SU576966A3 - Способ получени антибиотического комплекса а-28086 - Google Patents

Description

г)удельное вращение 54 , (с - 0,2 метанол), определ емое при 25°С; д)ИК - спектр поглощени  в хлороформе ее следующими максимумами поглощени ; 2,85; 3,34; 5,83; 6,84; 7,22; 7,53 (слабый), 5,78 (слабый ), 8,76 (сильный), 8,95 (сильный),9,15; 9,50 (сильный), 9,55 (сильный), 9,60; 9,85; 10,15; 10,45 и 10,70 (слабый) мк; е)в его УФ - спектре в этаноле только концевое поглощение ниже 200 ммк; ж)спектр ЯМР в дейтерохлороформе со следующими характеристиками: 66,01; 4,21; 4,11; 3,99; 3,89; 3,80; 3,67; 3,65; 3,57; 3,55; 2,83; 2,66; 2,58; 2,56; 2,30; 2,22; 1,96; 1,90; 1,85; 1,70; 1,62; 1,31; 1,25; 1,18; 0,95; 0,93; 0,77; 0,75; 0,73; 0,68 и 0,66 ч/млн; з) титруемую группу при величине рКд 7,9 в 80% - ном водном диметипформамиде; и) рентгенограмму, полученную методом дифракции рентгеновых лучей на образце в порошке (Си - радиаци , 1,5405Х, никелевый фильтр), имеющую следующие межплоскостные рассто ни  j в ангстремах (d); Значение Rf 0,11 Вода, насыщенна  0,41 Вода,насыщенна  кислоты и 1 % пип Вода- метанол-ац NH4OH до рН 10,5 1% МИБК, 0,5% Ы 17,4 г К2НР04, 30 Бензол, насыщенн Вода Вода-МИБК-этил м) кислотную функцию, способную образовать соли и эфир; н) одну по крайней мере гидроксильную группу , способную к этерификации. Изобретение предусматривает также.Cj-Cs -ациловые эфиры и физиологически приемлемые соли этих факторов. II. Фактор В антибиотика А-28086 - кристаллическое соединение белого цвета, когда кристаллизовано из смеси ацетона и воды, растворимо в низших спиртах, диметилформамиде, диметилсульфоксиде, этнлацетате, хлороформе, ацетоне и бензоле; но мало растворимо в гексане и нерастворимо в воде. Соединение имеет следующие характеристики: а)Т.ПЛ. 150-153С; б)молекул рный вес 762, определ емый масс спектрометрией с высоким разрешением; в)эмпирическую формулу С4зН-;оО11. определ емую масс - спектрометрией с высоким разрещением; г)ИК - спектр в хлороформе со следующими различными максимумами поглощени : ,82; 3,30; Система рас dОтносительна  интенсивность 12,00100 10,1050 9,2590 8,0040 7,5015 6,9290 6,4040 5,9805 5,6815 5.2040 4,9840 4,6240 4.2120 3,4810 к) Rf 0,24 при хроматографии в тонком слое на силикагеле в системе растворител  бензол-этилацетат (3:2) с применением Bacillus subtilis АТСС 6633 в качестве обнаруживающего организма; л) значение RfjB указанных ниже системах при хроматографии на бумаге с применением Bacillus subtilis АТСС 6633 в качестве обнаруживающего организма: ител  илизобутилкетоном (МИБК) К, плюс 2% паратолуолсульфоина (12:3:1) с добавлением ем НзГО4 до рН 7,5 в воде этанола на литр воды одой ат (98:1:1) ,77; 5,85; б,80; 7,20; 7,50 (слабый), 7,72 (сла8 ,57 (сильный), 8,68; ый), 7,80 (слабый), 9,50;9,83 (сильный), 9,90; ,90 (сильный), 9,10; 10,43 (слабый), 0,10; 10,17 (сильный), 11,35 (слабый). 0,80 (слабый), 11,20 (слабый), 11,73 (слабый) и 12,03 (слабый) мк; д) наблюдаемый максимум в этаноле в его УФ пектре при 220 ммк (E 137,5; ,477); е) спектр ЯМР в дейтерохлороформе со слеующими характеристиками: 5 7,20; 7,09; 6,26; 6,15; 4,19; 4,12; 4,05; 3,95; 3,89 3,52; 3,48; 2,81; 1,91; 1,84; 1,71; 1,18; 1,11; 0.96: 0,94; 0,90; 0,74 и 0,68 ч/млн; ж)величину fif 0,42 при хроматографии в тонком слое на силикагеле в смеси бензол - этилацетат (3.2) с применением Bacillus subtilis АТСС 6633 в качестве обнаруживающего организма; з)величины Rf в указанных ниже системах при хроматографии на бумаге с применением Bacillus subtilis АТСС 6633 в качестве обнаруживающего организма: G

RfСистема растворител 

Вода, насыщенна  МИБК, плюс 2% паратолуолсульфокислоты

и 1% пиперидина Вода-метанол-ацетон (12:3:1) с добавлением

NH40H до рН 10,5, затем НзР04 до

рН7,5

1%МИБК, 0,5% NH40H в воде

Бензол, насыщенный водой

Вода

Вода-МИБК-этилацетат (98:1:1) и) кислотную функцию, способную образоват соли и эфиры; к) две кетогруппы; л) одну по крайней мере гадроксильнуг группу. Предусмотрены и физиологически приемлемые соли фактора, III. Фактор D антибиотика А - 28086 - кристаллическое соединение белого цвета, когда кристаллизовано из смеси ацетона и воды, растворимое в метаноле, этаноле, диметилформамиде, диметилсульфоксвде , этилацетате, хлороформе, ацетоне и бензоле, но только мало растворимое в гексане и нерастворимое в воде; т.пл. 96-98°С. Соединение имеет следующие характеристики: а)молекул рный вес 778, определ емый массспектрометрией высокого разрешени ; б)примерный элементарный состав: 67,59% углерода , 9,38% водорода и 22,77% кислорода; в)эмпирическую формулу C4 H740i 1, определ емую - спектрометрией высокого разрешени ; г)удельное вращение - 56° (с 0,1 метанол ) , определ емое при 25° С; д)ИК - спектр в хлороформе со следующими максимумами поглощени : 2,89; 3,39; 3,43; 3,50; 5,88; 6,90; 7,25; 7,60; 7,84; 9,00; 9,26; 10,31; 10,58; 11,10 и 11,49 мк; е)УФ - поглощение в 95%-ном водном этаноле не наблюдаетс ; ж)спектр ЯМР в хлороформе со следующими характеристиками:5 6,00; 4,20; 4,10; 4,00; 3,98; 3,92; 3,86; 3,83; 3,79; 3,67; 3,64; 3,57; 3,54; 2,88; 2,81; 2,71; 2,62; 2,58; 2,48; 2,37; 2,29; 2,21; 2,15; 2,10; 2,04; 1, 1,89; 1,83; 1,76; 1,68; 1,61; 1,58; 1,55; 1,47; 1,39; 1,30; 1,25; 1,18; 0.95; 0,90; 0,88; 0,84; 0,74 и 0,68 ч/млн; Значение Rf Вода, насьц 0,10 Вода, насы 0,26 и 10% пипе Вода-мета NH4OH до до рН7,5 1% МИБК, 17,4 г К2Н Бензол, на

576966 з) титруемую группу с величино1 рКс 8,67 в 80%-ном вЬдном диметилформамиде; и) рентгенограмму, полученную методом дифракции рентгеновых лучей на образце в порошке ( радиаци , 1,5405Х, никелевый фильтр), имеющую следующие межплоскостные рассто 1ш , в ангс:фемах (d): Относительна  интенсивность 100 к) значени  Rf в указанных ниже системах при хроматографии в тонком слое в силикагеле с применением Bacillus subtilis АТСС 6633 в качестве обнаруживающего организма: Значение RfСистема растворител  0,26Бензол-этилацетат (3:2) 0,66Этилацетат-диэтнламин(95:5) л) значени  Rf в указанных 1шже системах при хроматографии на бумаге с применение Вас1Ии$ subtilis АТСС 6633 в качестве обнаруживающего организма: ма растворител    метшшзобутилкетоном (МИБК)   МИБК, плюс 2% паратолуолсульфокислоты а цетон (12:3:1) с добавлением ,5, затем НзР04 H4OH в воде 0 мл этанола на литр воды ный водой м) кислотную функцию, способную образоват;соли и эфиры; и) по крайней мере одну гидроксильную групну , способную к этерификации. Прегцусмотрены и Cj-Cg - аниловые эфиры и физиологически приемлемые соли этого фактора. Факторы А,В и D антибиотика А - 28086 Лвые члены группы полиэфирных антибиотиков. К членам этой гру1П1ы относ тс  монерпзин, дианэмицин (нигерцин) и салиномицин. Термин антибиотический комплекс означает смесь совместно ; образующихс  индивидуальных антибиотических факторов. Отношение ИНДИЕЙдуальных получаемых факторов в антибиотическом комплексе может измен тьс  в зависимости от примене1шых условий брожени . Комплекс антибиотика А - 28086 получают при выращивании нового штамма Streptomyces aureofaciuns-NRRL 5758 при брожении в аэробных услови х в толстом слое до достижени  значительного уровн  антибиотической активности. Этот антибиоти получают также при вырашивании еще одного нового штамма Streptomyces aureofaciens NRRL 8092. Полученный|с помощью S.aureofaciens NRRL 5758 или S.aureofaciens NRRL 8082 антибиотик экстрагируют из бродильного бульона и отдел ют от мицели  пол рнык-ш органическими растворител ми. Экстрагированную смесь раздел ют при концентрировании растворов, добавлении к концентрату петролейного эфира дл  осаждени  посторонних примесей с последующим фильтрованием и выпариванием фильтрата до получени  смеси антибиотика А - 28086. Эту смесь дополнительно очищают и раздел ют на индивидуальные факторь методом хроматографии на колонке. Содинени  А - 28086 замедл ют рост орга газмоЕ , патогенных дл  животных и растений. Соединега  А - 28086  вл ютс  агентами, замедл ющими рост кокцидий и, кроме того, они  вл ютс  антибакте альными,антивирусными;,активнымипротив органи мов, вызывающих пневмонии, инсектициднь1ми акарицидными агентами, а также веществами, повьпШющими эффективность использовани  корма жвачными животными. На фиг. 1-8 изображены ИК - спектры поглощени  в хлороформе. На фиг. 1 - фактора А антибиотика А - 28086; на фиг. 2 - фактора В антибиотика А - 28086; на фиг.-З - ацетилового эфира фактора А антибиотика А- 28086; на фиг. 4 - пропионилового эфира фак-тора А антибиотика А - 28086; на фиг. 5 - бутириловс го эфира фактора А антибиотика А - 28086; на фиг. 6 - валерилового эфира фактора А антибиотика А - 28086; на фиг. 7 - капроилового эфира фактора А антибиотика А - 28086 и на фиг. 8 - ИК -спектр поглощени  фактора D антибиотика А - 28086. Ь v БК-этилацетат (98:1:1) Факторы А - 28086 структурно похожи друг на  руга. Во врем  брожени  совместно образуютс  по крайней мере четыре фактора в BH/te смеси. Факторы отдел ют один от другого и факторы А,В нО вьщел ют в виде индивидуальных соединений. Смесь факторов А - 28086 растворима в больнгей части органических растворителей , но нерастворима в воде. Фактор А кристаллизуют из смеси ацетона и водь1. Он имеет температуру плавлени  У8100° С, отверждаетс  и снова плавитс  при 195-200° С. ЭлементарньЕЙ анализ фактора А дает следующий состав: углерод 66,69%,водород9,85; и кислород 23,10%. Эмпирическа  формула этого фактора С4зН72011 Фактор А имеет молекул рный вес приблизительно 764, определ емый масс - спектрометрией. На фиг. 1 показан ИК - спектр фактора А. Наблюдались следующие максимумь поглощени : 2,85; 3,34; 5,83; 6,82; 7,22; 7,5з (слабый), 7,78 (слабый), 8,75 (сильный), 8,95 (сильный), 9,15; 9,50 (сильный), 9,55 (сильный), 9,60; 9,85; 10,15; 10,45 и 10,70 (слабый) мк. . УФ - спектр фактора А в этаноле показывает только концевое поглощение ниже 220 ммк. Спектр ЯМР фактора А в дейтерохлороформе показал следующие характеристики: 66,01; 4,21; 4,11; 3,99; 3,89; 3,80; 3,67; 3,65; 3,57; 3,55; 2,83; 2,76; 2,74; 2,68; 2,66; 2,58; 2,56; 2,30; 2,22; 2,17; 2,10; 2,05; 1,96; 1,90; 1,85; 1,70; 1,62; 1,60; 1,47; 1,39; 1,31; 1,25; 1,18; 0,95; 0,93; 0,90; 0,88; 0,85; 0,77; 0,75; 0,73; 0,68 и 0,66 ч/млн. Фактор А, кристаллизованный из смеси ацетона и воды. Имел следующую рентгенограмму, полученную методом дифракции рентгеновых лучей на образце в порошке ( радиаил , 1,5405Х, никелевый фильтр, d - межплоскостное рассто  гие а ангстремах): dОтносительна  интенсивность 12,00100 10,1050 Удельное вращение фактора А -- 54° (с 0,2 метанол ) , определ емое при 25° С.

Электрометрическое титрование фактора А в 80% - ном водном растворе диметилформамида показывает присутствие титруемой группы с рК 7,9.

Фактор А растворим в таких органических растворител х, как метанол, этанол, диметилформамид , диметилсульфоксид, этилацетат, хлороформ , ацетон и бензол, но мало растворим в таких непоп рных органических растворител х, как гексан , и не раствор етс  в воде.

Фактор А антибиотика А 28086 имеет кислотную функцию, способную к образованию солей и эфиров, а также по крайней мере одну гидроксильную группу, способную этерифицироватьс .

Фактор В антибиотика А - 28086 - кристаллическое соединение белого цвета (при кристаллизации из смеси ацетона и воды), имеет т.пл. 150 Ч53° С.

Масс - спектрометрией с высоким разрешением установлено, что фактор В имеет молекул рный вес приблизительно 762 и предполагаемую змпиричесКуЮ формулу С4зН7о011.

На фиг. 2 показан ИК - спектр фактора В в хлороформе. Наблюдались следующие максимумы поглощени : 2,82; 3,30; 5,77; 5,85; 6,80; 7,20; 7,50 (слабый), 7,72,(слабый), 7,80 (слабый), 8,67 (сильный), 8,68;8,90 (сильный), 9,10; 9,50; 9,83 (сильный), 9,90; 10,10; 10,17 (сильный), 10,43 (слабый), 10,80 (слабый), 10,20 (слабый), 11,35 (слабый), 11,73 (слабый) и 12,03 (слабый) мк

УФ спектр фактора В в этаноле показьшает максимумы поглощени  при 220 ммк (Е 137,5; ,477).

Спектр ЯМР фактора В в дейтерохлороформе показал следующие характеристики; 6 7,20; 7,09; 6,26; 6,15; 4,19; 4,12; 4,05; 3,95; 3,89; 3,78; 3,62; 3,59; 3,52; 3,48; 2,81; 2,73; 2,63; 2,54; 2,52; 1,99; 1,91; 1,84; 1,71; 1,64; 1,55; 1,43; 1,33; 1,18; 1,11; 0,96; 0,94; 0,90; 0,87; 0,77; 0,74 и 0,68 ч/млн. .

Фактор В антибиотика А - 28086 растворим в таких органических растворител х, как, например, метанол, этанол, диметилформамид, диметилсульфоксид , этилацетат, хлороформ, ацетон и бензол; мало растворим в непол рных растворител х, например в гексане, и непастворим в воде.

Хот  химическа  структура фактора В не вы снена однако физические и химические свойства показывают , что фактор В имеет одну группу карбоновой кислоты, две кетонные группы и одну или более гидроксильных групп.

При получении с помощью S, aureofaciens NRRL 8092 фактор D составл ет до 10% вьщеленной антибиотической активности; при получении с помощью S. aureofaciens NRRL 5758 он  вл етс  наименьшим из факторов..

Фактор D антибиотика А - 28086 - кристаллический продукт белого цвета ( при кристаллизации из смеси воды и ацетона) с т.пл. 96-98° С. Кажуищйс  молекул 1: 1п,1й вес 778 (определ етс  массспектрометрией с высоким разрешением). Элементарный состав пика в масс-спектре натриевой соли фактора D 800,5050 (вьпшслено дл  €44473011 800,5050). В масс - спектре фактора О

в форме свободной кислоты наблюдали небольшой максимум при 778 и больший максимум при 760, 5117 ( вычислено дл  C44H720io ); м/з 760 в масс - спектре свободной кислоты  вл етс  результатом потери воды из молекул рного

иона. Поэтому состав молекул рного ио1И фактора D в форме свободной кислоты C44H74Ol 1

Предполагаема  эмпирическа  формула фактора D C44H740i 1 Элементарный анализ фактрра D дал следуюшлй состав: 67,59% углерода, 9% водорода и 22,77% кислорода.

Теоретически дл  C44H74Oi i требуетс  67,87% углерода, 9,51% водорода и 22,77% кислорода.

Фактор D в 95%

ном водном этаноле не поглощает УФ лучей.

Спектр ЯМР фактора D в дейтерохлороформе имеет следующие характеристики: 5 6,00; 4,20;

3,67; 4,10; 4,00; 3.98; 3,92; 3,86; 3,83; 3,79;

2,71; 3,64; 3,57; 3,54; 2,88; 2,91; 2,62; 2,58; 2,48; 2,43; 2,37; 2,29; 2,21; 2,10; 2,04; 2Д5; 1,97; 1,89; 1,83; 1,76; 1,68; 1,58; 1,55; 1,61; 1,47; 1,39; 1,30; 1,,18; 0,90; 0,88; 0,95; 0,84; 0,74 и 0,68 ч/млн.

Фактор D, кристаллизованный из смеси ацетона и воды, имеет следующую рентгенограмму, полученную методом дифракции рентгеновых лучей на образце в порошке (Си - радиаци , 1,5405 X, никелевый фильтр), d - межплоскостное рассто ние в ангстремах:

dОтносительна 

интенсивность

100 70 90 30 10

100 20 20 20 10 20 40 30 10 10 05 05 05

Удельное вращение фактора D - 56 (с - 0,1 метанол ) , определ емое при температуре

Электрометрическое титрование фактора в 80% ном водном диметилформамвде показало присутствие группы с рКа 8,67. Фактор D растворим в таких орга инорител х , как метанол, этанол, диметелферЛ:  диметилсульфоксид, этилацетат, хлороформ, ац и бензол; мало растворим в таких непол р органических растворител х, как, например, сан, и нерастворим в воде. Фактор D имеет кислотную функцию, спо Т сличина Rf фактор А фактор В бактор D 0,11 0,09 0,410,160,26 0,540,460,36 0,480,360,39 0,150,33 . 0,25 0,240,510,26 0,240,110,09 0,750,610,64 Величины Rf дл  факторов А, В и D в двух системах при хроматографии в тонком слое на силикагеле (предварительно покрытые пластины Величина Rf ФакюрА факторов факторЮ 0,240,420,26 0,540,340,66 Одновременно с комплексом антибиотика А-28086 образуетс  другое вещество, произвольно названное А-28086-1. Это вещество, не активное микробиологически, структурно родственно факторам антибиотика А-28086, А -28086 - 1 - кристаллическое соединение белого цвета (при кристаллизации из смеси ацетона и воды) имеет т.пл. 160-162° С. Сравнительное исследование спектров ЯМР и других свойств А -28086 - 1 и синтетически приготовленного метилового эфира фактора А доказьгеают, что А - 28086 представл ет собой метиловьш эфир фактора А или очень близкое соединение, т.е. стереоизомер. Хот  А - 28086 - 1 осаждаетс  совместно с активными факторами антибиотика А - 28086, однако он легко отдел етс  хроматографией на ошикагеле. А - 28086 - 1 имеет величину Rf, равную примерно 0,53 при хроматографии в тонком слое на силикагеле с этиладетатом в качестве элюента и при применении винилового реагента дл  опрыскивани  (3% ванилина в метаноле плюс 0,5 мл концентрированной серной кислоты на Шбмл раствора) с целью обнаружени . После опрыскивани  винилином и нагревани  А - 28086 - 1 дает синее п тно, в то врем  как факторы антибиотика А - 28086 дают  ркие розовые п тна, которые быстро станов тс  темными, коричневатосиними . Факторы А, В и D, а также указанные эфиры карбоновой кислоты и факторов А и D способны Сис Бен Эти гую образовать соли и фиры и но крайней мере одну гидроксильную группу, способную этерифини МЩ; роватьс . етон Значени  ,Rf факторов А, В и D в разных систеных мах хроматографии на бумаге с применением гекBacillus subtilis АТСС 6633 в качестве обнаружисобвающего организма, показаны ниже. Система растворител  Вода, насыщенна  мети)шзобутилкетоном (МИБК) Вода, насыщенна  МИБК, плюс 2% наратолуолсульфокислоты и }% пиперидина Вода-метанол-ацетон (12:3:1) при добавлении NH40H установлено, а затем снижено до рН 7,5 НзРО4. 1%МИБК,0,5%МН40Нвводе 17,4 г К2НР04,30 мл этанола в литре воды Бензол j насыщенный водой Вода Вода-МИБК-этилацетат (98:1:1). .Мерк, Дармщтат Г - 254, толщина сло  0,25 см) ри применении В. subtilis АТСС 6633 в качестве бнаруживающего организма с едующие. астворител  тилацетат (3 : 2) ат-диэтиламин (95 : 5) образов ьшать соли Физиологически приемлемыми сол ми, которые приемлемы также как фармацевтические средства,  вл ютс  соли, у которых токсичность в отношении теплокровных животных не превыщает токсичности несолевой формы соединений . Пригодными сол ми факторов А и В  вл ютс  соли натри , кали , лити , дези , рубиди , бари , кальци  и магни . К пригодным аминовым сол м факторов А и В относ тс  соли аммони , первичного, вторичного к третичного Ci-С4 - алкиламмони  и окси - - алкиламмони . Со и щелочных и щелочноземельных металлов факторов А, В и D: также ациловые эфиры факторов А и D получают обычными способами приготовлени  солей. Например, фактор в форме свободной кислоты или эфира раствор ют в подход щем растворителе , например теплом метаноле или этаноле, и к раствору добавл ют раствор, содержащий стехиометрическое количество неорганического основани  в водном метаноле. Полученную соль можно выделить обычными способами, например фильтроBaiffleM или выпариванием растворител . Таким же способом можно получать соли с органическими аминами. Например, газообразньш или жидкий амин можно добавить к раствору фактора в подход щем растворителе, например ацетоне, а затем выпарить растворитель и избыток амина. Формулу соли можно выбирать в записимости от упобсгва применени , токсичносги и 3jcoномии . Фактор А образует эфиры карбоновых кислот. Этерификаци  происходит у одной из гидроксильных групп фактора А при обработке ангидридом или хлорангидридом Cj -С кислоты. Такие эфиры обычно получают при реакции фактора А с соответствующим ангидридом кислоты при комнатной температуре. Такие эфиры также пригодны в качестве антибиотиков и агентов, повышающих эффективность использовани  корма. Ацетиловый эфир фактора А - кристаллическое соедине1ше белого цвета (при кристаллизации иэ смеси ацетона и воды) имеет т.пл. 100-103 С и эмпирическую формулу €4 j Н, г Молекул рный вес его равен примерно 807 в соответствии с эмпирической формулой, предложенной дл  фактора А. Элементарный анализ ацетилового эфира фактора А дает следующий процентный состав: Вычислено,% С 66,97; Н 9,24; О 23,79. C4sH74O| 1 Найдено,%: С 67,67; Н 8,71; О 23,13. ИК - спектр ацетилового эфира фактора А в хлороформе показан на фиг. 3. Наблюдались следующие максимумы поглощени : 2,85; 3,36; 3,38 (сильный), 5,80; 6,83; ./7,25 (сильный), 7,60 (слабый), 7,80 (сильный), 8,45 (сильный) 8,80 (сильный), 8,95 (сильный), 9,10 (сильный), 8 20; 9, 9,80.(сильный), 10,12 (слабый) и 10,50 мк. УФ - шектр (фактора А ацетилового эфира) в этаноле показывает только концевое поглощение. Электрометрическое титрование ацетилового эфира фактора А в 80% - ном водном диметилформамиде показывает присутствие титруемой груП|ПЫ с рКа 8,5. Пропиониловый эфир фактора А - кристаллическое вещество белого цвета (при кристаллизации из смеси ацетона и воды) с т.пл. около 96-98° С. Пропиониловый эфир фактора А имеет эмпирическую формулу C47H7sOij и молекул рный вес около 821, вычисленный по эмпирической формуле , предложенной дл  фактора А. Элементарный анализ пропионилового эфира фактора А дал следующий процентный состав: Вычислено,%: С67,29; Н9,33; О 23,38 С4бН7бО,, Найдено,%: С 66,06; Н 9,17; О 23,41. ИК - спектр пропионилового эфира фактора А в хлороформе показан на фиг. 4. Наблюдались следующие максимумы поглоще1ш : 2,85; 3,33; 3,38 (сильный), 3,45 (сильный), 5,75 (сильный), 5,82; 6,81; 7,22; 7,30 (сильный), 7,50 (слабый), 7,60 (слабый), 7,80; 8,43; 8,75 (сильный), 8,90; 9,05; 9,15 (сильный), 9,50 (сильный), 9,63; 9,83 (слабый), 10,05 (сильный), 10,13; 10,20 (сильный ) ; 10,45 и 10,68 мк. УФ - спектр пропио1шлового эфира фактора А в этаноле показал только концевое погло1це1ше. Бутнриловый эфир фактора А - кристаллическое соедииеш1е белого цвета (при крнст л,чи:иции из смеси ацетона и воды) с т.пл. с.коло96-98С . Этот эфир имеет эмпирическуто формулу C47H-)gOij, молекул рный вес около 835 и примерный состав:С67,60%,П 9.41%, 022,397г., вычисленный по эмпирической формуле факто{1а А. ИК - спектр бутирилового эфира фактора А в хлороформе показан на фиг. 5. Максимумы поглощени  следующие: 2,89; 3,40; 3,45; 3,51; 5,85; 5,92 (сильный), 5,97 (сильный), 6.90; 7.30; 7,84 (слабый), 8.55; 8,85 (слабый), 9,01 (сильный ),9,26; 9,76; 9,95; 10,31 и 10,64мк. Валериловый эфир из фактор гА и валериановой кислоты - кристаллическое соединение белого цвета (при кристаллизации из смеси ацето1и и воды) с Т.ПЛ. около 173 - 175°С имеет эмпирическую формулу G48HgoOij, молекул рный вес около 849 и примерный состав: С 67,89%; Н 9,50%; О 22,61%, как вычислено по предложенной эмпирической формуле фактора А антибиотика А - 28086. ИК - спектр валерилового эфира фактора А в хлороформе показан на фиг. 6. Максимумы поглощени  следующие: 2,90; 3,40; 3,45; 3,51; 5,87; 5,92 (сильньп), 5,99 (сильный), 6,81; 7,30; 7,69 (слабый ), 7,87 (слабый), 8,16; 8, 8,85 (слабьга),9,26; 9,76; 10,00 (слабый), 10,31 и 10,64 мк. Эфир капроновой кислоты и фактора А, капрс ловый эфир - кристаллическое соединение белого цвета (при кристаллизащда из смеси ацетона и войы) с т.пл. около 163-167° С имеет эмпирическую формулу C49H82Oj2, молекул рный вес около 863 и примерный состав: С 68,18%; Н9,58%; О 22,24%, определенньп1 по эмпирической формуле фактора А. ИК - спектр капроилового фактора А показан m фиг. 7. Максимумы поглощени :2,90; 3,40; 3,45; 3,51; 5,87; 5,92 (сильный), 5,97 (сильный), 6,90; 7,30; 7,66 (слабый), 7,84 (слабьш), 8,16; 8,58; 8,85 (слабый), 9,05 (сильный), 9,17; 9,72; 9,96; 10,29 и 10,62 мк. ИК спектр фактора D (фиг. 8) имеет следующие максимумы поглощени : 2,89; 3,39; 3,43; 3,50; 5,88;6,90; 7,27; 7,60; 7,84;9,00; 9,26; 9,62; 10,31; 10,57; 11,10 и 11,49 мк. В результате ацилировани  фактора А происход т следующие изменени  спектра I  дерного магнитного резонанса: карбо1шльный резошнс, происход щий примерно при 4 ч/млн, перемещаетс  примерно до 5,3 ч/млн ( точное положение немного измен етс  в разных ацилпроизвощ ых); смещаютс  также сигналы виниппротона. Эти характерные изменени  представлены в частнч ой структуре: и где R представл ет Ci - -Cs - алкнл. Эти частичные ст.уктуры полностью соответствуют aKcnopiiNiemaM но1 roNioMo;ieK ;iHpnoMv разъединению и ЯМР - шектру 13 зфйрйз уьссус с; и пропионовой .  тттьа эфир фактора А растворим в таких органичес сих расгворитёл х, как метанол этанол, димети формамид, даметилсульфоксид этилацетат, | хлороформ, ацепш и беиэоп, но мало рассорим в I непол рных i органических раствори тел х, например в гексане, и {«растворим в воде. Каждый Cj-Сб - ацеловый эфир антибиотика А -28086 имеет кислотную ф)гшсцию, шособнуго образовывать соли и эфиры. Новые анти&ютики получают при выращивании штамма Streptomycer aureofacJens, образувнцего А 28086 в аэробных услови х глубинным |способом подход щей питательной среде до образовани  зна чительной антибиотической активности- Антибиоти ки выдел ют, использу  разные, обычно приме н емые способы вьщелени  и очисткиХарактеристика NRRL 5758 в разных средах. JSP|3 2 (дрожжевой экстрактсолодовый ркстракт) iSP/33 (овс на  мука) ISPj34 (неорганическа  соль - крахмальный агар) JSPp5 (глицерин-асшрапшовый агар) Томатна  паста - агар с овс ной мукой Глицерин-глициновьш агар Глюкоза аспарагиновый агар Пищевой агар Один из организмов, пригодных дл  приготовлени  антибиотиков А - 28086, был выделен из образца почвы, собра1шой на Арарате, Typimn. Этот opraiffl3M классифицирован как штамм Streptomy5 ces aureofaciens Дутгара. Культуры выращивали при 30° С в течении 14 дней, кроме особо отмеченных случаев. Характеристика штамма NRRL 5758, образующего А - 28086. {ОМорфологи  Гифы, образующие споры, состо т из блоков, петель и открьггых спиралей. Наблюдалс  также морфологический представитель типа рек тис эластичный. Споры короткие и щишндрические, 15 образуют I цепи из 10-50 спор. Размер спор 1,3 X 1,75 /;в пределах от 1,3 до 1,96 х 1,3 д. Поверхность cnoip, наблюдаема  с помощью злектронногс микроскопа, гладка . Характеристика Обильный рост; обратна  сторона желта ; воздугщп ш мицелий и спорообразование от удовлетворительного до хорощего; мицелий белый (w) 13 Ьа и темно - серый (Gy), 3ih; j нерастворимый пигмент. Рост хорощий; обратна  сторона зеленовато желта  (11В2); удовлетворительный воздущный мицелий (Gy) темно-зеленый, 3ih; растворимый пигмент светло - коричневый. Обильный рост: обратна  сторона светла  желтовато - коричнева  (12Е5) ; воздущный мицелий и споры (w) пурпурные и белые 13 Ьа до (GV) светло- серых d нерастворимый пигмент. Рост хороший; обратна  сторона светла , желтовато - зелена ; хорошие воздупшьш мицелий и споры (Gy) желтовато - серые 2dc до светлых серовато - красновато коричневых 5fe; нерастворимый пигмент. Обильный рост; обратна  сторона светла , желтовато- коричнева  (13Ш),воздушный мицелий и споры от удовлетворительных до хороших (w), от белого А до (Gy) средне - серого д. Растворимый пигмент светло - коричневый. Обильный рост; обратна  сторона темна  серовато - желта  (1216) ; хорощие воздушный мицелий и споры (У), светло - желтые 2dbj нерастворимьш пигмент. Обильный рост; обратна  сторона серовато зеленовато- желта  (12Е2) обилие воздушного мицели  и спор (Gy) желтовато - серого цвета 2dc; светлый коричневый растворимый пигмент. Рост хороший; обратна  сторона серовато желта  (12В2), цвет воздушного мицели  и спор не определен ввиду плохого развити ; нерастворимый пигмент. АПШ Беннетга Агар с кальциевой солью  блочной кислоты Агар с раствором Чапек Агар Эмерсона Тнрозиновый агар Триптоново - дрожжев Организм NRRL 5758 определени  некоторых стандартным способом.

Свойства Действие на молоко

Нитратное восстановление Пищевой желатин Образование меланинового пигмента на косом агаре с тирозином

пептон Дифко - дрожжевом экстракте - железо - косом агаре

на бульоне с триптоном и экстрактом Необходима  температура ISP среда 02 - коса среда из щюжжевого и солодового экстрактов

Результаты опытов по определению утшгазавии углерода, проводимых с организмсм NRRL 5758, следующие. Дл  характеристаки роста применены следующие обозначени :

+ хороший рост положительное использование углерода;

(+) рост от плохого до удовлетворительного

(-) слабый рост, веро тно, без утилизации

- нет роста, нет утилизации.

Источник углерода

Реакци 

-I- + + D - глюкоза L - арабиноза D- ксилоза D - фруктоза

+ Сахароза

Характеристики

Молоко пептонизировалось, белое кольцо; прозрачна  область рыжевато- коричнева , рН 5,7.

Положительное Разжижение на 30% через 14 дней

Очень слабо положительна  (пигмент через 4 дн )

Отрицательна  Отрицательна 

Хороший рост при 26-30°С; отличный рост и спорообразование при 37°С; слабый вегетативный рост при 45°С; красноватый растворимый пигмент.

D - манчитИзоинозитол

Рамноза+

Рафиноза-

Контроль, без углевода-

Второй новый организм, образующий А- 28086, был получен из S. aureofaciens NRRL 5758 путем селекционировани , сопровождаемого химической л утацией. Этот организм, идентифицирова1Шый как NRRL 8092, и классифицирован как разновидность Streptomyces aureofaciens Дуггара. Эта классификаци  была основана на результэтах исследовани  организме NRRL 8092 ранее описанными методами Классификации Streptomices в таких же услови х поста. Обильный рост; обратна  сторона серовато желта  (1ЖЗ) ; скудные воздушный мнцелнй и споры (Gy) желтовато - серый 2dc; нерастворимый пигмент. Хороший рост; обратна  сторона серовато коричнева  (15С8); нет воздушного мицели  и спорообразовани ; коричневый растворимый пигмент. Рост хороший, цвет не определен ввиду плохого развити . Обильный рост; обратна  сторона серовато - желта  (11,5), нет воздушного мицели  или спор; нерастворимый пигмент. Обильный рост; обратна  сторона светла , слквково- коричнева  (14,5) обильные воздушный мицелий и споры от (w) Ь (центр) до (СУ) светлых коричневато-серых; 3fe (по кра м) ; очень светло - коричневый растворимый пигмент. Слабый рост; цвет не определен. Характеристика штам щего А 28086 Морфо В питательной среце 1S культура образует ред образом короткие и пр  ciiop состоит из не менее 10 Короткие пр мые цепн сп Характернстика NRRL (дрожжевой и солодовый экстракт (овс на  мука) 15РД4 ( агар с неорганическими сол ми и к iSP/35 (агар с гшщери и аспарагином) Агар с томатной пастой и овс ной мукой Агар с глицерином н глицином Агар с глюкозой и аспарагином Пищевой агар Агар Беннета Агар с малеиновокислым кальцием Агар с раствором Агар Эмерсона Агар с тирозином щих средах: ISP/33 в агаре с раствором Чапека и ISP(35. Обильна  коремн  наблюдалась в агаре Эмерсона. Наблюдени  с помощью электронного микроскопа производили на агаре с тирозином (18РД7) и на агаре с глюкозой и аспарагином. Споры были гладкие длиной от 1,2 до 2,0 и диаметром около 1,0 ac. Средний размер пор 1,,0мк. Характеристика Рост удовлетворительный; обратна  сторона светла , желтовато - коричнева  (12Н8) ; удовлетворительный воздушный мицелий; плохое спорообразование; мицелий светло - серый; нерастворимый пигмент. Рост разбросанный; обратна  сторона прозрачна ; нет воздушного мицели ; нерастворимый пигмент. Рост умеренный; обратна  сторона серовато желта  (11В2) ; скудньш воздушный мицелий и плохое спорообразова1ше; воздушный мицелий светлый, желтовато-серый; (10А1); нерастворимый пигмент. Рост умеренный; обратна  сторона светло - желта  (10Р2) ; удовлетворчтельный воздушный мицелий; скудное спорообразование; мицелий белый (10А1); нерастворимый пигмент. Рост умеренный; обратна  сторона серовата  зеленовато - желта ; воздушный мицелий удовлетворительный; средн   степень спорообразовани : бледно - сера  (55А2); нерастворимый пигмент. Обильный рост; обратна  сторона серовато - желта  (11Е4),умере1Шый воздушный мицелий, белый (10А1); спорообразование не происходит; нерастворимый пигмент. Рост умеренный; обратна  сторона светло - желта  (lOF): умеренный воздушный мицелий и такое же спорообразование, белый (10AI) мицелий; нерастворимый пигмент. Рост скудный, обратна  сторона светло - желта  (10В2); нет воздушного мицели ; нерастворимый пигмент. Рост удовлетворительный; обратна  сторона среды желтовато - пунцова ; очень скудный воздушный мицелий; спорообразование не происходит; нерастворимый пигме) т. Рост очеЯь скудный, просвечивающийс ; нет воздушного мицели ; нерастворимый пигмент. Рост очень скудный; обратна  сторона прозрачна ; нет мицели ; нерастворимый пигмент. Рост умеренный; обратна  сторона серовато - желта  (1115); п тнистый воздушный мицелий; спорообразовани  не происходит; нерастворимый пигмент. Рост умеренный; обратна  сторона светла  желтовато - кортчнева  (12Н6); умеренный возД5Ш1ньш мицелий, светлый слабо - серый край (53А2): центр почти белый; спорообразование 21 Агар с тр птоком и дрожжами Фкзиологические сдрцсгх Свойства Действие ш молоко Нитратное восстановле1ше Пищевой желатин Образование меланинового пигмента на косом агаре с тирозином -бульоне с трилтоном и дрожжевым экстрактом -морковной пробке -картофельной пробке Необходима  температу («SP/32); коса  среда- {дрожжевой экстракт и солодовый экстракт Результаты опыте по определению ут углерода приведены ниже. Дл  указаи   с роста использованы следувопще обозна%в хороший рост; полож телыо  утшшзац ( +) рост от плохого до удовлетворительн ( -) слабый рост, веро тж), без утшшзащш нет роста, нет упигазащга. Источник углеродаРезу D - глюкоза+ с. - арабиноза-iNRRL 5758

Желтый иа нескольких средах

Стрллылк спорофоры на среде из пасты томатной и овс ной муки; и на среде: неорганические соли крахмал

Рост удовлетворительный , коричневьш с просветлением

Умеренное спорообразование| воздушный мицелий

NRRL 8092

От кремового до светло - желтого цвета

на нескольких средах.

Короткие пр мые спорофоры

и случайные крючки

Рост скудный, светлый, без просветлений

Скудное споробразование; мицелий светлый, желтовато - серьги 22 умеренное; нерастворимый пигмент. Рост очень скудный, просвечнвающийс ; нет воздушного мицели ; нерзсгворнмын пигмент. NRRL 8092 Характеристики Пептонизнровалось (90%); светло:желтое кольцо; прозрачна  область светло-желта ; Положительное Гидролизовалс  в течение 14 дней на 50% Очень слабо положитешоеи Отрицательна  Обильный рост; светло - желтый; без воздушного мивдли  Обильный рост; серовато-белый; без воздушного мицели , без изменени  в пробке. При 25°С обильный рост; удовлетворительный воздушный мицелий; обратна  сторона светло - коричнева  нерастворимый пигмент. При 30° С обильный рост; удовлетворительный воздушный мицелий; обратна  сторон светло - коричнева ; нерастворимый пигмент. При 37° С обильный рост; удовлетворительный воздушный мицелий; обратна  сторош коричнева ; коричневый растворимый пигмент. При 40 С обильный рост; скудный в6з; цшшый мицелий i обратна  сторона красновато-коричнева ; растворимый пигмент красновато-коричневый. При 45°С удовлетворительный рост; без воздушного мицели ; обратна  сторона красновато-коричнева ; умеренный красновато-коричневый пигмент. 1У D - ксилоза+ D - фруктоза+ Сахароза- D - маннит- Изоинозитол+ Рамноза+ Рафиноза+ Контроль . без углевода Различи  в свойствах организмаNRRL 5758 и ор ганизма NRRL 8092 показаны ниже:

Aiap Беннета

KyjtbTypbi Streptomyces aureofaciens, приходнпые дл  образовани  антибиотиков А - 28086, хран тс  в коллекгдаи культур Северного исследовательского отдела торговли и питани  Министерства сельского хоз йства США, Служба сельскохоз йственного исследовани , Пеори , Иллинойс, 61604, номера NRRL 5758 и NRRL 8092.

Дл  выращивани  Strepfomyces :aureofaciens NRRL 5758 или Strepfomyces aureofaciens NRRL 8092 можно использовать любую нз сред. Однако цл  и1тимального выхода и легкого выделени  продукта предпочтительны определе1шые среды. Например, предпочтительными источниками углеводов дл  процессов брожени  в промышленном масштабе  вл ютс  декстрин тапиоки и сахароза, хот  можно примен ть также глюкозу, маисовый крахмал, фруктозу, маннозу, мальтозу, лактозу и т.п. Пригощагми источниками углерода  вл ютс  также кукурузное масло, арахисовое масло, соевое масло и рыбий жир. Предпочтителыйым источником азота  вл етс  элзиматический гидролизат казенна, но пригодны также пептоны, соева  мука, мука {ХЛОПКОВЫХ сем н, такие аминокислоты, как глу{Пминова  и т.п. К неорганическим сол м, которые можно вводить в питательную среду, относ тс  обычные растворимые соли, способные образовьшать ионы хлорида, карбоната, сульфата, нитрата, натри , магни , кальци , аммони  и т.п.

Дл  роста и развити  организмов в питательную Яреду необходимо включать также микроэлементы.

К питательной среде при ферментации в промышленном масштабе, еслн имеет место вспенивание , необходимо добавл ть небольшие количества (т.е. 0,2 мл/л), противовспенивател , например по: липропнленгликол .

Количество антибиотика А - 28086, образуемого штаммом Streptomyces aureofaciens, увеличиваетс  при добавлении к среде небольшого количества соевого масла.

Дл  получени  значительных количеств антибиотиков А 28086 Желательно примен ть аэрацию питательной среды в бродильных чанах. Небольшие количества антибиотиков А - 28086 можно получать при выращивании культуры во встр хиваемой колбе . Так как при инокул ции в больших чанах спорами организмов образование антибиотиков сильно замедл етс , то желательно примен ть вегетативный посевной материал. Такой материал приготовл ют при инокул ции небольшого объема питательной среды спорами или обрывками мицели  организма дл  получени  свежей, активно растущей культуры. Затем вегетативный инокулум перенос т в большой чан. Дл  вегетативного роста посевного материала можно примен ть такую же среду, как используема  при брожегши в большом масштабе, но пригодны и другие среды.

or светло-фиолетового

до серого

Обратна  сторона желта  j Обратна  сторона розона 

Орга1шзмы, образующие А - 28086, можно выращивать при температуре в пределах примерно от 20 до 40° С. Оптимальный рост А - 28086 происходит, по видимому, при температуре от 27 до 30° С.

Обьтчно в процессах выращивани  при аэробных услови х питательную среду продувают стерильным воздухом. Дл  эффективного роста организма предпочтительный объем воздуха, приме н емый в больших чанах, составл ет больше одного Ьбъема на объем среды в минуту. Дл  эффективного образовани  антибиотиков А - 28086 в чанах желательно примен ть аэрацию больше 0,25 объема воздуха на объем питательной среды в минуту. Большие количества растворенного кислорода не ;тормоз т юбразование антибиотика.

За образованием антибиотиков можно следить во врем  ферментации путем отбора проб бульона или экстрактов твердых веществ мицели . В этих пробах определ ют активность в отношении организмов , чувствительных к антибиотикам. Одним из организмов, пригодных дл  испытани  антибиоти ,ков данного изобретени ,  вл етс  Bacillus subtil is АТСС 6633. Испытание обычно производ т с помощью бумажного диска на агаровых пластинках.

Первоначальна  величина рН инокулированной питательной среды зависит от примене1шой среды. Вообще, рН должно быть в пределах от 6,0 до 7,5. В конце ферментации рН обычно несколько выще и пежит в пределах от 6,5 до 8,0.

Антибиотическа  активность про вл етс  на второй день ферментации. Максимальна  антибиотическа  активность обычно достигаетс  на шестой- седьмой день.

Образовавшиес  в результате брожени  антибиотики А - 28086 можно выдел ть из бродильной среды обышыми способами. Антибиотической активностью обладают как мицел рна  масса, так и профильтрованный бульон. Поэтому максимальное выделение антибиотиков А - 28086 достигаетс  при комбинации фильтровани , экстракции и адсорбционной хроматографии. Предпочтительньтм растворителем дл  вьщелени  этих антибиотиков из цельного или профильтрованного бродильного бульона  вл етс  этилацетат, хот  можно примен ть и другие растворители, обычно используемые дл  этой цели.

Особенно выгодный способ вьщелени  факторов А, В и D антибиотика А - 28086 состоит в снижении рН всего бродильного бульона примерно до рН 3,0. По этой величине рН факторы А,В и D обычно отдел ют фильтрованием совместно с мицел рной массой. Другой способ выделени  факторов А - 28086 св зан с добавлением к цельному бу;тьону бикарбоната, например, бикарбоната натри , в количестве равном примерно 1 г/л. Обычно факторы Л-2Я0 отдел ют совместно с мицел рной массой в форме солей. Пред очгательным растворителем дл  отделени  антибиотиков от мицел рной массы  вл етс  кютанол, одндко пригодны и другое низшие спирты в кетоны. Дл  выделени  антибиотиков А - 28086 с успехом можно применить азеотропную перегонку. В этом случае к водному бродильному бульону добавл ют органический растворитель, образующий соответствуннций а: еотроп, и полученную смесь подвергают азеотропной перегонке дл  удалени  по крайней мере половины воды из бульона. В результате остаетс  смесь воды и растворител , при этом антибиотики А 28086 растворены в органическом растворителе. Нерастворимые побочные продукты можно отделить подход щим способом, HanpHMejii, фильтрованием или центрифугированием. Затем антибиотики можнс выделить из органического раствора хорошо известными способами, например выпариванием растворител , осаждением при добавлении нерастворител  или экстракцией. К органическим растворител м, образующим требуемые азеотропы с водой при процедуре вьщелени , относ тс , например, бутиловый спирт, амиловый спирт, гексиловый спирт, бензиловый спирт, бутилацетат, амилацетат, 1,2 - дихлорэтан, 3 -пентанон , 2 - гексанон, бензол, циклогексанон, толуол, ксилолы и т.п. Азеотропна  перегонка особенно выгодна при процессах брожени  в большом масштабе. Воду и растворитель, отбираемые из верхней части колонны , можно раздел ть известными способами и возвращать дл  дальнейшего использовани . Отделенна  вода не содержит загр знителей. Выделенный растворитель можно возвращать в процесс. Дальнейша  очистка антибиотиков А - 28086 включает дополнительную экстракцию и адсорбцию . В качестве адсорбентов можно использовать жишкагель, уголь, флорисил ( силикат магни  фирмы Флоридин комп.) и т.п. С другой стороны, твердые вещества культуры, включа  компоненты среды и мицелий, можно использовать без разделени , но предпочтительно после удалени  воды, в качестве источника антибиотика А 28086. Например, питательную среду можно высушить ври лнофилизацик и смешать с кормом. С другой стороны, после окончани  ферментации в питательной среде можно отделить мицелий и после сушки его пол чить продукт, используемый непосредственно дл  приготовлени  предварительной кормовой смеси. При отделении мицели  дл  этой цели добавка карбоната кальци  (примерно 10 г/л) рбле1-чает фильтрование и дает сухой продукт лучшего качества. Штаммы Streptomyces aureofaciens, названные NRRL 5758 и NRRL 8092, образуют преимущественно фактор А антибиотика А - 28086. Хот  отношение факторов измен етс  в зависимости от примененных условий брожени , но вообще фактор А составл ет более 99% общей антибиотической активности , выделенной из NRRL 5758 и npiaiepHo 90% антибиотической активности, выделенной из NRRL 8092. Фактор В составл ет большую часть остальной активности, выделенной из NRRL 5758, фак тор D  вл етс  второстепенным. С другой стороны, фактор D составл ет примерно 8-10% антибиотической активности, выделенной из NRRL 8092, а фактор В  вл етс  второстепенным. Факторы А,В и D раздел ют и выдел ют в виде индавидуальных соединений известными способами , как например, хроматограф   на колонке, хроматографи  в тонком слое и т.п. Например, дл  выделени  факторов А,В и D примен ют хроматографию на колонне с силикагелем и колонну элюируют смес ми разных растворителей , например бензола и этилацетата. При применении такой смеси в колонке с силикагелем вначале злюируетс  фактор В, а затем факторы А и D. Обычно дл  регулировани  процесса элюировани  примен ют хроматографию в тонком слое. Соединени  А - 28086 задерживают рост бактерий и грибов, патогенных в отношении животных и растений. Ниже указана активность фактора А и В антибиотика А - 28086 в отношении р да микроорганизмов . Испытание производили обычным методом диск - диффузи  (6 - миллиметровые толтоны погружали в растворы, содержашие 1 мг соединени  в 1 мл; томпоны помещали на агаровые пластины , засе ннью испытуемым орга1шзмом):

3 994ATCC

Зона сдержива1ш  роста, мм фактор А фактор В 1921

2831

2616

1212

2366 17

1414

12Не испытывалс 

27

Соединеши А-28086|осо1б 1шо эффект шно задерживают рост анаэробных бактерий. Ыиаинаюь ш  ко1щентрацн , 11ри которс |фактор А задерживает раэлнчных анаэробных Gaxispwiit опре

Испытуемые oftnaHaiijai

АсИтютпусев bovCs Cto&iridiiuin tnocuutn CCostridium perjrtng-ens Ctostridiutn ramofteum CCo&triciium septicum

CtoftiridLuTn septicum bovine Eubacterium aet4)acUns Peptoeoccus anacrobius Peptostreptococcus intermediut PropiotiCbacterCum aene« i

PropiOnibaclerCum acne& 79 BocteroCdes fisp. Bacteraide« /raoriCis ssp. tKetaiotac bacteroldes frag-ceit «sp. Vvtyarit Bocteroidet ssp. vuCg-ari« Fusobacteriutn si mCiObum

Pu«0bacterium necropkorum VeilConctta aCeaCeseens Cj-Ce - ацилевые эфнры фактора А тшкжв обладают антибактериальной и противог1 1бковой активностью. Эти производные обладают повышенной активностью в отношении гра11«1оложителышх микроорганизме. Така  активность некоторых из таких производных сравнима с активностью фактора А. Соединени  испытывали нефелометрическим методом на полуавтомаппескш системе. При испытании антибиотиков А - 28086 были использованы следукицие параметры: Sl phylococcus aureus (Н- Хитли) NRRLB- 314 в питательной среде (рН7 инкубировали 4 часа при 37° С. Пробы и эталон раствор ли в смеси метанола с водой (10:90). Эталон, фактор А, находилс  в концентрации 2,3,4 и 5 мкг/мл. Соединени  разбавл ли до содержани  примерно 3 или 4мкг активности в мл перед помещением в аппарат. Ниже показаны относительные активности соединений в сравнении с активностью эталона. Относительна  Соединени  активность С 1 Фактор А (эталон) етиловьш эфир А - 28.086 - А Пропиониловый эфир А - 28086 - А Бутириловый эфир А - 28086 - А Валериловьгй эфир А - 28086 - А Капроиловый эфир А - 28086 - А

28

ленна  стандартным Цетодсж агар - разбавление, следующа  показате|ш получены после 24 - часовой .-.

Мншмашьна  концентраци , г/мл

0,S 0,5 0,S

4,0 0,5 0,5

1.0 0,5 16,0 16,0 2,0 8,0 8,0 8,0 2.0 0,5

4,0 16 Соединени  А 28086 обладают также антимикро алыюй активностью в отношешш микоплаэмы. Агенты, активные в отнощении организмов PPLO, особенно необходимы при разведении домашней птицы. Ниже показаны минимальные концентрации фактора А антибиотика А - 28086, задерживающие рост разновидностей микоплазмы, определенные in vitro при исследовании методом разбавлени  бульона. Организм Минимальна  концентраци , мкг/мл М. galiseptjcum 12,5 М. hyorhims М. synovicil М. hypopneumoniae М. hyosynoviae , Растворы,содержавшие всего лишь 10 мкг антибиотика А - 28086 в 1 мл, примен лись дл  дезинфекции поверхностей с целью зашиты животных от разных видов микоплазм. Соединени  А - 28086 обладают также способностью нейтрализовать действие вирусов. Фактор А активен в отношегши поливируса типа III, вируса вакцини , лишайного вируса и лесного вируса Семлики. Фактор А активен также в отношении передающегос  вируса, вызьшаюшего гастроэнтерит, вирусз , выэывашоего болезиь Нышкасла и вируса, вызывашцего ринотрахеит быков.

Поэтому соединение А 28086 можно давать , мест о или мину  шицеварительный тракт.

Дэза да  предотвращени  или лешни  вирусного эфбопеваин  измен етс  примерно от 1 до S мг/кг веса тела млекопитающего, в зависимости от вируса

к от шзначени  лекарства, т.е. с профилактической

нлв терапевпреской целью.

Кроме того, растворы, содержащие соединени  А - 28086, предпочтительно совместно с поверхшхгшо;активным веществом, можно примен ть дл  обеззараживани  участков, инфшдарованных, наа{жмер , вирусом лиша  илиполиомиэлита. Дл  борьбы с вирусом эффективны растворы, содержзщие примеров от 1 до 500мкг/л соединени  А - 28086.

Токсичность фактора А антибиотика А - 28086, введенного внутрибрюшинно мышам, определ етс  как ЛД5.о 7,15 мг/кг.

Соединени  А 28086  вл ютс  также инсектицидами и аскарнщ1Дзми. Эти соединени  активны в отношении таких насекомых, как мексиканские бобовые жуки, жуки молоча  и домашние мухи, а также в отношении таких клещей, как двуп тнистый паукообразный клещ, при применении в количестве 500 ч/млн. Кроме того, соединени  А - 28086 активны в отношении личинок москитов при применешш в количестве I ч/млн

Важньил свойством соединений А - 28086  в71 етс  способность их воздействовать на кокцнди. Например, эксперименты по использованию его в кормлении покаэьшают, что при содержании соединени  А - 28086 в корме даже в таком небольшом количестве (0,003%) наблюдаетс  увеличение в весе, а при содержании в количестве 0,005% - уменьшаетс  смертность цыпл т, заражен . ных кокциди ми.

В табл. 1 , 2 и 3 показаны результаты опытов по применению фактора А дл  лечени  цыпл т, зараженных разнь1ми авдами Е i meria.

Таблица 1

31

Средние показатели четы1)ехввшкш: 5 молоденьких петушков в каждом.

) Четыре опыта в каждом случае; 5 молоденьких петушков в каждом опыте.

Дл  предупреждею1Я или лечени  болезни, вызванной кокцида ми, птицам дают ежедневно, предпочтительно через клюв, нетоксичное количество соединени  А - 28086. Такое соединение можно примен ть в разной форме, но лучше всего давать совместно с физиологически приемлемым носителем, предпочтительно в смеш с кормом. Д   . определени  подход щей концентрации соединеташ А - 28086 следует учитывать р д факторов, но вообще пригодаа коидентраци  от 0,003 до 0,4% или предпочтительно от 0,005 до 0,02% веса корма.

576966

32 Таблица 2

Таблица 3

50

1,75

3,5

73 0,9

3,3

Важным свойством соединений А 28086  вл етс  также их способность улучшать эффективность использовани  корма. Например, соединени  А - 28086 улучшают эффективность использовани  корма. Например, соединени  А 28086 улучшают

эффективность использовани  корма жвачных животных , с развитой функцией рубца.

Эффект}шность использовани  углеводов у жвачных животных увеличиваетс  при стимулировании флоры в рубце животиого к образс анию

производных пропионовой кислоты, в не соединеЭффективность утилизации углеводов была показана ва опытах с животными с фистулами в рубцах.

Шыты проводили на животных весом около 454кг каждое. Двахототных получали нормальный корм и четыре животных в каждой подсшытной группе получали такой же корм, содержавший фактор А. Отирали аликвотные количества {100 мл) рубцовой жидкости и добавл ли к ней 1

10% метафосфорной кислоты. Пробы выдерживали до осаждени  и надосадочный слой анализировали методом газовой хроматографии дл  определени  55 , концентрации пропионовой кислоты.

Результаты опытов показьтают увеличение концентрации пропионовой кислоты в рубцовой . жидкости, определенной по п ти анализам в течевО ние 14 дней. Кроме того СИ1ЫТЫ in vivo показали, что фактор А увеличивает тшшзаци1а1сбрма овцдми. Производаше. фактора О а1Ш11биотшса А - 2SQ86  вл ютс  антивирусными агешамн- Фактор D активен в опношении вируса Мэриланд В, поливируса типа III, вируса СХЗЕ, ге петического вируса и лесного вируса Сем ики. Фактор D активен также в отношении вируса, вызывающего гастроэнтерит, вируса болезни Ньюкасла и вируса ринотрахеита крупиого рогатого скота. Тот факт, что производные фактора О активны в отношении вирусов и анаэробных бактерий, делает эти соединени  особенно благопри тными дл  профилактики энтеритов у цыпл т, свиней, рогатого скота и овец. Соединени  фактора О пригодны также дл  лечени  эктеротоксемии у жвачных животных . Важньид свойством соединений фактора D  вл етс  их активность в отношении кокцидий. Эксперименты in yitro показывают, что фактор D активен в отношении Eiineria tenella. При заражении клеточных культур жизнеспособными спорозоитами с последующим добавлением фактора D были получены следующие результаты . Активность в отношении кокцидий фактора D антибиотика А-28086; Концентраци  фактора. Характеристика 1 мкг/мл Результаты двух испытаний. Другой полезной особенностыо производных фактора О  вл етс  их способность улучшать эффективность утилизации корма жвачными животными Соединени  эти эффективно увеличивают количество пропионатов н тем самым способствуют эффективной утилизации корма при введении через рот жвачным хошотным в количестве пршдерно от 0,05 до 5,0 мг/кг в день. Наиболее благопри тные результаты достигаютс  при дозах примерно от 0,1 до 2,5 мг/кг в день. Соединение предварительно смешивают с кормом, но его можно примен ть также в форме таблеток, шариков и в капсулах. Такие препараты приготовл ют способами, хорошо известными в ветеринарной фармации. Кажда  отдельна  доза должна содержать количество соединени , соответствующее дневной дозе дл  животного . Антибиотик А - 28086 можно примен ть в Составе корма, предназначенного дл  откармлива5 JQ 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ни  скота, в количестве от 1 до 30 г соединени  н тонну корма Как сказано выш, соеданени  А - 28086 представл ют собой антиэирусные агенты и активны также в отношении анаэробных бактерий, в частности в отношении Clostridium perfringeusillo3toму такие соединени  пригодны дл  лечени  и предупреждени  энтеритов цьшл т, свиней, рогатого скота н овец. Они пригодны также дл  лечени  энтеро токсемии жвачных животных. Пример. А. Ферментаци  А - 28086 при взбалтьюашй в колбе с применением s. aureofaciens NRRL 5758. K nbTypynStfeptomyces aureofaciens NRRL 5758поместихш на косой агар следующего состава: ЙнгредаентыКоличество, Агар20 Декстрин10 Гидролизованный энзимом казеин2 М сн(ж экстракт2 Дрожжевой экстракт2 Диспшлированна  водадо 1 л. Косой агар инокулировали Btreptomyces aureofaciens NRRL 5758 и инкубировали при от 6 до 10 дней. Созревщую культуру покрыли бычьей сьшороткой и стерильной петлей разрыхл ли споры. Полученную суспензию шор и обрывков мицели  .в бычьей сьшоротке подвергали лиофилизации. Один из щести лиофилизированных шариков ис; пользовали дл  инокул ции 50 мл вегетативной среды, имеющей следующий состав: ИнгредиентыКоличество, г Глюкоза20 Соева  крупа15 Водный настой кукурузы10 Углекислый кальций2 Водопроводна  водадо 1 л. Инокулированную вегетативную среду в колбе Эрленмейера емкостью 250 мл инкубировали при 30° С в течение 72 часов на аппарате дл . встр хивани , вращающемс  по дуге диаметром 50,8 мм со осоростью 250 об/мин. ; Б.ферментаци  А-28086 в чане с применением S. aureofaciens NRRL 5758. Дл  увеличени  объема посевного материала 10 мл полученной инкуГ ированной вегетативной среды использовали дл  инокул ции 400 мл вегетативной среды второй стадии того же состава. Эту среду в 2-литровой колбе инкубировали при 30° С в течение 24 часов в аппарате, вращающемс  по дуге диаметром 50,8 мм со скорстью 250 об/мин. Вегетативную среду второй стадии (1л) использовали дл  инокул ции 100 л стерильной среды следующего.состава: ИнгредиентыКоличество, г/л Декстрин тапиока60,0 Казеин, гидролизованный энзимом8,0 Меласса15,0 ,О 0.5 CiaCSO, 2,0 5.0 1%1финированаов сооюе касш Деионизированш  вода ml литр После стерилизации в автоклаве в 120 С в течение 30 минут под давлением 1,05 - 1,4кг1ш величина рН была равной 6,7. В 165 - литровом бродильном чане инокулированш  среда подве1иалась брожению в течение 10 дней при температуре 29° С. Бродильную среду аэрировали стерильным воздухом, подаваемым со скоростью 0,4 объема воздуха на 1 объем среды в минуту. Среду перемешивали обычными мешалками со скоростью 250 об/мин. П р и м е р 2. Выделение антибиотического комплекса А - 28086, образованного S. aureofacie NRRL 5758. Сброженный бульон (132л), полученный, как описано в примере 1, профильтровали с помощью фильтра (Гифло Суперцел, инфузорна  земл , фирмы Джонс Маквилл Продактс корп.) и получили 97 л фильтрата, который экстрагировали примерно равным объемом этилацетата. Экстракт отде;шли от водной фазы и сконцентрировали до объема, равного примерно 500 мл. Этот концентрированный этилацетатный экстракт добавили : большому избытку петролайного эфира (Скелли Зольв; около 10 л) дл  осаждени  и тем самьин дл  отделе1ш  нежелательного продукта. Отделенный фильтрат вьшарили в,вакууме и получшш комплекс антибиотика А-28086 (6,9 г). Мицел рную часть этого комплекса по лучили при двойной экстракции отфильтрованного мицели  примерно половинными объемами метанола (62 и 59 л). Экстракты объединили и оконцентрировали в вакууме дл  удалени  метанола. После концентрировани  осталось примерно 10 л водной фазы, к которой добавили разбавленный раствор гидроокиси натри  до рН 7,5. Полученный раствор дважды экстрагировали примерно одинаковыми объемами этилацетата (9 и Юл). Экстракты объединили и сконцентрировали до объема, равного примерно 400 мл. Этот экстракт добавили к большому избытку петролейного эфирас целью удалени  нежелательных продуктов при описанной выше процедуре концентрировани  профильтрованного бульошюго экстракта. Мицел рна  порци  комплекса , полученна  из фильтрата, весила 20,6 г. П р и м е р 3. Выделение индивидуальных факторов А и В. Мицел рную порцию комплекса антибиотика А; 280В6 (235 г, как описано в примере 3) растворили примерно в 80 мл бензола. Этот раствор ввели в колонку си икагел  (9Х 130 см, 8л сшшкагель Мате зона сорт 62). Колонку элюировали разными смес ми бензола и этилацетата. Элюирование сопровождалось хроматографией в тонком слое. При применении системы растворител  бензол-этилацетат (90:10) вначале элюировали фактор В, который выделили как индивидуальный фактор. Этот фактор после кристаллизации из ацетона веежн 43 мг и имел тлл. 150-153° L. Продолжа  злю 1рование смес гаш бензола и этилацетата, но постепенно увел1 ква  отаооггельное количество этилацетата, выдеанзш фактор А. Фракции, содержавшие фактор А, объединюш и сконцентрировали в вакууме. Остаток растворили в ацетоне (примерно 150 мл) к к раствору добавили примерно 160 мл воды. При добавлении 1 н- сол ной кислоты установили рН 3 раствора. Подкисленную смесь перемешивали в течение 1 часа, в результате чего образовалс  осадсчс. Этот осадок отфильтровали и перекристаллизовали (примерно 150 мл) после добавлени  воды (примерно 60 мл). Продукт сушили в течение ночи в вакууме и полушли фактор А (примерно 6,6 г). После частичного испареин  ацетона из фильтрата получили дополнительк примерно 1,2 г фактора А. П р и м е р 4. Ацетиловый эфир фактора А. Фактор А антибиотика А-28086 (7,41 г) растворили в пиридине (150мл) и к раствору добавшш 50 мл уксусного ангидрида. Полученный раствор тщательно смешали и выдержал в течение ночи при комнатной температуре . Затем добавили 200 мл воды, тщательно смешали , и смесь выдержали в течмше 4 часов при комнатной температ фе. Образовавшийс  твердый осадок белого цвета отфильтровали, промыли водой и высушили на воздухе. Получе}щое твердое вещество растворили в ацетоне (100 мл) и раствор вьшарили досуха в вакууме (эту процедуру повторили 3 раза). Остаток кристаллизовали из смеси ацетона (100 мл) и воды (50 мл) и получили ацетиловый эфир фактора А (614 г) с т.пл. 100- 103°С. Приме р ы 5-9. Пропионшювый эфир Диктора А, полученный при реакции фактора А с ангидридом пропионовой кислоты в присутствии пиридина способом примера 5, имел т.пл. 96-98° С. Бутириловый эфир фактора А получили при реакции фактора А с ангидридом масл ной кислоты в присутствии пиридина способом, описанным в примере 5; т.ш1. 79-81° С. Капроиловый эфир фактора А приготовили при реакции фактора А с ангидридом капроновой кислоты в присутствии пиридана способом, описанным в примере 5; т.пл. 16-167° С. Валердловый эфир фактора А получили при реакции фактора А с ангидридом вариановой кислоты в присутствии пиридина способом, описанным в примере 5; т.Ш1.173-175°С. П р и м е р 10. Приготовление натриевой соли фактора А. Фактор А (500г) растворили в ацетоне (50 мл). К этому раствору добавили воду (50 мл) и 5н. раствор гидроокиси натри  до рН 10,5-11. Полу генный раствор перемешивали 1 час, а затем экстрагировали этилацетатом. Экстракт вьшарнлн досуха в вакууме и остаток переосаднлн из раствора в смеси

39

ацетона и ъоаи, получили 378мг натриевой соли фактора А с Т.Ш1. 120-123° С.

Примеры 11-15. Бариевую соль фактора А орнготовили из фактора А (500 мг) и насыщенного раствора гидроокиси бари  способом примера 10. Получили 369 мг бариевой соли фактора А с Т.ПЛ. 199-190° С.

Калиевую соль фактора А получили из фактора А (500 мг) и 5н. раствора гидроокиси кали  способом примера 10: получили 363 мг калиевой соли фактора А; т.пл. 165-167°С.

Цезиевую соль фактора А приготовили из фактора А (500 мг) и 1и. раствора гидроокиси цези  способом примера 10 . получили 540 мг цезиевой соли фактора А; т.пл. 190-210°С.

Натриевую соль фактора В приготовили из фактора В и 5н. раствора гидроокиси натри  шособом примера 10.

Пример 16. Ферментаци  А - 28086 в встр хиваемой колбе с применением S. anreofaciens NRRL 8092.

Культуру Streptomyces aureofaciens NRRL 8092 приготовили и выдержали на косом агаре, имевшем следующий состав:

ИнгредиентыКоличество, г

Кг НРО42,0

MgSO4 7H2O0,25

NH4 МОз2,0

СаСОз2,5

FeSO4-7H2O0,001

МпСЬ - 7Н2О0,001

ZnS047H2O0,001

Глюкоза10,0

Агар20,0

Деионизированна  водадо 1 л рН (самопроизвольное )

7,7.

Косой агар инокулировали Streptomyces aureofaciens NRRL 8092 и инкубировали при 30°С в течение примерно 7 дней. Созревшую культуру на агаре покрыли стерильной & 1чьей сывороткой и стерильной петлей си ли культуру дл  приготовлени  суспензии спор и мицели . Полученную суспензию подаергали лиофилизации.

Один из полученных лиофильных шариков использовали дл  инокул ции 50 мл вегетативнс« среды, имевшей следуннций состав:

ИнгредиентыКоличество, г

Глюкоза20

Соева  мука15

Водный кукурузный настой 10 СаСО 2,0

Водопроводна  водаДо 1 л,рН после

добавлени  МаОН

6,5.

Инокулированную вегетативную среду в 250 миллилитровой колбе Эрленмейера инкубировал при 30° С 48 часов на аппарате дл  взбалтывани вращающемс  со скоростью 250 об/мин по ду диаметром 50,8 мм.

40

Описанную выщ инкубированную вегетативную среду ишользовали (0,5 мл 1%) дл  инокул ции 50 мл бродильной среды следующего состава: Ингре1шентыКоличество, г

Декстин топиока60,0

Казеин, гидролизованный энзимом 6,0

Энзиматическнй гидролизат казеина 2,0

СаСОз2,0

MgS047H2015

Черна  тростниково - сахарна  меласса15,0

Рафинированное соевое масло5,0

Водопроводна  водадо 1 л, рЖсама . произвольное) 6,(

1)Декстрин Сталей N 11 фирмы А. Е. Сталей, Декатур, шт. Иллинойс

2)Амбер ШС, .Лаборатории Амбер, Джюно, - щт. Висконсин ,

3)NZ Амин А, фирмы Шеффилд Кемикал, Норвич , щт. Нью-Йорк

Пример 17. Ферментаци  в чане А - 28086 с применением S.ureofaciens NRRL 8092.

В данном случае примен ли первоначально описанную в примере 16 процедуру ферментации А-28086. Дл  получени  большего объема посевного материала Щмл инкубированной вегетативной среды использовали дл  инокул ции вегетативной среды второй стадии (400 мл), имевщей тот же состав. Среду второй стадии в 2 - литровой колбе Эрленмейера инкубировали при 30° С 24 часа во вращающемс  аппарате дл  взбалтьшани  при скорости 250 об/мин.

Инкубированную вегетативную среду второй стадии (800 мл) использовали дл  инокул ции 100л стерильной бродильной среды, имевшей следующий Состав:

ИнгредиентыКоличеслво. г/л

Q Декстрин тапиока60,0

Гидролизованный знзимом

6,0

казеин

Энзиматический гидролизат

казеина

2,0 2,0

СаСОз

0,5 г/л

MgSO4i-7H2O

Черна  тростниково - сахарна 

меласса 15,0

Рафинированное соевое масло5,0

Водопроводна  водадо 1 л.

1)Декстрин Сталей № 11 фирмы А. Е. Сталей, Декатур, щт. Иллинойс.

2)Амбер Н С, Лаборатории Амбер, Джюно, шт. Висконсин.

3) NZ Амин А, фирмы Шеффилд Кемикал, Норвич , шт. Нью-Йорк.

После стерилизации в автоклаве (в течение 30 минут при температуре 121°С и давлении 1,05-1,4кг/см) среда имела рН 6,8 + 0,1-Ферментаци  протекала в течение 10-12 дней при температуре 28±

4J

± 1°С в 165 - литровом чане при аэрировании среды стерюгьным воздухом, подаваемым в количестве 0,4 объема воздуха на 1 объем кулъгурной среды в минуту. Среду перемешивали мешалками, вращающимис  со скоростью 300 об/мин.

П р и м е р 18. AHTHtffloTHKM А - 28086 получили, как шисано в примере 17, но с применением среды дл  сбраживани  в колбе и чане, имевшей следуншдий состав: ИнгредиентыКоличество, г/л

Декстрин тапиока30,0

Глюкоза15,0 Казеин, гидролизованный

энзимом 3,0 Энзиматический гидролизат

казеина1,0

Дрожжевой экстракт 2«5i

CaCOj2,0

MgSO47H2O1,0 Черна  тростниково-сахарна 

меласса15,0

Рафи йровлиное соевое масло5,0

Зодовроводна  водадо 1 л.

1)Декстрин Сталей , А.Е.Сталей, Декатур,

шт. Иллинойс.

2)АмберН С Лаборатории Амбер, Джюно, шт. Висконсин.

3)NZ Амин А, Шеффилд Кемикал, Норвич, шт. Нью-Йорк.

После стерилизации в автоклаве, как описано q примере 17, среда имела рН 6,4.

Пример 19. Выделение комплекса антн& отика А - 28086, полученного с помощью S, aureofaciens NRRL 8092.

Цельный бродильный бульон (60л), полу%нный способом, описанным в примере 17, после добавле ш  разбавленной сол ной кислоты имел рН 3. Этот раствор профильтровали через фильтр (П1ФЛО Супер - цел, инфузорна  земл , фирмы Джон - Манвилл Продактс корп.). Мицел рный остаток на фильтре экстрагировали 30 л метанола и к зкстракту добавили при перемешивании 1,56к1 бикарбоната натри . Поаю отделени  этого экстракта мицел рный остаток снова экстрагировали в вакууме дл  удалени  метанола. Оставшийс  водный раствор ( 7 л) подкислили разбавленной сол ной кислотой до рН 7,5 и полученный раств дважды зкстрагировали этилацетатом (дважды по 7л). Экстракты объединили и концентрировали Р вакууме до получени  маслообразного остатка, который растворили в 1500мл ацетона. К этому раствору добавили разбавленную сол ную кислоту до рН 3 и перемешивали 1 час. Образовавшийс  осадок отфильтровали, растворили в ацетоне (1500мл) и к раствору добавили 400мл воды. Полученный раствор вьщержали 16 часов дл  кристаллизации. Кристаллы отфильтровали, высушили в вакууме и получили 74 г кристаллического продукта, содержавшего факторы А и D и кристалпические примеси.

42

Сырой кристаллический п;)одук1 (40 i) pacinoили примерно в 250 мл бензола и pactBfjp проj cnuiH колонку с силикагелем (9x120 см; илккагель сорта 62 Грайс - Давидсона). Колонку люировали последовательно 40 л каждого нэ еле ующих растворителей:

1)Бензол

2)Бензол- зтилацетат (9:1)

3)Бензол - зтилацетат (4:1)

4)Бензол- этилацетат (7:3)

5)Бензол- этилацетат (1:1)

6)Этилацетат

7)Метанол.

Каждую фракцию провер ли, определ   активность в отношении Bacillus subtilis и хроматографировали в тогком слое дл  идентификации злюированных соединений А - 28086, элюировали смесью бензола и этилацетата (4:1). Фактор В злюировалн смесью бензола и этилацетата (7:3). Факторы А и D злюировали смесью бензола и зтнлацетата (7:3 и 1:1), фракции 119-156. Эти фракции объединили, вьшариш досуха и остаток растворили в 500 мл ацетона. К полученному раствору добавили 500 мл воды, подкислили его разбавленной сол ной кислотой до рН 3 и перемешивали в течение 1 часа. Образовавшийс  осадок отфильтровали и кристаллизовали из смеси ацетона (500мл) и воды (180мл). Кристаллы отфильтровали , высушили в вакууме и получили 20,1 г смеси ракторов А и D.

Пример 20. Разделение и очистка ИНДИЕЙ дуальных факторов А и D.

f Кристаллическую смесь факторов А и D, полученную , как описано в примере 18 (18,8 г), растворили в бензоле (50 мл). Раствор поместили в колонке силикагелЯ (7X100 см) (силикагель сорта 60 фирмы Мерк, тоньше 230 меш ASTM). Колонку злюировали при скорости потока 90 мл/час последовательно следующими растворител ми:

1)12л бензола;

2)12л смеси бензола и этилацетата (9:1); 3) 12л смеси бензола и этилацетата (4:1) ;

4)32л смеси бензола и этилацетата (7:3);

5)Юл метанола.

После хроматографии в тонком слое (Целлюлоза Мерк, Дармштат на алюминиевой подложке) проводили биоавтографию с по мо1цью В. subtilis дл  регулировани  процесса элюировани . Применили следующую систему растворител : вода - метанол цетон (12:3:1), добавл   вначале гидроокись аммони  до рН 10,5, а затем сол ную кислоту до рН 7,6.

Фракции объемом от одного до двух литров отбирали, пока обнаруживали актщзность: затем собрали 200 - миллилитровыё фракции, содержавшие только фактор D, которые объеди1гили и выпарили в вакууме досуха. Остаток К1)исгаллизовали из смеси ацетона и воды. Кристаллы отлепили и высупшли в вакууме; получили 140 г кристалли ческого фактора D. Так же обработали фракци , содержавшие фактор D и следы фактора А, и получили дополнительно ISO мг кристаллического фактора D, содержавшегр небольшое количество фактора А. Фракции, содержавшие только фактор А, 5 ботали так же, получили 4,7 г кристаллическогс; фактора А. Пример21. Антибиотики А - 28086 получили в процессе примера 16, но с применением косой среды еледушцего состава:i о Ингредиенты1Соличес1во, г М сной экстракт2,00 Декстрин20,00 Дрожжевой экстракт2,00 Энзиматический гидролизатts казеина4,00 CoClj ,02 Агар20,00 Деионизированва  водадо 1 лС помощью КОН установили рН7,0 и инокулированную косую среду инкубировали при 28° С примерно 7 дней. Пример 22. Антибиотики А - 28086 приготовили в процессе примера 17, но с применением среды , следующего состава: Количество, г/л Ингредиенты Декствин тапиока Ингредае Измельченна  желта  кукуруза Соева  мука, экстрагированна  растворителем, обрушенна , тонк помола, 50% белка %1вотш ш жир (гов жий топлен Суха  рыбна  мука с растворимы веществами (60% белка) Р&створимые вещества кукурузы винно - водочного завода / Ь1капьцийфосфат пищевого сорт Карбонат кальци  Витаминна  CMeci (витамины А, D, Е, К, и В| 2, холии, ниащш, пентотенова  кислота, {жбофлавин, биотин с агентом, св зывающим глюкозу) Смесь минералов, содержащихс  в виде следов (представл юща  сульфат магни , окись цинка, йодистый калий, сульфат железа и карбонат кальци ) 2 - Амин - 4 - оксимасл на  кислота (оксианалог метионина) Фактор А антибиотика А - 28086 Эти композиты смешали обьтвым способом, примен емым дл  смешени  кормов. Цьшл та, которым скармливали этот корм, противосто ли воздействию кокцидий и прибавл ли в весе так же быстро, как цьшл та здоровые, получившие так же корм, но без антибиотика. Энзи aп{чecкий гвдролизованный казеин15,0 Тростниково - сахарф  меласса15,0 Карбонат кальци 2,0 Сульфат аммони ,о Сульфат магни 0,5 Рафинированное соевое масло4,6 1) Декстрин Сталей N11, А.Е.Сталей, Декатур, игг.Иллинойс. 2) Амбер ЕНС лабораторин Амбер, Джюно, шт.Висконсин. П р и м е р 23. Антибиотики А - 28086 приготовили в процессе примера 21, но с применением промежуточной вегетативной среды второй стадии, имевшей следующий состав: Ингредиенты Количество, r/f Церелоэа 20,0 Водный кукурузньш настой ( сырой вес) Соева  крупа Карбонат кальци  Дрожжи Свекольна  меласса П р и м е р 24. Модифицированный А - 28086 корм ДЛЯ лечени  болезни цыпл т, вызванной кокци дн ми. Сбалансированный высококачественный корм дл  цыпл т, обеспечивающий быстрое прибавление в весе, приготовили по следующему рецепту: Количество го й) и Пр мер25. Корм м сного скота с добавкой А - 28086. Сбалансированный с большим содержанием зерна корм дл  откармливаемого скота приготовили по следующему рецепту:

Иштйоденты Ji°кг

Тоикоизмельчанна  кукуруза6,78617

Измельчеш1ый стерзвень почапса

кукурузы1090,7

Обезвоженна  мука из люцерны, 17%

белкаS45,3

Мука из обрушенной сон,

экстрагированш  растворителем9,995690,0

Тростникова  меласса545

Мочевинао,65,4

Фактор А - 280866,00440,04

Дикальцийфосфат пищевой0,54,5

Карбонат кальци 0,54,5

Хлористый натрий0,32,7

Смесь минералов в виде следов0,030,27

Смесь витаминов А и D20,070,63

Предварительна  смесь

, витамина ,

Пропионат кальци ОД 51,36

1)Содержит в 1 фунте (0,453 кг) 2000000 ед. витамина А; 227200 ед витамина Оз и 385,7 г соевого корма с добавкой 1% ма

2)Сухие кукурузные зерна с растворителем, содержащим

о; а- токофериловый эфир уксусной кислоты в количестве 20000 Смешанный kbpM прессовали в форме таблеток . Средний дневной рацион - 6,8 кг дл  одного животного. Этот корм содержит примерно 300 мг фактора А на каждое животное. П р и м е р 26. Ациловьо эфир фактора D антбиотика А - 28086. Фактор О растворили в пиридане и к раствору добавида стехнометрическое ка;шчество уксусного ашидаи/щ. Полученный раствор тщательно перемеШЕ1ЛИ и выдержали в течение ночи при комнатной температуре. Затер добавили избыток воды, тщательно смещали   выдержали несколько часов при комнатной теьшервтуре. Образовавшийс  осадок отфильтровали , промыли и высуишли. Полученное твердое вещество { створили в ацетоне и выпарили досуха в вакууме; получили а131етиловьш зфир фактора О.. Примеры 27-30. Пропионовьш эфир фактора О получили при реакции фактора D с ангид ждом прс гаоновой кислоты в присутствии .пир дака способом, описанным в примере 26. Бутнридовьй эфир фактора О приготовили при реакщга фактора D с ангидридом масл ной кислоты в присутствии пиридит способом, описанным в примере 26.. J Каприловый зифир фактора О приготовили при реакции фактора D с ангидридом капроновой -.Ингредаенты

Молота  желта  кукуруза Мука из обрушенной соли, экстрагированна  растворителем и тонкоизмельченна ; 50% белка

Количество

453,5

50

282

31,09 кислоты в присутствии пиридина способом, описанным в примере 26. Валериловый эфир фактора D приготовили при реакции фактора D с ангидрвдом валериановой кислоты в присутствии пиридина способом, описанным в примере 26. П р и м е р 31. Получение натриевой соль фактора D. Фактор D растворили в ацетоне и к раствору добавили эквивалентное количество воды и 5н. раствор гидроокиси натри  в количестве , достаточном дл  установлени  рН 11. Полученный раствор перемешивали в течение примерно 1 часа, а затем экстрагировали этилацетатом. Экстракт выпарили в вакууме и получили натриевую соль фактора О. Примеры 32-34. Калиевую соль фактора D полущ| и из фактора D и 5н. раствора гидроокиси кали  способом примера 31. Бариевую соль фактора D получили из фактора D и насыщенного раствора гидроокиси бари  способом примера 31. Цезиевую соль фактора D получили из фактора О и }н. раствора гидроокиси цези  способом примера 31. Пример 35. Корм дл  цьшл т, содержащий фактор О и пригодный дл  лечени  кокцидиоза. Сбалансированный высококачественный корм, пригодный дл  быстрого увеличени  веса цьшл т, приготовили по следующему рецепту: Количество %кг

47

, UKaBonojA жир (топленый гов жий) Суха  ры&ш  мука с paciBopijMbiMH; 60% белка

йстаоримые вещества кукурузы, отхода огарто водочного производства

Дикальцийфосфат пшцевой Карбонат кальци  Смесь витаминов (витамины А, О, Е, КиВ22,холин, шшцин, нантотенова  кислота, рибофлавин, биотин с агентом, св зьтающим глюкозу) Смесь минералов, содержащихс  в виде следов, 2 амин - 4 - оксичуисл на  кислота (оксианалог метион Фактор D Эта компоненты смешали обычным способом. Цьаш п к laKOM рационе противосто т воздействшо кокцидий; вес их увеличиваетс  так же, ,как вес цыпл т не зараженных кокциди ми и волучашцих тот же корм, но без антибиотика. Ингредиенты Тонко измельченна  кукуруза Измельченный стержень початка кукурузы Обезвоженна  мука из люцерны; 17% белка Мука из обрушенной сои, зкстрагированна  растворителем; 50% белка Тростникова  меласса Мочевина Фактор Дикальцийфосфат пищевой Карбонат кальци  Хлористый натрий Смесь минералов в виде следов Смерь витаминов А и D «. Смесь витаминов Е Пропионат кальци  IJ Содержит в 1 фунте (0,45 227200 ед. витамина Dj и 385,7 2) Сухое зерно с растворимы спирто-водочного завода, содер в 1 фунте.

Смешанный корм прессовали в форме таблеток . При среднем количестве корма, равном 6,8 кг в день, каждое животное получало примерно 300 мг фактора D ежедневноФормула изобретени 

Claims (2)

1. Способ получени  антибиотического компл$кса А - 28086,отличающийс ,,тем, что,

48

58,9

6.5 5,0 45Д

36,3 16,3 7,27

4,53

0,9 ч0.09

Культуру микроорганизма Streptomycesaureofaciens NRRL 5758/или Streptomycesaijreofaciens NRRL 8092 выращивают в аэробньис услови х на питательной среде, содержащей усво емые источники углерода, азота и неорганических солей с последующим вьщелением из культуральной жидкости целевого продукта.

2. Способ по п. 1. о т л и ч а ю щ и и с   тем, что из, отделенного комплекса антибиотика выдел ют Пример 36. Корм дл  м сного скота, содержащий фактор D. Сбалансированный высокосортный корм дл  кота, идущего на м со, приготовили по еледующему рецепту: . Количество 000000 ед. витамина А, добавлением 1% масла. ествами-отходами 20000 еда-, а- токоф ерилацетата

49

фракции, содержащие А,В и О факторы данного антибиотикаПриоритет по,признакам:

. 10.06.74 (за вка N 477954) по признаку п. I Streptomyces aureotaciens NRRL 5758 - и по аризна-. куп. 2-фактор А;

21.04.75 (за вка N 569740) по признаку п. 1 Streptomyces aurefaciens NRRL 5758 - н по приз, наку п. 2 - фактоо В;

50

21.04.75 (за вка N 569719) по признаку п. 1 Streptomyces aurefaciens NRRL 8092 - и по признаку п. 2 - фактор DИсточники информ иши, прин тые во внимание

при экспертизе;

1.Авторское |хаидетельство N 121542. кл. C12D9/18. 1959.

2.Патент США М 3155578, кл. 424-115,1964.

/ 9nf 9fnOfi 2Olf

Csi

§Р

Й

fe 3t §

§

P l§ 5 5tJ

I

«M

j

-j I

ч

evj

: 6«i

Ю

8|

§

%

fif f 3/}iJOCfi/

CM

§

JX /7f ffAfJ trcflf

it

I I

« «

N ( 5)

elO

Csi

/Vi ffn oj sAuocfi/

м

c:a

«5 «O O

if

Csl

-л8

Cs

Сэ NJ

S

4i

CM

« «K

«5 ЧУ

«

ts.

5s

«r

I

5- c.

irT

X

§

I

«i

«i

«5

fn

«N

/ f-/oj/o/Ji/oef/

s

«5

§

2

иг

«N

э

о

«5

ъ

сэ

oi

«и

ад

«5

К

О

ча

S

г

iv

I

I

ъ

I I

л

sa

vrj Csi

% s/ ivгfno(