen von Antibioticum A-28086 Faktor B mit 5 n Natriumhydroxid nach dem in Beispiel 10 beschriebenen Verfahren erhält man Antibioticum A-28086 Faktor B Natriumsalz.

Beispiel 16

Schüttelflaschenfermentation von A-28086 unter Verwendung von S. aureofaciens NRRL 8092

Man stellt eine Kultur von Streptomyces aureofaciens NRRL 8092 her und hält diese auf Schrägagar folgender Zusammensetzung:

Bestandteile

Menge k2hpo4

2 g

MgS04. 7H20

0,25 g nh4no3

2 g

CaC03

2,5 g

FeS04. 7H20

0,001 g

MnCl2. 7HaO

0,001 g

ZnS04. 7H20

0,001 g

Glucose

10 g

Agar

20 g

Deionisiertes Wasser q. s. auf

1 Liter pH (nicht eingestellt)

7,7

Der Schrägagar wird mit Streptomyces aureofaciens NRRL 8092 inokuliert, worauf man die inokulierte Schräge bei 30°C etwa 7 Tage inkubiert. Die reife Schrägkultur wird mit sterilem Rinderserum überdeckt und mit einer sterilen Schlaufe abgekratzt, wodurch man aus der Schrägkultur eine Sporen- und Mycelsuspension erhält. Die erhaltene Suspension wird zu maximal 6 Pellets lyophilisiert.

Ein auf diese Weise hergestelltes lyophilisiertes Pellet verwendet man zum Inokulieren von 50 ml eines vegetativen Mediums folgender Zusammensetzung:

Bestandteile

Menge

Glucose

20 g

Sojabohnenmehl

15 g

Maisquellwasser

10 g

CaC03

2 g

Leitungswasser q. s. auf

1 Liter

Der pH Wert wird mit verdünntem NaOH auf pH 6,5 eingestellt.

Das in einem 250 ml Erlenmeyer-Kolben befindliche inokulierte vegetative Medium wird bei einer Temperatur von 30°C über einen Zeitraum von 48 Stunden auf einem Rotationsschüttler, der unter einem Bogen von 5 cm bei einer Geschwindigkeit von 250 Umdrehungen pro Minute rotiert, inkubiert.

Das oben beschriebene inkubierte vegetative Medium (0,5 ml, 1 %) verwendet man zum Inokulieren von 50 ml eines Fermentationsmediums folgender Zusammensetzung:

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

25

621687

Bestandteile Menge

Tapiocadextrin1)

60,0

g

Mit Enzym hydrolysiertes Casein2)

6,0

g

Enzymatisches Hydrolysat von Casein3)

2,0

g

CaCOa

2,0

g

MgS04. 7H20

0,5

g

Rummelasse (Blackstrap-Melasse)

15,0

g

Raffiniertes Sojabohnenöl

5,0

ml

Leitungswasser q. s. auf

1

Liter pH (nicht eingestellt)

6,6

*) Staley Dextrin No. 11, A. E. Staley Co, Decatur III.

2) Amber EHC, Amber Laboratories, Juneau, Wisc.

3) NZ Amin A, Sheffield Chemical Co., Norwich, N. Y.

Beispiel 17

Tankfermentation von A-28086 unter Verwendung von S. aureofaciens NRRL 8092

Das in Beispiel 16 für die Schüttelkolbenfermentation von A-28086 verwendete Verfahren wird auch für eine Tankfermentation herangezogen. Zur Bildung eines grösseren Volumens an Inokulum werden 10 ml des inkubierten vegetativen Mediums zum Inokulieren von 400 ml eines zweiten vegetativen Mediums verwendet, das die gleiche Zusammensetzung wie das erste vegetative Medium hat. Dieses zweite Medium wird in einem 2 Liter Erlenmeyer-Kolben bei 30°C über eine Zeitspanne von 24 Stunden auf einem Rotationsschüttler bei einer Geschwindigkeit von 250 Umdrehungen pro Minute und unter einem Bogen von etwa 5 cm inkubiert.

Die neuen Verbindungen erhöhen den Anteil an Propionaten und somit die Effizienz der Futterutilisation, wenn sie Wiederkäuern oral in Mengen von etwa 0,05 bis etwa 5,0 mg pro kg und Tag verabfolgt werden. Die günstigsten Ergebnisse erhält man bei einer Verabreichung von etwa 0,1 bis etwa 2,5 mg Wirkstoff pro kg und Tag. Ein bevorzugtes Verfahren zur Verabreichung der genannten Wirkstoffe besteht in einem Vermischen mit dem Tierfutter, die Wirkstoffe lassen sich jedoch auch in anderer Weise verabreichen, beispielsweise in Form von Tabletten, Tränken, Boli oder Kapseln. Diese verschiedenen Dosierungsformen lassen sich in in der Veterinärmedizin bekannter Weise formulieren.

Jede einzelne Dosierungseinheit sollte eine Wirkstoffmenge enthalten, die der jeweiligen Tagesdosis direkt entspricht, mit der das Tier behandelt werden soll.

Das A-28086 kann zusammen mit Rindermastfuttern verwendet werden, die ein Rinderfutter und 1 bis 30 g Wirkstoff pro Tonne enthalten. Rinderfutter unterscheidet sich bekanntlich von anderen Futtermitteln, wie beispielsweise Geflügelfutter. Rinderfutter enthält Rohfutter, wie Baumwollsaathülsen oder Maissilage. Darüber hinaus enthält Rinderfutter noch einen hohen Prozentsatz, oft 15 bis 25%, nichtproteinartiger Stickstoffquellen. Eine häufig verwendete nichtproteinartige Stickstoffquelle ist Harnstoff.

Wie oben erwähnt, sind die neuen A-28086-Verbindungen antivirale Mittel, und sie wirken ferner gegenüber anaeroben Bakterien, insbesondere Clostridium perfringens. Die A-28086-Verbindungen eignen sich daher zur Behandlung oder Verhinderung einer Enteritis bei Hühnern, Schweinen,

Rindern und Schafen. Die neuen Verbindungen A-28086 können ferner zur Behandlung von Enterotoxämie bei Wiederkäuern verwendet werden.

Das dabei erhaltene inkubierte vegetative Medium der 5 zweiten Stufe (800 ml) verwendet man zum Inokulieren von 100 Liter sterilem Fermentationsmedium folgender Zusammensetzung:

Bestandteile Menge

Tapiocadextrin *)

60,0

g/Liter

Mit Enzym hydrolysiertes Casein 2)

6,0

g/Liter

Enzymatisches Hydrolysat von Casein 3)

2,0

g/Liter

CaC03

2,0

g/Liter

MgS04. 7H20

0,5

g/Liter

Rummelasse (Blackstrap-Melasse)

15,0

g/Liter

Raffiniertes Sojabohnenöl

5,0

g/Liter

Leitungswasser q. s. auf

1

Liter

*) Staley Dextrin No. 11, A. E. Staley Co., Decatur, III.

2) Amber EHC, Amber Laboratories, Juneau, Wisc.

3) NZ Amin A, Sheffield Chemical Co., Norwich, N.Y.

Nach Sterilisation in einem Autoklaven bei einer Tem-30 peratur von 121°C über eine Zeitspanne von 30 Minuten bei einem Druck von 1,05 bis 1,41 kg/cm2 hat das Medium einen pH-Wert von 6,8±0,1. Das inokulierte Produktionsmedium lässt man in einem 165 Liter fassenden Fermentationstank 19 bis 12 Tage bei einer Temperatur von 28±1°C 35 fermentieren. Das Fermentationsmedium wird mit steriler Luft in einer Geschwindigkeit von 0,4 Volumina Luft pro Volumen Kulturmedium pro Minute belüftet. Das Medium wird mit üblichen Rührern bei einer Geschwindigkeit von 300 Umdrehungen pro Minute gerührt.

40

Beispiel 18

Die Herstellung der Antibiotica A-28086 erfolgt nach dem im Beispiel 17 beschriebenen Verfahren, wobei man jedoch ein Schüttelflaschen-Tank-Produktionsmedium fol-45 gender Zusammensetzung verwendet:

Bestandteile Menge

50

Tapiocadextrin 2)

30,0

g/Liter

Glucose

15,0

g/Liter

Mit Enzym hydrolysiertes Casein 2)

3,0

g/Liter

55

Enzymatisches Hydrolysat von Casein 3)

1,0

g/Liter

Hefeextrakt

2,5

g/Liter

CaC03

2,0

g/Liter

60

MgS04. 7H20

1,0

g/Liter

Rummelasse (Blackstrap-Melasse)

15,0

g/Liter

Raffiniertes Sojabohnenöl

5,0

ml/Liter

65

Leitungswasser q. s. auf

1

Liter

1) Staley Dextrin No. 11, A. E. Staley Co., Decatur, III.

2) Amber EHC, Amber Laboratories, Juneau, Wisc.

3) NZ Amin A, Sheffield Chemical Co., Norwich, N.Y.

621 687

26

Der pH-Wert des Mediums wird nach Sterilisieren in einem Autoklaven in der in Beispiel 17 beschriebenen Weise auf 6,4 eingestellt.

Beispiel 19

Abtrennung des durch S. aureofaciens NRRL 8092 produzierten A-28086 Antibioticumkomplexes

Die nach dem Verfahren von Beispiel 17 erhaltene gesamte Fermentationsbrühe (60 Liter) wird durch Zugabe verdünnter Salzsäure auf pH 3 eingestellt. Die erhaltene Lösung wird unter Verwendung einer Filterhilfe (Hyflo Su-percel, nämlich einer Diatomeenerde, Johns-Manville Products Corp.) filtriert. Der abgetrennte Mycelkuchen wird mit 30 Liter Methanol extrahiert, worauf man den Extrakt unter Rühren mit 1,56 kg Natriumbicarbonat versetzt. Nach Abtrennen dieses Extrakts wird der Mycelkuchen wiederum mit weiteren 30 Liter Methanol extrahiert. Die beiden Methanolextrakte werden vereinigt und zur Entfernung des Methanols unter Vakuum konzentriert. Die erhaltene wässrige Lösung (etwa 7 Liter) wird mit verdünnter Salzsäure auf pH 7,5 eingestellt. Diese Lösung extrahiert man dann zweimal mit Äthylacetat (jeweils 7 Liter). Die Äthylacetatextrakte werden vereinigt und unter Vakuum zu einem öligen Rückstand konzentriert. Der ölige Rückstand wird in 1500 ml Aceton gelöst. Die Acetonlösung versetzt man mit Wasser (1500 ml). Die erhaltene Lösung wird mit verdünnter Salzsäure auf pH 3 eingestellt und 1 Stunde gerührt. Der entstandene Niederschlag wird abfiltriert und dann in Aceton (1500 ml) gelöst, worauf man die Lösung mit Wasser (400 ml) versetzt. Die erhaltene Lösung lässt man anschliessend bis zum Kristallisieren 16 Stunden stehen. Die entstandenen Kristalle werden abfiltriert und unter Vakuum getrocknet, wodurch man 74 g rohes kristallines Produkt erhält, das A-28086 Faktoren A und B sowie andere kristalline Verunreinigungen enthält.

Das obige kristalline Produkt (40 g) wird in etwa 250 ml Benzol gelöst. Die Benzollösung wird dann auf eine Silica-gelsäule (9X120 mm, Silicagel von Grace-Davidson, Sorte 62) gegeben. Die Säule wird der Reihe nach mit jeweils

40 1 folgender Lösungsmittel eluiert:

1) Benzol

2) Benzol : Äthylacetat

(9:

: D

3) Benzol : Äthylacetat

(4:

: 1)

4) Benzol : Äthylacetat

(7:

: 3)

5) Benzol : Äthylacetat

(1:

: 1)

6) Äthylacetat

7) Methanol

Es werden Fraktionen von jeweils 1 Liter gesammelt. Jede Fraktion wird durch einen entsprechenden Versuch gegenüber Bacillus subtilis untersucht und zur Identifizierung der eluierten Verbindungen dünnschichtchromatogra-phisch ausgewertet. Das A-28086-I wird mit einem Gemisch aus Benzol u. Äthylacetat (4:1) eluiert. Die Eluierung von A-28086 Faktor B erfolgt mit einem Gemisch aus Benzol und Äthylacetat (7:3). A-28086 Faktoren A und D werden in den Fraktionen eluiert, die man mit den Gemischen aus Benzol und Äthylacetat (7:3 und 1:1), nämlich den Fraktionen 119 bis 156, erhält. Diese Fraktionen werden vereinigt und unter Vakuum zur Trockne eingedampft. Der dabei erhaltene Rückstand wird in Aceton (500 ml) gelöst. Die Acetonlösung versetzt man mit Wasser (500 ml), worauf man den pH-Wert der erhaltenen wässrigen Lösung mit verdünnter Salzsäure auf pH 3 einstellt und die Lösung 1 Stunde rührt. Der dabei entstandene Niederschlag wird abfiltriert und aus Aceton (500 ml) sowie Wasser (180 ml)

umkristallisiert. Die dabei entstandenen Kristalle werden abfiltriert und unter Vakuum getrocknet, wodurch man 20,1 g eines Gemisches aus A-28086 Faktoren A sowie D erhält.

5

Beispiel 20

Trennen und Reinigung der Einzelfaktoren A und B

Das nach Beispiel 18 erhaltene kristalline Gemisch der io Faktoren A und D von A-28086 (18,8 g) wird in Benzol (50 ml) gelöst. Die Benzollösung wird auf eine Silicagelsäule (7 X 100 cm Säule, E. Merk Silicagel, Sorte 60, feiner als 0,062 mm) aufgegeben. Die Eluierung der Säule erfolgt bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 90 ml pro Stunde der 15 Reihe nach mit folgenden Eluiermitteln:

D

12 Liter Benzol

2)

12 Liter Benzol :

: Äthylacetat

(9:

D

3)

12 Liter Benzol :

: Äthylacetat

(4:

1)

4)

12 Liter Benzol

: Äthylacetat

(7

:3)

5)

10 Liter Methanol

Das Eluierverfahren wird durch Dünnschichtchromato-25 graphie mit Cellulose (Merk. Darmstadt, Cellulose auf Aluminiumträger) sowie bioautographisch unter Verwendung von B. subtilis verfolgt. Man arbeitet mit folgenden Lösungsmittelsystemen: Wasser : Methanol : Aceton (12 : 3 : 1), wobei der pH-Wert der Lösung mit Ammoniumhydroxid zuerst auf 30 pH 10,5 und dann mit Salzsäure auf pH 7,5 eingestellt wird.

Bis zum Auffinden einer Aktivität werden Fraktionen von 1 bis 2 Liter aufgefangen, und dann sammelt man Fraktionen von 200 ml. Die Fraktionen, die lediglich A-28086 Faktor D enthalten, werden vereinigt und im Vakuum zu einem 35 Rückstand eingedampft. Der Rückstand wird aus Aceton-Wasser (1 : 1) umkristallisiert. Die Kristalle werden abgetrennt und unter Vakuum getrocknet, wodurch man 140 mg kristallines A-28086 Faktor D erhält. Diejenigen Fraktionen, die A-28086 Faktor D mit einer Spur A-28086 Faktor A ent-40 halten, werden genauso behandelt, wodurch man weitere 150 mg kristallines A-28086 Faktor D erhält, das eine geringe Menge A-28086 Faktor A enthält.

Die Fraktionen, die lediglich A-28086 Faktor A enthalten, werden ebenfalls in der gleichen Weise behandelt, wo-45 durch man 4,7 g kristallines A-28086 Faktor A erhält.

Beispiel 21

Nach dem in Beispiel 16 beschriebenen Verfahren werden A-28086 Antibiotica hergestellt, wobei man jedoch ein 50 Schrägemedium folgender Zusammensetzung verwendet:

Zusammensetzung Menge

55 Rinderextrakt 2,00 g

Dextrin 20,00 g

Hefeextrakt 2,00 g go Enzymatisches Hydrolysat von Casein 4,00 g

CoCl2. 6H.O 0,02 g

Agar 20,00 g

Deionisiertes Wasser q. s. auf 1 Liter 65 n

Der pH-Wert ist mit KOH auf 7,0

eingestellt.

27

621687

Die inokulierte Schräge wird bei einer Temperatur von 28°C etwa 7 Tage inkubiert.

Beispiel 22

Nach dem in Beispiel 17 beschriebenen Verfahren werden die Antibiotica A-28086 hergestellt, wobei man jedoch ein Kolben-Produktions-Medium folgender Zusammensetzung verwendet:

Bestandteile Menge

Tapiocadextrin l)

80

g/Liter

Mit Enzym hydrolysiertes Casein 2)

15,0

g/Liter

Rummelasse (Blackstrap-Melasse)

15,0

g/Liter

Calciumcarbonat

2,0

g/Liter

Ammoniumsulfat

1,0

g/Liter

Magnesiumsulfat

0,5

g/Liter

Raffiniertes Sojabohnenöl

4,6

g/Liter

1) Staley Dextrin No. 11, A. E. Staley Co., Decatur, III.

2) Araber EHC, Amber Laboratories, Juneau, Wisc.

Beispiel 23

Nach dem in Beispiel 21 beschriebenen Verfahren werden A-28086 Antibiotica hergestellt, wobei man als dazwischen befindliche dritte Stufe jedoch ein vegetatives Medium folgender Zusammensetzung verwendet:

Bestandteile Menge

Cerelose

20,0

g/Liter

Maisquellwasser (Nassgewicht)

10,0

g/Liter

Soj abohnenschrot

15,0

g/Liter

CaC03

2,0

g/Liter

Hefe

2,0

g/Liter

Zuckerrübenmelasse

5,0

g/Liter

Beispiel 24 A-28086 enthaltendes Rinderfutter

Aus folgenden Bestandteilen wird ein ausgewogenes Rinderfutter mit hohem Korngehalt hergestellt:

Bestandteile

%

kg

Feingemahlener Mais

67,8

615,6

Gemahlene Maiskolben

10

90,7

Entwässertes Alfalfamehl 17% Protein

5

45,4

Mehl aus enthülsten Sojabohnen, mit Lösungsmittel extrahiert, 50% Protein

9,9956

90,76

Rohzuckermelasse

5

45,4

Harnstoff

0,6

5,44

Bestandteile

%

kg

A-28086 Faktor A

0,0044

0,04

Dicalciumphosphat, Futterqualität

0,5

4,54

Calciumcarbonat

0,5

4,54

Natriumchlorid

0,3

2,72

Spurenmineralvorgemisch

0,03

0,27

Vorgemisch aus Vitamin A und D2 1)

0,07

0,63

Vorgemisch aus Vitamin E2)

0,05

0,45

Calicumpropionat

0,15

1,36

!) Enthält pro kg: 4405300 I.E. Vitamin A, 5004400 I.E.

Vitamin D2 und 849,5 g Sojabohnenfutter mit 1% Ölzusatz. 2) Getrocknete Destillationsrückstände aus Mais mit Solubles, die

440530 I.E. d-alpha-Tocopherylacetat pro kg enthalten.

Das Futtergemisch wird zu Pellets verpresst. Bei einer mittleren täglichen Fressmenge von 6,8 kg Futter pro Tier erhält man mit diesem Futter etwa 300 mg A-28086 Faktor A pro Tier und Tag.

Beispiel 25 A-28086 Faktor D Acetylester

Antibioticum A-28086 Faktor D wird in Pyridin gelöst. Die Lösung versetzt man mit einer stöchiometrischen Menge Essigsäureanhydrid. Die erhaltene Lösung wird gründlich durchmischt, worauf man sie über Nacht bei Raumtemperatur stehen lässt. Die erhaltene Lösung wird dann mit einem Überschuss Wasser versetzt, worauf man alles gründlich durchmischt und das Gemisch mehrere Stunden bei Raumtemperatur stehen lässt. Der dabei entstehende Niederschlag wird abfiltriert, mit Wasser gewaschen und getrocknet. Der erhaltene Feststoff wird in Aceton gelöst und unter Vakuum zur Trockne eingedampft, wodurch man A-28086 Faktor D Acetylester erhält.

Beispiele 26 - 29

a) Nach dem in Beispiel 26 beschriebenen Verfahren setzt man A-28086 Faktor D mit Propionsäureanhydrid in Gegenwart von Pyridin zu Antibioticum A-28086 Faktor D Propionylesterderivat um.

b) Nach dem in Beispiel 26 beschriebenen Verfahren setzt man A-28086 Faktor D mit n-Buttersäureanhydrid in Gegenwart von Pyridin zu Antibioticum A-28086 Faktor D n-Butyrylesterderivat um.

c) Nach dem in Beispiel 26 beschriebenen Verfahren setzt man A-28086 Faktor D mit Capronsäureanhydrid in Gegenwart von Pyridin zu Antibioticum A-28086 Faktor D n-Ca-proylesterderivat um.

d) Nach dem in Beispiel 26 beschriebenen Verfahren setzt man A-28086 Faktor D mit Valeriansäureanhydrid in Gegenwart von Pyridin zu Antibioticum A-28086 Faktor D n-Valerylesterderivat um.

Beispiel 30

Herstellung von A-28086 Faktor D Natriumsalz

Antibioticum A-28086 Faktor D wird in Aceton gelöst. Die Lösung wird mit einer äquivalenten Menge Wasser versetzt, worauf man soviel 5 n Natriumhydroxid zugibt, dass

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

621687

28

sich der pH-Wert auf etwa 11 einstellt. Die erhaltene Lösung wird etwa 1 Stunde gerührt und dann mit Äthylacetat extrahiert. Der Äthylacetatextrakt wird unter Vakuum eingedampft, wodurch man A-28086 Faktor D Natriumsalz erhält.

Beispiele 31-33

a) Nach dem in Beispiel 31 beschriebenen Verfahren setzt man A-28086 Faktor D mit 5 n Kaliumhydroxid zu Antibioticum A-28086 Faktor D Kaliumsalz um.

b) Nach dem in Beispiel 31 beschriebenen Verfahren setzt man A-28086 Faktor D mit gesättigtem Bariumhydroxid zu Antibioticum A-28086 Faktor D Bariumsalz um.

c) Nach dem in Beispiel 30 beschriebenen Verfahren setzt man A-28086 Faktor D mit 1 n Cäsiumhydroxid zu Antibioticum A-28086 Faktor D Cäsiumsalz um.

Beispiel 34 A-28086 Faktor D enthaltendes Rinderfutter

Aus folgenden Bestandteilen wird ein ausgewogenes Rin- 20 derfutter mit hohem Korngehalt hergestellt:

Bestandteile

%

kg

Feingemahlener Mais

5 Gemahlener Maiskolben

Entwässertes Alfalfamehl 17% Protein

I0 Mehl aus enthülsten Sojabohnen, mit Lösungsmittel extrahiert, 50% Protein

Rohzuckermelasse

15 Harnstoff

25

30

A-28086 Faktor A

Dicalciumphosphat, Futterqualität

Calciumcarbonat

Natriumchlorid

Spurenmineralvorgemisch

Vorgemisch aus Vitamin A und D, ï)

Vorgemisch aus Vitamin E 2)

Calciumpropionat

67,8 10

9,9956 5

0,6

0,0044

0,5 0,5 0,3 0,03

0,07 0,05 0,25

615,6 90,76

45,4

90,7 45,4 5,44 0,040

4,54 4,54 2,72 0,27

0,63 0,45 1,36

1) Enthält pro kg: 4405300 I.E. Vitamin A, 5004400 I.E.

Vitamin D2 und 849,5 g Sojabohnenfutter mit 1% Ölzusatz.

2) Getrocknete Destillationsrückstände aus Mais mit Solubles, die 440530 I.E. d-alpha-Tocopherylacetat pro kg enthalten.

35

Das vermischte Futter wird zu Pellets verpresst. Bei einer im Mittel täglich gefressenen Futtermenge von 6,8 kg Fut ter pro Tier liefert dieses Futtermittel etwa 300 mg A-28086

Faktor D pro Tier und Tag.

v

8 Blätter Zeichnungei

Claims (6)

621687

1. Verfahren des neuen Antibioticum A-28086-Kom-plexes mit den Faktoren A, B und D oder der physiologisch unbedenklichen Salze davon oder der entsprechenden C2-Cc-Acylester zur Erhöhung der Futteraufnahme bei Wiederkäuern.

2. Verwendung nach Anspruch 1 des Faktors A des Antibioticum A-28086-Komplexes oder der physiologisch unbedenklichen Salze oder der C2-Cu-Acy]ester davon.

2

PATENTANSPRÜCHE

3. Verwendung nach Anspruch 1 des Faktors D des Antibioticum A-28086-Komplexes oder der physiologisch unbedenklichen Salze oder der C2-C(i-Acylester davon.

4. Verfahren zur Herstellung des neuen Antibioticum A-28086-Komplexes mit den Faktoren A, B und D, dadurch gekennzeichnet, dass man Streptomyces aureofaciens NRRL 5758 oder Streptomyces aureofaciens NRRL 8092 in einem Kulturmedium, das assimilierbare Quellen für Kohlehydrat, Stickstoff sowie anorganische Salze enthält, submers unter aeroben Fermentationsbedingungen solange züchtet, bis diese Organismen im Kulturmedium eine wesentliche Menge antibiotischer Aktivität produziert haben und den Antibioticum A-28086-Komplex aus dem Kulturmedium abtrennt.

5. Verfahren zur Herstellung der neuen Faktoren A, B und D des Antibioticum A-28086-Komplexes bzw. Herstellung der physiologisch unbedenklichen Salze dieser Faktoren, dadurch gekennzeichnet, dass man nach dem Verfahren gemäss Anspruch 4 den Antibioticum A-28086-Komplex mit den Faktoren A, B und D erzeugt und aus dem Kulturmedium abtrennt und anschliessend die Faktoren A, B und D isoliert und diese gegebenenfalls in die physiologisch unbedenklichen Salze überführt.

6. Verfahren zur Herstellung von C2-Cc-Acylestern der neuen Faktoren A, B und D des Antibioticum A-28086-Kom-plexes, dadurch gekennzeichnet, dass man nach dem Verfahren gemäss Anspruch 5 die Faktoren A, B bzw. D herstellt und dann durch Umsetzung mit einem Acylierungs-mittel in die entsprechenden C2-Cß-Acylester überführt.